CN116496374A - 一种水通道蛋白在提高丛枝菌根真菌共生植物富集、吸收、转运砷和磷能力中的应用与方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水通道蛋白在提高丛枝菌根真菌共生植物富集、吸收、转运砷和磷能力中的应用与方法。本发明公开了一种水通道蛋白PvNIP2和其编码基因及其应用。在砷胁迫下，与丛枝菌根真菌共生的蜈蚣草的水通道蛋白PvNIP2表达量显著升高。在Δacr3酵母菌株过表达水通道蛋白PvNIP2，其对砷的转运功能得到提高。在烟草过表达水通道蛋白PvNIP2，再与丛枝菌根真菌共生，烟草地上部和根部的砷积累量显著提高，生物量升高，还促进了转基因烟草对磷的吸收，提高了烟草对砷的富集效果、对磷的吸收及生物量积累，适用于修复土壤砷污染。而在烟草中转入其他砷转运蛋白(例如PvACR3)，不能达到PvNIP2的效果。

Description

一种水通道蛋白在提高丛枝菌根真菌共生植物富集、吸收、转 运砷和磷能力中的应用与方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种水通道蛋白在提高丛枝菌根真菌共生植物富集、吸收、转运砷和磷能力中的应用与方法。

背景技术

随着矿山开采和冶炼、污水排放和城镇化发展，土壤中的砷污染越来越严重。植物修复环境中的砷，具有安全、环保、廉价等优势，目前迫切需要开发筛选出新的砷超富集植物，来治理和修复砷污染。然而砷超富集植物需要对砷有很高的吸收转运能力，且没有出现砷毒害现象。普通植物并不能达到这种条件，难以实现植物修复。

蜈蚣草是一种典型的砷超富集植物，具有将砷高效吸收并大量富集到地上部的能力。目前已发现一些普通植物利用水通道蛋白吸收As，有待于进一步挖掘探究新的As吸收转运蛋白，更加全面地阐明蜈蚣草转运砷的机理，利用新的转运蛋白，提高植物修复调控环境的效率。

丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是一类广泛存在的共生土壤真菌，能够与陆地上大多数植物形成共生关系，AMF从宿主植物种获取碳水化合物，同时帮助宿主植物从土壤中获取养分(如磷)，存在促进生长的作用。AMF在砷土壤污染修复中也有良好的应用效果，普通植物与AMF共生能够增强植物对重金属的耐受性，降低重金属地上部砷的积累。而砷超富集植物与AMF共生则显示出相反效果，会增强将砷转运到地上部的能力，强化砷提取修复的效果。蜈蚣草在与AMF共生后能显著提高对砷的富集。蜈蚣草富集砷依赖于一些关键的转运蛋白，但是与AMF特异响应表达的砷转运蛋白知之甚少。因此，研究AMF特异响应表达的砷转运蛋白，对强化蜈蚣草富集吸收砷，筛选培养出更加优异的砷超富集植物，加强植物修复技术治理砷污染，从而改善生态环境，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种水通道蛋白在提高丛枝菌根真菌共生植物富集、吸收、转运砷和磷能力中的应用与方法。

本发明的第一个目的是提供一种水通道基因PvNIP2。

本发明的第二个目的是提供一种水通道蛋白PvNIP2。

本发明的第三个目的是提供一种重组载体。

本发明的第四个目的是提供一种重组工程菌。

本发明的第五个目的是提供所述水通道基因PvNIP2、所述水通道蛋白PvNIP2、所述重组载体和所述重组工程菌中的一种或几种在提高与丛枝菌根真菌共生的植物，富集、吸收和/或转运砷和/或磷的能力中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种提高植物富集、吸收和/或转运砷和/或磷的能力的方法。

本发明的第七个目的是提供一种构建高富集、吸收和/或转运砷和/或磷的能力的植物的方法。

本发明的第八个目的是提供一种高砷富集、吸收和/或转运能力的酵母菌。

本发明的第九个目的是提供一种提高酵母菌富集、吸收和/或转运砷能力的方法。

本发明的第十个目的是提供一种构建高砷吸收、富集和/或转运能力的酵母菌的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种水通道基因PvNIP2，所述水通道基因PvNIP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一种水通道蛋白PvNIP2，所述水通道蛋白PvNIP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

一种重组载体，所述重组载体中含有所述水通道基因PvNIP2。

一种重组工程菌，所述重组工程菌中含有所述水通道基因PvNIP2。

所述水通道基因PvNIP2、所述水通道蛋白PvNIP2、所述重组载体和所述重组工程菌中的一种或几种在提高与丛枝菌根真菌共生的植物，富集、吸收和/或转运砷和/或磷的能力中的应用。

一种提高植物富集、吸收和/或转运砷和/或磷的能力的方法，在与丛枝菌根真菌共生的植物中过表达所述水通道基因PvNIP2和/或所述水通道蛋白PvNIP2。

一种构建高富集、吸收和/或转运砷和/或磷的能力的植物的方法，在与丛枝菌根真菌共生的植物中过表达所述水通道基因PvNIP2和/或所述水通道蛋白PvNIP2。

在本发明中，以烟草植物为例，构建了过表达水通道蛋白PvNIP2的转基因烟草，提高了丛枝菌根真菌共生的烟草，富集、吸收和/或转运砷和/或磷的能力。

环境中的AsⅤ(五价砷)，在植物体内被转化为AsIII(三价砷)。丛枝菌根真菌(AMF)特异性诱导蜈蚣草中的水通道蛋白PvNIP2表达，再将AsIII进行转运。基于此，本发明在普通植物烟草中表达水通道蛋白PvNIP2，得到转基因烟草，再与AMF共生，使转基因烟草地上部和根部的砷含量显著提高，同时生物量升高，大幅提高了转基因烟草对于砷的富集效果，适用于修复土壤砷。

一种高砷富集、吸收和/或转运能力的酵母菌，在酵母菌中过表达所述水通道基因PvNIP2和/或所述水通道蛋白PvNIP2。

一种提高酵母菌富集、吸收和/或转运砷能力的方法，在酵母菌中过表达所述水通道基因PvNIP2和/或所述水通道蛋白PvNIP2。

一种构建高砷吸收、富集和/或转运能力的酵母菌的方法，在酵母菌中过表达所述水通道基因PvNIP2和/或所述水通道蛋白PvNIP2。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种水通道蛋白PvNIP2和其编码基因，在提高与丛枝菌根真菌共生的植物，富集、吸收、转运砷和/或磷的能力中的应用。在砷胁迫下，与丛枝菌根真菌(AMF)共生的蜈蚣草的水通道蛋白PvNIP2表达量显著升高。在Δacr3酵母菌株中过表达水通道蛋白PvNIP2，其对三价砷的转运功能得到提高。

在烟草中表达水通道蛋白PvNIP2，得转基因烟草，再与丛枝菌根真菌共生，烟草地上部和根部的砷积累量显著提高，生物量升高。接AMF菌后，转基因烟草地上部砷含量显著上升，可提高4.2倍。转基因烟草地下部砷积累量也显著上升，可提高34.7％。不接AMF菌时与野生型相比，转基因烟草地上部生物量最多可增加38.8％，接AMF菌时与野生型相比，转基因烟草的地上部的生物量最多可增加21.8％，同时，还促进了转基因烟草对磷的吸收。因此在烟草中表达水通道蛋白PvNIP2，再与AMF菌共生，有效提高了烟草对砷的富集效果、对磷的吸收及生物量积累，适用于修复土壤砷污染。

而在烟草中转入其他砷转运蛋白(例如PvACR3)，不能达到水通道蛋白PvNIP2的效果：在As(V)处理条件下，接种AMF后，PvACR3转基因烟草地上部的砷含量与野生型相比并未出现显著提高。AMF共生时，对于PvACR3对砷的富集效果无显著影响，也表明PvACR3对AMF无特异性响应。

附图说明

图1为As胁迫和与AMF共生，对蜈蚣草内PvNIP2基因表达的影响。

图2为在As(III)胁迫下，以葡萄糖和半乳糖作为碳源时，表达PvNIP2蛋白的酵母细胞的生长情况。

图3为与AMF共生，对过表达PvNIP2蛋白的烟草生长情况的影响。其中，A为不接AMF的烟草生长情况；B为与AMF共生的烟草生长情况；C为不接AMF，烟草地上部的生长情况；D为不接AMF，烟草根部的生长情况；E为与AMF共生，烟草地上部的生长情况；F为与AMF共生，烟草根部的生长情况。

图4为与AMF共生，对表达PvNIP2蛋白的烟草砷积累和磷吸收情况的影响。其中，A为不接AMF的烟草地上部砷积累情况；B为与AMF共生，烟草地上部砷积累情况；C为不接AMF的烟草根部砷积累情况；D为与AMF共生，烟草根部砷积累情况；E为不接AMF的烟草地上部磷吸收情况；图4F为与AMF共生，烟草地上部磷吸收情况；G为不接AMF的烟草根部磷吸收情况；H为与AMF共生，烟草根部磷吸收情况。

图5为与AMF共生，对过表达PvACR3蛋白的烟草的生长情况和砷积累的影响。其中，A为与AMF共生，烟草生长情况；B为与AMF共生，烟草地上部砷积累情况；C为与AMF共生，烟草根部砷积累情况。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1蜈蚣草PvNIP2基因对砷胁迫和丛枝菌根真菌(AMF)的响应情况

一、实验方法

(1)蜈蚣草的预培养和处理

蜈蚣草孢子萌发后，将其分散在水中，并洒在营养土表面，通过定期浇水和覆膜保持土壤水分。2个月后，孢子生长出蜈蚣草幼苗，将蜈蚣草幼苗移栽到新的营养土中继续培养，待幼苗长至5～6叶后，移至1/5霍格兰营养液中曝气培养，即得后续实验所用蜈蚣草植株。所有植株均生长在光照14h、昼温度25℃、夜温度18℃、相对湿度50％和光强3000lx的温室中。

本发明使用的AMF菌剂(BGC菌种保藏编号：BGC HEB07D，国家自然科技共享平台资源号:1511C0001BGCAM0056，中文名称：根内球囊霉，属名：Glomus，种名加词：intraradices，来源：北京市农林科学院植物营养与资源研究所)由大豆扩繁，培养体系为沙培体系。为了了解砷(As)与蜈蚣草PvNIP2基因(PvNIP2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，PvNIP2蛋白的氨基酸片段如SEQ ID NO：2所示，)的表达情况，共设置四组实验，分别为空白对照(CK)、不接菌加砷、接菌不加砷和接菌加砷，每组包括4棵长势较好且一致的蜈蚣草。接菌一个月后，加砷组中每盆添加80mL浓度为50μM的As(V)，三天后收样，作为待测蜈蚣草样品。

CK和不接菌组的培养体系为普通沙培体系，接菌组的培养体系为均匀混合了AMF菌剂的沙培体系，其中沙与AMF菌剂的体积比为16：1。

(2)RNA提取和转录分析

从步骤(1)蜈蚣草样品的根系组织中提取总RNA。用HiScript II One Step RT-PCR试剂盒(Vazyme Biotech,Nanjing,China)将总RNA反转录成cDNA。以PvActin基因作为内参基因，定量引物信息见表1。

以所得cDNA作为模板，用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(Vazyme Biotech,Nanjing,China)进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)，qRT-PCR体系见表2，qRT-PCR程序见表3，用2-ΔΔCT法统计qRT-PCR结果，记录PvNIP2基因的表达情况。

表1qRT-PCR引物列表

名称	序列编号	序列
			qRT-PvNIP2-F	SEQ ID NO：3	TGCACACGTGCAACATAACAGA
qRT-PvNIP2-R	SEQ ID NO：4	TGAGCACTGTGAAGGGCTTTGA
			qRT-PvActin-F	SEQ ID NO：5	GGGCAGTATTTCCAAGCATAGTGGG
qRT-PvActin-R	SEQ ID NO：6	TGCCTCGCTTTGATTGAGCCTCATC

表2qRT-PCR体系列表

表3qRT-PCR程序

温度(℃)	时间(s)
		94	30
94	5
		50～60	15
72	10

二、实验结果

如图1所示，在定量分析中，As胁迫对PvNIP2的表达没有显著差异。在无AMF共生的情况下(不接菌)，几乎检测不到蜈蚣草内PvNIP2表达，而在AMF共生时(接菌)，其蜈蚣草内PvNIP2表达丰度显著上调。PvNIP2基因的表达对于AMF存在正向响应，表明蜈蚣草与AMF共生，对PvNIP2表达有的重要影响。

实施例2蜈蚣草PvNIP2蛋白酵母砷抗性实验

一、实验方法

为确定PvNIP2蛋白转运As(III)的功能，以空载为对照，在Δacr3酵母菌株中异源表达PvNIP2基因，载体是pYes2，用酵母快速转化试剂盒(Yeast Transformation Kit,coolaber)将空载体与重组载体分别转入酵母突变株Δacr3。

Δacr3酵母菌株是突变了As(III)的外排蛋白的酵母突变体，丧失了对于As(III)的外排能力，当以半乳糖为唯一碳源时，载体受半乳糖启动子驱动，PvNIP2蛋白表达，使得酵母细胞具有了转运As(III)的功能，而酵母菌株在以葡萄糖为唯一碳源的培养基上无法表达PvNIP2蛋白。

因此本发明在Δacr3酵母菌株中表达了PvNIP2基因及其蛋白，此时表达的PvNIP2蛋白强化了突变Δacr3酵母菌株对于As(III)的吸收，更好的反应PvNIP2蛋白对As(III)的转运功能。

将转有空载和表达PvNIP2基因的酵母转化株分别接种至SD-U培养基中，得酵母转化株悬液，进行扩培。当酵母转化株培养至OD₆₀₀为1.0时，将酵母转化株悬液离心富集，重悬于无菌水中，使OD₆₀₀重新调至1.0作为起始点，10倍梯度稀释3次，得到4组梯度稀释的酵母转化株悬液。在SD-U液体培养基中分别加入不同量As(III)，使As(III)终浓度为0μM、10μM、50μM和100μM，再加入琼脂，于115℃高压蒸汽灭菌30min，灭菌结束后倒平板，冷却后制成固体平板培养基。

将4组梯度稀释的酵母悬液分别混匀后，分别吸取2.5μL酵母悬液，从右至左滴在不同砷浓度的固体培养基平板上。置于30℃恒温培养箱中培养3～5天，通过酵母生长状况，反应PvNIP2蛋白对As(III)的转运功能。

二、实验结果

如图2所示，在As(III)胁迫下，PvNIP2蛋白被GAL启动子启动，其表达受半乳糖的诱导。当葡萄糖作为碳源时，表达PvNIP2蛋白的酵母细胞与对照组无显著差异，表明PvNIP2蛋白未表达，此时酵母细胞不具有As(III)转运能力。当半乳糖作为唯一碳源时，在100μMAs(III)的培养基中，PvNIP2蛋白表达后具有As(III)转运能力，酵母细胞生存能力降低，而在10μMAs(III)的培养基中，仍有酵母细胞存活。这表明PvNIP2蛋白对As(III)具有转运能力，其对砷的转运能力较强。

实施例3表达蜈蚣草PvNIP2蛋白，且接种丛枝菌根真菌(AMF)后的烟草与野生型烟草生物量比较

一、实验方法

(1)转基因烟草的获得

通过表4所示的引物，分别扩增三个片段(启动子pro.LePT4，目标基因PvNIP2，终止子NOS)，得到启动子扩增片段、目标基因扩增片段和终止子扩增片段，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：13、1和14所示。

将3份扩增片段通过多片段同源重组酶2×Hieff Canace Gold PCR Master Mix(Yesen)，一次性连接到经BamHI、EcoRI酶切线性化的载体PCAMBIA2300上，构建重组质粒PCAMBIA2300::pro.LePT4::PvNIP2::NOS。

表4

将重组质粒导入农杆菌菌株GV3101中，通过农杆菌转化法构建转基因烟草株系。

通过培养繁殖收获转基因株系T1代种子，在添加30mg/L潮霉素的1/2MS培养基上萌发T1代烟草幼苗，筛选出阳性转化植株，即转入PvNIP2蛋白的烟草，收获其种子。

(2)转基因烟草的培养

使野生型和转入PvNIP2蛋白的烟草种子，在无菌1/2MS和含有15mg/L潮霉素的无菌1/2MS培养基上萌发，2周后，长出烟草幼苗，将长势一致的烟草幼苗移入无菌沙中预培养2周，每3天加一次1/5霍格兰营养液。选择出长势一致的野生型(WT)和转基因烟草进行盆栽实验(N2、N7和N8)。

盆栽实验中，每个株系的烟草分别接菌或不接菌，每3天补充一次80mL的新鲜1/5HNS营养液(含有30μM Pi，为低磷条件)。植物生长1个月后，每个株系中选择一个最有代表性的盆栽进行拍照，并将植株分成地上部和根系，通过测量其鲜重，分别进行生物量的测定和统计。接菌的方法与实施例1相同。

二、实验结果

如图3中A，图3中B所示，无论是否有AMF的存在，转入PvNIP2蛋白的烟草的表型与野生型相比表现出明显差异，表明转入PvNIP2蛋白的烟草长势较好。

如图3中C和图3中D所示，不接菌时与野生型相比，表达PvNIP2蛋白的烟草地上部生物量最多可增加38.8％，最少可增加20.6％。根部的生物量虽无明显差异但总体也有上升的趋势。

如图3中E和图3中F所示，接菌时，表达PvNIP2蛋白的烟草的地上部的生物量显著增加，增加量最多可达21.8％，而根部的生物量虽无明显差异但总体也有上升的趋势。

实施例4表达蜈蚣草PvNIP2蛋白的烟草接种丛枝菌根真菌(AMF)后地上部的砷富集效果

一、实验方法

(1)烟草的预培养和处理方法

选择实施例3中的烟草株系萌发2周后，将长势一致的烟草幼苗移入无菌沙中预培养1个月，每3天加一次1/5霍格兰营养液。选择长势一致的野生型(WT)和转基因烟草进行盆栽实验(N2、N7和N8)。

盆栽实验中，每个株系的烟草分别接菌或不接菌，每3天补充一次80mL的新鲜1/5HNS营养液(含有30μM Pi，为低磷条件)。烟草生长1个月后，向每盆烟草中加入80mL含150μM As(V)，三天后相同条件再次进行As(V)处理，一周后收样。将蜈蚣草分成地上部和根系两部分，烘干后保存备用。

(2)磷含量的测定

分别称取0.05g的本实施例4步骤(1)烘干烟草地上部与地下部样品于消解管中，加入10mL 1：1(v/v)硝酸，用石墨炉消解仪分别消解各待测烟草样品，获得植物样品消解液。消解液经定容稀释后，上清液经0.45μm孔径滤膜过滤；过滤后，电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定消解液中样品的总磷含量。

(3)砷含量的测定

各样品消解液经定容稀释后，将上清液经0.45μm孔径滤膜过滤；过滤后，使用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定消解液中砷的含量。

二、实验结果

如图4中A和图4中B所示，在无AMF共生条件下，表达PvNIP2蛋白的烟草与野生型(WT)相比，地上部砷含量无显著差异；接种AMF后，表达PvNIP2蛋白的烟草地上部砷含量显著上升，N7上升约2.1倍，N8上升约4.2倍。

如图4中C和图4中D所示，存在AMF共生条件下，表达PvNIP2蛋白的烟草地下部的砷积累量也显著上升，N2上升了34.7％，N8上升了30.7％；而不接AMF菌时，对地下部的砷积累无明显影响。

由此说明，存在AMF共生时，PvNIP2显著增加了植物对于砷的富集效果。

如图4中E和图4中F所示，在低磷条件下，表达PvNIP2烟草(N2、N7、N8)与野生型(WT)相比，其地上部磷含量未显示出显著差异；而AMF共生后，促进了烟草地上部对磷的吸收，与野生型相比磷含量最多可提高30.7％，且地下部和地上部呈现出相似的趋势(图4中G和图4中H)。这表明表达PvNIP2促进了AMF共生后烟草对于磷的吸收。

对比例1表达蜈蚣草PvACR3蛋白的烟草接种丛枝菌根真菌(AMF)后表型和地上部的砷富集效果

一、实验方法

PvACR3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示，PvACR3蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：16所示。已有研究表明，PvACR3可以显著提高砷在地上部的积累，并降低植物根部的砷含量。

用与实施例3相同的方法构建表达PvACR3的转基因烟草(L1和L8)，使用的载体为1381Z，其中扩增PvACR3目的基因的引物见表5。

用与实施例3和实施例4采用相同的方法，观察其L1和L8接菌后表型和地上部对于砷的富集效果。

表5

名称	序列编号	序列
			PvACR3-PCR-F	SEQ ID NO：17	CTAAACTGCAAGGGCTTTTC
PvACR3-PCR-R	SEQ ID NO：18	CCGGTACTTCAATAAGAGGG

二、实验结果

如图5中A所示，接种AMF后，L1和L8转基因烟草表型并无显著差异。

如图5中B和图5中C所示，在As(V)处理条件下，接种AMF后，PvACR3转基因烟草地上部的砷含量与野生型相比并未出现显著提高。AMF共生时，对于PvACR3对砷的富集效果无显著影响，也表明PvACR3对AMF无特异性响应。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种水通道基因PvNIP2，其特征在于，所述水通道基因PvNIP2的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

2.一种水通道蛋白PvNIP2，其特征在于，所述水通道蛋白PvNIP2的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体中含有权利要求1所述水通道基因PvNIP2。

4.一种重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌中含有权利要求1所述水通道基因PvNIP2。

5.权利要求1所述水通道基因PvNIP2、权利要求2所述水通道蛋白PvNIP2、权利要求3所述重组载体和权利要求4所述重组工程菌中的一种或几种在提高与丛枝菌根真菌共生的植物，富集、吸收和/或转运砷和/或磷的能力中的应用。

6.一种提高植物富集、吸收和/或转运砷和/或磷的能力的方法，其特征在于，在与丛枝菌根真菌共生的植物中表达权利要求1所述水通道基因PvNIP2和/或权利要求2所述水通道蛋白PvNIP2。

7.一种构建高富集、吸收和/或转运砷和/或磷的能力的植物的方法，其特征在于，在与丛枝菌根真菌共生的植物中表达权利要求1所述水通道基因PvNIP2和/或权利要求2所述水通道蛋白PvNIP2。

8.一种高砷富集、吸收和/或转运能力的酵母菌，其特征在于，在酵母菌中表达权利要求1所述水通道基因PvNIP2和/或权利要求2所述水通道蛋白PvNIP2。

9.一种提高酵母菌富集、吸收和/或转运砷能力的方法，其特征在于，在酵母菌中表达权利要求1所述水通道基因PvNIP2和/或权利要求2所述水通道蛋白PvNIP2。

10.一种构建高砷吸收、富集和/或转运能力的酵母菌的方法，其特征在于，在酵母菌中表达权利要求1所述水通道基因PvNIP2和/或权利要求2所述水通道蛋白PvNIP2。