CN109956997A

CN109956997A - 水稻水通道蛋白编码基因OsNIP3;3的应用

Info

Publication number: CN109956997A
Application number: CN201711426035.1A
Authority: CN
Inventors: 赵方杰; 孙晟凯; 唐仲; 黄新元; 马建锋
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2017-12-26
Filing date: 2017-12-26
Publication date: 2019-07-02
Anticipated expiration: 2037-12-26
Also published as: CN109956997B

Abstract

本发明公开了水稻水通道蛋白编码基因OsNIP3；3的应用。一种水通道蛋白编码基因OsNIP3；3，Genbank中的登录号为AB710141。该基因可在减少水稻中柱部分三价As的浓度，减少三价As向木质部装载，和显著降低水稻地上部与籽粒砷的积累中的应用。本发明通过大量实验发现了水稻中的水通道蛋白编码基因OsNIP3；3的生物功能，该基因超表达后，降低了水稻地上部的As含量。超表达该基因显著降低水稻叶片、种壳和籽粒中As的积累。

Description

水稻水通道蛋白编码基因OsNIP3；3的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及水稻水通道蛋白编码基因OsNIP3；3的应用。

背景技术

目前，环境中的重金属污染问题日益突出，其中耕地土壤砷(As)污染也日趋严重。水稻是重要的粮食作物，全球一半左右的人口以水稻为主要粮食作物。由于水稻对砷的富集，稻米占我国人口膳食砷摄入的60％(Li et al.2009)。因此解析水稻对As的吸收解毒机制以及通过基因工程技术开发降低水稻籽粒对As的积累的方法十分重要。在土壤中，砷在好氧条件与淹水条件分别以五价砷As(V)和三价砷As(III)的形态存在(Zhao et al.,2010)。As(III)主要通过水通道蛋白Lsi1被水稻根部吸收(Ma et al.,2008)，在植物体内，As(III)可以被植物螯合肽(PCs)螯合并被转运到液泡中(Ha et al.,1999；Raab et al.,2005；Liuet al.,2010)或者直接被排出体外进行解毒。而As(V)主要通过磷酸盐转运蛋白被水稻吸收(Wang et al.,2016；Wu et al.,2011；Kamiya et al.,2013)。吸收到植物体内的As(V)会被硫氰酸酶家族基因还原成As(III)(Chao et al.,2014；Sanchez-Bermejo et al.,2014；Shi et al.,2016；Xu et al.,2017)，进而被螯合或者排出体外进行解毒。在许多植物中发现砷主要以As(III)的形态存在，因此水稻体内As(III)的运输过程十分重要。

植物水通道蛋白(NIPs)不仅可以高效转运水分子,还可作为一种离子选择性透过膜有效介导其他小分子物质、营养元素以及金属离子的运输。小麦和拟南芥的水通道蛋白能通透NH⁴⁺/NH^3-(Holm et al.,2005)；西葫芦的水通道蛋白NIP1能够转运尿素(Klebl et al.,2003)；一些NIPs除了通透水外，拟南芥AtNIP5；1和AtNIP6；1,水稻OsNIP2；1(Lsi1)还可双向转运亚砷酸盐(Ma et al.,2008；Bienert et al.,2008)。目前在水稻中参与体内As(III)运输的水通道蛋白基因除Lsi1外很少被报道。OsNIP3；3基因在Genbank中的登录号为AB710141。本发明OsNIP3；3基因在Genbank中被注释为类NOD26的水通道蛋白(NOD26-likeintrinsic protein)。

发明内容

本发明的目的是提供水稻水通道蛋白编码基因。

本发明的目的是提供该基因的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种水通道蛋白编码基因OsNIP3；3，Genbank中的登录号为AB710141。

所述的水通道蛋白编码基因的超表达载体，含有所述的水通道蛋白编码基因。

所述的超表达载体，优选以pTCK303载体为出发载体，将所述的水通道蛋白编码基因的开放阅读框序列插入Spe I及Kpn I酶切位点间所得。

所述的水通道蛋白编码基因在减少水稻根中三价砷向木质部装载，和显著降低水稻地上部与籽粒砷的积累中的应用。

所述的应用优选将所述的水通道蛋白编码基因构建超表达载体，并导入水稻得到超表达该基因的水稻，从而减少水稻根中三价砷向木质部装载，和显著降低水稻地上部与籽粒砷的积累中的应用。

所述的水通道蛋白编码基因在降低砷污染水稻土中水稻籽粒砷含量中的应用。

本发明所述的超表达载体在减少水稻根中三价砷向木质部装载，和显著降低水稻地上部与籽粒砷的积累中的应用。

所述的应用，将所述超表达载体导入水稻得到超表达该水通道蛋白编码基因的水稻，在减少水稻根中三价砷向木质部装载，和显著降低水稻地上部与籽粒砷的积累中的应用。

本发明所述的超表达载体在降低砷污染水稻土中水稻籽粒砷含量中的应用。

本发明的有益效果

1、本发明通过系统研究，首次提供了一种水通道蛋白编码基因OsNIP3；3及其生物学功能。

2、该水通道蛋白编码基因OsNIP3；3在非洲爪蟾卵母细胞中异源表达后，证明了其对As(III)的运输能力(图1)。

3、构建了OsNIP3；3超表达材料(图2)

3、该水通道蛋白编码基因OsNIP3；3超表达后，减少了水稻地上部和木质部汁液里面的As含量(图3，图4)。

4、超表达该水通道蛋白编码基因OsNIP3；3显著降低水稻叶片和种壳中砷的积累(图5)。

5、超表达该水通道蛋白编码基因OsNIP3；3显著降低水稻籽粒中砷的积累(图6)。

附图说明

图1为OsNIP3；3在蛙卵细胞中异源表达后，证明了其对As(III)的运输能力。其中，H₂O代表注射水的蛙卵细胞，为负对照，Lsi1表示注射Lsi1的cRNA的蛙卵细胞，为正对照。NIP3；3表示注射OsNIP3；3的cRNA的蛙卵细胞。OsNIP3；1表示注射OsNIP3；1的cRNA的蛙卵细胞，为弱功能对照。

图2为OsNIP3；3在超表达材料和野生型中表达量。

图3为OsNIP3；3超表达材料与野生型相比，根部As含量没有明显变化，但是地上部As含量明显减少。外界5μM As(III)处理24h后超表达材料与野生型中根部和地上部As的含量。

图4为OsNIP3；3超表达材料与野生型相比，木质部汁液中As含量量明显减少。

图5为OsNIP3；3超表达材料与野生型相比，叶片和种壳As含量显著降低。

A：OsNIP3；3超表达材料和野生型生长在湖南郴州As污染土(85.8mg/kg As)中；

B：OsNIP3；3超表达材料和野生型生长在浙江上虞As污染土(75.8mg/kg As)中。

图6为OsNIP3；3超表达材料与野生型相比，籽粒As含量显著降低40-50％左右。

具体实施方式：

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1水通道蛋白编码基因OsNIP3；3在非洲爪蟾卵母细胞中的运输活性试验。

根据NIP3；3、NIP2；1(Lsi1)和NIP3；1基因的cDNA读码框序列，设计PCR引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点，引物序列见下表。

扩增的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，并分离后切胶回收，产物回收后用相应限制性内切酶进行酶切，同时酶切蛙卵表达载体pT7TS,将酶切过的载体与PCR片段用T4连接酶连接，转化到大肠杆菌中并提取阳性克隆进行酶切以及DNA测序鉴定。检测正确的质粒经过线性化处理后，利用mMESSAGE mMACHINE(Ambion)试剂盒合成NIP基因的单链cRNA.50ng/oocyte的cRNA被显微注射入蛙卵中，以注射水为对照，注射后蛙卵置于Modified Barth’sSaline(MBS)培养液在18℃中进行48至72小时的蛋白表达，之后应用含有100μM亚砷酸的MBS营养液分别处理蛙卵30-60分钟，处理后用营养液彻底清洗蛙卵并收集利用硝酸消解，最后经ICP-MS检测As元素总量，从而分析不同NIP基因对上述底物的转运能力。

本实施例的研究表明水通道蛋白编码基因OsNIP3；3在蛙卵细胞中异源表达后，证明了其对As(III)的运输能力，而NIP3；1仅有非常弱的转运活性(图1)。

实施例2OsNIP3；3超表达载体材料的构建

1)总RNA的提取：将水稻种子经30％次氯酸钠溶液消毒30min后，用无菌水洗涤4-5次，然后用1/2MS培养基培养至2周左右，选择大小一致的幼苗转移至培养桶中，用1/2的Kimura营养液培养一周后取叶片于液氮中保存，利用植物总RNA提取试剂盒(北京百泰克公司)提取RNA。

2)使用反转录试剂盒(南京诺唯赞公司)进行总cDNA的合成。

3)OsNIP3；3基因全长的获得及超表达载体的构建：

根据OsNIP3；3全长cDNA序列设计超表达引物，引物序列如下：

OsNIP3；3-F:AGAGGATCCCCGGGTACCATGGAAGGGCACAAGAGTGGC(seq id no.1)；

osnip3；3-r:GTCTTTGTAGTCCATACTAGTCAGCTTAATTGCAACATAAGCCCCA(SEQ ID NO.2)；

以水稻cDNA为模板扩增得到OsNIP3；3开放阅读框序列。含目的基因的PCR产物经回收纯化后连入用Spe I及Kpn I双酶切得到含特定酶切位点的pTCK303载体，得到表达载体pTCK303-OsNIP3；3，经测序验证正确后备用。

4)将酶连正确的载体pTCK303-OsNIP3；3转入农杆菌备用。

实施例3水通道蛋白编码基因OsNIP3；3超表达转基因材料的获得

将实施例2中获得的转有pTCK303-OsNIP3；3质粒的农杆菌，侵染日本晴水稻愈伤组织，共培养2天后经过选择培养、分化、生根、炼苗得到T0代转基因植株。

试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的英文所写缩写表示如下：6-BA(6-苄基腺嘌呤)；Car(羧苄青霉素)；NAA(萘乙酸)；IAA(吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(乙酰丁香酮)；CH(水解酪蛋白)；L-pro(L-脯氨酸)；L-Glu(L-谷氨酰胺)；MES(2-吗啉乙磺酸)；N6(N6大量元素成份溶液)；B5(B5微量元素成份溶液)；AA(AA大量元素成份)；Agar(琼脂)。

溶液与培养基配方

Ⅰ激素配制方法

Ⅱ水稻组培中激素及抗生素的浓度

III水稻组培培养基母液配方

Ⅳ粳稻成熟胚愈伤组织诱导培养基(1L用量)

Ⅴ粳稻成熟胚愈伤组织继代培养基(1L用量)

Ⅵ粳稻共培养培养基(1L用量)

Ⅶ愈伤选择培养基(1L用量)

Ⅷ粳稻分化培养基(1L用量)

Ⅸ粳稻生根培养基(1L用量)

Ⅹ悬浮农杆菌侵染愈伤组织的培养基(AAM感菌液，1L用量)

农杆菌介导的水稻转化

水稻成熟胚愈伤组织的诱导：去皮的水稻种子(一盘14粒)入三角瓶，用体积比70％乙醇浸泡1min(淹没种子)，倒掉体积比70％乙醇，用体积比30％次氯酸钠浸泡30min，然后用灭菌水清洗5-6次直至清亮。用镊子把种子拨到灭菌的滤纸上，吸干水分，最后把日本晴水稻种子置于诱导培养基上，在30℃光照培养箱培养20-30d。

农杆菌培养：挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌(EHA 105)菌液100μL于4mLYEP(含50mg/L Kan和50mg/L Str)培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD₆₀₀为0.8～1.0。

感菌共培养：取培养好的菌液500μL于1.5mL离心管中，4℃，4000rmp，离心2min，去上清。用含200μmol/L As的30mL AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD600的终浓度为0.01-0.05；将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5min；将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40min；将愈伤组织置于共培养基上，25℃暗培养2.5d；

选择：将愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次，其间需不停的振荡。再用含500mg/L羧苄青霉素(Car)的无菌水清洗1-2遍。最后置于无菌滤纸上沥干2h；将晾干的愈伤转入含500mg/L羧苄青霉素和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28℃，光照培养14d；将长有抗性愈伤的初始愈伤转到含500mg/L羧苄青霉素和80mg/L潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28℃，光照培养，直到长出颗粒性的抗性愈伤组织。

抗性愈伤组织的诱导分化和生根：在超净台上挑取从同一愈伤来的颜色鲜黄的抗性愈伤3-4颗，移入装有分化培养基的塑料广口瓶中(每瓶放置5-7颗)，用封口膜封好，放入恒温培养室中，等待分化成苗(25-30d)。待苗长至2-3cm左右，放入生根培养基中壮苗。

转基因苗移栽：转基因苗从分化到移栽最短时间为两个月左右。将苗根部和茎叶分化得较完好的试管挑出(苗长至试管顶部，就要及时开盖)，打开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水，炼苗3d至7d左右，然后洗去琼脂，移栽到水稻全营养液中生长，检测。

转基因苗的检测：潮霉素筛选：准备生根后经过清洗的水稻苗，取完好的转基因水稻叶片(叶片颜色正常)0.8～1.5cm放到含有筛选培养基的培养皿中。同时将没有转基因的叶片做为阴性对照，将经过鉴定的阳性苗叶片作为阳性对照。在光照培养箱内倒置培养48h后观察处理情况：叶片变黄、枯萎的是假阳性植株；而颜色不变的叶片是阳性苗。

PCR扩增潮霉素筛选方法：采用微量DNA提取(TPS法)方法，提取DNA。以所提DNA为模板，进行PCR检测。潮霉素引物为HYG-F:atcttagccagacgagcg gg(SEQ ID NO.3)，HYG-R:acacagccatcggtccagac(SEQ ID NO.4)。提取转基因植株DNA(GUS已经检测为阳性的苗)，以DNA为模板进行PCR扩增。产物大小为589bp。

GUS检测：含有将准备好的材料浸泡在染液里，37℃保温过夜，染出蓝色的即为阳性苗。转基因苗的分子鉴定：提取OsNIP3；3超表达材料不同株系叶片的总RNA，反转录总cDNA(总RNA的提取，总cDNA的合成同实施例2)，进行荧光定量PCR鉴定，定量PCR方法如下：反转录合成总cDNA第一链后，以其为模板进行荧光定量PCR扩增，并以水稻组蛋白蛋白基因(OsHistone H3)为内参基因进行表达量校正。OsNIP3；3定量PCR程序如下：95℃预变性5min，94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸30s，40个循环后，72℃5min。基因的序列号和引物设计如下表：

另外我们随机挑选得到超表达效果明显的OsNIP3；3超表达材料NIP3；3OX1；OX2；OX3(图2)。

实施例4

OsNIP3；3的超表达材料对As(III)的吸收实验，具体实施过程如下：

1)将鉴定正确的超表达材料与野生型用30％次氯酸钠溶液灭菌30min；然后用灭菌水清洗4-5次，将种子于1/2MS培养基中萌发；

2)培养两周后将幼苗转移至1/2Kimura营养液中培养，培养2周后进行处理；

3)5L培养皿中种植16棵幼苗，每种材料4个重复，以5mM As(III)处理24h。

4)处理24h后将收集水稻地上部与地下部，并用去离子水清洗清洗3次，于70℃烘干2天。

5)将样品添加5ml混酸(HNO₃:HClO₄＝85:15)进行消煮。

6)以2％HNO₃将样品消煮液定容至10ml，充分摇匀并过滤(0.45μm)。

7)利用ICP-MS测定各样品中As含量。

本实施例表明OsNIP3；3超表达材料与野生型相比，明显减少了水稻地上部的As含量(图3)。

实施例5

OsNIP3；3的超表达材料对As(III)的木质部转运实验，具体实施过程如下：

3)5L培养皿中种植12棵幼苗，每种材料3个重复，以5mM As(III)处理30分钟。

4)处理30分钟在地上部3cm左右减去地上部，用0.3g棉花裹住，4个小时后收取棉花，4000rpm离心3min收集，4℃保存。

5)利用HPLC-ICP-MS测定木质部汁液中的As形态。

本实施例表明OsNIP3；3超表达材料与野生型相比，明显减少了水稻木质部汁液中的As含量(图4)。

实施例6

OsNIP3；3超表达材料以及野生型中茎秆、叶片、种壳和籽粒中As总量的测定，具体实施过程如下：

1)超表达材料(OX1,OX2,OX3)以及背景野生型日本晴。利用1/2MS萌发2周。

2)将幼苗移至5L的塑料桶中，用1/2Kimura营养液培养1周。

3)选取大小一致的幼苗，进行土培，土培土壤分别来自于湖南郴州砷污染水稻土和浙江上虞砷污染水稻土。

4)收获成熟期水稻，于70℃烘箱烘2d。

6)称取0.25g左右茎秆和叶片于消煮管中，添加5ml混酸(HNO₃:HClO₄＝85:15)进行消煮。

6)称取0.2g左右种壳和籽粒于消煮管中，添加5ml HNO₃进行消煮。

7)以2％HNO₃将样品消煮液定容至10ml，充分摇匀并过滤(0.45μm)。

8)利用ICP-MS测定各样品中As含量。

本实施例结果表明OsNIP3；3超表达材料与野生型相比，叶片、种壳和籽粒中As含量显著降低(图5和图6)。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 水稻水通道蛋白编码基因OsNIP3;3的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agaggatccc cgggtaccat ggaagggcac aagagtggc 39

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtctttgtag tccatactag tcagcttaat tgcaacataa gcccca 46

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcttagcca gacgagcggg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acacagccat cggtccagac 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catcatcact gctcttgcca ctg 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aattgtacgc gccggattca tc 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggtcaacttg ttgattcccc tct 23

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaccgcaaaa tccaaagaac g 21

Claims

1.一种用于减少水稻根系中三价砷向木质部的转运，降低水稻地上部与籽粒砷的积累的超表达载体，其特征在于所述的超表达载体为含有水通道蛋白编码基因OsNIP3；3的重组表达载体；所述的水通道蛋白编码基因OsNIP3；3在Genbank中的登录号为AB710141。

2.根据权利要求1所述的超表达载体，其特征在于以pTCK303载体为出发载体，将所述的水通道蛋白编码基因OsNIP3；3的开放阅读框序列插入出发载体Spe I及Kpn I酶切位点间所得。

3.权利要求1所述的所述的水通道蛋白编码基因OsNIP3；3在减少水稻根系中三价砷向木质部的转运，降低水稻地上部与籽粒砷的积累中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于将权利要求1所述的超表达载体导入水稻得到超表达水通道蛋白编码基因OsNIP3；3的水稻，从而减少水稻根系中三价砷向木质部的转运，降低水稻地上部与籽粒砷的积累中的应用。

5.权利要求1所述的超表达载体在减少水稻根系中三价砷向木质部的转运，降低水稻地上部与籽粒砷的积累中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于将权利要求1所述的超表达载体导入水稻得到超表达水通道蛋白编码基因OsNIP3；3的水稻，从而减少水稻根系中三价砷向木质部的转运，降低水稻地上部与籽粒砷的积累中的应用。