CN108795974A - 水稻OsPCR3基因在培育抗重金属植物中的应用 - Google Patents

水稻OsPCR3基因在培育抗重金属植物中的应用 Download PDF

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贺希格都楞
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Abstract

本发明提供了一种水稻OsPCR3基因在培育抗重金属植物中的应用，涉及基因工程技术领域，本发明提供的水稻OsPCR3基因在培育抗重金属植物中的应用，所述水稻OsPCR3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。在本发明通过实验证明转入了水稻OsPCR3基因并过表达的植物对重金属的抵抗能力有了显著的提高。本发明培育出抗重金属植物的方法简便而有效，为提高植物抗重金属能力提供了新的有效选择，具有好的应用前景。

Description

水稻OsPCR3基因在培育抗重金属植物中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种水稻OsPCR3基因在培育抗重金属植物中的应用。
背景技术
土壤是人类赖以生存的主要资源之一，它是生态环境的重要组成部分，也是地球化学循环的储存库，对环境变化具有高度的敏感性，所以土壤污染是环境污染的重要环节。近年来，随着现代工业的发展和农业生产的现代化，土壤污染日益严重。其中重金属污染是当今面积最广，危害最大的环境问题之一。
土壤污染方面所涉及的重金属主要是指生物毒性显著的汞、镉、铅、铬以及类金属砷，还包括具有毒性的重金属锌、铜、钴、镍、锡、钒等。当土壤中的重金属含量积累到一定程度，会对土壤植物系统产生毒害作用，导致土壤退化、农作物的产量和品质下。另外，重金属可以通过植物的吸附作用进入植物体内，另外还可以通过径流和淋洗等作用污染地表水和地下水，最终能通过接触和食物链等途径危害人们的生命健康。
因此，近年来重金属污染的问题越来越受到人们的重视。对于植物抗重金属机制的研究和抗重金属基因工程方面的工作已有表明通过生物技术手段，将抗重金属机制中相关基因导入植物体内得到抗重金属转基因植株将会成为植物抗重金属改良的一种新的育种途径，对于作物的生产和抗重金属种质的筛选具有重要的意义。但是目前本领域很少有可供选用的抗重金属基因。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种水稻OsPCR3基因在培育抗重金属植物中的应用，本发明通过实验证明转入了水稻OsPCR3基因并过表达的植物对重金属的抵抗能力有了显著的提高。本发明培育出抗重金属植物的方法简便而有效，为提高植物抗重金属能力提供了新的有效选择，具有好的应用前景。
本发明提供的一种水稻OsPCR3基因在培育抗重金属植物中的应用，所述水稻OsPCR3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步的，所述抗重金属为抗重金属镉元素和铅元素。
进一步的，所述应用包括以下步骤：将所述水稻OsPCR3基因连接至植物过表达载体，并转化目的植物后进行筛选，得到抗重金属植物。
进一步的，所述植物过表达载体为35S-1300-EGFP质粒。
更进一步的，所述水稻OsPCR3基因连接至植物过表达载体的方法为：
(a)克隆水稻OsPCR3基因：以水稻总RNA为模板，反转获得cDNA第一链，然后以cDNA第一链为模板，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，获得带酶切位点的水稻OsPCR3基因；
(b)植物表达载体的构建：将步骤(a)扩增获得的带酶切位点的水稻OsPCR3基因分别用KpnI和SalI双酶切，同时用KpnI和SalI双酶切35S-1300-EGFP质粒载体，然后将酶切后的水稻OsPCR3基因与35S-1300-EGFP载体骨架连接，得含有水稻OsPCR3基因的植物过表达载体。
进一步的，所述转化为通过农杆菌介导进行转化。
更进一步的，所述农杆菌介导的方法为将含有水稻OsPCR3基因的植物过表达载体转化至农杆菌后用所述农杆菌对目的植物进行侵染转化，得到抗重金属植物。
进一步的，所述目的植物为禾本科或茄科植物中的一种。
更进一步的，所述目的植物为水稻、玉米、高粱、辣椒、番茄、枸杞或烟草中的一种；
更优选的，所述目的植物为水稻或烟草。
进一步的，所述筛选方法为在镉和/或铅胁迫培养下对抗重金属植物进行筛选。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的水稻OsPCR3基因在培育抗重金属植物中的应用，所述水稻OsPCR3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。在本发明通过实验证明转入了水稻OsPCR3基因并过表达的植物对重金属的抵抗能力有了显著的提高。本发明培育出抗重金属植物的方法简便而有效，为提高植物抗重金属能力提供了新的有效选择，具有好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中植物过表达载体35S-1300-EGFP质粒的信息图谱；
图2为本发明实施例2中pMD19T-OsPCR3质粒的测序鉴定图；
图3为本发明实施例2中质粒p1300-OsPCR3的双酶切鉴定图；
图4为本发明实施例2中测序结果与OsPCR3的cDNA序列比对图；
图5为本发明实施例4中OsPCR3过表达转基因株系的PCR潮霉素基因鉴定电溶图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，一种水稻OsPCR3基因在培育抗重金属植物中的应用，所述水稻OsPCR3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明提供的水稻OsPCR3基因在培育抗重金属植物中的应用，所述水稻OsPCR3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。在本发明通过实验证明转入了水稻OsPCR3基因并过表达的植物对重金属的抵抗能力有了显著的提高。本发明培育出抗重金属植物的方法简便而有效，为提高植物抗重金属能力提供了新的有效选择，具有好的应用前景。
在本发明的一种优选实施方式中，所述抗重金属为抗重金属镉元素和铅元素。
作为一种优选的实施方式，上述抗重金属为抗重金属镉元素和铅元素。镉元素和铅元素均属于重金属元素，对土壤植物系统产生毒害作用，导致土壤退化、农作物的产量和品质下。另外，镉元素和铅元素可以通过植物的吸附作用进入植物体内，还可以通过径流和淋洗等作用污染地表水和地下水，最终能通过接触和食物链等途径危害人们的生命健康。因此，对植物镉元素和铅元素的抗逆性品种的筛选和育种变得尤为重要。
在本发明的一种优选实施方式中，所述应用包括以下步骤：将所述水稻OsPCR3基因连接至植物过表达载体，并转化目的植物后进行筛选，得到抗重金属植物。
作为一种优选的实施方式，本发明首先将水稻OsPCR3基因连接至植物过表达载体，随后将连接有水稻OsPCR3基因的植物过表达载体转化目的植物，然后将目的植物进行筛选，得到抗重金属植物。该方法简便而有效，为提高植物抗重金属能力提供了新的有效选择。
如图1所示，在本发明的一种优选实施方式中，所述植物过表达载体为35S-1300-EGFP质粒。
作为一种优选的实施方式，上述植物过表达载体为35S-1300-EGFP质粒。35S-1300-EGFP质粒具有KpnI和SalI双酶切位点，可以很好的将酶切后的水稻OsPCR3基因与35S-1300-EGFP载体骨架连接。
在上述优选实施方式中，所述水稻OsPCR3基因连接至植物过表达载体的方法为：
(a)克隆水稻OsPCR3基因：以水稻总RNA为模板，反转获得cDNA第一链，然后以cDNA第一链为模板，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，获得带酶切位点的水稻OsPCR3基因；
(b)植物表达载体的构建：将步骤(a)扩增获得的带酶切位点的水稻OsPCR3基因分别用KpnI和SalI双酶切，同时用KpnI和SalI双酶切35S-1300-EGFP质粒载体，然后将酶切后的水稻OsPCR3基因与35S-1300-EGFP载体骨架连接，得含有水稻OsPCR3基因的植物过表达载体。
在本发明的一种优选实施方式中，所述转化为通过农杆菌介导进行转化。
在上述优选实施方式中，所述农杆菌介导的方法为将含有水稻OsPCR3基因的植物过表达载体转化至农杆菌后用所述农杆菌对目的植物进行侵染转化，得到抗重金属植物。
在本发明的一种优选实施方式中，所述目的植物为禾本科或茄科植物中的一种。
在上述优选实施方式中，所述目的植物为水稻、玉米、高粱、辣椒、番茄、枸杞或烟草中的一种；
更优选的，所述目的植物为水稻或烟草。
在本发明的一种优选实施方式中，所述筛选方法为在镉和/或铅胁迫培养下对抗重金属植物进行筛选。
下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中，所用农杆菌采用EH105菌株，其余化学试剂均为市售分析纯。
实施例1 OsPCR3基因的克隆及获取
根据所述水稻OsPCR3基因的核苷酸序列SEQ ID No.1设计引物。
上游引物(SEQ ID No.2)：5’-GGTACCATGTATCCCTCCGCCCCT-3’；
下游引物(SEQ ID No.3)：5’-GTCGACCCTCATCATGCCGACCGG-3’。
随后以水稻总RNA为模板，反转获得cDNA第一链，然后以cDNA第一链为模板，SEQID No.2和SEQ ID No.3所示核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，经测序验证，获得带酶切位点的水稻OsPCR3基因序列。
上述PCR的扩增反应体系为：总体积25μL，包括cDNA模板3μL，2×GC buffer I12.5μL，LA Taq酶0.3μL，dNTP 45μL，上下游引物各2μL，双蒸水补齐。
PCR基本扩增程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，45～56℃退火15s，72℃延伸17s，进行38个循环；72℃延伸2min。
实施例2 OsPCR3水稻过表达载体的构建
将实施例1扩增获得的带酶切位点的水稻OsPCR3基因连接到pMD19-T克隆载体上，将重组质粒到受体细胞大肠杆菌DH5α中，并在受体细胞大肠杆菌DH5α中复制和遗传，通过菌落PCR鉴定，鉴定出的菌液送去测序公司进行阳性菌落鉴定，鉴定得出的阳性菌株取500-1000μL送往测序公司进行重组质粒的测序工作，反馈的测序结果使用DNAMAN软件与数据库中OsPCR3的cDNA序列比对，其结果如图2所示。
随后分别用KpnI和SalI双酶切pMD19-T克隆体系，同时用KpnI和SalI双酶切35S-1300-EGFP质粒载体，然后将酶切后的水稻OsPCR3基因与35S-1300-EGFP载体骨架连接，得到含有水稻OsPCR3基因的植物过表达载体。
然后，将重组质粒转化到受体细胞大肠杆菌DH5α中，利用质粒双酶切鉴定阳性菌落，其结果如图3所示。定得出的阳性菌株取500-1000μL送去测序公司进行重组质粒的测序，反馈的的测序结果使用DNAMAN软件与数据库中OsPCR3的cDNA序列比对，其结果如图4所示，测序结果比对正确的阳性菌株进行扩大培养，将对数生长期菌液和30％的无菌甘油各500mL，混匀后-80℃保存菌种。
实施例3含重组质粒的农杆菌的制备
所述含重组质粒的农杆菌的制备方法为：
1.从-80℃超低温冰箱中拿出EH105农杆菌感受态细胞于冰水浴中自然融解。
2.无菌条件下，向刚融化了的农杆菌感受态细胞悬液中加入1μg的重实施例2得到的重组质粒p1300-OsPCR3，混合均匀，冰上放置10min。
3.将1.5mL离心管放置在液氮中速冻5min。
4.快速将1.5mL离心管放在37℃水浴锅中水浴6min，注意不要晃动水面。
5.将离心管重新放回冰水浴中，放置6min。
6.无菌前提下向离心管中加入800μL的不含抗生素的LB液体培养基，28℃振荡培养2.5h，达到让菌体复苏并表达抗生素抗性的目的。
7.5000rpm离心1min后收集管底的菌种，并留100μL左右的上清，轻轻混匀重悬菌体，将菌体加到含有相应抗生素的LB固体培养基平板上，用无菌的细菌涂布器将液体涂匀。等平板中的液体完全吸收后，倒置平板，28℃培养48-7h，每隔12h去看一下菌落生长状况以防止菌落生长过大，得到含重组质粒的农杆菌。
实施例4农杆菌介导的水稻遗传转化
诱导水稻成熟胚性愈伤组织本实验选用的原材料为颗粒饱满，表面光洁无菌斑霉斑发育良好的粳稻秀水11的成熟胚诱导的愈伤组织。胚性愈伤组织的继代培养上述自然分裂的胚性愈伤组织中，用消毒过的镊子挑取淡黄色、致密呈球状的胚性愈伤组织，转入继代培养基中，28℃光下继代培养10-15d，备用于农杆菌侵染。
随后活化实施例3含重组质粒的农杆菌，配置菌悬液，最后在共培养培养基里，25℃，暗培养3d。用带有羧苄青霉素的纯水浸泡共培养后的愈伤，在选择培养基(含头孢与潮霉素)中28℃光培养10-14d，两周换一次选择培养基。用带有羧苄青霉素的纯水浸泡共培养后的愈伤，在选择培养基(含头孢与潮霉素)中培养10-14d。筛选两次。挑选颜色鲜黄的愈伤转入分化培养基，15-30d后，挑选分化完整的再生苗移栽，经测序验证后得到的转基因水稻株系。
上述转基因阳性植株的测序验证方法为：首先提取转基因苗的DNA，用载体质粒为阳性对照，野生型植株作为阴性对照，通过PCR潮霉素基因进行阳性株系的鉴定，PCR产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，观察是否出现预期大小的条带，从而获得转基因阳性株系，其电溶检测结果如图5所示。
潮霉素素基因引物序列：
HPT-F：5’-GTTTATCGGCACTTTGCATCG-3’；
HPT-R：5’-GGAGCATATACGCCCGGAGT-3’。
实施例5 OsPCR3过表达水稻转基因株系的筛选
水稻苗期筛选：利用测序验证后的实施例4得到的转基因水稻株系与野生型粳稻秀水11分别在镉含量1.5mg/kg、铅含量40mg/kg的重金属污染土壤中进行重金属胁迫培养试验，待水稻成熟后，对水稻各部位进行重金属含量检测，其结果如下表所示。
实施例6农杆菌介导的烟草遗传转化
挑取实施例3含有目标载体的农杆菌在含有卡那霉素和利福平的LB平板上划线，28℃培养2～3天。
刮取划线菌斑接菌于含有卡那霉素和利福平的MS培养基中，28℃，220rpm震荡培养，菌液浓度达到OD＝0.5～0.8时进行侵染。
将菌体收集到离心管中，6000rpm离心分钟富集菌体，弃上清，再用约20ml液体MS培养基重悬菌体。
将烟草品种K236的叶片置于500mL广口瓶中，加入适量70％乙醇，漂洗1min；倒掉乙醇，加入0.1％HgCl2溶液(称取升汞0.1克，用少许酒精溶解，再加水至100毫升)，置摇床上室温振荡15～30分钟；倒掉溶液，用无菌水冲洗6遍；将叶片取出，用灭菌吸水纸洗去表面液体，取无菌叶片用剪刀切成1cm×1cm的小片，将切成小片的植物叶片放入无菌MS液体培养基悬浮的菌液中，静置15～20min。
取出材料，用无菌滤纸吸去多余菌液，于共培养培养基中(MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L)，25℃暗培养两天。
把材料转入分化培养基中(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 200mg/L+Carb(羧苄青霉素钠)500mg/L)，切口接触培养基，于温室中分化培养，每2-3周将其转移到新的培养基中。切口处逐渐长出愈伤组织，最后分化出芽。将长至3～5cm的芽切下，转入生根培养基(MS)诱导生根。生根后的转基因植株由生根培养基中取出，用自来水净培养基，移植于灭菌的营养土中。
转基因植株经水稻OsPCR3基因特异引物PCR验证扩增，鉴定转基因阳性植株。
实施例7 OsPCR3过表达烟草转基因株系的筛选
将实施例6得到转化的烟草转基因阳性植株移栽到一次性花盆后，置于育苗池中，育苗池内的土壤为镉含量1.5mg/kg、铅含量40mg/kg的重金属污染土壤中，同时取普通烟草品种K236的叶片做对照组实验。生长30天后，取上述烟草植株叶片和根，60℃烘干，测定镉和铅元素含量，其结果如下表所示。
组别 镉元素含量 铅元素含量
实施例5中转化得到的油菜 53.4mg/kg 78.6mg/kg
普通甘蓝型油菜 93.7mg/kg 117.3mg/kg
综上所述，本发明提供的水稻OsPCR3基因在培育抗重金属植物中的应用，所述水稻OsPCR3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。在本发明通过实验证明转入了水稻OsPCR3基因并过表达的植物对重金属的抵抗能力有了显著的提高。本发明培育出抗重金属植物的方法简便而有效，为提高植物抗重金属能力提供了新的有效选择，具有好的应用前景。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国计量大学
<120> 水稻OsPCR3基因在培育抗重金属植物中的应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 546
<212> DNA
<213> 水稻OsPCR3基因
<400> 1
atgtatccct ccgcccctcc cgacgcgtat aacaagtaca gcgccggtgc tccaccgacg 60
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtcgaccctc atcatgccga ccgg 24

Claims (10)

1.一种水稻OsPCR3基因在培育抗重金属植物中的应用，其特征在于，所述水稻OsPCR3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗重金属为抗重金属镉元素和铅元素。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用包括以下步骤：将所述水稻OsPCR3基因连接至植物过表达载体，并转化目的植物后进行筛选，得到抗重金属植物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述植物过表达载体为35S-1300-EGFP质粒。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述水稻OsPCR3基因连接至植物过表达载体的方法为：
(a)克隆水稻OsPCR3基因：以水稻总RNA为模板，反转获得cDNA第一链，然后以cDNA第一链为模板，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，获得带酶切位点的水稻OsPCR3基因；
(b)植物表达载体的构建：将步骤(a)扩增获得的带酶切位点的水稻OsPCR3基因分别用KpnI和SalI双酶切，同时用KpnI和SalI双酶切35S-1300-EGFP质粒载体，然后将酶切后的水稻OsPCR3基因与35S-1300-EGFP载体骨架连接，得到含有水稻OsPCR3基因的植物过表达载体。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述转化为通过农杆菌介导进行转化。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述农杆菌介导的方法为将含有水稻OsPCR3基因的植物过表达载体转化至农杆菌后用所述农杆菌对目的植物进行侵染转化，得到抗重金属植物。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述目的植物为禾本科或茄科植物中的一种。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述目的植物为水稻、玉米、高粱、辣椒、番茄、枸杞或烟草中的一种；
更优选的，所述目的植物为水稻或烟草。
10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述筛选方法为在镉和/或铅胁迫培养下对抗重金属植物进行筛选。
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CN113980987A (zh) * 2021-12-06 2022-01-28 上海市农业科学院 一种提高植物抗镍性能的PgIREG1S和AlATP-PRTS双基因组及其应用

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US20060023046A1 (en) * 2004-07-30 2006-02-02 Seiko Epson Corporation Droplet application method, droplet application device, electro-optical device, and electronic apparatus

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