CN105624162B - 针对哺乳动物R-Spondin2基因靶点的小干扰RNA、短发卡RNA及载体和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了针对哺乳动物R‑Spondin2基因靶点的小干扰RNA、短发卡RNA及载体和应用。所述小干扰RNA包含正义链和反义链。基于该小干扰RNA可通过化学合成法合成短发卡RNA。短发卡RNA可进一步与病毒表达载体或非病毒表达载体相连，形成一种针对哺乳动物R‑Spondin2基因靶点的载体。其中病毒表达载体为慢病毒载体或腺病毒载体，非病毒表达载体为质粒载体。上述的短发卡RNA的载体可用于制备肝纤维化基因治疗药物。本发明设计的针对R‑Spondin2基因靶点的RNA干扰片段能促使激活的肝星状细胞回退到静止状态或凋亡，从而有效促进肝纤维化的恢复过程。

Description

针对哺乳动物R-Spondin2基因靶点的小干扰RNA、短发卡RNA 及载体和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种针对哺乳动物R-Spondin2基因靶点的小干扰RNA、短发卡RNA及载体和应用。
背景技术
肝纤维化是肝脏对各种原因所致慢性肝损伤的创伤愈合反应，导致肝小叶内和汇管区大量纤维组织增生和沉淀，病理学特点是以胶原蛋白为主的细胞外基质各种成分合成增多，降解相对不足，但并未形成小叶内间隔，如进一步则发展成肝硬化。肝纤维化是可逆的过程，对肝纤维化的预防和早期干预是稳定病情、阻止肝纤维化向肝硬化和肝癌发展的最佳措施。
肝星状细胞是肝脏合成细胞外基质的主要细胞，其激活发生肌成纤维细胞的表型转换是肝纤维化发生的中心环节。肝星状细胞的激活受众多细胞因子的调控，现有研究结果证实Wnt信号通路影响肝星状细胞的活化，阻断Wnt信号通路可抑制肝星状细胞的增殖及诱导其凋亡。但Wnt信号通路参与了多种生物学过程，包括细胞形态与功能的分化及维持、免疫、细胞癌变与凋亡，直接阻断该信号通路可能具有广泛的不良生物学效应。R-脊椎蛋白2(R-Spondin2)是新发现的Wnt信号通路的重要调控因子，R-Spondin2可以激活并增强Wnt/β-catenin信号通路，在生物体的组织分化、器官形成以及疾病发生过程中发挥重要作用。
RNA干扰(RNAi)是利用序列特异性的、与靶基因同源的双链RNA(dsRNA)对靶基因转录后的信使RNA(mRNA)的分解，从而抑制靶基因表达的一种转录后基因沉默技术。其作用机制是：dsRNA被Dicer酶识别，并被切割为小干扰RNA(siRNA)。siRNA与RNA介导沉默复合体(RISC)结合后，识别并降解同源的mRNA，特异性抑制目的基因的表达。由于RNA干扰抑制靶基因表达具有特异性强、快速、高效等优点，尤其适合特异靶向性的基因治疗。
最初RNA干扰采样体外合成siRNA的方法，但存在转染效率低、转移到细胞内的siRNA不能持久性表达、对靶基因表达的抑制作用短暂等缺点，从而限制了其应用。将siRNA合成为短发卡RNA(shRNA)并由载体导入细胞，能在细胞内稳定的转录生成shRNA，并进一步加工生成靶基因特异性的siRNA，可以发挥长期抑制靶基因表达的作用。
发明内容
本发明的目的是基于RNA干扰技术抑制R-Spondin2基因表达，使激活的肝星状细胞回退到静止状态或凋亡，从而有效促进肝纤维化的恢复过程。
本发明采用的技术方案如下：
根据GeneBank公布的人R-Spondin2蛋白基因的cDNA序列，应用siRNA设计原则，设计siRNA-R-Spondin2序列，经Blast比对，序列的特异性好。所述siRNA设计原则包括：靶位点在AA序列之后，GC碱基含量大于45％，长度在19-23个bp等。基于上述原则设计的一种针对哺乳动物R-Spondin2基因靶点的小干扰RNA(siRNA-R-Spondin2)，所述小干扰RNA包含正义链和反义链，其中：
正义链序列为5`-GUUGGUCAUUGGAGCGAAU-3`，如SEQ ID NO：1所示；
反义链序列为5`-AUUCGCUCCAAUGACCAAC-3`，如SEQ ID NO：2所示。
所述的哺乳动物为人。
一种所述的小干扰RNA的用途，即所述的小干扰RNA通过化学合成法合成短发卡RNA。
根据所述siRNA-R-Spondin2序列，应用shRNA设计原则，设计shRNA-R-Spondin2序列。所述shRNA-R-Spondin2的两端带Hind III和BamH I酶切位点，中间loop接头序列为5`-TCAAGAG-3`，尾部带有RNA聚合酶III终止子TTTTTT。所述的shRNA设计原则包括：序列5`端带限制性酶切位点，酶切位点下方紧连一个C，目的序列的第一个碱基为G，loop接头序列应在shRNA序列中间，不能出现连续3个以上的T。
本发明的另一目的在于提供一种由所述的小干扰RNA合成的短发卡RNA(shRNA-R-Spondin2)，包含正义链和反义链，其中：
正义链序列为
5`-GATCCCCGTTGGTCATTGGAGCGAATTCAAGAGATTCGCTCCAAT
GACCAACTTTTTTGGAAA-3`，如SEQ ID NO：3所示；
反义链序列为
5`-AGCTTTTCCAAAAAAGTTGGTCATTGGAGCGAATCTCTTGAATTCG
CTCCAATGACCAACGGG-3`，如SEQ ID NO：4所示。
所述shRNA-R-Spondin2序列可由化学合成法合成。在肝纤维化的基因治疗中，本发明的化学合成片段可能会经多种化学方法进行修饰以增加稳定性和靶向性。
本发明的另一目的在于提供一种含有所述的短发卡RNA的载体，其中所述的短发卡RNA与病毒表达载体或非病毒表达载体相连。所述病毒表达载体为慢病毒载体或腺病毒载体。所述非病毒表达载体为质粒载体。
即所述shRNA序列可由多种载体导入细胞，包括质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒等。如将上述shRNA-R-Spondin2合成oligo DAN单链片段并退火形成双链DNA，其两端含酶切位点粘端，连入酶切后的载体质粒，构建的shRNA-R-Spondin2质粒载体。或将shRNA-R-Spondin2与慢病毒载体质粒进行酶切并连接，并与骨架质粒、慢病毒包装质粒共转染293T细胞，培养液离心形成浓缩病毒液，得到慢病毒载体Lenti-shRNA-R-Spondin2。
本发明还提供了所述的短发卡RNA的载体在制备肝纤维化基因治疗药物中的应用。
经实验证明，本发明设计的siRNA-R-Spondin2能有效抑制人肝星状细胞LX2中R-Spondin2基因的表达，降低了Wnt信号通路的活性，促使肝纤维化的标志物α-SMA和Collagen I的表达降低，抑制了人肝星状细胞LX2的增殖并使其恢复存储油脂功能。表明本发明设计的针对R-Spondin2基因靶点的RNA干扰片段能促使激活的肝星状细胞回退到静止状态或凋亡，从而有效促进肝纤维化的恢复过程。
附图说明
图1为pGCL-GFP载体结构体。
图2为Lenti-shRNA-R-Spondin2慢病毒载体转染人肝星状细胞LX2后，抑制R-Spondin2蛋白表达与mRNA水平。A.Western blot检测R-Spondin2蛋白表达；B.Real-timePCR检测R-Spondin2的mRNA水平。
图3为免疫荧光检测Lenti-shRNA-R-Spondin2慢病毒载体转染人肝星状细胞LX2后，抑制肝纤维化标志物α-SMA和Collagen I的表达。
图4为Lenti-shRNA-R-Spondin2慢病毒载体转染人肝星状细胞LX2后，抑制肝纤维化标志物α-SMA和Collagen I蛋白及mRNA的表达。A.Western blot检测α-SMA和Collagen I蛋白表达；B.Real-time PCR检测α-SMA和Collagen I的mRNA水平。
图5为A.油红O染色检测Lenti-shRNA-R-Spondin2慢病毒载体转染人肝星状细胞LX2后，LX2恢复油脂存储状态；B.MTT法检测Lenti-shRNA-R-Spondin2慢病毒载体转染人肝星状细胞LX2后，LX2增殖率下降。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的范围。以下实施例中所涉及的技术，包括细胞培养、载体构建、细胞转染、克隆、基因测序、Western blot检测、PCR扩增与检测、免疫荧光等分子生物学技术，除非特别说明，均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂、质粒、细胞株等，除非特别注明，均为一般本领域的技术人员可以通过公共途径获得。
实施例1 siRNA序列设计
应用siRNA设计的原则(Petri S,siRNA design priciples and off-targeteffects.Methods Mol Biol.2013；986:59-71)筛选siRNA序列：(1)从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3`端的19-23个碱基序列作为siRNA的候选靶位点；(2)siRNA序列的GC含量在45％至55％之间；(3)长度在19-23个bp；(4)不含反向重复序列；(5)没有连续9个以上的GC序列；(6)正义链的5`端最好为G/C；(7)反义链的5`端最好为A/U；(8)正义链的15-19碱基最好含有3个以上A/U；(9)反义链的5`端7个碱基中最好有5个以上A/U。
使用Blast(www.ncbi.nlm.nig.gov/Blast)将候选序列和基因组数据库进行同源分析，保证设计的siRNA序列不会与人R-Spondin2基因之外的其他基因序列同源。得到的siRNA序列(siRNA-R-Spondin2)为：
正义链序列为5`-GUUGGUCAUUGGAGCGAAU-3`
反义链序列为5`-AUUCGCUCCAAUGACCAAC-3`。
所述siRNA序列长度均为19bp，易于合成。
实施例2 shRNA设计及合成
应用shRNA设计原则(Sun G,Molecular Properties,Functional Mechanisms,and Applications of Sliced siRNA.Mol Ther Nucleic Acids.2015Jan 20；4:e221.)，根据上述siRNA-R-Spondin2序列，设计shRNA序列：(1)两条互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点；(2)酶切位点下方紧连一个C，以确保转录发生；(3)shRNA目的序列以G碱基开始，以确保RNA聚合酶转录；(3)shRNA插入的loop接头序列应当靠近寡核苷酸的中间，5`-TCAAGAG-3`最有效；(4)shRNA只能有一个特定且唯一loop构造；(5)shRNA片段尾部插入5-6个T，以确保RNA聚合酶III终止转录；(6)G/C含量为40％至50％；(7)shRNA序列应避免连续三个以上的G/C/A/T出现。得到的shRNA序列(shRNA-R-Spondin2)为：正义链序列为
5`-GATCCCCGTTGGTCATTGGAGCGAATTCAAGAGATTCGCTCCAAT
GACCAACTTTTTTGGAAA-3`
反义链序列为
5`-AGCTTTTCCAAAAAAGTTGGTCATTGGAGCGAATCTCTTGAATTCG
CTCCAATGACCAACGGG-3`。
所述shRNA序列两端带有BamH I和Hind III限制性酶切位点。应用化学合成法合成包含上述shRNA序列的DNA模板序列及互补序列。
实施例3质粒载体构建
将上述shRNA-R-Spondin2合成oligo DAN单链片段并退火形成双链DNA，连接pGCL-GFP载体(上海吉凯)，构建质粒载体pGCL-GFP-shRNA-R-Spondin2(参见图一)。该质粒载体将在细胞内转录出shRNA，并经细胞内修饰后产生针对R-Spondin2基因靶点的siRNA-R-Spondin2。退火及连接过程如下：
1.退火成双链DNA
1)在0.5ml无菌离心管中建立以下退火反应体系(室温)：
2)95℃温育4分钟，70℃温育10分钟；
3)取出离心管，室温放置5-10分钟，冷却至室温；
4)短暂离心，混匀。
2.双链DNA连接至pGCL-GFP载体
本发明合成的DNA模板序列退火后，前后端分别形成BamH I和Hind III内切酶的粘性末端，与经BamH I和Hind III酶切的线性化pGCL-GFP载体连接。
1)将50μM退火双链DNA用Dnase/Rnase-Free H2O稀释至500nM：
50μM双链DNA 1μl
Dnase/Rnase-Free H2O 99μl
2)pGCL-GFP质粒用BamH I和Hind III双酶切，酶切体系为：
3)室温下建立如下连接反应体系：
4)充分混匀后，室温孵育1小时。
3.质粒载体转化感受态细菌
1)DH5a感受态细菌4℃冰浴5分钟；
2)加入新构建的质粒载体10μl，4℃冰浴30分钟；
3)加入LB细菌培养液(NaCl 1g，蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，溶于100ml H2O，高压湿热灭菌)30μl，混匀，37℃水平震荡(200rpm)1小时；
4)加入含卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂培养板上，37℃孵育过夜；
5)挑选5-10个克隆菌落，与含卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂培养基中摇菌。
4.质粒提取及鉴定
1)取过夜震荡培养的菌液(3ml)，放入离心管中，室温下离心(3000rpm)5分钟，收集菌体，重悬于250μl的细胞悬浮液中；
2)加入250μl碱裂解液，混匀，室温静置5分钟；
3)加入350μl中和液，混匀，室温下离心(10000rpm)10分钟；
4)将上清液移入吸附柱，室温下离心(10000rmp)1分钟。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中；
5)吸附柱中加入750μl洗涤液(含60％无水乙醇)，室温下离心(10000rpm)1分钟。倒掉收集管中的液体，重复洗涤一次。倒掉收集管制液体，将吸附柱放入同一收集管中，室温下离心(10000rpm)1分钟，除去残余乙醇；
6)将吸附柱放入1.5ml离心管中，中吸附膜中央加入50μl洗脱液(Tris-HCL2.5mM)，50℃温育1分钟，收集质粒DNA；
7)对克隆质粒分别用限制性内切酶BamH I和Hind III做双酶切鉴定；
8)对双酶切初步鉴定阳性的克隆质粒进行PCR鉴定，引物序列为：
上游引物：5`-GCCCCGGTTAATTTGCATAT-3`
下游引物：5`-GTAATACGGTTATGCACGCG-3`
扩增条件：94℃10分钟，1个循环；94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃6分钟，1个循环。
9)对PCR鉴定阳性的克隆质粒进行DNA测序鉴定。
实施例3慢病毒载体构建
1.慢病毒包装
1)用0.25％胰酶消化生长状态良好的293T细胞，并于感染前一天接种到10cm培养皿；
2)制备慢病毒包装系统三种质粒DNA溶液：
pGCL-GFP-shRNA-R-Spondin2载体20μg
pHelper 1.0载体 15μg
pHelper 2.0载体 10μg
与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5分钟；
3)取100μl Lipofectamine2000试剂在另一管中与2.4ml Opti-MEM混合，在室温下温育5分钟。把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻轻颠倒混匀5分钟。室温下温育20分钟；
4)将DNA与Lipofectamine2000混合液转移至细胞密度达70％-80％的293T细胞培养液中，混匀，培养8小时后更换培养基，继续培养48小时；
5)收集转染48小时后的293T细胞上清液。4℃，离心(1000rpm)10分钟，0.45μm滤器过滤，4℃，离心(1000rpm)15分钟，收集慢病毒浓缩液，得到Lenti-shRNA-R-Spondin2慢病毒载体。分装，-80℃保存。
2.病毒滴度测定
1)按相同浓度接种生长状态良好的293T细胞到96孔板，分为两组，每组5个孔；
2)使用病毒感染293T细胞，按MOI值分为5个梯度：1、3、5、10和20；
3)实验组使用上述构建的慢病毒液，对照组使用标准病毒液(1x1010ifu/ml)；
4)感染24小时后，通过倒置荧光显微镜观察GFP表达情况，与对照组比较确定病毒滴度：计算荧光细胞比例在10％左右的荧光细胞个数，病毒滴度＝表达GFP细胞数量×慢病毒颗粒梯度稀释倍数。
实施例4转染人肝星状细胞株LX2
1)培养人肝星状细胞LX2，将细胞悬液接种于12孔板中，37℃5％CO2培养箱培养；
2)待细胞融合度达30％至40％时，将细胞分为两组：①阴性对照组：阴性对照慢病毒颗粒感染细胞；②Lenti-shRNA-R-Spondin2实验组：使用上述构建的shRNA-R-Spondin2慢病毒载体感染细胞；
3)根据不同的MOI值，加入适宜量病毒，12小时后观察细胞状态，未出现明显细胞毒性作用，继续培养48小时后更换培养基；若有明显细胞毒性，立即更换培养基；
4)感染4至5天后观察慢病毒报告基因GFP表达情况，感染效率低于50％者，重新进行感染；感染效率大于50％者继续培养，然后收集细胞作进一步检测。
实施例5实时RT-PCR检测
如实施例4所述，将构建的Lenti-shRNA-R-Spondin2慢病毒载体转染人肝星状细胞LX2，Real-time PCR检测LX2中R-Spondin2和肝纤维化标志物α-SMA、Collagen-I的mRNA水平。1)PCR引物如下所示
2)Trizol法提取总RNA，-80℃保存；
3)紫外分光光度计测定260nm和280nm波长处的吸光度值，计算提取的总RNA浓度；4)用逆转录试剂盒逆转录合成cDNA后，-20℃保存；
5)PCR反应体系为：
在ABI 7500PCR仪上进行反应；
6)PCR条件：95℃4分钟，1个循环；95℃30秒，60℃45秒，72℃1分钟，共35个循环；72℃延伸5分钟；
7)用SDS软件进行数据分析，用比较Ct值的方法分析结果，目的基因的表达量由β-actin进行标准化。
Real-time PCR检测显示，与对照组相比，Lenti-shRNA-R-Spondin2显著下调人肝星状细胞LX2中的R-Spondin2(参见图二)和肝纤维化标志物α-SMA、Collagen-I(参见图四)的mRNA水平。表明本发明所设计的RNA干扰片段沉默了R-Spondin2靶基因的表达，从而抑制的肝星状细胞的激活。
实施例6 Western blot检测
如实施例4所述，将构建的Lenti-shRNA-R-Spondin2慢病毒载体转染人肝星状细胞LX2，Western blot法检测LX2中R-Spondin2蛋白和肝纤维化标志物α-SMA、Collagen-I蛋白的表达。
1)RIPA裂解液提取人肝星状细胞LX2的总蛋白；
2)用酶标仪测定562nm波长处各孔的吸光度，最后根据标准曲线计算蛋白浓度；
3)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜、5％脱脂奶粉封闭后，分别加入R-Spondin2抗体(1:1000)、α-SMA抗体(1:300)和Collagen I抗体(1:1000)，4℃孵育过夜；
4)洗膜后加入二抗(1:2000)，室温孵育2小时后电化学发光试剂检测；
5)β-actin蛋白为内参照，凝胶扫描成像系统(美国Bio-Rad公司)对各条带的灰度值进行分析。
Western blot法检测显示，与对照组相比，Lenti-shRNA-R-Spondin2显著下调人肝星状细胞LX2中的R-Spondin2蛋白(参见图二)和肝纤维化标志物α-SMA蛋白、Collagen-I蛋白(参见图四)的表达。表明本发明所设计的RNA干扰片段下调了R-Spondin2靶基因的表达，从而抑制肝星状细胞的激活。
实施例7免疫荧光检测
如实施例4所述，将构建的Lenti-shRNA-R-Spondin2慢病毒载体转染人肝星状细胞LX2，免疫荧光法检测LX2中R-Spondin2蛋白和肝纤维化标志物α-SMA的表达。
1)对慢病毒转染的人肝星状细胞LX2，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10分钟，然后用4％多聚甲醛在室温条件下固定细胞15分钟；
2)PBS冲洗细胞2次，每次10分钟，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15分钟；
3)PBS冲洗细胞2次，每次10分钟，然后在室温条件下，用4％BSA封闭细胞30分钟；
4)按1:100的比例分别稀释各一抗(R-Spondin2和α-SMA)，然后将其放在4℃冰箱中孵育过夜；
5)PBS冲洗细胞3次，每次10分钟，按1：100的比例稀释相应二抗，37℃条件下放置1小时；
6)用PBS冲洗3次，每次10分钟，最后DAPI染细胞核并用荧光显微镜拍照。
免疫荧光显示(参见图三)，与对照组相比，Lenti-shRNA-R-Spondin2明显降低了人肝星状细胞LX2中R-Spondin2蛋白和α-SMA蛋白的表达。表明本发明所设计的RNA干扰片段下调了R-Spondin2靶基因的表达，从而抑制了肝星状细胞的肝纤维化发展。
实施例8油红O染色检测
如实施例4所述，将构建的Lenti-shRNA-R-Spondin2慢病毒载体转染人肝星状细胞LX2，油红O染色法检测LX2中油脂的储存状况。
1.染料的配制
Oil Red O 0.5g溶于100ml异丙醇。
2.染色步骤
1)稀释，染料同蒸馏水按3：2稀释；
2)过滤，通过定性滤纸过滤；
3)固定，吸弃培养液后加入固定液5分钟；
4)吸弃固定液，加入染色液15分钟后水洗一次镜检观察；
5)苏木晶复染；
6)水冲洗至变蓝后观察并拍照。
油红O染色显示(参见图五)，与对照组相比，Lenti-shRNA-R-Spondin2明显增强了人肝星状细胞LX2中油脂的存储。表明本发明所设计的RNA干扰片段抑制了R-Spondin2靶基因的表达，从而促使激活的肝星状细胞向静止状态转化。
实施例9 MTT增殖检测
如实施例4所述，将构建的Lenti-shRNA-R-Spondin2慢病毒载体转染人肝星状细胞LX2，MTT法检测LX2的增殖情况。
1)人肝星状细胞LX2接种于96孔培养板，每孔细胞密度为4×103；
2)如实施例4所述，转染Lenti-shRNA-R-Spondin2慢病毒载体；
3)在转染后24小时、48小时和72小时，每孔加入10μL MTT液体；
4)37℃孵育4小时，每孔加入100μL DMSO，充分摇匀；
5)用酶标仪，以570nm的波长进行吸光度检测，计算细胞存活率。
MTT增殖检测显示(参见图五)，与对照组相比，Lenti-shRNA-R-Spondin2明显降低了人肝星状细胞LX2的增殖。表明本发明所设计的RNA干扰片段抑制了R-Spondin2靶基因的表达，从而抑制了肝星状细胞的增殖。

Claims (5)

1.一种针对哺乳动物R-Spondin2基因靶点的小干扰RNA在制备肝纤维化基因治疗药物中的用途，所述小干扰RNA包含正义链和反义链，其特征在于其中：
正义链序列为 5`- GUUGGUCAUUGGAGCGAAU-3`，如SEQ ID NO：1所示；
反义链序列为 5`-AUUCGCUCCAAUGACCAAC-3`，如SEQ ID NO：2所示。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的哺乳动物为人。
3.一种含有短发卡RNA的载体在制备肝纤维化基因治疗药物中的用途，其特征在于，所述的短发卡RNA由如权利要求1中 所述的小干扰RNA设计 合成；所述短发卡RNA包含正义链和反义链，其中：
正义链序列为5`-GATCCCCGTTGGTCATTGGAGCGAATTCAAGAGATTCGCTCCAAT
GACCAACTTTTTTGGAAA-3`，如SEQ ID NO：3所示；
反义链序列为5`-AGCTTTTCCAAAAAAGTTGGTCATTGGAGCGAATCTCTTGAATTCG
CTCCAATGACCAACGGG-3`，如SEQ ID NO：4所示；所述的短发卡RNA与病毒表达载体或非病毒表达载体相连。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述病毒表达载体为慢病毒载体或腺病毒载体。
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述非病毒表达载体为质粒载体。
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