CN109402117A - 一种沉默小鼠肠道rasgrp1表达的腺相关病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种沉默小鼠肠道RASGRP1表达的腺相关病毒及其制备方法和应用。本发明针对RASGRP1基因设计了三对siRNA序列，并构建了RasGRP1 shRNA干扰载体，qPCR筛靶结果显示，PAAVE2113,PAAVE2114和PAAVE2115均有沉默效果，其中PAAVE2115沉默效果最好，沉默效率约为74％，与WB结果一致。将所述的干扰载体和辅助质粒共转染工程细胞，获得沉默小鼠肠道RASGRP1表达的腺相关病毒，动物实验证实，采用该腺相关病毒干扰C57小鼠，可使小鼠小肠组织中RasGRP1蛋白表达下降，且采用腹腔注射的方式，干扰效果最好。

Description

一种沉默小鼠肠道RASGRP1表达的腺相关病毒及其制备方法 和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种沉默小鼠肠道RASGRP1表达的腺相关病毒及其制备方法和应用。

背景技术

RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象，是生物体在进化过程中抵御外界病毒等感染和维持基因组稳定性的一种保护型机制。当病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅疾产生反应，其胞质中RNaseIII核酶家族的Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA(即siRNA)。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义和反义链，而反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)。RISC与外源性基因表达mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。使用RNAi治疗疾病的思路是根据病原体的致病基因序列以及生物体内与疾病发生相关的基因序列，设计和制备与这些基因序列具有同源性的小干扰RNA(siRNA)，然后通过某种方式将siRNA转移到动物体内使有关疾病基因发生沉默，从而达到治疗目的。直接转染合成的siRNA能特异性抑制动物细胞内同源基因的表达，但是细胞内siRNA很容易降解，因此这种方法不能实现稳定的RNA干扰。而病毒载体在动物细胞内感染效率高，免疫原性低，既能干扰分裂期的细胞，又能感染非分裂期的细胞。由于病毒载体的这些特性，慢病毒介导RNA干扰能在各类动物细胞内长期稳定地表达siRNA，抑制相关基因表达，因此该方法具有高效、稳定、特异性强、适用范围广的特点。在siRNA设计的过程中，不同位点的siRNA对基因的抑制作用不同，siRNA的抑制效率与基因的设计位点密切相关。因此，寻找最合适的siRNA对于RNA干扰的应用至关重要。

Ras鸟苷酸释放蛋白1(Ras guanyl nucleotide releasing protein 1,RasGRP1)是鸟嘌呤核苷酸交换因子中的一员，能通过交换鸟嘌呤核苷酸将Ras蛋白从无活性的GDP形式变成有活性的GTP形式。RasGRP1主要表达在T细胞中，对T细胞的生长、发育和分化有着重要的作用。T细胞中RasGRP1的过度表达能够导致MAPK信号通路的活化增加；完全敲除RasGRP1后的小鼠T细胞不能正常分化，并显示出MAPK信号通路的活化受损。研究证实，RasGRP1可激活MAPK信号通路，是MAPK信号通路中重要的激活因子。RasGRP1可通过T细胞中MAPK通路的三条不同的信号(ERK1/2、P38MAPK、JNK)发挥调节作用。现有技术中，关于本发明沉默小鼠肠道RASGRP1表达的腺相关病毒，目前还未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种抑制RASGRP1基因表达的siRNA。

本发明的第二个目的在于，提供一种抑制RASGRP1基因表达的干扰载体。

本发明的第三个目的在于，提供一种沉默小鼠肠道RASGRP1表达的腺相关病。

本发明的第四个目的在于，提供RASGRP1腺相关病毒干扰C57小鼠模型的构建方法。

本发明的第五个目的在于，提供一种RASGRP1腺相关病毒干扰C57小鼠模型的构建方法。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种抑制RASGRP1基因表达的siRNA，所述的siRNA编码序列为：

(1)正义链：5’-CcggTCGACACGACCCAAATTAATTCTCGAGAATTAATTTGGGTCGTGTCGATTTTTT-3’

反义链：5’-ctagaaaaaaTCGACACGACCCAAATTAATTCTCGAGAATTAATTTGGGTCGTGTCGA-3’；或

(2)正义链：5’-CcggAGAACAAAGAGTCCCTTATAACTCGAGTTATAAGGGACTCTTTGTTCTTTTTTT-3’

反义链：5’-ctagaaaaaaAGAACAAAGAGTCCCTTATAACTCGAGTTATAAGGGACTCTTTGTTCT-3’；或

(3)正义链：5’-CcggGAACTGGAACAGGAAATAAATCTCGAGATTTATTTCCTGTTCCAGTTCTTTTTT-3’

反义链：5’-ctagaaaaaaGAACTGGAACAGGAAATAAATCTCGAGATTTATTTCCTGTTCCAGTTC-3’。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种包含如上所述siRNA编码序列的干扰载体。

在上述干扰载体中，作为本发明的一个优选方案，所述载体为pMT149。

在上述干扰载体中，作为本发明的一个优选方案，所述载体是将所述siRNA插入载体质粒的BspEI和NheI-HF位点间得到。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种沉默小鼠肠道RASGRP1表达的腺相关病毒，由如上所述的干扰载体和辅助质粒共转染工程细胞后包装而成。

在上述腺相关病毒中，作为本发明的一个优选方案，所述辅助质粒为pAAV-RC载体和pHelper载体；所述工程细胞为293细胞。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述的siRNA、干扰载体或腺相关病毒在制备抑制RASGRP1基因表达的产品(如药物或抑制剂)的中应用。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：

一种RASGRP1腺相关病毒干扰C57小鼠模型的构建方法，采用腹腔注射的方式将权利要求5-6所述沉默小鼠肠道RASGRP1表达的腺相关病毒注入到C57小鼠体内。

本发明公开了一种沉默小鼠肠道RASGRP1表达的腺相关病毒及其制备方法和应用。本发明针对RASGRP1基因设计了三对siRNA序列，并构建了RasGRP1shRNA干扰载体，qPCR筛靶结果显示，PAAVE2113,PAAVE2114和PAAVE2115均有沉默效果，其中PAAVE2115沉默效果最好，沉默效率约为74％，与WB结果一致。将所述的干扰载体和辅助质粒共转染工程细胞，获得沉默小鼠肠道RASGRP1表达的腺相关病毒，动物实验证实，采用该腺相关病毒干扰C57小鼠，可使小鼠小肠组织中RasGRP1蛋白表达下降，且采用腹腔注射的方式，干扰效果最好。

附图说明

附图1为实施例1RasGRP1过表达质粒构建流程示意图。

附图2为实施例1的工具载体图谱。

附图3为实施例1的终载体图谱。

附图4为实施例1的工具载体酶切结果图谱。

附图5为实施例1的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱。

附图6为实施例1的菌落PCR鉴定示意图。

附图7为实施例1的菌落PCR鉴定结果。

附图8为实施例2的载体图谱。

附图9为实施例2的工具载体酶切结果图谱。

附图10为实施例2的菌落PCR鉴定示意图。

附图11为实施例2的菌落PCR鉴定结果。

附图12为实施例4的荧光定量PCR反应结果。图中293T-Control：293T空细胞；293T-PSE3029+PAAVE2099：PSE3029(RasGRP1过表达)和PAAVE2099(RasGRP1干扰对照)共转染293T细胞；293T-PSE3029+PAAVE2113：PSE3029(RasGRP1过表达)和PAAVE2113(RasGRP1-shRNA1)共转染293T细胞；293T-PSE3029+PAAVE2114：PSE3029(RasGRP1过表达)和PAAVE2113(RasGRP1-shRNA2)共转染293T细胞；293T-PSE3029+PAAVE2115：PSE3029(RasGRP1过表达)和PAAVE2113(RasGRP1-shRNA3)共转染293T细胞。

附图13为RasGRP1表达量数据结果。

附图14为实施例5的各样本中RasGRP1的表达水平。

附图15为实施例6标准品pAVV-GFP质粒扩增标准曲线。

附图16为实施例6病毒质粒转染结果。

附图17为实施例7各组RASGRP1表达结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1 RasGRP1过表达质粒构建

1.实验流程

PCR扩增目的基因。表达载体酶切后进行胶回收载体片段。目的基因与载体片段同源重组后转化E.coli感受态细胞。用菌落PCR鉴定转化子，阳性克隆送测序。测序无误的克隆进行质粒抽提。实验流程如图1所示。

2.实验材料

试剂名称	试剂来源	cat.No.
			工具载体	生工生物工程(上海)股份有限公司	/
PrimeSTAR	Takara	DR010A
			Taq酶和dNTP	Takara	DR001B
无缝克隆试剂盒	生工生物工程(上海)股份有限公司	/
			NheI-HF	NEB	R3131L
HindIII-HF	NEB	R3104L
			DH5a感受态细胞	Takara	D9057
小抽试剂盒	Promega	A1460
			琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒	Takara	DV805A
DL2,000DNA Marker	Takara	D501A
			1kb DNA ladder Marker	Fermentas	SM0311
引物合成	生工生物工程(上海)股份有限公司	/
			阳性克隆测序	生工生物工程(上海)股份有限公司	/

3.表达载体的线性化

工具载体图谱如图2所示。终载体图谱如图3所示。

4.载体酶切

用XhoI和EcoRI-HF对工具载体进行酶切，回收3341bp载体片段，酶切图谱如图4所示。

5.引物设计合成

Primer 1(+)AGGAAGATCGTACTCGAGAAGGATCTGCGATCGCTCC

引物说明：用于PCR钓取启动子EF1A。

Primer 2(－)TTCCCATGGTGGCTCTAGAGTAGGCGCCGGTCACAGC

引物说明：用于PCR钓取启动子EF1A。

Primer 3(+)CTCTAGAGCCACCATGGGAACCCTGGGCAAGG

引物说明：用于PCR钓取目的基因。

Primer 4(－)AGCACTATCACCGTGGTCCATC

引物说明：用于PCR钓取目的基因。

Primer 5(+)GGACCACGGTGATAGTGCTGGTTCTGGCGTGAAACAGAC引物说明：用于PCR钓取F2A-EGFP。

Primer 6(-)TCCAGAGGTTGATTGAATTCCTACTTGAGCTCGAGATCTGAGTAC引物说明：用于PCR钓取F2A-EGFP。

Primer 7(+)GCTGCGTAAAAGAGAACCCCAC

引物说明：用于菌落PCR鉴定转化子。

Primer 8(－)CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG

引物说明：用于菌落PCR鉴定转化子。

6.PCR扩增目的基因片段

结果如图5所示：

Primer1+2：PCR产物a大小：583bp

Primer3+4：PCR产物b大小：2398bp

Primer5+6：PCR产物c大小：852bp

7.目的基因同源重组入表达载体

将目的DNA片段和线性化载体以摩尔比2:1加到试管中进行重组反应：

试剂	阳性对照(μl)	自连对照(μl)	连接组(μl)
				胶回收后的abc片段	4	4	4
线性化的表达载体	1	1	1
				无缝克隆反应液	15	0	15
dd H2O	Up to 20	Up to 20	Up to 20

混匀后在42℃孵育30分钟，然后转移到冰上。放置2-3分钟后取10ul反应液体转化到感受态细胞中。

说明：阳性对照和自连对照，加入的载体和连接组一致，但阳性对照加入的基因片段是目的基因(带有同样的同源重组交换臂)。

8.转化

(1)取一支感受态细胞(每管100μl，-80℃保存)于冰上，待溶解后加入10μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。

(2)将管放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激90秒。

(3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟。

(4)每管加900μl LB培养液，然后将管转移到37℃摇床上，温育1小时使细菌复苏。

(5)取恰当量的转化菌液涂布于LB琼脂平板上(含表达载体相应的抗生素)。

(6)倒置平皿，于恒温培养箱中37℃培养，16小时。

9.阳性克隆鉴定

挑取平板上长出的转化子重悬于10μl LB培养液中，从中取1μl做模板进行菌落PCR鉴定。菌落PCR鉴定示意图(图6)。阳性克隆得到1818bp的片断，阴性克隆得到0bp的片断。

10.菌落PCR鉴定结果

如图7所示，接种阳性克隆，保种并分装100ul送测序。测序正确的，再接种抽提质粒。

11.阳性克隆测序结果分析

阳性克隆测序结果(SEQ ID NO.1)表明，和预期的目的基因序列基本一致，其中108-3869bp为目的基因序列。

实施例2RasGRP1shRNA干扰载体构建(3个靶点)

1.实验流程

PCR扩增目的基因。表达载体酶切后进行胶回收载体片段。目的基因与载体片段同源重组后转化E.coli感受态细胞。用菌落PCR鉴定转化子，阳性克隆送测序。测序无误的克隆进行质粒抽提。

2.实验材料

3.载体图谱

载体图谱如图8所示。

4.载体酶切

用BspEI和NheI-HF对工具载体进行酶切，回收5719bp载体片段，酶切图谱如图9所示。

5.siRNA设计

病毒载体构建框架:

NO.	5’	STEMP	Loop	STEMP	3’
						pAAVE2113-1	Ccgg	TCGACACGACCCAAATTAATT	CTCGAG	AATTAATTTGGGTCGTGTCGA	TTTTTT
pAAVE2113-2	ctagaaaaaa	TCGACACGACCCAAATTAATT	CTCGAG	AATTAATTTGGGTCGTGTCGA
						pAAVE2114-1	Ccgg	AGAACAAAGAGTCCCTTATAA	CTCGAG	TTATAAGGGACTCTTTGTTCT	TTTTTT
pAAVE2114-2	ctagaaaaaa	AGAACAAAGAGTCCCTTATAA	CTCGAG	TTATAAGGGACTCTTTGTTCT
						pAAVE2115-1	Ccgg	GAACTGGAACAGGAAATAAAT	CTCGAG	ATTTATTTCCTGTTCCAGTTC	TTTTTT
pAAVE2115-2	ctagaaaaaa	GAACTGGAACAGGAAATAAAT	CTCGAG	ATTTATTTCCTGTTCCAGTTC

DNA合成片段：

pAAVE2113-1：CcggTCGACACGACCCAAATTAATTCTCGAGAATTAATTTGGGTCGTGTCGATTTTTT

pAAVE2113-2：ctagaaaaaaTCGACACGACCCAAATTAATTCTCGAGAATTAATTTGGGTCGTGTCGA

pAAVE2114-1：CcggAGAACAAAGAGTCCCTTATAACTCGAGTTATAAGGGACTCTTTGTTCTTTTTTT

pAAVE2114-2：ctagaaaaaaAGAACAAAGAGTCCCTTATAACTCGAGTTATAAGGGACTCTTTGTTCT

pAAVE2115-1：CcggGAACTGGAACAGGAAATAAATCTCGAGATTTATTTCCTGTTCCAGTTCTTTTTT

pAAVE2115-2：ctagaaaaaaGAACTGGAACAGGAAATAAATCTCGAGATTTATTTCCTGTTCCAGTTC

将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20μM，互补单链各取30μl混合。然后将oligo混合物在水浴锅中95℃加热5分钟，然后水浴锅开盖置室温中自然冷却至室温，形成双链oligo片段。取1μl用于后续的连接反应，其余-20℃保存。

6.干扰片段连接入表达载体

连接反应体系：

试剂	阳性对照(μl)	自连对照(μl)	连接组(μl)
				退火的双链oligo 10mM	1	-	1
线性化的干扰载体40ng/μl	3	3	3
				10×T4DNA ligase Buffer	2	2	2
T4DNA ligase	1	1	1
				dd H<sub>2</sub>O	Up to 20	Up to 20	Up to 20

说明：阳性对照所加的退火的双链oligo是以前退火好的验证好用的片段，和连接组所加的退火的双链oligo长度一样，但序列无关。

7.转化

(1)取一支感受态细胞(每管100μl，-80℃保存)于冰上，待溶解后加入10μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。

(2)将管放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激90秒。

(3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟。

(4)每管加900μl LB培养液，然后将管转移到37℃摇床上，温育1小时使细菌复苏。

(5)取恰当量的转化菌液涂布于LB琼脂平板上(含表达载体相应的抗生素)。

(6)倒置平皿，于恒温培养箱中37℃培养，16小时。

8.阳性克隆鉴定

挑取平板上长出的转化子重悬于10μl LB培养液中，从中取1μl做模板进行菌落PCR鉴定。菌落PCR鉴定示意图(图10)。

Primer(+)：hU6-F2 TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG

Primer(－)：ITR-R GCCATGCTCTAGGAAGATCCTTATC

阳性克隆得到310bp条带，阴性克隆(空载体自连)得到254bp条带

9.菌落PCR鉴定结果

如图11所示，泳道1～4为挑取PAAVE2113的4个转化子，泳道5-8为挑取PAAVE2114的4个转化子，泳道9-12为挑取PAAVE2115的4个转化子。

10.阳性克隆测序结果分析

PAAVE2113

AGCCTAGTGACTGTAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACTCCGGTCGACACGACCCAAATTAATTCTCGAGAATTAATTTGGGTCG TGTCGATTTTTTCTAGCATCGATAAGGATCTTCCAGAGCATGGCAAATC

PAAVE2114

TTCCATAGTTGACTGTACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACTCCGGAGAACAAAGAGTCCCTTATAACTCGAGTTATAAGGGACTCT TTGTTCTTTTTTTCTAGCATCGATAAGGATCTTCCAGCAGCATGGCCAA

PAAVE2115

AGCCTACTTGACTGTACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACTCCGGGAACTGGAACAGGAAATAAATCTCGAGATTTATTTCCTGTTC CAGTTCTTTTTTCTAGCATCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCCATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCATTTTAAAACATAATTTTAAAACTGCAAACTACCCAAGAAATTATTACTTTCTACGTCACGTATTTTGTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATTAATTCCAATTATCTCTCTAACAGCCTTGTATCGTAA

实施例3过表达和干扰质粒共转染293T细胞

(1)转染前一天，细胞铺孔板。

(2)细胞铺板后12H即可以转染。

(3)细胞铺板12H后，准备好相应质粒/Lipo2000。

(4)将质粒(过表达使用1ug，干扰和干扰对照使用3ug)与250ul的OPTI-MEM混匀孵育5min。

(5)在进行4的同时，将10ul的Lipo2000与250ul的OPTI-MEM也混匀孵育5min。

(6)五分钟后，将两个混匀好的溶液混合到一起混匀后孵育15min。

(7)在孵育的同时，将昨天铺好的板中原始培养基吸出，加入1ml的OPTI-MEM。

(8)孵育完成后，将6液加入孔板中，轻轻摇晃。

(9)将孔板置于37度培养箱培养。

(10)培养6H后，将孔板取出，吸掉里面的所有液体。

(11)加入2ml的新鲜培养基，继续放置于37度培养箱培养。

(12)一般48H后进行(荧光)拍照，检测。

实施例4 Qpcr外源筛靶

1.总RNA提取

(1)往收集完毕的细胞样品中加入1ml Ezol裂解液，漩涡震荡混匀。

(2)加入0.2ml三氯甲烷，剧烈摇动10s，室温放置1分钟。

(3)4℃，12,000x g离心15min。

(4)将上清水相转移至另一新的无RNA酶离心管中，并加入等体积的100％乙醇。

(5)吸取全部样品，加入带有2ml收集管的mini-spin离心柱。8,000x g，室温离心15s，弃尽流穿液。

(6)将剩余的样品转移至离心柱，重复第5步。

(7)往离心柱中加入700μl WB，轻盖盖子，8,000x g，室温离心15s，弃尽流穿液。

(8)重复第7步，用500μl WB洗涤离心柱两次。

(9)将离心柱转移至一新的无RNA酶的1.5ml离心管中，往硅胶膜中央滴加50μlDEPC水，4℃，10,000x g离心3min洗脱RNA。

2.逆转录反应体系

组分	终浓度	用量
			2×逆转录缓冲液	2×	10μl
逆转录引物(1uM)	50nM	1.2μl
			总RNA	—	2μl
MMLV逆转录酶(200U/μl)	2U/μl	0.2μl
			DEPC水		To 20μl

3.逆转录程序

42℃，30min；85℃，10min。

4.荧光定量反应体系

组分	终浓度	用量
			2×定量PCR Master Mix	1×	10μl
上游引物(20uM)	0.08μM	0.08μl
			下游引物(20uM)	0.08μM	0.08μl
cDNA模板	—	2μl
			Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)	0.05U/μl	0.4μl
dd H<sub>2</sub>O		加至20μl

5.定量PCR反应程序

95℃，3分钟变性；5℃，12秒；62℃，40秒。40循环。

6.引物序列

7.结果

如图12-13，qPCR筛靶结果显示，PAAVE2113，PAAVE2114和PAAVE2115均有沉默效果，其中PAAVE2115(RasGRP1-shRNA3)沉默效果最好，沉默效率约为74％，结果与WB结果一致。

实施例5 Western Blot外源筛靶

1.收样与总蛋白抽提、定量：

(1)接收细胞平台的细胞，弃去细胞培养液，按细胞量加入适量的1×LysisBuffer。

(2)4℃裂解细胞10～15min，并标记空的1.5ml EP管。

(3)用细胞刮或移液枪把细胞刮下或吹下，并转移至相对应标记好的1.5mlEP管中，冰浴10～15min，标记一空的1.5mlEP管，并写上合同号，细胞名称，克隆号，日期等。

(4)4℃，12000g，离心5min，缓慢吸取上清至相对应标记好的1.5mlEP管中。

(5)BCA法蛋白定量，计算蛋白浓度。

(6)处理蛋白样品：加入5*Loading Buffer，95℃～100℃加热5min，-20℃保存至规定样品检测盒。

2.配制SDS-PAGE

(1)把玻璃板冲洗干净，烘干

(2)把晾干后的玻璃板按要求用架子架好，根据蛋白的大小配制相应浓度的SDS-PAGE胶。

3.上样电泳

(1)上样：把胶装在电泳槽中夹好，加足够的1*电泳液后开始准备上样。用双手抓住梳子的两端轻轻用力向上拔去梳子，用1ml的移液器吸入电泳缓冲液轻轻吹洗上样孔，将准备好的样品上样，每个样品取相同总蛋白量，用20ul的移液器垂直于上样孔把样品缓慢加入上样孔内，上样结束后，在电泳槽外部加入适量的1*电泳液，盖好盖子，并注意正负极不要插反。

(2)电泳：两块胶恒流25mA～30mA，3h左右。

4.免疫印迹(湿转)

(1)标记PVDF膜：在PVDF膜右侧写上日期，基因名，胶所对应的字母。

(2)转膜：在医用托盘中倒入500-800ml的电转移缓冲液，把玻璃板从电泳装置中取出来，并用自来水冲洗掉表面的SDS，放入一用托盘中，用铲子在玻璃板的上端轻轻地把两块玻璃板撬开，把胶的下端溴酚蓝部分切除，然后用胶铲把胶轻轻托起来放在滤纸上，从负极到正极依次放置：海绵—滤纸—胶—PVDF膜—滤纸—海绵，把夹板放入转移电泳装置中，加入合适的1*转移缓冲液，在冰浴中，400mA恒流条件下电转120min，进行转膜。

5.免疫显色

(1)封闭：在培养皿中掉入100ml的封闭液(含5％脱脂牛奶的TBST溶液)把已经转好的PVDF膜正面向上放入培养皿中，PVDF膜要完全浸没在封闭液中，室温封闭1h。

(2)一抗孵育：用PE手套把已封闭好的PVDF膜包起来，加入封闭液稀释的抗体，贴在H20型混合器上4度孵育过夜。

(3)洗膜：把PVDF膜从PE手套中取出来，放入培养皿中，加入适量1*TBST溶液，放在脱色摇床上轻摇，洗膜3次，每次10min

(4)二抗孵育：用封闭液稀释相应的二抗，室温下孵育PVDF膜2h

(5)洗膜：1*TBST洗膜3次，每次10min。

(6)ECL显色，X光显影，在暗房中进行获得显示条带的胶片。

6.抗体信息

蛋白预染marker信息

名称	公司	货号
			Prestained Protein Ladder	Thermo	26619

6.结果

结果如图14所示，结果显示，PAAVE2113和PAAVE2115均有沉默效果，其中PAAVE2115(RasGRP1-shRNA3)沉默效果最好。

实施例6腺相关病毒最有效靶点包装

订单号	克隆编号	基因名称	血清型	批次号
					SIR148	PAAVE2115	RasGRP1	AAV2/9	20171203

1.实验材料

1、质粒大抽试剂盒(Qiagen，cat.no.12263)

2、10cm培养皿(Corning cat.no.431067)

3、生物安全Ⅱ级实验室

4、生物安全柜(Thermo)

5、CO2培养箱(Thermo)

6、Beckman ultracentrifuge(Beckman Coulter)

7、FBS，heat inactivated(GIBCO，cat.no.26140-079)

8、DMEM high glucose(GIBCO，cat.no.11995)

9、Penicillin–streptomycin(GIBCO，cat.no.15140-122)

10、EDTA Trypsin-EDTA，0.25％(GIBCO，cat.no.3197)

11、magnesium chloride(without Ca/Mg)(GIBCO，cat.no.14190)

12、HEPES(Sigma，cat.no.H4034)

2.293T细胞传代

选取状态良好的293T细胞，按照1:4进行传代，每个10cm培养皿中加入4×10⁶个293T细胞，24小时后用于转染。

3.病毒包装

1、转染前检查前一天传代的293T细胞的状态，状态良好，密度应当达到70％左右的汇合度，开始转染。

2、转染体系配制：取一个无菌EP管，吸5ug pAAV-RC质粒，5ug pHelper质粒和5ug目的载体质粒，50ul 2.5M CaCl2后混匀，用灭菌水补齐到500ul。

3、吸取500ul的2xHBS，滴加到上述的DNA/CaCl2混合液中。通过翻转或是反复吹打温和混匀。

4、混匀后滴加到10cm培养皿中，加入的同时轻轻晃动细胞培养皿，使得溶液尽量均一的分布在培养基中。将细胞培养皿放回到37℃培养箱放置6-8小时。

5、培养6-8小时后，将培养皿中的培养基替换为10ml新鲜的培养基，放入37℃培养箱中继续培养。

4.收毒

1、转染60-72h后，把细胞连同培养基一起收集到50ml离心管中，3000rpm，离心10分钟，收集细胞沉淀，加入PBS重悬细胞沉淀。

2、将细胞悬浮液在液氮和37℃水浴中反复冻融三次。4000rpm，离心10分钟，收集上清。

5.AAV病毒浓缩

1、在上清中加入40％PEG8000直到终浓度为8％，在冰上放置2小时后，5000rpm离心30分钟。去掉上清液，沉淀用PBS重悬。

2、5000rpm离心30分钟，将上清转移到另一个干净的管中。此时上清中不应该有可见的细胞碎片。如果仍有部分碎片，则再次离心；

3、在上清中加入Benzonase核酸酶(终浓度为50U/ml)，混匀，在37℃孵育30分钟。4000rpm，离心10分钟，收集上清，用0.45um膜过滤，即为病毒浓缩液。

6.AAV病毒纯化

1、向病毒浓缩液中添加固体CsCl直到密度为1.41g/ml(折射率为1.372)，大概是10ml病毒液中加6.5g CsCl，振荡使之溶解，CsCl溶解会吸热变冷。

2、将样品加入到超速离心管中，用预先配好的1.41g/ml CsCl溶液将离心管剩余空间填满。

3、175,000g离心24小时，以形成密度梯度。按顺序分步收集不同密度的样品，取样进行滴度测定。收集富集有AAV颗粒的组分。

4、将密度梯度离心得到的病毒液加入到超滤装置中，并加入1xPBS，3000rpm离心10分钟，超滤管中保持500ul溶液，再加入1xPBS，3000rpm，离心10分钟，重复以上步骤3-5次。最后收集AAV病毒液。取10ul病毒做滴度检测。其他病毒进行分装保存-80℃冰箱。

7.qPCR滴度检测

7.1引物序列

7.2 Real-time PCR实验步骤

标准品pAVV-GFP质粒作103，104,105,106,107稀释，检测样品作1000，10000倍稀释

反应体系：

反应条件：95℃for 10min，followed by 40cycles of 95℃for 10s and 60℃for 35s。

8.实验结果

8.1标准品pAVV-GFP质粒扩增标准曲线：图15。

8.2腺相关病毒滴度结果：

8.4病毒质粒转染结果：图16。

实施例7 RASGRP1腺相关病毒干扰C57小鼠鉴定

1.C57小鼠，28只，SPF级，雄性，18-22克，适应性喂养7天，

随机分为四组，分组干预如下：正常对照组：4只，不做任何干预；灌胃组：4只，每只小鼠的灌胃pAAVE2115剂量为10¹¹vg；灌胃对照组：4只，每只小鼠的灌胃pMT149剂量为10¹¹vg；尾静脉注射组：4只，每只小鼠的注射pAAVE2115剂量为10¹¹vg；尾静脉对照组：4只，每只小鼠的注射pMT149剂量为10¹¹vg；腹腔注射组：4只，每只小鼠的注射pAAVE2115剂量为10¹¹vg；腹腔对照组：4只，每只小鼠的注射pMT149剂量为10¹¹vg。干预四周后，取小肠组织进行western blot检验RASGRP1的表达情况。

2.Western blot检测步骤及结果

2.1实验步骤

2.1蛋白样品的制备

2.1.1蛋白的提取

2.1.1.1组织中总蛋白的提取

1、将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

2、加400μl单去污剂裂解液裂(含PMSF)于匀浆器中进行匀浆，然后置于冰上。

3、几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。

4、裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。

2.1.2.蛋白浓度的测定

1、将蛋白样品各取1μl，与PBS19μl混合进行稀释，即测试样品稀释20倍。

2、将BSA标准品进行稀释，制成蛋白浓度为1，0.8，0.6，0.4，0.2标准蛋白。

3、将PBS稀释过的蛋白样品、稀释过的标准蛋白分别加入96孔板内，标准品各设2个平行孔，待测样品设3个平行孔，每孔加入体积20μl。加入PBS的2个平行孔为空白对照。

4、按50:1比例将BCA试剂盒中A液和B液进行混合，将混合液加入96孔板内，每孔加入200μl，注意不要产生气泡，以免影响反应。

5、37℃避光孵育30min。

6、用DG-3022A酶标仪测定OD568。

7、根据标准蛋白浓度和相应的OD值计算直线回归方程，根据蛋白样品OD值，利用回归方程计算出样品蛋白浓度。

2.1.3.蛋白变性

将提取的蛋白上清与5ⅹ蛋白上样缓冲液，放入沸水中进行沸水浴10min，检查样品是否透亮然后用移液枪吸取看是否粘稠，若不透亮或粘稠则需延长煮样时间。变性完后冷却至室温再放入-20℃保存。

2.2.电泳

2.2.1电泳胶的制备

将玻璃板洗净擦干后，固定在制胶器上后，开始配分离胶，将分离胶灌入玻璃板空隙内到适当的高度，用无水乙醇覆盖分离胶，直至胶完全聚合。倒出无水乙醇，用双蒸水轻轻冲洗后用滤纸吸干。然后加入浓缩胶到合适的高度，插入梳齿。浓缩胶完全聚合后取出梳齿。

2.2.2.电泳分离

将制备好的胶固定到电泳槽上，储液池中倒入电泳液。用微量加样器将制备好的蛋白样品和MAKER加入上样孔，各样品总蛋白量为40μg。加样后先恒压80V电泳至溴酚蓝指示剂在浓缩胶与分离胶交界处成线状，改为恒压120v至溴酚蓝到凝胶底部，此过程约用时1.5h。

2.3电转移

取出凝胶根据Marker切下目的条带，用蒸馏水冲洗，剪与PAGE凝胶相同大小的PVDF膜和滤纸，PVDF膜用甲醇浸泡数秒后和滤纸一同浸泡于电转缓冲液中。按照黑色板-纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-纤维垫-白色板依次放好，夹紧板后放入转膜仪内，黑色板的一面对照黑色负极。在转膜槽中加满电转液开始转膜。

转膜条件：GAPDH---200mA，0min；rasgrp1---200mA，120min后300mA，15min。

2.4免疫印迹显色：ECL显色系统

2.4.1.封闭

用含5％脱脂奶粉的TBST(封闭液)浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2h。

2.4.2.一抗

用封闭液稀释相应的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育过夜。

2.4.3洗去多余一抗

TBST充分洗涤PVDF膜5-6次，5min/次。一个皿中最多放3张膜，洗膜过程中注意膜是否贴到皿壁或膜是否重叠到一起。

2.4.4二抗

用封闭液稀释相应的HRP标记二抗---1:50000稀释，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37℃摇床孵育2h。

2.4.5洗去多余二抗

TBST充分洗涤PVDF膜5-6次，5min/次。

2.4.6显色曝光

将ECL试剂中增强液与稳定的过氧化物酶溶液按1:1比例混匀，滴加工作液于PVDF膜上，反应数分钟待荧光带明显后，用滤纸吸去多余的底物液，覆上保鲜膜，X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影，冲洗胶片。

3.结果分析

晾干胶片，扫描胶片，用BandScan分析胶片灰度值。分析结果如图17所示。结果显示：采用腹腔注射法，可以使小鼠小肠组织中RasGRP1蛋白表达下降达到56％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海中医药大学附属曙光医院

<120> 一种沉默小鼠肠道RASGRP1表达的腺相关病毒及其制备方法和应用

<130> /

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3889

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agcgcgcaga gagggagtgg ccaactccat cactaggggt tccttgtagt taatgattaa 60

cccgccatgc tacttatcta cgtagccatg ctctaggaag atcgtactcg agaaggatct 120

gcgatcgctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 180

tggggggagg ggtcggcaat tgaacgggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 240

aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 300

gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacagctga 360

agcttcgagg ggctcgcatc tctccttcac gcgcccgccg ccctacctga ggccgccatc 420

cacgccggtt gagtcgcgtt ctgccgcctc ccgcctgtgg tgcctcctga actgcgtccg 480

ccgtctaggt aagtttaaag ctcaggtcga gaccgggcct ttgtccggcg ctcccttgga 540

gcctacctag actcagccgg ctctccacgc tttgcctgac cctgcttgct caactctacg 600

tctttgtttc gttttctgtt ctgcgccgtt acagatccaa gctgtgaccg gcgcctactc 660

tagagccacc atgggaaccc tgggcaaggc gagagaggct ccgcggaaac cttgccatgg 720

ctccagagct ggccccaaag caagactaga ggccaaatca accaacagcc ctctccctgc 780

ccagcccagc ttggcccaga tcacccagtt ccgaatgatg gtgtccctgg gacatttggc 840

caaaggagcc agcctggatg atcttattga cagctgcatt caatcttttg atgcggatgg 900

aaacctgtgt cggaataacc aactgttaca agtcatgcta accatgcacc ggatcatcat 960

ctcctcagcc gagctgctac aaaaagtcat gaatctatat aaggatgccc tggaaaagaa 1020

ttctccagga gtttgcctga agatctgcta ttttgtcagg tattggataa cagaattctg 1080

gatcatgttc aagatggatg ccagcttgac cagcaccatg gaagagttcc aagacctggt 1140

gaaagccaat ggtgaggaga cccactgcca cctcatcgac acgacccaaa ttaattctcg 1200

agactggtcc aggaaactga ctcagaggat aaaatcgaat actagcaaga agcgcaaagt 1260

gtccctgctg tttgaccatc tggaacctga agaactgtct gaacacctca cctaccttga 1320

gttcaagtcc ttccgacgga tatctttctc tgattaccaa aattaccttg taaatagctg 1380

cgtaaaagag aaccccacca tggagaggtc cattgccctg tgcaatggca tctcccagtg 1440

ggtacaactg atggttctca gccgtcccac cccgcagctc cgggcagagg tcttcatcaa 1500

gttcatccat gtggctcaga aactccacca gctacagaac ttcaacacgc tgatggctgt 1560

gatcggggga ctgtgtcaca gctccatctc caggcttaag gaaacaagtt cacatgtccc 1620

acatgagatc aataaggttc tgggcgagat gactgaactg ctgtcctcct gcagaaacta 1680

tgacaactac aggcgagcct atggggagtg cacccacttc aaaatcccca tactgggtgt 1740

gcacctcaag gacctcatat ccctgtatga ggctatgccc gactatctgg aagatgggaa 1800

ggtgaatgtc caaaagctcc tggcccttta caatcatatc aatgaattgg tccagctgca 1860

ggagatggcc ccaccattgg atgccaacaa ggacttggtg catctgctga cgttatccct 1920

ggatctatac tatacagaag atgaaatcta tgagctttcc tatgcccggg agccgaggaa 1980

ccacagagct ccgccactga caccttcgaa gccaccagtt gtagtagact gggcctctgg 2040

agtgtctccc aaacctgacc caaagaccat cagcaaacac gtccaaagga tggtggattc 2100

tgtctttaag aactatgatc tcgaccagga tggctatatc tctcaggagg agtttgagaa 2160

gatcgctgca agctttccat tttccttctg tgtgatggac aaagataggg aaggcctcat 2220

cagcagagac gagatcacgg cctacttcat gagggccagc tccatctatt ccaagctggg 2280

cctgggcttt ccacacaact ttcaagaaac cacttacctg aagcccacct tctgtgacaa 2340

ctgtgctggc tttctctggg gcgtgatcaa gcaaggctat cgctgtaaag actgcgggat 2400

gaactgccac aaacagtgca aagacctggt ggtgttcgag tgcaagaagc gaatcaagag 2460

cccagcaata tccacagaga acatcagctc tgtggtacca atgtccaccc tttgtccact 2520

gggaaccaaa gatctgctcc atgcacccga agaaggatct ttcattttcc aaaacggaga 2580

gattgtggac cacagtgagg agagcaagga taggaccatc atgctcctcg gagtgtcctc 2640

ccagaaaatt tcagttcggc tgaagaggac tgttgcccac aagagcaccc aaacagaatc 2700

gttcccgtgg gttggtggcg agacgacccc tggtcacttt gtgctgtctt ctccaaggaa 2760

gtcggcgcag ggcgctcttt atgtgcacag tccagcatct ccatgcccca gcccagcact 2820

ggtccgaaag cgggcattcg tcaagtggga gaacaaagag tcccttataa aaccaaaacc 2880

agaacttcac ctccggctcc ggacctacca agaactggaa caggaaataa ataccctgaa 2940

agcagataac gatgctctga agatccaact gaagtacgca cagaagaaaa tagaatccct 3000

gcagcttggg aaaagcaatc atgtcttagc ccagatggac cacggtgata gtgctggttc 3060

tggcgtgaaa cagactttga attttgacct tctcaagttg gcgggagacg tggagtccaa 3120

cccagggccc gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga 3180

gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc 3240

cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg 3300

gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca 3360

catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac 3420

catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga 3480

caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct 3540

ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca 3600

gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca 3660

gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga 3720

caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca 3780

catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta 3840

caagtactca gatctcgagc tcaagtagga attcaatcaa cctctggat 3889

<210> 2

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ccggtcgaca cgacccaaat taattctcga gaattaattt gggtcgtgtc gatttttt 58

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ctagaaaaaa tcgacacgac ccaaattaat tctcgagaat taatttgggt cgtgtcga 58

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ccggagaaca aagagtccct tataactcga gttataaggg actctttgtt cttttttt 58

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ctagaaaaaa agaacaaaga gtcccttata actcgagtta taagggactc tttgttct 58

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ccgggaactg gaacaggaaa taaatctcga gatttatttc ctgttccagt tctttttt 58

<210> 7

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ctagaaaaaa gaactggaac aggaaataaa tctcgagatt tatttcctgt tccagttc 58

Claims (8)

1.一种抑制RASGRP1基因表达的siRNA，其特征在于，所述的siRNA编码序列为：

(1)正义链：5’-CcggTCGACACGACCCAAATTAATTCTCGAGAATTAATTTGGGTCGTGTCGATTTTTT-3’

反义链：5’-ctagaaaaaaTCGACACGACCCAAATTAATTCTCGAGAATTAATTTGGGTCGTGTCGA-3’；或

(2)正义链：5’-CcggAGAACAAAGAGTCCCTTATAACTCGAGTTATAAGGGACTCTTTGTTCTTTTTTT-3’

反义链：5’-ctagaaaaaaAGAACAAAGAGTCCCTTATAACTCGAGTTATAAGGGACTCTTTGTTCT-3’；或

(3)正义链：5’-CcggGAACTGGAACAGGAAATAAATCTCGAGATTTATTTCCTGTTCCAGTTCTTTTTT-3’

反义链：5’-ctagaaaaaaGAACTGGAACAGGAAATAAATCTCGAGATTTATTTCCTGTTCCAGTTC-3’。

2.含权利要求1所述siRNA编码序列的干扰载体。

3.根据权利要求2所述的干扰载体，其特征在于，所述载体为pMT149。

4.根据权利要求3所述的干扰载体，其特征在于，所述载体是将所述siRNA插入载体质粒的BspEI和NheI-HF位点间得到。

5.一种沉默小鼠肠道RASGRP1表达的腺相关病毒，由权利要求2-4任一所述的干扰载体和辅助质粒共转染工程细胞后包装而成。

6.根据权利要求5所述的腺相关病毒，其特征在于，所述辅助质粒为pAAV-RC载体和pHelper载体；所述工程细胞为293细胞。

7.权利要求1所述的siRNA、权利要求2-4所述的干扰载体、权利要求5-6所述的腺相关病毒在制备抑制RASGRP1基因表达的产品的中应用。

8.RASGRP1腺相关病毒干扰C57小鼠模型的构建方法，采用腹腔注射的方式将权利要求5-6所述沉默小鼠肠道RASGRP1表达的腺相关病毒注入到C57小鼠体内。