CN1686566A - Cark基因在制备治疗心肌肥厚药物中的应用及一种抑制心肌肥厚的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及CARK基因在制备治疗心肌肥厚药物中的应用及一种抑制心肌肥厚的药物,属于生物制药领域。本发明以原代培养的心肌细胞作为靶细胞,腺病毒载体介导,验证CARK基因在体外对心肌细胞肥大的抑制作用。通过细胞学、体外实验证实,其心肌细胞肥大的抑制作用非常明显,且毒副作用低,致病性小。本发明又通过建立CARK转基因小鼠动物模型,在动物体内验证了CARK基因抑制心肌肥厚,改善心功能的作用。我们探索了腺病毒介导和利用显微注射转基因技术使CARK基因在心肌细胞特异性高表达治疗心肌肥厚的可行性,为心肌肥厚的基因治疗提供候选基因,并为心肌肥厚基因治疗的临床前研究提供体外和动物模型体内实验的依据。
Description
技术领域
本发明涉及CARK基因在制备治疗心肌肥厚药物中的应用及一种抑制心肌肥厚的药物,属于生物制药领域。
背景技术
近几十年来,心脏病已经成为影响人类生命健康的主要危险因素。当心脏受到生理或病理因素的刺激时,形态上会出现心肌细胞重构,主要有两种形式:肥厚或扩张。这种重构是心肌细胞在异常状态下,为维持心脏发挥正常的功能而出现的一种代偿机制。心肌肥厚是心脏功能失调的一种最常见的表现。心肌肥厚的定义是:左心室和/或右心室出现不对称性的肥厚、室间隔和心尖肥厚,伴有心律失常、心绞痛、呼吸困难并最终导致猝死;其主要病理学特征是心肌细胞体积增大、心肌细胞排列紊乱,经常伴有心肌纤维化;在分子水平则表现为ANP、BNP、α-SA、β-MHC等基因的表达异常,心肌细胞内钙离子的浓度异常;高血压、主动脉瓣狭窄等都能引起心室肥厚。1990年首次发现编码β肌球蛋白重链(β-MHC)的基因突变能引起家族性肥厚型心肌病(HCM)。尽管随后进行的分子遗传学研究,相继又发现了9个肌小节蛋白的基因突变,它们都能引起家族性肥厚型心肌病,但这种结构蛋白的突变是如何引起心肌细胞发生肥大反应的机制目前还不是十分清楚。
越来越多的证据表明,若干条细胞内信号通路参与了这个反应。因此,阻断心肌肥厚的信号通路可以降低心肌肥厚患者发生猝死的危险性和死亡率。寻找有效的针对肥厚过程信号分子的目的基因以及高效安全的载体的应用,无疑对心肌肥厚的防治具有重要意义。
大多数对肥大分子和细胞学方面的研究依赖于新生的大鼠心室肌细胞系统、转基因鼠和基因敲除鼠模型的建立。由于心肌细胞是一种终末分化细胞,在体外不能增殖,存在操作困难,转染效率低等特点。为了实现对心肌细胞的转基因操作,必须选择高效的基因载体。腺病毒载体可借助于病毒颗粒的主动侵染能力,产生高效的转染效率。经改造后的腺病毒载体只能在特定的细胞293A细胞株中进行自我复制,因而操作安全,简便。而且,腺病毒感染细胞后,其基因并不整合到宿主的基因组内。基于以上优点,腺病毒载体已被越来越多地应用于将外源基因导入心肌细胞内。我们在研究中发现,腺病毒感染效率高,能将目的基因转移到几乎100%的心肌细胞中,通过GFP(绿色荧光蛋白)显示在MOI=10时,培养细胞的感染效率即高达90%以上。如此高的转导效率对于心肌肥厚的体内基因治疗有很大的促进作用。
转基因动物是指以实验方法导入外源基因,在染色体组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。转基因动物能在活体中接近真实地再现某一特定基因的表达和所导致的后果,能把把复杂系统简化进行研究,是目前层次最高的实验体系。建立目的基因的转基因动物模型,研究外源基因在整体动物中的表达调控规律,具有系统的整体性和独立性,能够从四维时空观察基因调控的整体效应。近十年来,转基因动物,尤其是转基因小鼠这一生命科学研究的新体系已被广泛应用于肥厚型心脏病的病因、发病机理及治疗方法等方面研究,并取得许多令人瞩目的研究成果。
CARK蛋白是一个新发现的心肌细胞特异性的蛋白激酶,该基因cDNA全长约3,420bp,含一个2,505bp的完整阅读框,可编码835个氨基酸,分子量约为93KDa。结构域分析表明:CARK蛋白N端为6个锚蛋白重复结构域(Ankyrin repeat domain),中间为一酪氨酸激酶结构域,C端为富含丝氨酸结构域。经76种组织的多组织点阵膜杂交证实,CARK仅在成人与胎儿心脏表达。在成人心脏各个部位的表达有以下特点:室间隔、心尖最强,右心房及右心室次之,左心室较弱,左心房最弱。CARK基因在GENEBank中的编号为AF116826,参考mRNA序列为NM_015978。
目前,针对CARK基因功能的研究还在不断深入,人们期待着能够发现与人类疾病相关的CARK基因的新功能,从而为这些疾病的诊断和治疗提供分子医学领域的辅助。
发明内容
本发明的主要目的是提供CARK基因用于制备治疗心肌肥厚的药物的应用。
本发明的第二个目的是提供能够抑制心肌肥厚的含有CARK基因的药物。
本发明的第三个目的是提供能够抵抗心肌肥厚的转CARK基因小鼠,为研究心肌肥厚疾病致病机理和治疗方法提供动物模型。
为实现上述目的,本发明采取以下技术方案:
一、CARK基因用于制备治疗心肌肥厚的药物的应用。
本发明首先将CARK基因与2.6kb Nppa promoter-Luciferase报告载体及内参pRL-CMV共转染入心肌细胞中,观察其对ANF启动子活性的影响。与转染空载体组比较,转染CARK基因组的2.6kb Nppa promoter-荧光素酶的活性下降了19%,(p>0.05);当给予正常心肌细胞以100nM AngII的刺激后,2.6kb Nppa promoter-荧光素酶的活性明显增加了2.39倍(p<0.05)。同样地,当分别给转染了空载体和CARK的细胞以100nMAngII的刺激后,发现转染了CARK基因的细胞其荧光素酶的活性显著性的下降了44.7%(p<0.05)。此结果说明,CARK基因的过表达能显著地降低ANF的表达水平。
心肌肥厚发生的一个标志是心肌细胞体积的增大。本发明构建了含有CARK基因的腺病毒载体,分别用含CARK基因的腺病毒载体和腺病毒空载体感染心肌细胞,并给以10-7mol/L AngII刺激24小时后,在共聚焦激光显微镜下观察,发现CARK基因的过表达能显著地抑制AngII引起的心肌细胞体积的增大。
给予体外培养的心肌细胞一定量的TNFα刺激后,心肌细胞中NFκB-p65亚基的磷酸化水平明显增加;用表达CARK基因或空载体的腺病毒感染心肌细胞,再用25ng/ml的TNFα刺激30分钟后,发现CARK基因的过表达能明显抑制NFκB-p65亚基的磷酸化水平;而据报道心肌细胞中NF-κB活性的降低可以抑制心肌细胞的肥大反应。
肥厚性刺激因子AngII能促进原代培养的心肌细胞中NFκB亚基的核转位并提高其转录活性,在此过程中NFκB的激活依赖于IκBα的降解增加。本发明中,将表达CARK基因的真核表达载体与2×NFκB-Luciferase报告载体及内参pRL-CMV共转染心肌细胞后,发现与转染空载体组比较,转染CARK基因组的NFκB-荧光素酶的活性下降了13%,(p>0.05)。MEKK(有丝分裂原激活蛋白激酶激酶,与cark无关,但可以活化NFkB系统,在本试验中作为阳性对照)可以激活IKKα(NF-κB抑制蛋白激酶α)和IKKβ(NF-κB抑制蛋白激酶β),进而磷酸化IκBα,促进NF-κB亚基进入细胞核调节一系列下游基因的转录。向心肌细胞中转染表达MEKK的质粒后,可明显激活NFκB-荧光素酶的活性,其活性增加了7.74倍(p<0.05);当将MEKK分别与空载体或CARK表达载体共转染心肌细胞时,与转染空载体组比较,转染CARK基因组的NFκB-荧光素酶的活性下降了45%(p<0.05)。为了进一步验证上述结果,本研究又用AngII刺激经Ad-CARK腺病毒或Ad-Track腺病毒感染的心肌细胞,通过使用特异性的抗磷酸化p65抗体、抗p65抗体和抗IκBα抗体检测发现,CARK抑制了p65的磷酸化及IκBα的降解。以上结果说明,CARK基因能抑制由于不同刺激因素引起的NFκB的活化,而且这个抑制反应是通过阻碍IκBα的降解而实现的。
二、一种抑制心肌肥厚的药物,其有效成分为含有CARK基因的载体。
所述载体可以是原核载体也可以是真核载体;可以是裸体质粒、腺病毒(Adenovirus)、腺相关病毒(Adeno-Associated Virus,AAV)、逆转录病毒(Retrovirus和Lentivirus)等基因治疗载体。这些载体均实现了商业化,可以方便地购得,使用其进行基因工程操作属于本领域通用技术。
所述载体内含有至少一个拷贝正常的CARK基因,具有抑制心肌细胞肥大的的作用。
所述抑制心肌肥厚的药物为携带有CARK基因的腺病毒载体溶液,溶剂为磷酸盐缓冲液(1×PBS),病毒浓度为1012病毒颗粒/毫升。
三、利用转基因小鼠模型研究CARK基因抑制心肌肥厚的功能
本发明用显微注射法构建了含CARK基因的C57转基因小鼠动物模型,founder代经PCR和Southern Blot方法鉴定阳性后传代成功。Northern blot表明,与同窝阴性鼠相比,CARK基因在转基因阳性鼠心脏内的表达显著升高,且特异性强,在转基因阳性鼠的肺、肾、肝、脾、脑等组织均未检测到CARK基因表达。当小鼠受到AngII持续刺激两周后,阴性刺激组中雄鼠的心脏显著肥厚,与阴性对照组相比,小鼠心脏重量增加极为显著(P=0.002),心脏体重比的增加为极显著(P=0.001)。转基因阳性雄鼠在AngII刺激后,心脏重量和心脏体重比亦稍有增加,但增加幅度远小于阴性刺激组,两组之间差异显著,证明CARK基因能够显著抑制由AngII途径引起的心肌肥厚。
本发明所述的含有CARK基因的抑制心肌细胞肥大药物,可用于治疗各种原因引起的心肌肥厚:包括左心室和/或右心室不对称性的肥厚、室间隔和心尖肥厚,伴有心律失常、心绞痛、呼吸困难并最终导致猝死。
本发明的有益效果是:本发明以原代培养的心肌细胞作为靶细胞,腺病毒载体介导,验证CARK基因在体外对心肌细胞肥大的抑制作用。通过细胞学、体外实验证实,其心肌细胞肥大的抑制作用非常明显,且毒副作用低,致病性小。本发明又通过建立CARK转基因小鼠动物模型,在动物体内验证了CARK基因抑制心肌肥厚,改善心功能的作用。我们探索了腺病毒介导和利用显微注射转基因技术使CARK基因在心肌细胞特异性高表达治疗心肌肥厚的可行性,为心肌肥厚的基因治疗提供候选基因,并为心肌肥厚基因治疗的临床前研究提供体外和动物模型体内实验的依据。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明,并非对本发明的限制,凡依照本发明公开的内容进行的本领域的等同替换,均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1为CARK基因的全长编码序列的扩增图谱。
图2为真核表达载体pCMV-CARK酶切鉴定图谱。
图3为原代培养的心肌细胞的鉴定图谱。
图4为2.6kb Nppa-Promoter荧光素酶活性分析图谱。
图5为NFκB-荧光素酶活性分析图谱。
图6为重组腺病毒载体的PacI酶切鉴定图谱。
图7为重组腺病毒的PCR鉴定图谱。
图8为重组腺病毒在293A细胞系中的包装结果图谱,其中(a)为转染后2天;(b)为转染后5天。
图9为重组腺病毒感染心肌细胞的结果图谱,其中(a)为含CARK基因的腺病毒感染心肌细胞;(b)为空载体腺病毒感染心肌细胞。
图10为通过共聚焦显微镜观察CARK基因对心肌细胞形态大小的影响图。
图11为蛋白印记法检测Ad-CARK对心肌细胞内NFκB-p65亚基活性的影响结果图谱。
图12为蛋白印记法检测Ad-CARK对心肌细胞内IκB含量的影响结果图谱。
图13为转基因founder代鼠southern blot检测图,EcoRI酶切转基因鼠全基因组DNA,以转基因载体EcoRI、HandIII双酶切产物为探针进行杂交,根据条带的亮度定拷贝数。
具体实施方式
实施例1.CARK基因在心肌细胞中对ANF表达及对NFκB核结合活性的影响
一.材料
(一)生物材料:1~3天Sprague-Dawley乳鼠(购自北京大学医学部实验动物研究所)。
(二)工具酶及常用试剂盒:血管紧张素II(AngII)、胰酶(1∶250)、青霉素、链霉素、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine,Brdu)、Phalloidin-TRITC购自SIGMA公司;Lipofectamine 2000(LF2000)、DMEM、Opti-MEM I、Fetal Bovine Serum购自Invitrogen公司;2.6kb Nppa promoter-luciferase载体、内参pRL-CMV及Dual-luciferaseReporter Assay试剂盒购自Promega公司;EndoFree Plasmid Maxi Kit购自QIAGEN公司。2×NFκB-Luciferase报告载体购自Stratagene公司,pCMV-MYC购自Clontech公司。
二.方法
(一)从人心脏cDNA文库中获得CARK全长CDS序列
1.以下列引物从人心脏cDNA文库中扩增CARK基因cDNA:
上游引物:5’-AACTGAATTCAAATGGGAAATTATAAATCTAG-3’,
下游引物:5’-CCGACTCGAGTCAGCTGCTGTCCTCAAAG-3’。
2.PCR(聚合酶链式扩增反应)体系,见下表:
表1
PCR引物(5pmol/μl) 各1μl
10×Pyrobest聚合酶缓冲液 5μl
2mM dNTP混合液 2μl
模板cDNA 1μl
Pyrobest DNA聚合酶(5U/μl) 0.5μl
ddH2O 39.5μl
PCR参数:
94℃ 5分钟
72℃ 10分钟
3.PCR产物纯化:按照DNA片断回收试剂盒(MARLIGEN公司)说明书操作。
4.经1%琼脂糖凝胶电泳后,如图1所示PCR扩增的产物大小为2.5kb,经测序验正无误。
5.将纯化产物连接入T Easy载体中:按照pGEM-T Easy Vector System试剂盒(Promega公司)说明书操作。
(二)构建真核表达载体
1.设计含特异性限制性酶切位点的引物,PCR扩增CARK基因的全长编码序列:
上游引物(EcoRI)5’-AACTGAATTCAAATGGGAAATTATAAATCTAG-3’,
下游引物(XhoI)5’-CCGACTCGAGTCAGCTGCTGTCCTCAAAG-3’。
2.PCR反应体系,见下表:
表2
Pyrobest DNA聚合酶(5U/μl) 0.5μl
10×缓冲液 5μl
dNTP(2mM) 4μl
引物(5pmol/μl) 2μl each
模板 0.5μl
ddH2O To 50μl
PCR参数:
94℃ 5分钟
72℃ 10分钟
3.将目的片断与载体连接:
(1)为增加连接效率,首先将载体片断去磷酸化,以减少载体自连的可能性。具体反应及反应体系如下:
表3
DNA(200ng) 20μl
10×碱性磷酸酶缓冲液 5μl
碱性磷酸酶(30u/μl) 0.5μl
ddH2O 24.5μl
37℃水浴30分钟,75℃10分钟灭活,酚/氯仿抽提,-20℃乙醇沉淀1小时。
(2)连接反应:
表4
10×T4 DNA连接酶缓冲液 2.5μl
DNA片断(50ng) 2μl
Vector片断(100ng) 6μl
T4 DNA连接酶 1μl
ddH2O 13.5μl
16℃连接过夜。
(3)取2μl连接产物与DH5α感受态细胞混匀,冰浴30分钟,42℃热激90秒,再冰浴3~5分钟,在无抗的LB培养基中于37℃振荡复苏1小时,取适量菌液铺板(50μg/μl Km+),37℃培养12~16小时。
(4)少量提取质粒DNA:按照Plasmid Plasmid Mini Kit(QIAGEN公司)说明书操作。EcoRI/XhoI双酶切及测序验证,测序结果正确。结果如图2所示,双酶切后得到一个长2.5kb的片断(CARK基因)和一个长3.8kb的片断(pCMV-MYC载体)。
(三)乳鼠心肌细胞原代培养
取1~3天龄的Sprague-Dawley大鼠,在无菌条件下开胸取出心脏,立即置入4℃DMEM培养基中剪取心室肌,充分洗净残血,剪成约1mm3大小的碎块,弃去DMEM培养基液,然后将碎块小心吸入50ml的无菌离心管中,加入0.8%胰蛋白酶8ml左右,置37℃恒温水浴箱中,震荡8分钟;再弃去首次的消化悬液(主要含血细胞),加入胰蛋白酶消化液消化8分钟,如此重复,直至组织块消失。分别收集每次消化悬液,加等量含10%小牛血清DMEM培养液终止消化,离心(1,000rpm,5分钟),弃上清,再加入15ml含10%小牛血清DMEM培养液,用吸管轻轻吹散沉淀细胞,将细胞悬液用300目的无菌滤网过滤至T75培养瓶中,置37℃、5%CO2培养箱内,根据心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同,差速贴壁1.5小时,分别获得心肌细胞和成纤维细胞。加入DMEM/F12(1∶1)培养基,含10%小牛血清以及0.1mmol/L Brdu(5溴,2脱氧尿嘧啶),以抑制成纤维细胞的增殖。在倒置相差显微镜下动态观察细胞生长情况。
(四)原代培养心肌细胞的鉴定
用phalloidin-TRITC(SIGMA公司)标记心肌结构:将心肌细胞接种于盖玻片上;PBS洗涤细胞三次;4%多聚甲醛固定10分钟;冷丙酮脱水10分钟,0.1%Triton-X100 PBS透化处理,PBS洗涤细胞;50μg/ml荧光染料室温染色40分钟;PBS洗涤三次,封片;荧光显微镜观察,拍照。图3为40倍荧光显微镜下的原代培养的心肌细胞,新生SD大鼠心室细胞,初呈圆形;数小时后心肌细胞贴壁生长,逐渐伸展为短柱状及棒状;24h后少许心肌细胞搏动,细胞展平呈不规则形;48h后心肌细胞呈自聚集现象,且进行同步搏动。Phalloidin(鬼笔环肽)能特异性地与微丝结合,它与荧光染料TRITC(四甲基异硫氰酸罗丹明)耦联后,在荧光显微镜下能清晰的显示细胞结构,通过观察细胞结构能较容易的区别心肌细胞与其他细胞。如图3所示,本试验所培养的心肌细胞相对较纯,能应用于实验研究。
(五)大量提取无内毒素的质粒DNA
挑单克隆菌落于5ml LB中(kana+),37℃、300rpm振摇8小时,按1∶500的比例稀释至100ml,37℃,300rpm振摇12~16小时;6,000rpm,4℃离心15分钟,收获细菌,倒尽上清;将细菌重悬于10ml Buffer P1(含RNase A 100μg/ml),加10ml Buffer P2,轻轻颠倒混匀4~6次,室温放5分钟。准备QIAfilter Cartridge:把盖放到QIAfilter MaxiCartridge上,并将Cartridge放在一管上;加10ml预冷的Buffer P3,轻轻颠倒混匀4~6次,将裂解液移入QIAfilter Cartridge中,室温放置10分钟,过滤至50ml管中;加2.5ml Buffer ER,颠倒混匀10次,放冰上30分钟;(以下操作在超净台中操作)用10mlBuffer QBT平衡QIAGEN-tip500,将过滤后的裂解液加入tip中,使其自然流下,加30mlBuffer QC洗QIAGEN-tip两次,用15mlBuffer QN洗脱DNA,并用无菌管收集;加10.5ml(0.7V)异丙醇沉淀DNA,混匀,11,000rpm,4℃离心30分钟;用5ml Endotoxin-free的70%乙醇洗DNA沉淀,11,000rpm离心10分钟,弃上清,空气中干燥;重溶于endotoxin-free的TE中。
(六)心肌细胞转染
分别用250μl Opti-MEM I稀释4μg DNA和10μl Lipofectamine 2000,室温放置5分钟;将前两者混合,室温放置20分钟;用生理盐水洗涤细胞,加入1.5ml无抗含10%小牛血清的DMEM培养基;20分钟后,向混合液中加500μl无抗含10%小牛血清的DMEM培养基,混匀后加入细胞中,置37℃、5%CO2培养箱内12~16小时。
(七)荧光素酶分析
用脂质体Lipofectamine 2000,分别将2×NFκB-Luciferase报告载体或2.6kb Nppapromoter-luciferase报告载体与pCMV-MYC-CARK(具体过程见前面第二部分真核表达载体的构建)或pCMV-MYC空载体,以及内参pRL-CMV共转染入原代培养的心肌细胞,转染后,用无血清的DMEM/F12(1∶1)联合培养基培养心肌细胞,同时在部分心肌细胞内加入100nM的AngII。24小时后,弃培养基,用PBS洗一次,去掉PBS;加300μl1×PLB,在摇床上室温孵育15分钟,使细胞完全裂解;将裂解液移入1.5ml离心管中离心,去掉沉淀;取100μl LAR II及20μl裂解液至荧光管中,混匀;测量萤火虫荧光素酶的活性;再加入100μl Stop & Gol Reagent,测量海肾荧光素酶的活性。
三.实验结果
图4为2.6kb Nppa-Promoter荧光素酶活性分析图谱。与转染空载体组比较,转染CARK基因组的2.6kb Nppa promoter-荧光素酶的活性下降了19%,(p>0.05);当给予正常心肌细胞以100nM AngII的刺激后,2.6kb Nppa promoter-荧光素酶的活性明显增加了2.39倍(p<0.05)。同样地,当分别给转染了空载体和CARK的细胞以100nM AngII的刺激后,发现转染了CARK基因的细胞其荧光素酶的活性显著性的下降了44.7%(p<0.05)。此结果说明,CARK基因的过表达能显著地降低ANF的表达水平。
图5为NFκB-荧光素酶活性分析图。将表达CARK基因的真核表达载体与2×NFκB-Luciferase报告载体及内参pRL-CMV共转染心肌细胞后,发现与转染空载体组比较,转染CARK基因组的NFκB-荧光素酶的活性下降了13%,(p>0.05)。MEKK可以激活IKKα和IKKβ,进而磷酸化IκBα,促进NF-κB亚基进入细胞核调节一系列下游基因的转录。向心肌细胞中转染表达MEKK的质粒后,可明显激活NFκB-荧光素酶的活性,其活性增加了7.74倍(p<0.05);当将MEKK分别与空载体或CARK表达载体共转染心肌细胞时,与转染空载体组比较,转染CARK基因组的NFκB-荧光素酶的活性下降了45%(p<0.05)。
实施例2.重组腺病毒载体的构建以及重组病毒的获得
为了进一步证实CARK基因对心肌肥厚的抑制作用,我们构建了携带CARK基因的重组腺病毒载体pAd-CMV-CARK,以及另一腺病毒空载体pAd-CMV-GFP作为负对照。载体构建好之后,我们利用293细胞包装、扩增出大量的重组腺病毒,并将所得的病毒进行滴度的测定。
一.材料
(一)生物材料
1.腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV(购自QUANTUM公司)
2.腺病毒骨架载体pAdeasy-1(购自QUANTUM公司)
3.大肠杆菌(E.Coli)BJ5183(本实验室保存,可购自Stratagene:200154)
4.宿主菌E.Coli DH10B(本实验室保存,可购自Invitrogen:10356038)
5.293细胞系(购自协和医大基础所细胞中心,还可购自ATCC:CRL-1573)
(二)工具酶及常用试剂盒:各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、RNase A等均为TaKaRa或NEB公司产品。转染试剂Lipofectamine2000购自GibcoBRL,PCR产物回收纯化试剂盒购自鼎国。EndoFree Plasmid Maxi Kit购自QIAGEN公司。其余各种试剂为进口或国产分析纯试剂。
(三)按照常规方法配制下列试剂并灭菌:磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)、DMEM高糖培养基、F12培养基、LB培养基、溴化乙锭(EB)溶液(10mg/ml)、TE缓冲液。
二.方法
(一)将目的基因CARK克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中:
用XhoI & KpnI双酶切质粒pCMV-CARK(前面(二)有具体步骤)和pAdTrack-CMV,切胶回收。将回收片断连接,转化大肠杆菌DH5α,酶切筛选得到pAd-CMV-CARK。
(二)在大肠杆菌BJ5183中通过同源重组产生腺病毒质粒:
1.用QIAGEN试剂盒(EndoFree Plasmid Maxi Kit)纯化pAd-CMV-CARK,pAdTrack-CMV以及腺病毒骨架载体pAdeasy-1。
2.BJ5183感受态细菌的制备:挑取新鲜单克隆于3ml LB(含30μg/ml链霉素)中,37℃,300rpm,12小时;按1∶500稀释于250ml LB中(含30μg/ml链霉素),37℃,300rpm,4-6小时,直至OD550=0.6;将菌液收集于50ml离心管中,冰浴2-4hr;4℃,3000rpm离心10分钟;弃上清,将细菌沉淀悬浮于250ml无菌的、冰预冷的WB溶液(甘油∶水=1∶10)中,于4℃,3000rpm离心10分钟;弃上清,重复洗涤二次;小心吸弃大部分上清,剩约5ml,将细菌悬液转移至50ml离心管,4℃,3000rpm离心10min;再次倒掉大部分上清,只留0.5ml上清;将细菌悬液分装于在-80℃预冷的离心管中,每管约20μl,保存于-80℃。
3.电击共转化入大肠杆菌BJ5183:重组穿梭质粒(pAd-CMV-CARK和pAdTrack-CMV)分别用PmeI单酶切,使之线性化,纯化回收酶切产物;0.1μg pAdEasy-1与1.0μg线性化穿梭质粒混合,高压电转化入BJ5183感受态细菌中(电转条件:2500V,200Ohms,25mFD);电转后立即将1ml LB培养液加入细菌中,37℃培养30分钟;取适量细菌涂在含50μg/ml卡那霉素的培养板上,37℃培养16-20小时;挑选卡那霉素抗性克隆,碱裂解法小量提取质粒DNA,用0.8%琼脂糖凝胶电泳初步分析,并以PacI酶切进行鉴定(图6),阳性克隆经测序验证;将所得的阳性重组腺病毒质粒与上述同样条件电转化入宿主菌DH10B中。这样即得到两个重组腺病毒质粒:pAd-CMV-CARK和pAd-CMV-GFP。
(三)在293细胞系中包装出腺病毒
1.腺病毒质粒的线性化
取重组腺病毒质粒8μg,用PacI酶切(1U/1μg DNA),37℃,2小时完全消化以切去ori和kana抗性基因等质粒元件,并暴露其反转末端重复序列(ITR)。酶切产物经酚/氯仿抽提,乙醇沉淀,溶于无菌水中。
2.转染293细胞及病毒的包装:转染前24小时于每T-25cm2培养瓶中接种1×106细胞,转染时细胞密度为50-70%;转染时,将含有4μg重组腺病毒质粒(线性化好的)和10μl的脂质体(Lipofectamine2000,Gibcol)分别加到1.5ml的离心管中,然后加入500μl DMEM(无抗生素,无血清),两种液体混合,室温放置20分钟;同时吸掉293细胞的旧培养液,用4ml的无血清,无抗生素的DMEM培养液洗1-2次,加入2-3mlDMEM(无抗生素,无血清),于37℃,5%CO2,条件下培养10分钟;将脂质体-DNA混合物加入上述293细胞中,轻轻混匀,于37℃,5%CO2,培养;4-6小时后,吸走转染液,换入5ml的完全DMEM(10%FBS,100单位/ml的青霉素,100单位/ml的链霉素),于37℃,5%CO2,继续培养;转染后7-10天,大约30-50%的细胞已经漂起,用吸管吹下细胞转入50ml离心管中;将细胞冻于-70℃,30分钟,然后放入37℃水浴中融化,待半融化状态时,涡旋震荡2分钟。重复此步3次(一共4次);1000-2000rpm,离心10分钟;分装上清(此即为包装好的病毒),保存于-70℃备用。
(四)大规模扩增以得到高滴度的病毒
1.首次扩增的存储病毒的获得:用上述收集的病毒的20-30%去感染1瓶T-25cm2培养瓶的293细胞(50-70%汇合),在感染后3-4天,当大部分的细胞脱落时,收集病毒;依上述步骤(-70℃/37℃/Vortex)收集病毒上清及细胞,每瓶T-25cm2培养瓶收获的病毒溶于1-2mlPBS中,此时至少有107感染性病毒颗粒/ml;
2.准备下一步大规模扩增病毒
每次扩增之前,都应该作MOI试验以确定下一步扩增所需的病毒用量。
MOI试验:24孔板培养293细胞,待70-80%融合,移去培养基,每孔加入以新鲜培养基梯度稀释的病毒上清,留一孔作对照。感染3小时,其间隔30分钟轻摇一次。感染后移去病毒,加0.5ml完全培养基,37℃,5%CO2,继续培养。感染后3天产生完全CPE(细胞毒性反应)所对应孔的MOI即相当于10-20。
除每次的规模有所不同外,每轮扩增的方法基本相同。另外第一次大规模扩增的MOI值用10,随后几轮用25。
3.腺病毒的大规模扩增:用10ml完全DMEM于T-75cm2的培养瓶中种植3×106个293细胞,使其在感染时约80%汇合。从75cm2的培养瓶中移去培养基,小心将病毒上清(MOI=10-20)加到细胞表面,注意不要破坏细胞层,交叉方向慢摇培养皿3次以铺展混合物;于5%CO2、37℃孵育90分钟,其间每15分钟轻摇一次培养瓶。补加9ml的完全DMEM。感染后通常于CO2孵箱37℃孵育3-4天,当全部的细胞卷起,约一半细胞脱落时,准备收集病毒。按前面的方法收集病毒上清,保存于-70℃。
(五)病毒滴度测定
进行细胞实验需要定量的病毒浓度指导,因此在这之前必须测定病毒的确切滴度。GFP法(适用于带GFP的腺病毒滴度测定):
将病毒储存液作不同比例的稀释,取500μl稀释液加至T-25cm2培养瓶培养的293细胞中,于37℃吸附30分钟,换新鲜培养基继续培养36小时,在荧光显微镜下计数GFP阳性细胞数,按病毒滴度=GFP阳性细胞数×病毒上清稀释倍数/0.5ml=pfu/ml计算。
(六)重组腺病毒CARK基因的PCR鉴定
1.病毒基因组DNA提取
收集正常及2种病毒感染后发生病变的各组293细胞,弃上清,加入2ml PBS,刮下细胞,混匀,冻融细胞4次,于4℃ 10000rpm离心10分钟,取上清,加入200μl蛋白酶K(5mg/ml),并加入2ml SET裂解液(1%SDS,10mM EDTA,20mM Tris HClpH8.0),56℃消化2小时,12000rpm离心10分钟,取上清,等体积的酚/氯仿抽提一次,无水乙醇沉淀,20μl TE溶解。
2.PCR鉴定
以上述病毒基因组DNA为模板,以扩增CARK基因的引物进行扩增。
PCR体系: 表5
10×缓冲液 1.0μl
脱氧核糖核酸(dNTP) 0.2μl
上游引物(5pM) 0.2μl
下游引物(5pM) 0.2μl
Taq酶(5U/μl) 0.2μl
模板 0.2μl
无菌水 8.0μl
PCR参数:
94℃ 5分钟
72℃ 10分钟
PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。
三.实验结果:
1.重组腺病毒载体的构建及酶切鉴定
腺病毒骨架载体pAdeasy-1与带CARK基因的穿梭载体pAd-CMV-CARK以及作为阴性对照的空载体pAd-CMV-GFP共转化大肠杆菌BJ5183,在同源重组相关酶的作用下发生同源重组。穿梭载体的右臂与骨架载体的右臂均含有Ad5病毒基因组3524bp-5772bp的序列,可介导二者的同源重组;而穿梭载体的左臂与骨架载体的左臂共有腺病毒Ad5的右端34931-35935序列,同源重组可在此区发生(PacI酶切出35kb和3.0kb片段),也可在其共有的质粒复制原点ori处发生(PacI酶切出35kb和4.5kb片段)。PacI酶切鉴定构建好的pAd-CARK和pAd-GFP质粒,发现属于第二种情况,如图7所示,其中M.为Marker(DL15000,TaKaRa)1为pAd-CARK+PacI 2为pAd-GFP+PacI 3为pAd-CARK 4为pAd-GFP。
2.重组腺病毒的制备及鉴定
Ad-CARK及Ad-GFP重组腺病毒,经293细胞包装、扩增并纯化后制备成病毒贮存液,各重组腺病毒的滴度测定为Ad-CARK:1.0×1011pfu/mL,Ad-GFP:5.0×1010pfu/mL。提取各重组腺病毒DNA,以CARP基因的引物进行PCR鉴定,结果如图8所示,其中M为Marker(DL2000,TaKaRa),1、2为Ad-CARK,3、4为Ad-GFP(Ad空载体重组腺病毒)。Ad-CARP可见534bp的阳性扩增条带,而Ad-GFP没有条带。
实施例3.制备治疗心肌肥厚的药物
用磷酸盐缓冲液(1×PBS)将实施例2得到的病毒溶液配制成浓度为1012病毒颗粒/毫升的溶液,即得本发明所述的含有抑制心肌肥大基因CARK基因的药物。该药物的使用方法同已有的基因治疗药物,如注射给药,其在生物体内将表达CARK基因产物,在分子水平阻碍心肌肥厚成因的发生。因此,该药物可用于治疗各种原因引起的心肌肥厚。
实施例4.用腺病毒将CARK基因导入心肌细胞内观察其对心肌细胞体积的影响
一.材料
所用试剂同前。
二.方法
(一)腺病毒感染心肌细胞,表达外源蛋白:
原代培养的心肌细胞,接种于六孔板中,48小时后,心肌细胞形态正常,跳动良好。换无血清的DMEM/F12(1∶1)混合培养基,37℃培养3小时,加入约10MOI的腺病毒,继续培养24~48小时,至90%以上的心肌细胞都表达绿色荧光蛋白。如图9所示。
分组分别加入刺激因子:a.心肌细胞感染含空载体的腺病毒;b.心肌细胞感染含CARK基因的腺病毒;c.(a)组细胞中加入100nM的AngII作用72小时;d.(b)组细胞中加入100nM的AngII作用72小时。
(二)用共聚焦显微镜观察细胞大小(放大倍数×400)
观察发现,感染了CARK基因的心肌细胞其体积明显小于对照组。如图10所示。
实施例5.蛋白印记法分析CARK对心肌细胞内NFκB-p65亚基活性的影响
一.材料
p65和phospho-p65抗体购自Cell Signal Technology公司;IκBα抗体购自Santa Cluz公司。其他试剂同前。
二.方法
(一)腺病毒感染心肌细胞,表达外源蛋白:
原代培养心肌细胞,接种于T25小瓶中,48小时后,心肌细胞形态正常,跳动良好。换无血清的DMEM/F12(1∶1)混合培养基,37℃培养3小时,加入约10MOI的腺病毒,继续培养24~48小时,至90%以上的心肌细胞都表达绿色荧光蛋白。
分组分别加入刺激因子:a.正常心肌细胞;b.正常培养的心肌细胞加入100nM的AngII作用30分钟;c.正常培养的心肌细胞加入25ng/ml的TNFα作用30分钟;d.心肌细胞感染含CARK基因的腺病毒;e.心肌细胞感染含空载体的腺病毒。
(d)组细胞中加入100nM的AngII作用30分钟;(e)组细胞中加入100nM的AngII作用30分钟;(d)组细胞中加入25ng/ml的TNFα作用30分钟;(e)组细胞中加入25ng/ml的TNFα作用30分钟。
(二)蛋白印迹法检测细胞内蛋白表达及磷酸化程度的改变
细胞内总蛋白的提取:倒出培养基,加PBS洗一遍,加入0.125%胰酶消化若干分钟;1,000rpm离心,弃上清,用冰冷的PBS重悬;1,000rpm离心,弃上清,加入裂解液100μl/T25培养瓶;冰上放置20~30分钟;4℃,12,000rpm离心5分钟,取上清于另一管中,保存于-20℃。
Lowery法检测细胞总蛋白浓度:准确称取10mg牛血清白蛋白,加蒸馏水定容至100ml。取10支试管分别编为1~10号,分别加入上述标准蛋白溶液0、10、20、40、60、80、100、140、180、200μl,并都用蒸馏水补足200μl。各试管加入已混好的2ml溶液C(无水碳酸钠20克、氢氧化钠4克定容至1L水中;硫酸铜0.2克溶于20ml水中;酒石酸钾钠0.4克溶于20ml水中;测定当天将这三种溶液按100∶1∶1的体积混合,混合后30分钟使用。),立即混匀,室温放置10分钟。各试管加入200μl溶液D(等体积的Folin phenol与水混匀),立即混匀,室温放置30分钟。各试管加入100μl 2.5%的SDS终止反应,在分光光度计上,以1号为参比,测定各管样品在670nm的吸光度值,以蛋白浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线。取按一定比例稀释的样品溶液,按上述方法同时测定670nm的吸光度值,代入上述标准曲线,计算蛋白浓度。
SDS-PAGE电泳分离细胞总蛋白:取50μg细胞总蛋白,10%SDS-PAGE胶100V电泳1.5小时,分离细胞总蛋白。
蛋白质的电转移:剪6块3MM滤纸和一块硝酸纤维素膜,其大小应与SDS-凝胶的大小相同;将剪好的滤纸及硝酸纤维素膜在转移缓冲液中浸泡3~5分钟;按照3层滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、3层滤纸的顺序依次放入电转仪内,硝酸纤维素膜一侧靠正极,胶一侧靠负极;接通电源,按照0.65mA/cm2的条件电转移2小时,转移结束后,用铅笔在膜上做好标记;将硝酸纤维素膜浸泡在封闭液中,室温振摇1小时;封闭结束后,弃去封闭液,加入按一定比例稀释的一抗,4℃振摇过夜;弃去反应液,用TBST(Tris盐缓冲液)洗三遍,每次8分钟;加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗溶液,室温振摇1小时;弃去反应液,用TBST洗三遍,每次8分钟;ECL(化学发光试剂)显色:将硝酸纤维素膜用滤纸吸干,加入显色液,放置1分钟,吸干显色液,放入暗盒中,X光片显色。
三.实验结果
本研究用表达CARK基因的腺病毒和含空载体的腺病毒分别感染心肌细胞,48小时后,部分细胞用AngII或TNFα刺激30分钟,然后收集蛋白,经用抗p65和抗磷酸化p65抗体检测后发现:(1)正常心肌细胞内,p65以非磷酸化的形态与IκB结合,当心肌细胞受到外界刺激时,如AngII/TNFα,p65亚基被磷酸化,入核启动一系列基因的转录图11(a);(2)用表达CARK基因的腺病毒和含空载体的腺病毒分别感染心肌细胞后,发现CARK基因能抑制NFκBp65亚基的磷酸化图11(b);(3)腺病毒感染心肌细胞后,在给予心肌细胞一定量的刺激后,包括100nM的AngII或25ng/ml的TNFα,如图11(c)、(d)所示,CARK明显地抑制了p65亚基的磷酸化程度。(4)为了进一步揭示CARK影响NFκB活化的机制,本研究用抗IκBα的特异性抗体检测了细胞内IκB含量的变化,同时用抗α-actin的抗体作为内参,发现CARK能抑制IκBα的降解(图12)。
实施例6.用转基因小鼠在体内研究CARK基因抑制心肌肥厚的功能
一.材料和仪器
Pyrobest高保真聚合酶和工具酶购自TaKaRa公司;转基因C57小鼠由中国科学院发育生物所用显微注射法构建;Trizol试剂购自Invitrogen公司;AngiotensinII、Avertin购自SIGMA公司;微型渗透压泵购自Alza公司;多导生理仪购自Powerlab Adinstruments公司;其他试剂同前。
二.方法:
(一)转基因载体构建及转基因小鼠模型获得
PCR法扩增人的CARK全长CDS序列,SalI和HindIII双酶切后亚克隆入转基因载体pBSII-alpha-MHC-hGH,得到pBSII-alpha-MHC-CARK-hGH。CARK的CDS上游为5.8kb的α肌球蛋白重链的启动子序列,下游为人生长激素polyA序列。NotI酶切使转基因载体线性化,请中国科学院发育生物所用显微注射法构建C57转基因小鼠模型。经PCR法和Southern blot法检测,共计获得的founder代转基因阳性鼠4只。根据所含CARK基因CDS拷贝数的不相同,将这四只founder代鼠依次编号为TG1,TG2,TG3和TG4。其中,仅有TG2传代成功。以下实验均在TG2这一支中进行。
(二)转基因表达
α-MHC-promoter指导CARK基因在小鼠心肌细胞特异性高表达。为检测CARK转基因的表达情况,提取小鼠心、肺、肾、肝、脾、脑等组织的total RNA,进行Northernblot检测。Trizol一步法提取组织中的total RNA,分光光度计定量,每种组织取30ugRNA,MOPS胶电泳分离,湿转至尼龙膜。以350bp长的CARK CDS片断作为探针模板,450bp长的GAPDH片断作为内参模板,随机引物法合成α-32P标记探针,68℃杂交反应2小时后,1xSSC/0.5xSDS室温洗膜30分钟,0.5xSSC/0.1xSDS 68℃洗膜两次,每次20分钟,压X关片,-70℃放射自显影12~24小时。CARK探针模板引物:上游引物5’-ATGGCAAGAGCATTGACCTAGTC,下游引物5’-GGATGATTGAGCTGGCAGAGA,GAPDH探针模板引物:上游5’-AGCCAAACGGGTCATCATCT,下游5’-GCCTGCTTCACCACCTTCTT
(三)动物实验
为检测CARK基因的心脏特异性高表达是否可以在体内抑制或减缓AngII刺激引起的小鼠心肌肥厚,我们对12周龄的转基因阳性雄鼠及其同窝阴性雄鼠进行了刺激实验。腹腔注射225ug/g Avertin(Aldrich)麻醉小鼠,皮下植入含有AngII(Sigma)或PBS(对照)的微型渗透压泵(2002型,Alza),使AngII以432ug/kg/day的速度持续缓释2周。2周后,颈椎脱臼法处死所有小鼠,称重,解剖取出心脏,去除主动脉后称重心脏,计算心脏体重比。
(四)心功能检测
在处死小鼠前用多导生理仪(Powerlab,Adinstruments)对小鼠的左心室功能进行检测。腹腔注射225ug/g Avertin(Aldrich)麻醉小鼠后,在记录心电图的同时下,采用闭胸型插管法,从右颈动脉插管入左心室,分别记录主动脉压(AP),左室舒张压(LVEDP),左室收缩压(LVESP),并计算dp/dtmax和dp/dtmin。每只小鼠测量三个周期,每个周期间隔5分钟,计算均值。然后颈椎脱臼处死、取出心脏、称重、液氮冻存。同时取肺、脾、肝、肾等部分组织用于石蜡切片。
(五)统计
数据以mean±SE表示,采用非配对t检验进行统计,P<0.05为有显著性差异,P<0.01为有极显著性差异。
三.实验结果:
Southern Blot结果如图13所示,传代成功的TG2在四只founder代鼠中所含CARK基因拷贝数居中。其他三只founder代鼠均未能得到转基因阳性后代,疑似可能都为嵌合体。
CARK转基因阳性鼠出生后发育正常,无明显的病理症状。但与同窝阴性鼠相比,转基因阳性鼠明显瘦小。12周龄时,转基因阳性雄性小鼠的体重(25.625±2.053,n=16)显著轻于同窝雄性阴性鼠(27.286±2.016,n=14,p<0.05)。提示CARK基因在心脏的过表达可能影响了小鼠的发育。
Northern blot表明,与同窝阴性鼠相比,CARK基因在转基因阳性鼠心脏内的表达显著升高,且特异性强,在转基因阳性鼠的肺、肾、肝、脾、脑等组织均未检测到CARK基因表达。
AngII刺激实验的结果如表6所示。AngII持续刺激两周后,阴性刺激组中雄鼠的心脏显著肥厚,于阴性对照组相比,小鼠心脏重量增加极为显著(P=0.002),心脏体重比的增加亦极为显著(P=0.001)。转基因阳性雄鼠在AngII刺激后,心脏重量和心脏体重比亦稍有增加,但增加幅度远小于阴性刺激组,两组之间差异显著。
表6:AngII刺激后小鼠的基本生理和心功能指标
AngII刺激(432ug/kg/day) | PBS对照 | |||
阳性雄鼠(n=3) | 阴性雄鼠(n=5) | 阳性雄鼠(n=4) | 阴性雄鼠(n=5) | |
BW(g) | 26.271±0.45 | 27.95±0.63 | 27.32±1.65 | 26.75±1.36 |
HW(mg) | 141.33±3.93** | 176.40±5.95 | 133.50±11.8 | 133.00±7.48 |
HW/BW | 5.388±0.244* | 6.324±0.271 | 4.863±0.162 | 4.967±0.054 |
本发明以原代培养的心肌细胞作为靶细胞,腺病毒载体介导,验证CARK基因在体外对心肌细胞肥大的抑制作用。通过细胞学、体外实验证实,其心肌细胞肥大的抑制作用非常明显,且毒副作用低,致病性小。本发明又通过建立CARK转基因小鼠动物模型,在动物体内验证了CARK基因抑制心肌肥厚,改善心功能的作用。我们探索了腺病毒介导和利用显微注射转基因技术使CARK基因在心肌细胞特异性高表达治疗心肌肥厚的可行性,为心肌肥厚的基因治疗提供候选基因,并为心肌肥厚基因治疗的临床前研究提供体外和动物模型体内实验的依据。
Claims (10)
1.CARK基因在制备治疗心肌肥厚药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的CARK基因在制备治疗心肌肥厚药物中的应用,其特征在于:所述CARK基因cDNA全长约3,420bp,含一个2,505bp的完整阅读框,可编码835个氨基酸,分子量约为93KDa,定位在一号染色体短臂,N端含有6个锚蛋白重复结构域(ankyrin repeat domain),中间为一酪氨酸激酶结构域。
3.根据权利要求1所述的CARK基因在制备治疗心肌肥厚药物中的应用,其特征在于:所述心肌肥厚是指左心室和/或右心室不对称性的肥厚、室间隔和心尖肥厚,伴有心律失常、心绞痛、呼吸困难并最终导致猝死。
4.一种抑制心肌肥厚的药物,其特征在于:该药物的有效成分为含有CARK基因的载体。
5.根据权利要求4所述的一种抑制心肌肥厚的药物,其特征在于:所述载体为真核载体或原核载体。
6.根据权利要求4所述的一种抑制心肌肥厚的药物,其特征在于:所述载体选自裸体质粒、腺病毒、腺相关病毒或逆转录病毒中的一种。
7.根据权利要求4所述的一种抑制心肌肥厚的药物,其特征在于:所述载体内含有至少一个拷贝正常的CARK基因。
8.根据权利要求4或5或6或7中任何一项所述的一种抑制心肌肥厚的药物,其特征在于:所述病毒浓度为1012个病毒颗粒/毫升。
9.根据权利要求4所述的一种抑制心肌肥厚的药物,其特征在于:所述药物为溶液,还含有生物体可接受的溶剂。
10.根据权利要求7所述的一种抑制心肌肥厚的药物,其特征在于:所述溶剂为磷酸盐缓冲液。
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---|---|---|---|---|
CN102051380A (zh) * | 2009-10-29 | 2011-05-11 | 哈尔滨医科大学 | 一种心律失常动物模型建立的方法 |
CN104998276A (zh) * | 2015-07-07 | 2015-10-28 | 广东药学院 | Scad基因在制备治疗心肌细胞凋亡相关疾病的药物中的应用 |
CN108192922A (zh) * | 2018-01-03 | 2018-06-22 | 李江 | 受磷蛋白基因反义rna重组aav载体、病毒、构建方法及应用 |
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-
2005
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102051380A (zh) * | 2009-10-29 | 2011-05-11 | 哈尔滨医科大学 | 一种心律失常动物模型建立的方法 |
CN104998276A (zh) * | 2015-07-07 | 2015-10-28 | 广东药学院 | Scad基因在制备治疗心肌细胞凋亡相关疾病的药物中的应用 |
CN108192922A (zh) * | 2018-01-03 | 2018-06-22 | 李江 | 受磷蛋白基因反义rna重组aav载体、病毒、构建方法及应用 |
CN108949673A (zh) * | 2018-08-13 | 2018-12-07 | 武汉华联科生物技术有限公司 | 一种大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法 |
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |