CN111705080A - Hbv非人动物模型的构建方法及其应用 - Google Patents

Hbv非人动物模型的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种HBV非人动物模型的构建方法及其应用。包括：构建转入第一融和基因片段和第二融和基因片段的转基因动物，其中：第一融和基因片段含有诱导型反应元件、启动子、入核信号以及位点特异性重组酶，诱导型反应元件能够在诱导剂存在的条件下使得位点特异性重组酶入核表达；第二融和基因片段含有HBV基因和报告基因，报告基因分为两段，分别与HBV基因的N端和C端融合，第二融和基因片段的两端还分别设置有位点特异性重组酶的识别位点，在位点特异性重组酶的作用下，第二融和基因片段能够环化，并使得报告基因的两段融合为完整的活性片段；当转基因动物体内注射诱导剂时，能够产生HBV cccDNA。

Description

HBV非人动物模型的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种HBV非人动物模型的构建方法及其应用。
背景技术
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一种独特的具有逆转录过程的双链DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)。其基因组全长约3.2kb，编码7个功能蛋白：HBV核心抗原(HBcAg)、e抗原(HBeAg)、表面抗原(HBsAg)、聚合酶(pol)和X蛋白(HBx)。病毒在侵染宿主细胞的过程中，会把病毒核酸(RC-DNA)释放在胞质内，进一步在细胞核形成共价闭合环状DNA(cccDNA)或直接整合到宿主基因组中。其中cccDNA是以微染色体的形式存在，指导前基因组RNA(pre-genomic RNA)的合成，通过一系列的表观遗传调控，控制病毒的生命周期(Chen et al.,2015；Seeger and Mason,2015)。
现阶段的临床治疗通常采用核苷类似物(nucleot(s)ide analogs，NAs)和干扰素(interferon，IFN)两种方式，尽管核苷类似物能有效抑制病毒的复制和逆转录过程，但不能清除HBV的慢性感染，主要原因在于共价闭合环状DNA(cccDNA)在肝细胞的长期稳定存在以及缺乏宿主对HBV的免疫应答。另外，对于HBV的研究主要集中在病毒的侵入(Infection)、复制(Replication)以及逆转录(Reverse Transcription)过程，而对于宿主与病毒在维持慢性感染的相互作用以及相应的免疫反应缺乏探索，主要是因为乙肝病毒狭隘的宿主感染范围和组织细胞嗜性，只能在少数的几种生物中感染复制。
目前研究HBV的动物模型，主要分为非人灵长类动物、非灵长类动物和小鼠三大类。黑猩猩(Chimpanzee)和食蟹猴(Mauritius Island，毛里求斯岛)是唯一支持HBV感染的非人灵长类动物。HBV感染黑猩猩人后主要表现为急性病毒肝炎，能诱导与乙型肝炎病人类似的病理和免疫反应，但不能建立慢性感染(Larkin J，Science.1999)。在毛里求斯食蟹猴中，HBV可以建立慢性感染(Dupinay T，Hepatology.2013)，但由于动物伦理的严格要求和成本考虑，非人灵长类动物用于生物医学研究受到限制。此外，树鼩是另一个支持HBV感染的非灵长类动物，其肝脏细胞具有HBV的受体Na+牛磺胆酸盐协同转运多肽(NTCP)(Yan H，Elife.2012)。HBV可以在树鼩建立慢性感染，并诱发肝脏疾病发生。但是，非人灵长类和树鼩HBV动物模型在应用方面受到了许多限制，诸如：妊娠周期长、饲养成本高、资源缺乏等(Brezillon N，Dis Model Mech.2008)。而与之相比较更有优势的是，小鼠作为广泛应用的实验动物模型，具有易获得、经济、易饲养管理的特点，构建模拟HBV感染的小鼠动物模型成为HBV研究领域的重要内容。1995年，Guidotti LG等研究者构建了带有1.3倍HBV基因组长度(HBV1.3×)的转基因小鼠模型，可以产生高水平的HBV病毒(Guidotti LG,J Virol,1995)。但遗憾的是，该小鼠模型无法打破免疫耐受，不能诱导肝炎以及其他相关疾病，只能用于研究病毒的产生。1999年，zhang利用高压注射的体内转染技术构建水动高压力注射小鼠模型，通过从尾静脉快速注射大量裸质粒DNA，导致肝血管内静水压力升高，将使质粒DNA挤进肝细胞(Zhang G,Hum Gene Ther,1999)。该模型避免了基因组整合的问题，但所注射的质粒DNA中含有非HBV病毒基因组的质粒骨架，质粒骨架序列通常会引起较强的免疫反应，造成HBV质粒的快速清除(＜3周)，导致病毒持续时间较短。另外，高压注射效率低，只有5％～10％肝细胞含有HBV基因组，而且小鼠的个体差异较大，这些潜在的风险因素限制其在HBV研究领域的应用(Yang PL,Proc Natl Acad Sci USA.2010)。随后，为了克服这些不利因素，AAV-HBV小鼠模型应运而生。腺相关病毒(AAV)结构简单，转染效率高，而且能够长期在宿主内稳定表达，最重要的是，AAV载体不表达任何AAV病毒蛋白，也不会引起宿主对AAV载体本身的免疫反应。2013年，Dion S等报道了一种基于腺相关病毒血清型2/8(AAV2/8)的AAV-HBV感染小鼠模型(Dion S,J Virol,2013)，结果显示，小鼠血清中HBsAg、HBeAg和HBV DNA病毒学指标可以持续1年以上，在肝脏中没有明显的炎症。但是，由于AAV载体存在特殊的ITR序列结构，这种结构可能是保持AAV载体在体内长期稳定的主要原因，而不是与HBV DNA有关(Zincarelli C,Mol Ther.2008)。因此，利用该模型得到的结果可能存在巨大的误导。不仅如此，上述各种小鼠模型均存在一个最大的缺陷：小鼠肝脏细胞中没有cccDNA的形成，导致模型只能研究HBV病毒蛋白与宿主因子的相互作用，不能反应真正的cccDNA生物学特征。而通过利用人肝细胞置换小鼠肝脏细胞所构建的肝脏人源化小鼠模型不仅支持HBV的感染，也有cccDNA的产生。2001年，Dandri和Mercer DF等将正常人肝细胞移植到Alb-uPA/SCID小鼠中，构建了真正意义上的第一个人源化小鼠模型，该模型可以支持HBV感染，并能完成完整的生命周期(Dandri M,Hepatology,2001；Mercer DF,Nat Med,2001)。但是，该模型的小鼠死亡率高，产率低，移植时间窗窄限制了其运用。2007年，Azuma H等利用乙酰水解酶(FAH)缺失导致的肝损伤构建了Fah-/-/SCID人源化小鼠模型，并在此基础上，构建了重组激活因子2(RAG2)、白介素受体γ(IL2Rγ)双缺失的Fah-/-/Rag-/-/IL2Rr-/-/SCID人源化小鼠模型，移植生存率可达到95％(Azuma H,Nat Biotechnol,2007)。总的来说，上述人源化小鼠模型优势在于可以支持HBV的感染复制，并有cccDNA的产生，但遗憾的是都有相同的一个缺点，即存在免疫缺陷，导致该模型无法研究HBV与宿主免疫反应的相互作用关系，也限制了其在免疫病理机制和疫苗研制等方面的应用。而利用Cre-Loxp策略构建的HBVcccDNA小鼠模型则是一大技术进步，通过高压注射携带双Loxp位点的HBV cccDNA前体质粒DNA，在Cre重组酶的作用下形成只含有一个Loxp位点的环状cccDNA。2018年，Li G等利用Cre转基因小鼠，通过使用腺病毒载体(Ad)递送线性HBV基因组到小鼠肝脏内，通过Cre酶在肝脏细胞内进行重组得到HBV cccDNA。该小鼠模型中，HBV可以持续时长62周以上，并在小鼠肝脏中发现持续的坏死性炎症反应和纤维化。但是，该Cre-Loxp介导的cccDNA小鼠模型会因为细菌来源质粒DNA的强免疫原性、Cre的低效率和双向不间断重组，导致cccDNA体内的稳定性降低而被快速清除，而且HBV不能进行二次感染，不能模拟HBV感染的整个生命周期。
因此，一种非感染的、支持cccDNA长期稳定存在的、具有完整免疫系统的小鼠模型对于cccDNA的研究是具有现实意义的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从转基因小鼠中稳定诱导产生cccDNA并易于检测的方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及一种HBV非人动物模型的构建方法，包括：
构建转入第一融和基因片段和第二融和基因片段的转基因动物，其中：
所述第一融和基因片段含有诱导型反应元件、启动子、入核信号以及位点特异性重组酶，所述诱导型反应元件能够在诱导剂存在的条件下使得所述位点特异性重组酶入核表达；
所述第二融和基因片段含有HBV基因和报告基因，所述报告基因分为两段，分别与所述HBV基因的N端和C端融合，所述第二融和基因片段的两端还分别设置有所述位点特异性重组酶的识别位点，在所述位点特异性重组酶的作用下，所述第二融和基因片段能够环化，并使得所述报告基因的两段融合为完整的活性片段；
当所述转基因动物体内注射所述诱导剂时，能够产生HBV cccDNA。
根据本发明的再一方面，本发明还涉及依照如上所述的方法获得的转基因非人动物在构建HBV感染疾病模型中的应用。
根据本发明的再一方面，本发明还涉及依照如上所述的方法获得的转基因非人动物在鉴别和/或测试药物中的用途；所述药物用于预防和/或治疗乙型病毒性肝炎和/或治疗乙型病毒性肝炎相关的并发症。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明所提供的方法构建得到的非人动物模型能够产生cccDNA，并无任何病毒的产生以及基因组整合，易于检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明所提供的微环HBV cccDNA小鼠模型构建流程示意图；
图2为本发明一个实施例中phiC31转基因小鼠的鉴定结果；
图3为本发明一个实施例中cccDNA形成的鉴定结果。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明涉及一种HBV非人动物模型的构建方法，包括：
构建转入第一融和基因片段和第二融和基因片段的转基因动物，其中：
所述第一融和基因片段含有诱导型反应元件、启动子、入核信号以及位点特异性重组酶，所述诱导型反应元件能够在诱导剂存在的条件下使得所述位点特异性重组酶入核表达；
所述第二融和基因片段含有HBV基因和报告基因，所述报告基因分为两段，分别与所述HBV基因的N端和C端融合，所述第二融和基因片段的两端还分别设置有所述位点特异性重组酶的识别位点，在所述位点特异性重组酶的作用下，所述第二融和基因片段能够环化，并使得所述报告基因的两段融合为完整的活性片段；
当所述转基因动物体内注射所述诱导剂时，能够产生HBV cccDNA。
本发明所提供的方法只产生cccDNA，并无任何病毒的产生以及基因组整合，易于检测。
术语“转基因”在用于本文时描述人工插入细胞特别是哺乳动物细胞的基因组中用于植入存活动物的遗传材料。对于特定国家，可能必需由这个方面专门排除某些主题，例如人的全能干细胞，受精卵等。
“转基因动物”指在其部分细胞中具有非内源(即异源)核酸序列作为染色体外元件中的非人动物，通常是哺乳动物，优选啮齿动物，再优选大鼠(Rattus norregicus)或小鼠(Mus musculus)，且最优选C57BL/6小鼠。
所述诱导型反应元件可以为启动子激活型(例如四环素诱导型、干扰素诱导型)、或配体诱导型(例如雌激素诱导型)。
其中，优选的情况下所述诱导型反应元件与所述位点特异性重组酶是融合在一起的。在一些实施方式中，所述诱导型反应元件为雌激素受体反应元件。
在一些实施方式中，所述诱导型反应元件为ERT2。
在一些实施方式中，所述ERT2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
在一些实施方式中，所述启动子为肝脏特异性启动子。
在一些实施方式中，所述启动子为ALB启动子。
在一些实施方式中，所述ALB启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在一些实施方式中，所述入核信号由一个或多个核定位信号提供。
在一些实施方式中，所述入核信号的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
位点特异性重组酶可以选自phiC31、Bxb1、TP901-1、U153或TGl，在一些优选的实施方式中，所述位点特异性重组酶为phiC31。
在一些实施方式中，所述phiC31的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一些实施方式中，所述诱导剂为外源的人工合成雌激素，比如：Tamoxifen、4-OHT，优选Tamoxifen。
在转基因动物体内注射Tamoxifen后，其代谢物4-OHT与ERT2结合，使位点特异性重组酶例如phiC31脱离胞浆，进入细胞核。在核内，phiC31作用于线性HBV DNA上的重组特异性位点attP、attB，使其发生非同源重组，诱导线性HBV DNA环化，形成cccDNA。
在一些实施方式中，所述识别位点为attP和attB。
在一些实施方式中，attP的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
在一些实施方式中，attB的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
在一些实施方式中，所述HBV基因为C型HBV基因。
在一些实施方式中，所述C型HBV基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。这段基因可以表达HBV的PreS1、PreS2，S、HBx、Pol、HBc等病毒相关蛋白。
在一些优选的实施方式中，为便于观察和检测，所述报告基因的表达产物为可通过催化底物反应自身发光或产生颜色变化、或可通过催化底物反应使底物发光或产生颜色变化、或经过激发光照射而产生发射光或产生颜色变化的物质。此类物质较为代表性的包括荧光蛋白、荧光素酶以及LacZ。荧光蛋白和荧光素酶都属于发光蛋白，可用照相机或类似的装置来检测荧光表达。荧光蛋白通过吸收一种颜色的光(激发)，然后发出不同颜色(发射)的较低能量光来起作用。相反，荧光素酶(和其他生物发光酶)通过催化底物(即荧光素)发生化学反应而发光。与上述两种标记不同，LacZ不发光。LacZ基因的产物β-半乳糖苷酶可以催化X-gal转化成类似于靛蓝的不透明蓝色化合物。
荧光蛋白可以选择绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白或红色荧光蛋白。绿色荧光蛋白可以采用常见的GFP，也可以采用经过改造后的GFP基因，例如增强型GFP基因EGFP等；蓝色荧光蛋白可以选自EBFP、Azuritc、TagBFP等；黄色荧光蛋白可以选自EYFP、Ypct、PhiYFP等；橙色荧光蛋白可以选自mKO、mOrange、mBanana等；红色荧光蛋白可以选自TagRFP、mRuby、mCherry、mKate等。
在一些优选的实施方式中，所述报告基因为荧光素酶报告基因。荧光素酶报告基因是指以荧光素(luciferin)为底物来检测海肾荧光素酶(Ranilla luciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。
在一些实施方式中，所述荧光素酶报告基因分为的两段的核苷酸序列优选如SEQID NO:6(N端序列)和7(C端序列)所示。
在一些实施方式中，所述第一融和基因片段通过受精卵细胞显微注射的方式转入所述动物。
在一些实施方式中，所述第二融和基因片段通过腺病毒转导的方式转入所述动物。
在一些实施方式中，所述腺病毒为AD5。
根据本发明的再一方面，本发明还涉及依照如上所述的方法获得的转基因非人动物在构建HBV感染疾病模型中的应用。
根据本发明的再一方面，本发明还涉及依照如上所述的方法获得的转基因非人动物在鉴别和/或测试药物中的用途；所述药物用于预防和/或治疗乙型病毒性肝炎和/或治疗乙型病毒性肝炎相关的并发症。
乙型病毒性肝炎相关的并发症例如关节炎、皮肤病变(例如荨麻疹、红旗、斑丘疹、血管神经性水肿、红斑性结节及猩红热样疹)、心血管病变(例如心肌炎、心包炎、结节性动脉周围炎)、肾脏病变、血液系统病变(例如再生障碍性贫血与溶血性贫血)、消化系统病变、急性胰腺炎、精神神经系统病变、维生素缺乏症(例如维生素D缺乏)、干燥结合症(例如干性角膜炎、口腔干燥)、甲状腺功能改变等。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例
一、获得病人样品中的基因组DNA
1、利用核酸提取或纯化试剂盒(中山大学达安基因)提取病人样品的乙肝病毒DNA，操作如下：
1)取200ul样品加入离心管中，加入50ul蛋白酶K
2)加入200ul裂解液，旋涡震荡15sec，离心10sec，72℃ 10min
3)加入250ul无水乙醇，漩涡震荡15秒
4)将混合液吸至离心柱，室温下12,000g离心1min，将离心柱转至新的收集管
5)将500ul抑制物去除液加入离心柱，室温下12,000g离心1min，将离心柱转至新的收集管
6)将500ul去离子液加入离心柱，室温下12,000g离心1min，将离心柱转至新的收集管
7)重复步骤6
8)将离心柱-收集管于室温下14,000g离心3min以除去残余乙醇
9)将离心柱取出，放置于新的1.5ml离心管，72℃放置2min
10)在离心柱的膜正上方小心加入72℃预热的洗脱液50ul，盖紧管盖，室温静置1min，14,000g离心1min。
二、获得C型HBV片段
利用PCR技术从提取纯化的DNA中扩增出C型HBV基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
利用
Figure BDA0002491821720000091
Taq 2x Mix试剂盒(NEB,M0287S)扩增C型HBV，按照以下比例配置反应液：
Figure BDA0002491821720000092
并按以下程序反应：
1)变性94℃30秒
2)退火60℃30秒
3)延伸68℃3分钟
4)循环数为35次
利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化科技)从PCR产物中提取C型HBV基因。其中，用琼脂糖凝胶按分子量分离PCR产物，将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中，称取重量。向胶块中加入等倍体积溶液PN(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μl PN溶液)，60℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中(柱平衡步骤：吸附柱CA2中加入500μl平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。12,000rpm(～13,400×g)离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12,000rpm(～13,400×g)离心2min收集DNA溶液。
三、获得截断的Luciferase两部分片段
以包含Luciferase的质粒为模板，利用PCR技术将Luciferase扩增分为两部分，标为Glu-N和Glu-C，核苷酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。
利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化科技)回收PCR产物，具体回收步骤详见步骤2。
四、获得融合的HBV-Glu片段
利用重叠延伸PCR技术，将Glu-N和Glu-C分别连接在HBV的N端和C端，构成一个Glu-N+HBV+Glu-C的融合片段，当HBV环化，Glu-N和Glu-C便会形成完整的Luciferase片段，从而作为一个报告系统提示cccDNA的形成。PCR反应条件如下：
1)PCR Round1：
Figure BDA0002491821720000101
Figure BDA0002491821720000102
2)PCR Round2：
Figure BDA0002491821720000111
Figure BDA0002491821720000112
五、获得重组型质粒PMC-HBV-C-Gluc
以PMC-P2B9为骨架载体，Glu-N+HBV+Glu-C为片段，分别将其进行酶切，然后连接，最后取连接产物转化感受态细胞(天根生化科技),转化过程如下：
取一个1.5ml离心管，加入100μl感受态细胞悬液，置冰上：加入10ul连接产物，用移液器轻柔混匀，冰上静置30min。42℃水浴中热激90秒，然后迅速置冰上3～5min。整个过程不要振荡菌液。加入1ml LB液体培养基(每升含胰蛋白胨10g酵母提取物5g，NaCl 5g，pH7.0,不含抗生素，高压灭菌)，混匀后37℃振荡培养(180rpm)1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。取100μl菌液，至含有抗生素Amp的LB固体培养基上(LB液体培养基加入15g/L细菌培养用琼脂，高压灭菌，稍冷却后导入细菌培养平板中继续冷却)，涂布均匀。待菌液被培养基吸收后，37℃倒置培养12～16小时。
六、获得穿梭质粒PGA1-HBV-C-Gluc以及腺病毒质粒AD5-HBV-C-Gluc
以PGA1-empty为骨架载体，PMC-HBV-C-Gluc为目的片段，利用TaKaRa公司的限制性内切酶进行酶切，反应体系如下：
Figure BDA0002491821720000113
Figure BDA0002491821720000121
利用TaKaRa公司的SolutionI连接试剂盒连接PGA1和HBV-C-Gluc，反应时间为8小时，体系如下：
试剂 体积
SolutionI 5ul
PGA1 0.5ul
HBV-C-Gluc 4.5ul
反应完成后，转化TOP10感受态细胞(天根生化公司)，具体步骤见步骤五。菌落PCR以及酶切鉴定正确克隆。
利用TaKaRa公司的限制性内切酶SgrAI和SgrAI、BstZ17I分别对PGA1-HBV-C-Gluc、AD5-E1E3进行酶切，反应时间为12小时，回收酶切产物后，进行BJ5183感受态细胞转化，使两者重组。感受态转化步骤见步骤五。
对转化后的克隆进行琼脂糖电泳大鉴定重组质粒(AD5为32K bp)，重组成功的克隆必然为大质粒。鉴定成功的克隆，再进行XL-Blue感受态的转化，XL-Blue感受态细胞限制小质粒的生长，达到纯化大质粒的作用。
利用TaKaRa公司的限制性内切酶HindIII对转化XL-Blue后的克隆进行鉴定，琼脂糖电泳显示目的条带的插入。
七、腺病毒AD5-HBV-C-Gluc的包装与纯化
15cm培养皿中铺种293T细胞，待细胞密度为70％即可进行转染，在转染前需更换新鲜培养基(Gibco DMEM+10％FBS)。转染试剂为Lipo3000，用Opti-MEM对AD5-HBV-C-Gluc和Lipo3000稀释，将两者充分混合后室温静止15分钟，然后轻轻添加到细胞皿培养基上，无需换液。48小时后，观察细胞病变状态，胞质透亮，细胞核变小即可，收集细胞，液氮-37℃水浴反复三遍，离心收上清即为病毒上清。病毒上清经过氯化铯梯度离心进行纯化，存于-80冰箱。
八、获得重组酶phiC31 CDS片段、ERT2 CDS片段
利用本实验室质粒PT-phiC31、PT-ERT2为模板，PCR技术扩增phiC31 CDS、ERT2CDS，并引入核定位信号(NLS)，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，反应体系和试剂盒见步骤二。
九、获得融合片段phiC31ERT2
利用PCR扩增的phiC31和ERT2片段，通过phiC31的5’引物和ERT2的3’引物进行overlap PCR扩增，得到融合片段phiC31-ERT2。PCR反应条件如下：
Figure BDA0002491821720000131
Figure BDA0002491821720000132
十、获得穿梭质粒Alb-Shuttle-phiC31-ERT2以及BAC-Alb-phiC31-ERT2
以ALB-shuttle为骨架载体，phiC31-ERT2为目的片段，进行酶切连接，转化TOP10感受态，鉴定正确的转化克隆，获得质粒即为穿梭质粒Alb-Shuttle-phiC31-ERT2。通过Lambda-RED体外重组系统，将穿梭质粒与BAC质粒(RP24-116E22,购自CHORI)在细菌中进行重组，得到BAC-Alb-phiC31-ERT2大质粒。
十一、受精卵细胞显微注射与移植代孕小鼠
受精卵细胞显微注射步骤如下：1、每只胚胎供体小鼠腹腔注射5U孕马血清促性腺激素(PMSG)，46-48h后腹腔注射5U成人绒毛膜促性腺激素(hCG)，并与种公鼠合笼。2、合笼次日，剪取见栓小鼠输卵管，置于M2培养滴中。3、转移输卵管至含有透明质酸酶(0.3mg/ml)M2培养滴中。4、待受精卵表面颗粒细胞在透明质酸酶作用下脱离后，将形态正常的受精卵转移到干净的M2操作滴中，去除杂质和透明质酸酶，最后转移至KSOM培养滴待用。5、在特制注射玻璃槽中滴加10ul M2，并用矿物油覆盖，将待注射胚胎转移至注射微滴中。
受精卵移植到代孕小鼠步骤如下：6、注射前日，将处于发情期CD1与结扎雄鼠合笼，注射当日取见栓鼠待用。7、麻醉见栓假孕鼠，背部开口，夹取卵巢处脂肪垫拉出输卵管，每只小鼠移植入30枚胚胎。
十二、phiC31转基因小鼠鉴定：Real-Time PCR检测phiC31表达
收理3只phiC31转基因小鼠，取心脏、肝脏、脾、肺、肾组织，超声充分破碎，使用TRIZOL裂解法提取总RNA。每个样品加入1ml TRIZOL液，充分裂解后，加入0.2ml氯仿，剧烈摇荡30秒，室温静止5分钟。吸取上层液体，转移至新的离心管，加入同等体积异丙醇，冰上放置10分钟，12000g离心10分钟。弃去上清液，加入1ml 75％乙醇，上下颠倒至RNA沉淀悬起，后将RNA溶于50ul RNase-Free ddH2O中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。使用ReverTra
Figure BDA0002491821720000141
试剂盒(TOYOBO，FSK-101)逆转录合成cDNA，反应体系如下：
试剂 体积
5×RT buffer 4ul
dNTP mixture(10mM) 2ul
RNase inhibitor(10U/μl) 1ul
Oligo(dT)20 2ul
RNA 2ug(～ul)
RNase-Free ddH<sub>2</sub>O 补至20ul
反应程序如下：
(1)42℃孵育20min.
(2)99℃加热5min.
(3)将反应后的溶液储存在4℃或–20℃
使用SsoAdvancedTM Universal
Figure BDA0002491821720000142
Green Supermix试剂盒(BIO-RAD，172-5274)检测转基因小鼠各组织的phiC31 RNA表达水平。
十三、诱导鉴定cccDNA形成
取phiC31转基因小鼠与同品系小鼠各3只，设置为实验组和对照组，注射纯化后的腺病毒AD5-HBV-C-Gluc，注射量为Vp＝6×1011，3天后给药100ul Tamoxifen(20mg/ml)，共7次，第三周尾静脉收集小鼠血清进行检测。
利用Renilla Luciferase Assay System试剂盒(Promega，E2810)检测Luciferase，将待测样品与检测试剂同等体积混合，充分反应后，于多孔微孔板发光检测仪
Figure BDA0002491821720000151
读取荧光数值。
本实施例使用的C57BL/6小鼠生物背景简单，具有完整的免疫系统，是研究乙型肝炎病毒和cccDNA的良好载体，phiC31重组酶基因受肝脏特异性启动子Alb和他莫西芬(Tamoxifen)的双重调控，确保在肝脏中特异性表达，避免在其他组织造成影响。由于腺病毒自身的作用方式，在形成cccDNA这一过程中，并没有病毒的产生，HBV也不会整合到宿主细胞基因组，得到的实验数据能更直观反映cccDNA的状态，表达的荧光素酶分泌到血清，直接尾静脉抽取少量血液分离血清即可检测。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州市第八人民医院
<120> HBV非人动物模型的构建方法及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3215
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 1
ctccacaaca ttccaccaag ctctgctaga tcccagagtg aggggcctat attttcctgc 60
tggtggctcc agttccggaa cagtaaaccc tgttccgact actgcctcac ccatatcgtc 120
aatcttctcg aggactgggg accctgcacc gaacatggag aacacaacat caggattcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc 240
acagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggagcac ccacgtgtcc 300
tggccaaaat tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcttgtc ctccaatttg 360
tcctggctat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcata ttcctcttca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctaccaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
acttccagga acatcaacca ccagcacggg gccatgcaag acctgcacga ttcctgctca 540
aggaacctct atgtttccct cttgttgctg tacaaaacct tcggacggaa actgcacttg 600
tattcccatc ccatcatcct gggctttcgc aagattccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcctgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtttggctt tcagttatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acaacatctt 780
gagtcccttt ttacctctat taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttaaaccct 840
aataaaacca aacgttgggg ctactccctt aacttcatgg gatatgtaat tggaagttgg 900
ggtactttac cgcaggaaca tattgtacta aaactcaagc aatgttttcg aaaattacct 960
gtaaatagac ctattgattg gaaagtctgt caaagaattg tgggtctttt gggctttgct 1020
gcccctttta cacaatgtgg ctatcctgcc ttgatgcctt tatatgcatg tatacaatct 1080
aagcaggctt tcactttctc gccaacttac aaggcctttc tgtgtaaaca atatctgaac 1140
ctttaccccg ttgcccggca acggtcaggt ctctgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggatggg gcttggccat aggccatcgg cgcatgcgtg gaacctttgt ggctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact cctagcagct tgtttcgctc gcagccggtc tggagcgaaa 1320
cttatcggca ccgacaactc tgttgtcctc tctcggaaat acacctcctt tccatggctg 1380
ctagggtgtg ctgccaactg gatcctgcgc gggacgtcct ttgtctacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc gtctcggggc cgtttggggc tctaccgtcc ccttcttcat 1500
ctgccgttcc ggccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggtctcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cggaccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtcgcatg gagaccaccg 1620
tgaacgccca ccaggtcttg cccaaggtct tacataagag gactcttgga ctctcagcaa 1680
tgtcaacgac cgaccttgag gcatacttca aagactgtgt gtttaaagac tgggaggagt 1740
tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tactaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gttcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccgtataa 1920
agaatttgga gcatctgtgg agttactctc ttttttgcct tctgacttct ttccttctat 1980
tcgagatctc ctcgacaccg cttctgctct gtatcgggag gccttagagt ctccggaaca 2040
ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctattctg tgttggggtg agttgatgaa 2100
tctggccacc tgggtgggaa gtaatttgga agacccagca tccagggaat tagtagtcag 2160
ctatgtcaat gttaatatgg gcctaaaaat cagacaacta ttgtggtttc acatttcctg 2220
tcttactttt ggaagagaaa ctgttcttga gtatttggta tcttttggag tgtggattcg 2280
cactcctccc gcttacagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 2400
atctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa tctcaatgtt agtatccctt 2460
ggactcataa ggtgggaaac tttactgggc tttattcttc tactgtacct gtctttaatc 2520
ccgagtggca aactccctcc tttcctcaca ttcatttaca ggaggacatt attaatagat 2580
gtcaacaata tgtgggccct cttacagtta atgaaaaaag gagattaaaa ttaattatgc 2640
ctgctaggtt ctatcctaac cttaccaaat atttgccctt agacaaaggc attaaaccgt 2700
attatcctga acatgcagtt aatcattact tcaaaactag gcattattta catactctgt 2760
ggaaggctgg cattctatat aagagagaaa ctacacgcag cgcctcattt tgtgggtcac 2820
catattcttg ggaacaagag ctacagcatg ggaggttggt cttccaaacc tcgacaaggc 2880
atggggacga atctttctgt tcccaatcct ctgggattct ttcccgatca ccagttggac 2940
cctgcgttcg gagccaactc aaacaatcca gattgggact tcaaccccaa caaggatcac 3000
tggccagagg caaatcaggt aggagcggga gcattcgggc cagggttcac cccaccacac 3060
ggcggtcttt tggggtggag ccctcaggct cagggcatat tgacaacagt gccagcagca 3120
cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaagacagc ctactcccat ctctccacct 3180
ctaagagaca gtcatcctca ggccatgcag tggaa 3215
<210> 2
<211> 1818
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
atggacacct atgctggcgc ctatgaccgc cagtccaggg agagggagaa ctcctctgct 60
gcctcccctg ccacccaacg cagcgccaat gaggacaagg ctgctgacct gcagagggag 120
gtggagaggg atggcggcag gttcaggttt gtgggccact tctctgaggc ccctggcacc 180
tctgcctttg gcacagctga gaggcctgag tttgagagga ttctgaatga gtgcagggct 240
ggcaggctga acatgatcat tgtctatgat gtctcccgct tctcccgcct gaaagtcatg 300
gatgccatcc ccattgtctc tgagctgctg gccctgggcg tgaccattgt ctccacccaa 360
gagggcgtct tcaggcaggg caatgtgatg gacctgatcc atctgatcat gaggctggat 420
gcctcccaca aggagtcctc cctgaagtct gccaagatcc tggacaccaa gaacctgcag 480
agggagctgg gcggctatgt gggcggcaag gccccatatg gctttgagct ggtctctgag 540
accaaggaga tcaccaggaa tggcaggatg gtgaatgtgg tgatcaacaa gctggcccac 600
tccaccaccc ccctgaccgg cccatttgag tttgagcctg atgtgatcag gtggtggtgg 660
agggagatca agacccacaa gcatctgcca ttcaagcctg gctcccaggc tgccatccat 720
cctggctcca tcaccggcct gtgcaagagg atggatgctg atgctgtgcc caccaggggc 780
gagaccattg gcaagaagac agcctcctct gcctgggacc ctgccacagt gatgaggatt 840
ctgagggacc ccaggattgc tggctttgct gctgaggtga tctacaagaa gaagcctgat 900
ggcaccccca ccaccaagat tgagggctac aggattcaga gggaccccat caccctgagg 960
cctgtggagc tggactgtgg ccccatcatt gagcctgccg agtggtatga gctgcaggcc 1020
tggctggatg gcaggggcag gggcaagggc ctgtccaggg gccaggccat cctgtctgcc 1080
atggacaagc tgtactgcga gtgtggcgct gtgatgacct ccaagagggg cgaggagtcc 1140
atcaaggact cctaccgctg ccgccgccgc aaggtggtgg acccatctgc ccctggccag 1200
catgagggca cctgcaatgt ctccatggct gccctggaca agtttgtggc tgagaggatc 1260
ttcaacaaga tcaggcatgc tgagggcgat gaggagaccc tggccctgct gtgggaggct 1320
gccaggaggt ttggcaagct gacagaggcc cctgagaagt ctggcgagag ggccaacctg 1380
gtggctgaga gggctgatgc cctgaatgcc ctggaggagc tgtatgagga cagggctgct 1440
ggcgcctatg atggccctgt gggcaggaag cacttcagga agcagcaggc tgccctgacc 1500
ctgaggcagc agggcgctga ggagaggctg gctgagctgg aggctgctga ggcccccaag 1560
ctgcccctgg accagtggtt ccctgaggat gctgatgctg accccaccgg ccccaagtcc 1620
tggtggggca gggcctctgt ggatgacaag agggtctttg tgggcctgtt tgtggacaag 1680
attgtggtga ccaagtccac cacaggcagg ggccagggca cccccattga gaagagggcc 1740
tccatcacct gggccaagcc ccccacagat gatgatgagg atgatgccca ggatggcaca 1800
gaggatgtgg ctgcctag 1818
<210> 3
<211> 134
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 3
gtgaatggcg tgaaggtgct gtttgccctg atctgcattg ctgtggctga ggccaagccc 60
acagagaaca atgaggactt caacattgtg gctgtggcct ccaactttgc caccaccgac 120
ctggatgccg acag 134
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 4
cccaagaaga agaggaaggt g 21
<210> 5
<211> 1800
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 5
atgaccatga cccttcacac caaagcctcg ggaatggcct tgctgcacca gatccaaggg 60
aacgagctgg agcccctcaa ccgcccgcag ctcaagatgc ccatggagag ggccctgggc 120
gaggtatacg tggacaacag caagcccact gtgttcaact accccgaggg cgccgcctac 180
gagttcaacg ccgccgccgc cgccgccgcc gccgcctcgg cgccggtcta cggccagtcg 240
ggcatcgcct acggccccgg gtcggaggcg gccgccttca gtgccaacag cctgggggct 300
ttcccccagc tcaacagcgt gtcgcctagc ccgctgatgc tgctgcaccc gccgccgcag 360
ctgtctcctt tcctgcaccc gcacggccag caggtgccct actacctgga gaacgagccc 420
agcgcctacg ccgtgcgcga caccggccct cccgccttct acaggtctaa ttctgacaat 480
cgacgccaga atggccgaga gagactgtcc agcagtaacg agaaaggaaa catgatcatg 540
gagtctgcca aggagactcg ctactgtgcc gtgtgcaatg actatgcctc tggctaccat 600
tatggggtct ggtcctgcga aggctgcaag gctttcttta agagaagcat tcaaggacac 660
aatgactaca tgtgtccagc tacaaaccaa tgcaccattg acaagaaccg gaggaagagt 720
tgccaggcct gtcggctgcg caagtgttac gaagtgggca tgatgaaagg cggcatacgg 780
aaagaccgcc gaggagggag aatgttgaag cacaagcgtc agagagatga cttggaaggc 840
cgaaatgaaa tgggtgcttc aggagacatg agggctgcca acctttggcc aagccctctt 900
gtgattaagc acactaagaa gaatagccct gccttgtcct tgacagctga ccagatggtc 960
agtgccttgt tggatgctga accgcccatg atctattctg aatatgatcc ttctagaccc 1020
ttcagtgaag cctcaatgat gggcttattg accaacctag cagataggga gctggttcat 1080
atgatcaact gggcaaagag agtgccaggc tttggggact tgaatctcca tgatcaggtc 1140
caccttctcg agtgtgcctg gctggagatt ctgatgattg gtctcgtctg gcgctccatg 1200
gaacacccgg ggaagctcct gtttgctcct aacttgctcc tggacaggaa tcaaggtaaa 1260
tgtgtggaag gcatggtgga gatctttgac atgttgctgg ctacgtcaag tcggttccgc 1320
atgatgaacc tgcagggaga agagtttgtg tgcctcaaat ccatcatttt gcttaattcc 1380
ggagtgtaca cgtttctgtc cagcaccttg aagtctctgg aagagaagga ccacatccac 1440
cgtgtcctgg acaagatcac agacactttg atccacctga tggccaaagc tggcctgact 1500
ctgcagcagc agcatcgccg cctagctcag ctccttctca ttctttccca tatccggcac 1560
atgagtaaca aaggcatgga gcatctctac aacatgaaat gcaagaacgt tgtgcccctc 1620
tatgacctgc tcctggagat gttggatgcc caccgccttc atgccccagc cagtcgcatg 1680
ggagtgcccc cagaggagcc cagccagacc cagctggcca ccaccagctc cacttcagca 1740
cattccttac aaacctacta catacccccg gaagcagagg gcttccccaa cacgatctga 1800
<210> 6
<211> 134
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 6
gtgaatggcg tgaaggtgct gtttgccctg atctgcattg ctgtggctga ggccaagccc 60
acagagaaca atgaggactt caacattgtg gctgtggcct ccaactttgc caccaccgac 120
ctggatgccg acag 134
<210> 7
<211> 430
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 7
gggcaagctg cctggcaaga agctgcccct ggaggtgctg aaggagatgg aggccaatgc 60
caggaaggct ggctgcacca ggggctgcct gatctgcctg tcccacatca agtgcacccc 120
caagatgaag aagttcatcc ctggccggtg ccacacctat gagggcgaca aggagtctgc 180
ccagggcggc attggcgagg ccattgtgga catccctgag atccctggct tcaaggacct 240
ggagcccatg gagcagttca ttgcccaggt ggacctgtgt gtggactgca ccaccggctg 300
cctgaagggc ctggccaatg tgcagtgctc tgacctgctg aagaagtggc tgccccagag 360
atgtgccacc tttgcctcca aaatccaggg ccaggtggac aagatcaagg gcgctggcgg 420
cgatgacacc 430
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 8
gccccaactg gggtaacctt tgagttctct cagttggggg 40
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 9
ggtgccaggg cgtgcccttg ggctccccgg gcgcg 35

Claims (10)

1.HBV非人动物模型的构建方法，其特征在于，包括：
构建转入第一融和基因片段和第二融和基因片段的转基因动物，其中：
所述第一融和基因片段含有诱导型反应元件、启动子、入核信号以及位点特异性重组酶，所述诱导型反应元件能够在诱导剂存在的条件下使得所述位点特异性重组酶入核表达；
所述第二融和基因片段含有HBV基因和报告基因，所述报告基因分为两段，分别与所述HBV基因的N端和C端融合，所述第二融和基因片段的两端还分别设置有所述位点特异性重组酶的识别位点，在所述位点特异性重组酶的作用下，所述第二融和基因片段能够环化，并使得所述报告基因的两段融合为完整的活性片段；
当所述转基因动物体内注射所述诱导剂时，能够产生HBV cccDNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述启动子为肝脏特异性启动子，优选为ALB启动子，其核苷酸序列优选如SEQ ID NO:3所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述入核信号由一个或多个核定位信号提供，其核苷酸序列优选如SEQ ID NO:4所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述位点特异性重组酶为phiC31，其核苷酸序列优选如SEQ ID NO:2所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HBV基因为C型HBV基因，其核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1所示。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述报告基因为荧光素酶报告基因；
优选的，所述荧光素酶报告基因分为的两段的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:6和7所示。
7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，所述第一融和基因片段通过受精卵细胞显微注射的方式转入所述动物；
和/或，所述第二融和基因片段通过腺病毒转导的方式转入所述动物。
8.根据权利要求1～6任一项所述的方法，所述转基因动物是小鼠(Mus musculus)。
9.依照权利要求1～6任一项所述的方法获得的转基因非人动物在构建HBV感染疾病模型中的应用。
10.依照权利要求1～6任一项所述的方法获得的转基因非人动物在鉴别和/或测试药物中的用途；所述药物用于预防和/或治疗乙型病毒性肝炎和/或治疗乙型病毒性肝炎相关的并发症。
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