CN106497930B

CN106497930B - 骨骼肌细胞高效特异性启动子及其应用

Info

Publication number: CN106497930B
Application number: CN201611199759.2A
Authority: CN
Inventors: 江明锋; 王刚; 刘益丽
Original assignee: Southwest Minzu University
Current assignee: Southwest Minzu University
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2016-12-22
Publication date: 2019-08-06
Anticipated expiration: 2036-12-22
Also published as: CN106497930A

Abstract

本发明公开了骨骼肌细胞高效特异性启动子及其应用。本发明高效启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3任意一项所示。本发明还公开了包含前述启动子的重组载体和/重组菌及其用途。本发明提供了的骨骼肌细胞高效特异性启动子在体内、体外实验中的表达效率高于CMV，可以使目标基因高表达，并且，其中的启动子SP‑301在骨骼肌中的启动基因表达的强度、特异性及持续时间方面表现出明显的优势，在后续的基因治疗领域具有很大的潜能。

Description

骨骼肌细胞高效特异性启动子及其应用

技术领域

本发明涉及骨骼肌细胞高效特异性启动子及其应用。

背景技术

在基因治疗中，肌肉注射治疗基因是一种简单有效的治疗方法。骨骼肌具有分布广、数量多、血管丰富等特点，其肌肉细胞特别是横纹肌细胞还具有细胞体积大和多核的等特点，从而使其具有体积大、注射容量大及易操作的优点，功能性分泌蛋白更易于进入血液循环系统发挥治疗作用。另外，基于骨骼肌的生命周期较长，肌肉注射简便易行及可大量摄入外源基因等特点，且重组治疗蛋白可在肌肉组织中持续表达数月至数年，故骨骼肌成为基因治疗的首选组织。基于上述几点，骨骼肌在基因治疗方面具有很大的潜力，将会得到广泛的应用。

外源基因进入肌肉组织中表达主要通过2种方式，分别是基于病毒与非病毒载体的方式。基因治疗研究中，因病毒载体基因转染效率高，被应用于基因治疗临床试验中，但因其具有制备较难、外载基因容量小、靶向性差、易引起机体的免疫和炎症反应，甚至能产生有活性的病毒颗粒和引起肿瘤突变的潜在危险等缺点，因此限制了它们的广泛应用。和病毒载体系统相比，非病毒载体系统有着明显的优势，如低毒性、低免疫原性，易组装和携带更大的外源基因片段等特点，故成为了目前基因传递载体研究的热点。简而言之，非病毒载体系统在基因治疗中是一种更安全，更廉价，更便捷的方法。但外源基因在肌肉组织中表达效率较低成为以骨骼肌作为转染组织进行基因治疗的一个重要制约因素，故提高外源基因在肌肉组织中的表达具有重要意义。

外源基因在肌肉组织中的表达效率受多方面因素的影响，主要包括载体、转染材料和转录表达元件等。目前已有商用质粒Pluronic L64作为转染材料，能高效地将原位肌肉注射的质粒DNA导入肌肉细胞中。而外源质粒进入细胞后，提高基因表达效率的关键因素是转录表达元件的选择，其中启动子的选择是一个非常重要的因素。启动子作为基因的一个组成部分，控制基因表达的起始时间和表达程度，启动子的强度和特异性直接决定了功能基因的表达效率。

人巨细胞病毒启动子(CMV)是一种广泛应用的病毒启动子，其活性较强，但其特异性和基因表达的持续时间均不高，表达外源基因几乎没有细胞特异性。一些天然的肌肉特异性启动子，例如骨骼肌特异性基因α-actin启动子，肌球蛋白轻链2(MLC2)启动子，肌球蛋白轻链3F启动子和肌酸激酶(MCK)启动子能在肌肉细胞中特异性激活，其中MLC2启动子的肌肉特异性最高，只能在心肌细胞中激活。但这些天然的肌肉特异性启动子表达外源基因的效率通常远低于病毒性启动子，如CMV启动子，因此也限制了其在肌肉组织的应用。

目前已有部分关于合成启动子的研究，SPc5-12启动子是一个较强的肌肉特异性合成启动子，是由SRE元件(serum response element)、肌细胞增强因子1和2(MEF-1和MEF-2)以及转录增强因子(TEF-1)4种调控序列随机组合筛选得到的，但这个启动子不能持续性地表达外源基因。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的骨骼肌细胞高效特异性启动子。

本发明高效启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3任意一项所示。

本发明重组载体，它含有前述的启动子。

优选地，所述重组载体是重组TOPO质粒、重组pGL3-SP-Luc质粒。

本发明重组菌，它含有前述的启动子或者前述的重组载体。

本发明还提供了前述的启动子、重组载体或者重组菌在制备肌肉注射的基因治疗药物中的用途。

本发明提供的骨骼肌细胞高效特异性启动子在体内、体外实验中的表达效率高于CMV，可以使得目标基因高表达，并且启动子SP-301在骨骼肌中的启动基因表达的强度、特异性及持续时间方面表现出明显的优势，在后续的基因治疗领域具有很大的潜能。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1.高效肌肉特异性合成启动子的体外筛选。分别用小鼠成肌细胞C2C12(A)，非肌肉细胞系NIH/3T3(B)和Hela细胞(C)对pCMV-Luc和1000多个pSP-Luc质粒进行瞬时转染。细胞转染48h后，利用荧光素酶报告基因检测启动子的转录效率，分别筛选出3个不同细胞系中具有较高转录活性的合成启动子质粒。

图2.11个高效特异性性合成启动子的体内评估。(A)利用荧光素酶报告基因检测合成启动子质粒在小鼠胫骨前肌中的转录效率。**，P<0.01vs CMV。(B)合成启动子的结构。R：反向互补序列。

图3.外源基因β-半乳糖苷酶与红色荧光蛋白E2在小鼠胫骨前肌中的表达水平。(A)在肌注第7天，β-半乳糖苷酶在肌肉中的表达评估。n＝6只/组，CMV:pCMV-LacZ、SP-301:pSP301-LacZ、SP-985:pSP985-LacZ。(B)红色荧光蛋白E2-Crimson(E2)基因在小鼠胫骨前肌中的表达强度和持续时间。n＝7/组，CMV:pCMV-E2、SP-301:pSP301-E2。

图4.单次注射外源GHRH基因质粒在小鼠肌肉组织中的表达及其对生长的影响。每组n＝6，每只小鼠注射50μg质粒。CMV:pCMV-GHRH,SP-301:pSP301-GHRH,SP-985:pSP985-GHRH。(A)小鼠的平均体重。*，P<0.05vs生理盐水组；**，P<0.001vs生理盐水组。(B)体重的增加值。*，P<0.05vs生理盐水组；**，P<0.001vs生理盐水组。(C)GHRH在血液中的平均含量。*P<0.05vs CMV；**P<0.001vs CMV。

图5.水流动力学注射介导含不同合成启动子的荧光素酶基因质粒在小鼠体内各组织(心、肝、脾、肺、肾和肌肉)中的表达。利用水流动力学对每只小鼠注射50μg pGL3-CMV-Luc或pGL3-301-Luc质粒，体积为1.6ml，分别注射4h、8h、24h和48h后，检测不同器官中荧光素酶的表达情况。

图6.荧光素酶基因在心脏、肝、脾、肺、肾和肌肉组织中的相对表达水平(SP/CMV)。

图7.流体力学注射法对小鼠影响。

图8.在C2C12细胞中含合成启动子质粒DNA的入核研究。

图9.在HepG2细胞中含合成启动子质粒DNA的入核研究。

具体实施方式

实施例1：骨骼肌细胞高效特异性启动子的制备

一.高效启动子的制备方法

1、合成调控元件

将19种调控元件的互补寡核苷酸送生工生物工程(上海)股份有限公司单独合成，寡核苷酸序列如表1所示。

表1 19种调控元件

2、合成小片段的磷酸化及退火

将合成的19种调控元件的互补寡核苷酸按照合成说明分别进行稀释、磷酸化及退火，得到每种调控元件的DNA片段。磷酸化和退火反应是在30μl的反应体系中进行，步骤如下，先将每种元件的互补寡核苷酸序列分别稀释成到100μM，然后根据T4多聚核苷酸激酶反应的说明书进行，将同种元件的互补序列等量加入反应体系中，在30μl体系中，10μl的互补寡核苷酸，1mM ATP和30U的T4多聚核苷酸激酶，在37℃静置1h，94℃金属浴中5min，然后冷却至室温，得到了19种调控元件的双链DNA片段，-20℃保存。

3、含合成启动子质粒的构建

将19种调控元件的DNA片段等摩尔比加入50μl的T4DNA连接酶(Invitrogen)的连接反应体系中，14℃金属浴过夜连接。连接反应后，用CHROMA SPIN-1000Columns(Clontech)将上述连接产物进行纯化，目的在于除去连接体系中小分子DNA和包括酶在内的所有蛋白质，以便后续的载体构建。将柱子纯化后的合成启动子(SP)片段在1％琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定，然后利用胶回收试剂盒(OMEGA)将长度在100-1000bp的连接片段进行回收。将胶回收的合成启动子(SP)片段利用ZeroPCR Cloning Kit连接到pCR^TM-Blunt(Invitrogen)载体上，转化，得到了大量的不同长度的Topo-SP单菌落。随机挑10个Topo-SP单克隆进行PCR分析并测序，鉴定合成启动子序列来源是否正确。由测序和序列比对可知，合成启动子的序列来源正确。将同一LB平板上所有单菌落用LB液体培养基收集到同一试管中，37℃下震荡过夜培养，提取质粒，得到Topo-SP的混合质粒。

4、含合成启动子的荧光素酶报告基因质粒的构建

将Topo-SP的混合质粒用KpnI和XhoI进行双酶切，同时将含荧光素酶报告基因的pGL3载体用KpnI和XhoI进行双酶切，然后将混合质粒与pGL3-Basic进行连接，得到大量pGL3-SP-Luc单菌落。挑取所有的pGL3-SP-Luc单菌落，37℃过夜培养，将菌液快速裂解，用1％琼脂糖凝胶对质粒大小进行初步判断，提取质粒，测序，比对并编号。每个序列比对正确的pGL3-SP-Luc质粒均被编号，如pGL3-SP-Luc-1、pGL3-SP-Luc-2和pGL3-SP-Luc-3等。用MluI与NheI将pcDNA3.1(+)进行双酶切，得到巨细胞病毒(CMV)启动子，然后连接到pGL3-Basic载体上，得到了pGL3-CMV-Luc质粒，作为实验阳性对照质粒。

将所有表达强度和特异性高于对照组pGL3-CMV-Luc的pGL3-SP-Luc质粒，与pGL3-CMV-Luc用XhoI与XbaI进行双酶切，将荧光素酶基因分别替换成β-半乳糖甘酶(LacZ)，红色荧光蛋白(E2-Crimson)和生长激素释放激素(GHRH)基因，得到了pGL3-SP-LacZ/E2/GHRH和pGL3-CMV-LacZ/E2/GHRH报告基因质粒。其中荧光素酶(luciferase，Luc)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，LacZ)和远红外荧光蛋白(E2-Crimson，E2)基因分别是从pGL3-control、pUB6/V5-His/lacZ和pE2-Crimson三种质粒中通过PCR扩增获得。除以上报告基因外，为构建一种具有生物学功能的报告基因，即小鼠生长激素释放激素(mGHRH；GenBankversion：NM_010285.2)，该基因通过以下方法获得：首先从新生的BALB/c小鼠的脑垂体中提取RNA，反转录成cDNA，通过PCR扩增获得GHRH基因，然后将所有质粒进行PCR扩增、限制性酶切和测序鉴定。不同基因的质粒构建方案如表2所示。

表2.构建的质粒的信息

5、肌肉特异性合成启动子的筛选

5.1体外筛选

为得到肌肉组织特异性高表达的启动子，将1172个pGL3-SP-Luc单菌落进行快速碱裂解，然后用1％琼脂糖凝胶电泳初步鉴定质粒大小。将初步鉴定连接正确的497个单克隆提取质粒，测序鉴定。

将测序比对正确的pGL3-SP-Luc质粒在小鼠C2C12骨骼肌细胞中进行体外转染，利用荧光素酶报告基因表达强度检测合成启动子的转录效率。实验分为三组：生理盐水组，pGL3-CMV-Luc为阳性对照组，pGL3-SP-Luc为实验组，在96孔板中每孔中加入200ng的质粒，用Lipofectamine^TM 2000进行转染，每组设3个复孔。转染48h后，用1×Lysis Buffer收集96孔板中的细胞，-80℃过夜，备用。过夜冻存后，将样品在冰水浴中完全融化，涡旋15s，4℃，12000g离心3min。精密吸取20μL上清于白色微孔板中，每个样品3个平行，设置自动进样器每孔加入50μL荧光素酶底物，酶标仪测定荧光素酶的活性。然后用BCA蛋白含量测定试剂盒对蛋白浓度进行测定，计算相对荧光素酶活单位，即荧光素酶活性/蛋白含量。

为进一步验证启动子的肌肉特异性，将鉴定得到的强合成启动子分别在2个非肌肉细胞系(NIH/3T3与Hela)和C2C12细胞中进行转染，得到了在C2C12细胞中高效表达而在其它两个细胞系中低表达的特异性启动子报告基因质粒。

5.2体内筛选

本实验所有动物实验和手术方式均符合国家《实验动物管理条例》，所有实验动物均由成都达硕实验动物有限公司提供。选取6-8周大，体重20–22g的雄性BALB/c小鼠评估报告基因Luc、LacZ和E2在合成启动子作用下的表达强度。用4-6周大，体重12-14g的雄性BALB/c小鼠用来评估功能性基因GHRH的表达。

5.2.1荧光素酶报告基因的定量检测

为进一步筛选出高效且高特异性的启动子，将细胞实验中筛选得到的11种高特异性的启动子SP-301、SP-985、SP-817、SP-631、SP-852、SP-1069、SP-129、SP-849、SP-762、SP-182和SP-61在小鼠体内进行评估，将11种质粒的荧光素酶报告基因分别肌肉注射到雄性BALB/c小鼠胫骨前肌。具体步骤如下，将小鼠胫骨前肌(TA)毛发用脱毛膏褪去，酒精棉轻柔擦拭消毒。实验共分为13组、生理盐水组、pGL3-CMV-Luc对照组和11个实验组，每组6只小鼠。用生理盐水将Pluronic L64(Sigma-Aldrich，St Louis,MO,USA)稀释至0.2％(W/V)，取0.2％的L64与同等体积的15μg质粒DNA(pDNA)混合，总体积为40μl，室温静置5min。用医用1ml的胰岛素注射器吸取40μL pDNA生理盐水和11种pDNA/L64(0.1％)沿平行于肌纤维的方向进针约2mm，缓慢注射。在注射报告基因质粒第6天后处死小鼠，剥离胫骨前肌、称重，在1mL预冷的1×裂解缓冲液中匀浆，在冰上操作，-80℃保存。参照说明书测定各样品的荧光素酶活性，筛选到体内活性最高的合成启动子。

5.2.2β-半乳糖苷酶基因的定性检测

选取体内荧光素酶活性检测中高效特异性的启动子SP-301与SP-985，构建成pGL3-SP-301-LacZ和pGL3-SP-985-LacZ。实验分4组：生理盐水组、pGL3-CMV-LacZ组、pGL3-SP-301-LacZ组和pGL3-SP-985-LacZ组，每组6只小鼠。参照5.2.1中荧光素酶报告质粒的注射方法进行。在注射第7天后处死小鼠并剥离胫骨前肌，参照碧云天的β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒操作说明对小鼠β-半乳糖苷酶报告基因进行定性检测，用高清数码相机拍照。

5.2.3E2-Crimson报告基因的活体成像检测

活体成像实验分4组：生理盐水组、pGL3-CMV-E2组、pGL3-SP-301-E2组和pGL3-SP-985-E2组，每组6只小鼠，参照5.2.1中的注射方法进行。E2基因注射后，分别于注射后7d、14d、21d和28d后采用活体成像系统检测E2-Crimsom原位红色荧光蛋白的表达情况，由黄光激发，扫描600nm-700nm之间的信号，最后进行图像处理，利用系统软件对图像在统一参数下进行处理。

5.2.4生长激素释放激素基因(GHRH)的生物学效应检测

为进一步试验高特异性启动子SP-301是否能显著地提高小鼠的体重和功能基因(growth hormone-releasing hormone,GHRH，生长激素释放激素)表达，进行了生长激素释放激素基因(GHRH)的生物学效应检测。试验中分别称取小鼠体重和进行GHRH含量检测。每个实验分成3组：生理盐水组、pGL3-CMV-GHRH组和pGL3-SP-301-GHRH组。参照5.2.1中的实验方法，每只小鼠注射50μg质粒，每组6只注射当天及注射后每3天对每只小鼠称重，记录每次体重，持续称重1个月。将注射后7d、14d、21d和30d的小鼠处死，收集血清，用酶联免疫吸附法检测小鼠生长激素释放激素的表达水平，参照小鼠生长激素释放激素(GHRH)ELISA检测试剂盒说明书进行操作。

5.2.5裸质粒的流体力学注射法

使利用流体力学鼠尾静脉注射方法可将目的基因转移到动物各器官，并在靶器官内表达。因此，流体力学注射法是进行基因功能研究、体内基因治疗的有效方法。将含50μg的pGL3-CMV-Luc与pGL3-301-Luc质粒加入1.6mL生理盐水中，在5s内完成尾静脉注射。本实验共分成3组：生理盐水组、pGL3-CMV-Luc组和pGL3-301-Luc组。在注射后4h、8h、24h和48h处死小鼠，每个时间点5只。采用外科手术法解剖不同时间点的小鼠，分别取出心脏、肝脏、脾脏、肺、肾和肌肉的组织，其中采集整个心脏、肾、脾和肺，再从每只老鼠的同一部位取大小接近的肝脏和肌肉组织。将所有样品置于冰上，加入1ml预冷的1×荧光素酶报告基因裂解缓冲液，匀浆，-80℃保存。参照荧光素酶测定说明进行酶活和蛋白测定。

5.3合成启动子报告基因质粒入核研究

由体外细胞实验和体内实验表明，SP-301启动子比CMV启动子活性更强，特异性更高。为进一步对合成启动子SP-301的高表达量和特异性的作用机理进行研究，本实验对含SP-301与CMV的荧光素酶报告基因质粒的入核机理进行了初步探索。具体步骤如下：(1)荧光标记质粒：参照LabelTracker^TM 3 Kit说明书对pGL3-CMV-Luc与pGL3-SP-301-Luc质粒进行荧光标记，得到Cy3-CMV与Cy3-SP-301的荧光标记质粒；(2)玻底皿中培养细胞：选择状态较好的C2C12与HepG2细胞系，加入300μl细胞悬液于15mm玻底皿底部培养(约1×10⁴细胞/皿)，置于5％CO2培养箱中，37℃过夜培养；(3)转染：将Cy3-CMV与Cy3-SP-301分别与LP2000转染试剂孵育，在转染后7个不同时间点进行观察，分别为5min、15min、0.5h、1h、1.5h、2h和3h；(4)固定细胞：转染后，去除培养基，每皿均用1ml的PBS洗涤3次，加入1ml的4％的多聚甲醛，室温静置20min进行固定，用1×PBS漂洗3次，每次5min；(5)DAPI染核：配制1.5ml的DAPI稀释液(6.7ng/μl)，每皿加入300μl的DAPI稀释液对细胞核进行染色，置于37℃培养箱中15min，PBS洗涤3次，每次5min，染核完成，加入1ml的PBS，激光共聚焦显微镜拍照观察。

5.4合成启动子荧光素酶基因的转基因小鼠模型

为进一步探究SP-301启动子的肌肉特异性，本实验利用pGL3-CMV-Luc与pGL3-SP-301-Luc两种质粒分别构建了2种转基因小鼠模型。将pGL3-CMV-Luc与pGL3-SP-301-Luc质粒送赛业生物科技有限公司建立转基因小鼠模型。建模成功后，剪去2-5mm的小鼠尾尖组织进行基因组DNA提取，PCR扩增鉴定。鉴定正确后，将小鼠处死，分别采集转基因小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和肌肉组织。参照荧光素酶活性测定方法，对不同部位样品的酶活进行测定，由此评估合成启动子SP-301是否具有肌肉特异性。

二、结果

1、合成启动子报告质粒的构建

本实验将19种调控元件应用于合成启动子的文库构建中。主要分为3类元件：1)肌肉特异性元件：包括SRE、MEF-1、MEF-2、MEF-3、TEF-1、Trex、MPEX和MAPF；2)高度保守调控元件：包括AP1、AP2、GATA-2、TATA box和CAAT box；3)病毒来源元件：包括72bp DNA、19bp CMV启动子、16bp CMV启动子、19bp CMV增强子、18bp CMV增强子和21bp CMV增强子，其中72bpDNA元件来自猿猴病毒40(SV40)增强子，是有助于质粒入核的DNA核靶向序列。19个DNA片段按照等摩尔比随机结合，与pGL3-Basi荧光素酶报告载体连接，得到合成启动子报告基因质粒文库。

2、含合成启动子的报告基因的体外表达

为验证合成启动子的强度和肌肉特异性，将含合成启动子的荧光素酶报告基因质粒分别在NIH/3T3，Hela和C2C12的3种细胞系中瞬时转染，48小时后测定荧光素酶的活性，结果如图1所示，在C2C12细胞中，32种合成启动子荧光素酶相对表达强度高于CMV启动子1-6倍不等，其中SP-301、SP-985、SP-129、SP-182和SP-61的活性分别高于CMV 5.6、3.7、3.6、2.5和2.1倍。另外，有数百个合成启动子的活性均低于CMV启动子。

为进一步探讨SP的体外组织特异性，将SP质粒在小鼠胚胎成纤维细胞系NIH/3T3和人宫颈上皮癌细胞系Hela中进行瞬时转染。结果表明，SP报告基因质粒在NIH/3T3和Hela中的荧光素酶活性相较于C2C12细胞中的活性大幅度降低，并显著低于CMV组(图1B和C)。由此表明，部分合成启动子具有肌肉细胞特异性。

3、特异性合成启动子报告基因体内表达

3.1荧光素酶报告基因的表达

为进一步探讨体外细胞筛选得到的特异性合成启动子，将11个SP荧光素酶报告质粒肌肉注射到小鼠胫骨前肌，进行荧光素酶活性测定，结果如图2A所示。结果表明，SP-301、SP-985和SP-817的活性分别为CMV的6.6、4.5和1.7倍，这与体外细胞实验结果相近，SP-301和SP-985启动子在体内具有很好的特异性，活性均显著高于CMV(P<0.01)。但部分在体外细胞实验中高表达的合成启动子，在小鼠体内的表达较低，并明显低于CMV，如SP-61、SP-182、SP-228和SP-230(图2A)。

如图2B所示，合成启动子序列组成由19种调控元件随机组成，将特异性启动子组成元件列出。三个特异性高启动子分别是SP-301(580bp)、SP-985(301bp)和SP-817(346bp)，分别由28、9和13个转录元件组成，另外，SP-619是最长的合成启动子(586bp)，包含了32个转录元件，但活性并不强，这也说明启动子的强弱和特异性并不是和序列长短直接相关，而和元件的种类和组成顺序密切相关。

SP-301、SP-985和SP-817三个启动子的核苷酸序列如下：

SP-301(SEQ ID NO.1):580bp，28个元件组成

TGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCGGGAGTTATTTTTAGAGCGATATGGCGACGGCCACTTGGCAGTACATCAATTGGAAAGTCCCGTTAGTGCTATTGGCTGGCCAGCCAATAGCTGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCGTGAGGAATGGTGCCAGGCATCTCGGGTTTGATGTACTGCCAAGCCAGCCAATAGCCGCTCTAAAAATAACTCCCCCGTCGCCATATTTGGGTGTCCGCTCTAAAAATAACTCCCGGCCGTCGCCATATGGGCCCCTCCCTGGGGACAGCCCCTTGGAAAGTCCCGTTAGTGCCAGGCGGGCCATTTACCGTCGCTCTAAAAATAACTCCCTAGGGAAACCTGAAGCCCCCATTGACGTCAATGGGGCAGGTTTTTTATATAGTCCGGCTTCAGGTTTCCCTACAAGGCCTGGGGACAACCCGAGATGCCTGGCAGGTTTTTTATATAGTCCACCAAGTCAGCA

SP-985(SEQ ID NO.2):301bp，9个元件组成

TGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCCTTGGCAGTACATCAAGCCCATTGACGTCAATAATCTTGGCAGTACATCAATGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCTGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCCAGGTTTTTTATATAGTCCCAAGGCCTGGGGACA

SP-817(SEQ ID NO.3):(346bp,13元件)

TGTCCCCAGGCCTTGCCGTCGCCATATTTGGGTGTCACCAAGTCAGCAGGCAGGCAGCAGGTGTTGGCAGGTTTTTTATATAGTCCTTGATGTACTGCCAAGTTGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCTGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCCAGGTTTTTTAATAGTCCGGACACCCGAGATGCCTGGTTATTGATGTACTGCCAAGGGGGCTGTCCCCAGGGAGGGGCCCATTATTGACGTCAATGGGC

本发明三个启动子可以按照前述方法制备，也可以按照前述核苷酸序列直接合成。

3.2β-半乳糖苷酶基因的表达

利用β-半乳糖苷酶在小鼠胫骨前肌中的表达，合成启动子的强度和特异性能得到更直观的评估。如图3A所示，与比CMV相比，SP-301合成启动子的报告基因具有更高的LacZ表达量，而SP-985低于CMV，从对胫骨前肌处理的颜色和分部情况明显可见。

3.3 E2红荧光蛋白基因的表达

在机体内进行合成启动子对报告基因的表达强度和持续时间的评价是非常重要的，能利用E2-Crimson远红荧光蛋白在体内的表达进行方便直观的评价。单次注射E2-Crimson质粒7d、14d、21d和28d后，采用活体成像系统检测E2红色荧光蛋白的表达情况(如图3B)。结果表明，SP-301和CMV的E2基因表达显著高于生理盐水，但与CMV相比，SP-301报告基因的强度更强，表达持续时间更长。另外，SP-301的红色荧光信号的持续时间在至少21天没有衰减，而CMV组的红色荧光蛋白信号持续超过14天就开始衰减。

3.4功能基因表达

通过荧光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因和E2远红外荧光蛋白基因的表达证实了合成启动子的特异性和强度，需进一步研究此合成启动子能否在体内发挥生物学功能。鼠生长激素释放激素(GHRH)具有促进生长的生理学功能，可用于评估合成启动子提高基因治疗系统的效率的可行性，结果见图4。结果表明，在图4B中，在单次注射质粒24d内，CMV、SP-301和SP-985的小鼠体重增长值均高于生理盐水组，其中SP-301组的小鼠体重增长值明显高于CMV与SP-985的(图4B)。为进一步解释验证这个结果，分别采集了注射后7d、14d、21d和28d的小鼠血液样本，利用小鼠GHRH的ELISA试剂盒进行检测了血液中GHRH的平均浓度。如图4C所示，在7d时，SP-301、SP-985和CMV的浓度几乎均为生理盐水组的3-4倍；在14d和21d时，SP-301和SP-985的GHRH浓度明显高于CMV；在30d、SP-301、SP-985和CMV组的GHRH浓度与生理盐水组的相近。

3.5基于流体力学注射法对含合成启动子报告基因表达的影响

采用流体力学尾静脉注射法对含合成启动子的荧光素酶基因载体进行器官靶向性研究,为今后质粒载体的基因治疗和功能研究寻找潜在靶器官，结果见图5和6。结果表明，在不同器官中，CMV与SP-301组报告基因表达量的变化模式类似，注射4h后，各器官荧光素酶开始积累，8h表达达到高峰，24h开始下降；在所有的器官中，报告基因在肝脏的表达量最高，在心、脾、肺、肾和肌肉中表达强度比较接近，但均远远低于肝脏中的表达量；pGL3-301-Luc的荧光素酶表达水平显著高于pGL3-CMV-Luc，且表达水平下降更慢，由此说明，SP-301的表达强度和持续时间均优于CMV。图6所示，荧光素酶基因在不同组织中的相对表达水平(SP-301/CMV)进一步表明SP-301组的报告基因表达具有肌肉特异性。

流体力学尾静脉注射法作为一种基因转移方法，能实现目的基因短时间内在多种组织中的高效表达，特别是在肝脏中高水平表达，大大提高了质粒DNA的转染效率，在短时间内产生大量的治疗性蛋白产物，能用于基因治疗。部分研究也报道，基于流体力学的尾静脉注射后，采血对小鼠的各项生理生化指标进行测定，结果证明各项指标正常，对小鼠没有伤害。但本实验中，对注射后不同时间点的小鼠处死，解剖观察发现，流体力学注射法的小鼠全部出现胸腔大量出血现象，对小鼠身体伤害较大，具体见图7。

4、含合成启动子的报告基因质粒入核的初步研究

基于SP-301合成启动子的强度和特异性，对其序列和组成元件进行分析尤为重要。结果分析发现，SP-301由28个元件组成，11个元件是肌肉来源，9个元件来源于保守元件，8个元件是病毒来源，其中8个病毒来源元件包括2个72bp SV40元件序列。

SP-301合成启动子的入核研究结果见图8和9。结果表明，在C2C12和HepG2细胞中，与CMV质粒相比，SP-301质粒具有入核早的特点，在15min时，已有部分质粒进入细胞核，而CMV质粒在0.5h或1h才能观察到质粒的入核现象。

5、合成启动子报告基因在转基因小鼠中的表达

为进一步鉴定合成启动子的特异性，建立了含合成启动子的报告基因质粒的转基因小鼠模型进行研究。PCR鉴定结果发现，所有的小鼠模型均鉴定正确。进一步对各组织中荧光素报告基因表达实验结果表明，与CMV相比，SP-301的报告基因的表达具有肌肉特异性，结果见表3。

表3.两种启动子在转基因小鼠不同组织中的相对表达水平

综上，本发明筛选得到了3个高效肌肉特异性启动子：SP-301，SP-985和SP-817合成启动子，它们的荧光素酶表达水平明显高于CMV启动子，分别是CMV活性的6.6、4.5和1.7倍，其中，SP-301，SP-985合成启动子的效率较高，SP-301启动子的效率最高，在体外和体内环境下，SP-301的活性和特异性均比CMV强，而且稳定性强，还具有肌肉特异性，具有良好的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南民族大学

<120> 骨骼肌细胞高效特异性启动子及其应用

<130> GY223-16P1572

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 580

<212> DNA

<213> SP-301 的核苷酸序列

<400> 1

tggttgctga ctaattgaga tgcatgcttt gcatacttct gcctgctggg gagcctgggg 60

actttccaca ccgggagtta tttttagagc gatatggcga cggccacttg gcagtacatc 120

aattggaaag tcccgttagt gctattggct ggccagccaa tagctggttg ctgactaatt 180

gagatgcatg ctttgcatac ttctgcctgc tggggagcct ggggactttc cacaccgtga 240

ggaatggtgc caggcatctc gggtttgatg tactgccaag ccagccaata gccgctctaa 300

aaataactcc cccgtcgcca tatttgggtg tccgctctaa aaataactcc cggccgtcgc 360

catatgggcc cctccctggg gacagcccct tggaaagtcc cgttagtgcc aggcgggcca 420

tttaccgtcg ctctaaaaat aactccctag ggaaacctga agcccccatt gacgtcaatg 480

gggcaggttt tttatatagt ccggcttcag gtttccctac aaggcctggg gacaacccga 540

gatgcctggc aggtttttta tatagtccac caagtcagca 580

<210> 2

<211> 301

<212> DNA

<213> SP-985的核苷酸序列

<400> 2

tggttgctga ctaattgaga tgcatgcttt gcatacttct gcctgctggg gagcctgggg 60

actttccaca cccttggcag tacatcaagc ccattgacgt caataatctt ggcagtacat 120

caatggttgc tgactaattg agatgcatgc tttgcatact tctgcctgct ggggagcctg 180

gggactttcc acacctggtt gctgactaat tgagatgcat gctttgcata cttctgcctg 240

ctggggagcc tggggacttt ccacacccag gttttttata tagtcccaag gcctggggac 300

a 301

<210> 3

<211> 346

<212> DNA

<213> SP-817的核苷酸序列

<400> 3

tgtccccagg ccttgccgtc gccatatttg ggtgtcacca agtcagcagg caggcagcag 60

gtgttggcag gttttttata tagtccttga tgtactgcca agttggttgc tgactaattg 120

agatgcatgc tttgcatact tctgcctgct ggggagcctg gggactttcc acacctggtt 180

gctgactaat tgagatgcat gctttgcata cttctgcctg ctggggagcc tggggacttt 240

ccacacccag gttttttaat agtccggaca cccgagatgc ctggttattg atgtactgcc 300

aagggggctg tccccaggga ggggcccatt attgacgtca atgggc 346

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> SRE

<400> 4

gacacccaaa tatggcgacg g 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> MEF-1

<400> 5

ccaacacctg ctgcctgcc 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> MEF-2

<400> 6

cgctctaaaa ataactccc 19

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> MEF-3

<400> 7

ggcttcaggt ttcccta 17

<210> 8

<211> 13

<212> DNA

<213> TEF-1

<400> 8

caccattcct cac 13

<210> 9

<211> 12

<212> DNA

<213> Trex

<400> 9

tgctgacttg gt 12

<210> 10

<211> 15

<212> DNA

<213> MPEX

<400> 10

caaggcctgg ggaca 15

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> MAPF

<400> 11

ggacacccga gatgcctggt ta 22

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> AP-1

<400> 12

gggcccctcc ctggggacag cccc 24

<210> 13

<211> 14

<212> DNA

<213> AP-2

<400> 13

atatggcgac ggcc 14

<210> 14

<211> 15

<212> DNA

<213> GATA-2

<400> 14

acccgatatg cctgg 15

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> TATA Box

<400> 15

ggactatata aaaaacctg 19

<210> 16

<211> 12

<212> DNA

<213> CAAT box

<400> 16

ccagccaata gc 12

<210> 17

<211> 72

<212> DNA

<213> SV40

<400> 17

ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 60

agtcagcaac ca 72

<210> 18

<211> 16

<212> DNA

<213> CMV promoter

<400> 18

cttggcagta catcaa 16

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> CMV enhancer

<400> 19

actaacggga ctttccaa 18

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> CMV promoter

<400> 20

ccccattgac gtcaatggg 19

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> CMV enhancer

<400> 21

gcccattgac gtcaataat 19

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> CMV enhancer

<400> 22

acggtaaatg gcccgcctgg c 21

Claims

1.高效启动子，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种重组载体，其特征在于：它含有权利要求1所述的启动子。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是重组TOPO质粒、重组pGL3-SP-Luc质粒。

4.一种重组菌，其特征在于：它含有权利要求1所述的启动子或者权利要求2或3所述的重组载体。

5.权利要求1～4任意一项所述的启动子、重组载体或者重组菌在制备肌肉注射的基因治疗药物中的用途。