KR20180002706A - Smad7 유전자 전달 치료법 - Google Patents

Abstract

본원발명은 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus; AAV) 벡터 및 Smad7을 발현하는 재조합 AAV에 관한 것이다. 개시된 AAV 벡터 및 rAAV는 암 악액질(cancer cachexia)과 관련된 근육 소모(muscle wasting), 심근(cardiac) 및/또는 골격근 소모(skeletal muscle wasting)의 치료 및 개선에서의 치료적 적용에 사용될 수 있다. 구체적으로, rAAV 구조물(construct)은 혈청형 6(rAAV6), 혈청형 8(rAAV8), 또는 혈청형 9(rAAV9)이다.

Description

SMAD7 유전자 전달 치료법{SMAD7 GENE DELIVERY AS A THERAPEUTIC}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2015년 4월 23일에 출원된 미국 가출원 제 62/151,547 호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 본원에 참조로서 통합된다.

연방 기금에 대한 감사의 말

본 발명의 특정 측면은 적어도 부분적으로는 국립 과학 재단(IOS1147275), 근육 영양 장애 협회(216602), 및 호주 국립 보건 및 의학 연구 협의회(1046782)의 지지를 받았다.

서열목록(Sequence Listing) 참조에 의한 통합

서열목록은 2016년 4월 22일에 작성된 96554-01_SeqList.txt(~ 12KB)라는 ASCII 텍스트 파일로 제출되며, 이 파일은 본 명세서에 참조로 포함된다.

종양 유발 인자는 진행성 암 환자의 최대 80%에서 현저한 체중 감소, 근육 및 지방의 심한 위축을 특징으로 하는 약화 및 피로의 상태인 악액질(cachexia)을 유발한다(Tisdale, Physiol Rev 89, 381-410, 2009; Fearon et al., Cell Metabolism 16, 153-166, 2012). 이 경로가 근육의 이화 작용을 자극하고 이들 리간드의 발현이 종종 근육 소모와 함께 상승하기 때문에, 이 환자에서 타입 IIB 액티빈 수용체(ActRIIB) 리간드를 억제하는 치료적 전망에 많은 관심이 집중되었다(Fearon et al., Cell Metabolism 16, 153-166, 2012; Lee & Glass, Skelet Muscle 1, 2, 2011, doi : 10.1186 / 2044-5040-1-2). 실제로, 변형된 ActRIIB 또는 다른 "리간드 트랩"(예 : 용해성 ActRIIB, ACE-031, 면역 중화 등)의 순환 형태는 다른 pro-cachectic 사이토카인이 상승된 상태임에도 불구하고, 근육 소모를 반전시키고 수명을 증가시킬 수 있다(Klimek et al., Biochem Biophys Res Commun 391, 1548 -1554, 2010; Zhou et al., Cell 142, 531-543, 2010). 따라서, 근육에서 ActRIIB 신호 전달을 선택적으로 차단하는 개입은 암 악액질 치료에 유용할 수 있다(Zhou et al., Cell 142, 531-543, 2010). 그러나, 순환 또는 세포 외 환경에서 ActRIIB 리간드를 표적으로 하는 것은 이러한 리간드가 재생 및 혈관 신생을 포함하여 많은 장기 시스템에 중요하기 때문에 불리하고 심각한 오프-타겟 효과(off-target effects)를 생성할 수 있다(Massague, Nat Rev Mol Cell Biol 13, 616-630, 2012).

예를 들어, ActRIIB의 세포 외 도메인을 주로 구성하는 펩티바디 리간드 트랩(peptibody ligand trap)인 ACE-031의 임상 연구는, 점액 막 및 피부 혈관 확장으로부터의 출혈을 포함하여, 유전성 출혈성 모세 혈관 확장증 (heredity hemorrhagic telangiectasia; HHT) 환자에서 흔히 볼 수 있는 징후가 나타나기 때문에 조기에 중단되었다(Smith & Lin, Curr Opin Support Palliat Care 7, 352-360, 2013). 따라서, 순환에서 ActRIIB 리간드를 표적으로 하는 다른 접근법은 유사한 오프-타겟 효과를 생성할 수 있다. 이 질환은 내피 세포에서 TGFβ 수용체 신호 전달을 궁극적으로 손상시키는 두 가지 신호 전달 단백질인 endoglin 또는 activin-1과 같은 돌연변이로 인해 발생한다. HHT 환자 및 이러한 마우스 모델에서 혈관 완전성은 유사하게 손상된다(Bourdeau et al., J Clin Invest 104, 1343-1351, 1999; Bourdeau et al., Am J Pathol 156, 911-923, 2000; Bourdeau, et al., Trends Cardiovasc Med 10, 279-285, 2000; Bourdeau et al., Am J Pathol 158, 2011-2020, 2001; Satomi, et al., Stroke 34, 783-789, 2003; Torsney et al., Circulation 107, 1653-1657, 2003). 사실, 이 모델은 코, 귀 및 꼬리에 출혈을 일으키는데, 이 모든 것은 외부 검사를 통해 쉽게 볼 수 있으며 부분적으로 꼬리를 잃어 버릴 수도 있다. 출혈의 초점 부위는 육안 검사에서 분명히 드러나지만, 출혈은 또한 몇몇 내부 기관에서 발생하며 간 및 폐에서 조직학적으로 가장 뚜렷하다. 일부 생쥐는 심지어 뇌에서 동정맥 기형으로 뇌졸중을 겪었으며 이것은 근육의 가려움증 및 안검하수증으로 나타났으며 이는 다시 쉽게 발견되었다.

일단 활성화되면, ActRIIB는 타입 I 액티빈 수용체(activin like kinase (ALK) 4/5)를 모집하여 Smad2/3를 인산화시키는 활성화된 ActRIIB:ALK4/5 복합체를 형성한다(Massague, Nat Rev Mol Cell Biol 13, 616-630, 2012). 그런 다음 이러한 수용체 Smads는 Smad4와 결합하여 복합체가 핵에 들어가 E3 유비퀴틴 리가제, MuRF1 및 MAFbx를 상향 조절하고 Akt를 탈인산화시키는 단백질 분해 전사 프로그램을 수정한다(Amirouche et al., Endocrinology 150, 286-294, 2009; Trendelenburg et al., Am J Physiol Cell Physiol 296, C1258-1270, 2009). 이 경로는 또한 Smad2/3 인산화를 방지하고 ActRI 분해를 촉진하는 세포 내 부정적인 피드백 형태로 Smad7 발현을 증가시킨다(Chen et al., Genes Dev 12, 2144-2152, 1998).

잠재적으로 리간드 트랩의 오프-타겟 효과를 피할 수 있기 때문에, 본 발명자들은 리간드(미오스타틴, 액티빈 및 GDF-11) 보다는 세포 내 ActRIIB 신호 경로를 약화시킴으로써 악액질 치료에 대한 개선된 전략을 개발하려고 시도했다. 본 발명자들은 특히 가로무늬근(striated muscle)에서 Smad7 발현이 증가하면 ActRIIB 신호 전달을 약화시킴으로써 근육 소모(muscle wasting)를 개선할 수 있다는 것을 보여 주었다. 리간드 트랩의 잠재적인 오프-타겟 효과를 피하면서 이 목표를 달성하기 위해 우리는 가로무늬근에 특이 친화성(tropism)을 갖는 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터(adeno-associated viral vector)(혈청형 6, rAAV6)를 사용했다(Gregorevic et al., Nat Med 10, 828-834, 2004; incorporated herein by reference). 사실, 본 연구에 의하면 가로무늬근에 특이적으로 Smad7의 과발현은 근량 및 근기능을 향상시킬 뿐만 아니라 암 악액질, 당뇨병, 비만, 심혈관 질환 및 노화를 비롯한 근육 소모의 다른 조건 하에서의 근육 소모를 예방할 수 있다.

특정 측면에서 진행성 암을 가진 환자가 가로무늬근의 심각한 소모에 종종 굴복하게 됨을 보여준다. 순환 ActRIIB 리간드에 길항하여 이를 방지하기 위한 개입이 오프-타겟 효과에 의해 방해되었음에도, ActRIIB의 활성화는 이 이화작용(Catabolism)의 핵심 메커니즘으로 여겨진다. 가로무늬근에 대한 친화성(tropism)을 정의한 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터(혈청형 6, rAAV6)[rAAV:Smad7]로 Smad7을 과다 발현시켜 ActRIIB 신호를 감쇠시킴으로써 건강한 마우스에서 골격근 질량 및 기능을 향상시키면서 C-26 종양을 갖는 마우스에서 종양 크기(tumor burden) 및 pro-cachectic 리간드의 혈청 농도와는 독립적으로 골격 및 심장 근육의 소모를 방지했다.

또 다른 측면에 따르면, rAAV:Smad7은 또한 inhibin-a 녹아웃 마우스 및 미오스타틴 또는 activin A의 과발현으로 소모(wasting)를 방지했다. Smad7 발현은 Smad7 활성에 대한 바이오마커와 같이 가로무늬근에만 국한됨으로서 벗어난 오프-타겟 효과는 발견되지 않았다. 기계적으로, Smad7은 Smad2/3 신호 전달을 폐지하고 위축 관련(atrophy-related) 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligases)인 MuRF1 및 MAFbx의 발현을 억제하였다.

또 다른 측면에 따르면, 이러한 결과는 Smad7의 벡터 매개 근육 특이적 발현이 근육 소모 또는 과도한 ActRIIB 신호 전달을 방지하기 위한 새로운 접근일뿐만 아니라 심각한 오프-타겟 효과의 제한된 위험(limited risks)으로 근량 및 근기능을 향상시키는 수단임을 나타낸다.

따라서, 본원발명에서는 rAAV 구조물이 근육 세포에서 Smad7 유전자 또는 cDNA의 발현(구성적으로 또는 달리)을 제공하는, 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 구조물에서 Smad7 유전자 또는 cDNA를 포함하는 조성물이 제공된다. 이러한 조성물은 이에 한정되지 않으나, 특정 실시양태에서 rAAV 구조물은 혈청형 6(rAAV6), 혈청형 8(rAAV8) 또는 혈청형 9(rAAV9)이다. 상기 조성물은 이에 한정되지 않으나, 특정 실시양태에서 Smad7 유전자 또는 cDNA는 인간, 마우스, 말, 소, 양, 개 또는 돼지 유래의 것일 수 있다.

추가적인 구체예에서, rAAV 구조물은 근육 세포에서 Smad7 유전자 또는 cDNA의 발현을 지시하는 조직 특이적 프로모터 또는 인핸서(enhancer)를 포함한다. 대안으로, rAAV 구조물은 심근 세포, 골격근 세포 또는 둘 다에서 Smad7 유전자 또는 cDNA의 발현을 제공한다. 또한 추가적인 구체예에서, rAAV 구조물은 근육 세포 또는 심장 세포에 Smad7 유전자 또는 cDNA의 발현을 제한하는 조직 특이적 사일렌서(silencer)를 포함한다.

하나의 추가적인 실시양태는 본원에서 제공되는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 구조물에서 Smad7 유전자 또는 cDNA를 포함하는 약학적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 근량 및/또는 근력을 증진시키는 방법이다. 이러한 방법의 예에서, 개체는 근력 소모 장애 또는 질병으로 진단되지 않은 것이다. 예를 들어, 이러한 방법에서 개체는 일반적으로 건강할 수 있다. 따라서, 본원에서 고려되는 것은 개체의 근량 및/또는 근력 강도를 기준 또는 '정상' 이상으로 향상시키는 조성물 및 방법의 미용적 또는 선택적인 용도이다.

다른 실시양태는 암 악액질이 있다고 진단된 개체에서 근육 소모(예를 들어, 심장 근육, 골격근 또는 둘 모두의 소모)를 치료하는 방법으로서, 암 악액질을 갖는 개체를 선택하는 단계 및 개체에게 치료적 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조성물은 rAAV 구조물이 근육 세포에서 Smad7 유전자 또는 cDNA의 발현(구성적으로 또는 달리)을 제공하는, 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 구조물에서 Smad7 유전자 또는 cDNA를 포함하는 조성물 중 어느 하나의 조성물이다. 또한 이러한 조성물을 사용하여 근력 및/또는 근량을 증가시켜 근육 소모를 치료하는 방법이 제공된다. 추가의 실시양태는 치료적 유효량의 이러한 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하여, 환자에서 근육 소모를 억제 또는 예방하는 방법이다.

치료 방법의 실시예에서, 일부 경우에 근육 소모는 만성 장애에 의해 유발된다. 이에 한정되지 않으나, 만성 장애는 암, 노화(근육 감소증(sarcopenia)), 근육성 이영양증(muscular dystrophy), 근병증(myopathies), 신장 질환(kidney disease), 만성 폐색성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disorder), 만성 감염(chronic infection), 에이즈, 불용성 위축증(disuse atrophy), 신경 근육 부상(neuromuscular injury), 신경장해(neuropathies), 비만, 심혈관 질환(cardiovascular disease), 또는 이들 중 둘 이상의 조합을 포함한다. 또는 근육 소모는 미세 중력 스트레스(microgravity stress)에 의해 유발된다.

제공된 방법 실시양태 중 임의의 경우에서, 조성물은 일부의 경우 근육 내 또는 정맥 내 주사를 통해 전달될 것이다.

제공된 방법 실시양태 중 임의의 방법에서, rAAV를 투여하는 것은 어떤 경우에는 rAAV의 단일 투여를 포함할 것이다. 다른 경우, 이 방법은 rAAV의 다회 투여를 포함할 것이다.

전술한 특징 및 다른 특징 및 이점은 첨부된 도면을 참조하여 진행되는 몇몇 실시예에 대한 다음의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.

도 1A-1I는 특정 측면에 따라, Smad7의 발현의 증가는 골격근 비대를 촉진 시킨다는 것을 보여준다. (도 1A-1B) 마우스 사지 근육의 rAAV6:Smad7 주사는 7일에서 28일 사이에 근육량을 증가시켰다. (도 1C-1D) 근육 비대(Muscle hypertrophy)는 증가된 근섬유 직경과 관련된다(*, p= 0.03 vs. 대조군, 처리구 당 3개의 근육에서 계산된 500개의 근섬유, t-test). 스케일 바, 100 μm. (도 1E-1F) 마우스에게 IV를 rAAV6:Smad7을 와 함께 주사하였고, 28일 후 TA의 비대(*, p= 0.02 vs. 대조군, n= 3, t-test), 대퇴사의 사두근(quadriceps)(*, p= 0.004 vs. 대조군, n= 3, t-test) 및 삼두근(triceps muscles)(*, p= 0.003 vs. 대조군, n= 3, t-test) 및 TA, 대퇴사 사두근 및 심장에서의 Smad7 단백질 발현의 증가. (도 1G) rAAV6:Smad7은 투여 후 3가지 시점(*, p= 0.006 vs. 대조군, n= 4, t-test) 모두에서 Smad3의 인산화를 억제하였다. (도 1H) rAAV6:Smad3-CA(n= 3), rAAV6:Smad7(n= 5), 또는 rAAV6:Smad7 및 rAAV6:Smad3-CA(n= 5) 중 어느 하나를 주사한 마우스를 TA 질량 및 단백질 발현에 대한 효과에 대해 치료 28일 후에 검사하였다(*, p <0.001 vs. 대조군, #, p <0.001 vs. 대조군, +, p <0.001 vs. Smad7, by one-way ANOVA). (도 1I) 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 조직(cryosections)은 rAAV6:Smad7 및 rAAV6:Smad3-CA를 투여한지 28일 후 rAAV6:Smad7 단독 투여에 비해 근육 내 작은 근육 섬유를 나타내었다. 스케일 바, 100 μm.
도 2A-2D는 특정 측면에 따라, rAAV6:Smad7 전신투여의 특이성 및 골격근 비대의 유도를 나타낸다. (도 2A) rAAV6:Smad7의 정맥 내 투여 후 마우스의 골격근 및 심장에서 Smad7 단백질 발현(웨스턴 블럿팅으로 측정)이 검출되었지만 간, 신장, 폐, 비장 또는 지방에서는 검출되지 않았다. (도 2B) C26 종양을 가진 야생형 마우스(sham) 및 rAAV6:Smad7을 주사한 C26 마우스의 비 근육 조직(non-muscle tissues)에서 Smad2/3 유전자 표적의 유전자 발현(CTGF, 결합 조직 성장 인자; COL1A1, 콜라겐 타입 1a1, PAI1, 플라스미노겐 활성제 억제제 1, FN, 피브로넥틴). C26 및 C26+Smad7 사이의 유의한 차이는 발견되지 않았다(sham과 비교하여 *p <0.05). (도 2C) Van Gieson stain을 이용한, rAAV6:Smad7을 투여한 마우스 조직에서 손상되지 않은 혈관 및 출혈이 없는 조직 학적 증거. (도 2D) 대표적인 헤마톡실린 및 에오신 염색된 조직(cryosections)(스케일 바, 100 ㎛)에 의해 입증된 바와 같이, 근섬유 직경은 rAAV6:Smad7에 의해 증가하였다.
도 3A-3G는 특정 측면에 따라, Smad7은 Akt 및 mTOR 신호 전달과 독립적으로 골격근 성장을 조절한다. (도 3A) 근육 내 rAAV6:Smad7 주사 후 14일째에 조사한 근육은 단백질 합성의 분율(fractional rates)을 상향 조절하였다(n= 5-6, t-test). (도 3B) 마우스에게 rAAV6:Smad7을 주사하였고, 28일 후에, Akt^S473 또는 그의 기질인 GSK3β^{S9 /21} 및 TSC2^S939의 인산화가 증가하지 않았다(ND= 차이 없음, n= 6-7, t-test). rAAV6:Smad7은 S6RP^{S235 /236}(치료구 당 n= 6, t-test) 및 4EBP1^{T37 /42}(치료구 당 n= 4-5, t-test)의 인산화를 증가시킨다. (도 3C) Akt 키나아제 활성은 rAAV6:Smad7 전달 28일 후 변경되지 않았다. Neg= ATP가 첨가되지 않은 음성 대조군. pAkt는 총 Akt 수준으로 표준화(normalized)하였다(n = 5, t-test). (도 3D) 라파마이신 투여는 S6RP^{S235 /236}(n= 4-5, 양방향 ANOVA) 및 4EBP1^{T37 /43}(n= 3, two-way ANOVA)의 인산화를 억제하였다. (도 3E) rAAV6:Smad7(n= 6)으로 처리된 동물에게 라파마이신을 매일 투여하였다. 대측성 조절 근육(contralateral control muscle)에 대한 백분율 변화로 표현되는 경골전방(Tibialis anterior; TA) 질량. (도 3F) rAAV6:Smad7은 치료 후 14일 MAFbx(n= 9-11, t-test) 및 MuRF1(n= 9-11, t-test)의 전사를 억제하는 반면 rAAV6:Smad3-CA는 모두(n=4, t-test) 증가시켰다. (도 3G) rAAV6:Smad3-CA와 rAAV6:Smad7의 동시 투여는 MAFbx(n= 5) 및 MuRF1(n= 5) 전사에 대한 Smad7의 억제 효과를 예방하였다(n= 5, t-test).
도 4A-4G는 특정 양상에 따라, Smad7은 미오스타틴 및 액틴이 유도된 근육 위축을 방지한다. (도 4A-4B) 근육량 및 근섬유는 야생형 및 미오스타틴-null 마우스에서 rAAV6:Smad7의 국부 투여 후 14일(*, p<0.001 vs. Mstn+/+ control, #, p=0.003 vs. Mstn-/- control, +, p<0.001 vs. Mstn-/- control, n=5-6, two-way repeated measures ANOVA) 및 28일(*, p<0.001 vs. Mstn+/+ control, #, p=0.001 vs. Mstn-/- control, +, p=0.01 Mstn-/- vs. Mstn+/+, n=6-8, two-way repeated measures ANOVA)에서 조사하였다. 스케일 바= 100 μm. (도 4C) Smad7은 28일 후 미오스타딘-null 마우스에서 비교적 적은 비대를 유도하였다(*, p=0.03 vs. 대조군, two-way ANOVA). (도 4D) Smad7에 의한 Smad3^{S432 /435} 인산화의 억제는 야생형(wild-type) 마우스 (*, p=0.001 vs. control, n=4, two-way repeated measures ANOVA)와 비교하여 미오스타틴-null 마우스(*, p=0.006 vs. control, n=4, two-way repeated measures ANOVA)에서 보존되었다. (도 4E-4F) 치료 28일 후, rAAV6:Smad7 단독 투여 또는 rAAV6:미오스타틴(*, p<0.001 vs. control, #, p<0.001 vs. control, +, p=0.004 vs. Smad7, n=7-15, one-way ANOVA) 또는 rAAV6:Activin A(*, p<0.001 vs. control, #, p=0.003 vs. control, n=3-6, one-way ANOVA). (도 4G) Smad7의 존재하에서, 미오스타틴(*, p=0.015 vs. control, #, p<0.001 vs. control, +, p<0.001 vs. Mstn treatment, n=4-9, one-way ANOVA) 또는 액티빈 A(*, p=0.01 vs. control, #, p<0.001 vs. control, treatment, +, p<0.001 vs. Act A treatment n=5-7, one-way ANOVA)를 발현하는 근육에서 Smad3^{S432 /435} 인산화.
도 5A-5C는 특정 양태에 따라, 미오스타틴 및 액티빈 A가 rAAV6:Smad7의 단일 투여 동안 또는 동시 투여되는 동안 동등하게 발현됨을 보여준다. (도 5A) 액티빈 A 및 (도 5B) 미오스타틴 트랜스진 유전자 발현은 rAAV6 투여 28일 후 RT-PCR에 의해 확인되었다. 액티빈 A 또는 미오스타틴 유전자 발현 수준은 액티빈 A 또는 미오스타틴 단독의 발현 수준과 비교하여 Smad7과 함께 발현될 때 다르지 않았다(ND= 차이 없음, n= 3-6, t-test). (도 5C) rAAV6:Smad7 및/또는 rAAV6:Mstn을 투여한 경우와 비슷하게 마우스의 경골전근(tibialis anterior muscle)에서의 미오스타틴 단백질 수준. 액티빈 A 단백질 수준은 또한 rAAV6:ActA를 투여한 마우스에서 측정되었지만, ActA가 분비되고 세포 내외로 저장되지 않았기 때문에 검출되지 않았다.
도 6A-6I는 특정 측면에 따라, C-26 종양 이식에 의해 유발된 암 악액질(cancer cachexia)을 보여준다. (도 6A) 시험 전 21일간의 C-26 종양의 이식은 체질량의 25% 감소를 유도하였다(*, p<0.001 vs. control, tumor-free mass, n=13-14, t-test). (도 6B-6C) C-26 종양 보유 마우스에서 대퇴부 사두근(Quadriceps) 및 심장 질량이 감소되었다(*, p<0.001 vs. control, n=13-14, t-test). (도 6D) C-26 종양을 갖는 마우스에서 부고환(Epididymal) 지방량이 감소되었다(*, p<0.001 vs. control, n=6-7, t-test). (도 6E) 증가된 Smad7 발현은 C-26 종양 보유 마우스의 원위치에서 TA 근육에 의해 생성된 peak tetanic force(*, p<0.001 vs. control, #, p=0.03 vs. control, n=8-9, two-way ANOVA)의 손실을 방지하였다. (도 6F) IIa 형 및 IIx/b 형 섬유의 영역(비 반응성)을 평가하기 위해, TA 근육의 단면을 라미닌(적색) 및 MHCIIa(IIa 형, 녹색)으로 라벨하였다. (도 6G) Smad7은 종양 보유 마우스의 근육에서 IIa 형(*, p<0.001 vs. control, #, p<0.001 vs. control, +, p<0.001 vs. C-26, n=8, two-way ANOVA) 및 IIx/b 형(*, p=0.002 vs. control, +, p=0.001 vs. C-26, n=8, two-way ANOVA) 섬유 영역에서 면적 감소를 방지하였다. (도 6H-6I) 섬유형 비율은 건강한 마우스 및 rAAV6:Smad7 또는 가짜(sham) 벡터를 수신하는 종양 보유 마우스의 근육 비율이다(*, p=0.02 vs. control group, n=8, two-way ANOVA).
도 7A-7K는 특정 측면에 따라, 증가된 Smad7 발현이 암 악액질을 예방하는 것을 보여준다. (도 7A) C-26 종양을 투여받은 마우스의 사지 근육(limb muscles)에 전달된 rAAV6:Smad7은 질량(*, #, p<0.001 vs. control, +, p<0.001 vs. C-26, n=11-14), (도 7B) 힘 생산 용량(force producing capacity)(*, #, p<0.001 vs. control, +, p<0.001 vs. C-26, n=11-14) 및 (도 7C) 근육 섬유 단면적(CSA, *, #, p<0.001 vs. control, +, p<0.001 vs. C-26, n=8)을 보존한다. (도 7D) 건강 및 종양 보유 마우스로부터의 근육에서의 Smad7 발현(웨스턴 블롯). (도 7E) 종양 이식 후(종양 질량이 커지는 경우, 오른쪽 패널) rAAV6:Smad7 전달 7일(*, p<0.001 vs. control, #, p=0.01 vs. control, +, p<0.001 vs. C-26 control, n=5-7) 14일(*, p=0.03 vs. control, #, p=0.004 vs. control, +, p=0.02 vs. C-26 control, n=5-6) 후에 근육량(muscle mass)을 보존하였다(*, p<0.001 vs. 7 days, n=10, t-test). (도 7F) 전신 rAAV6:Smad7 처리는 체질량 손실을 감소시키고(*, p=0.005 vs. control, #, p<0.001 vs. control), 및 (도 7G) 근육량 손실을 방지하였다(Gastrocnemius - Ga, *, p<0.001 vs. control, #, p<0.001 vs. control, +, p=0.04 vs. C-26, n=4-7. Quadriceps - Qd, *, p<0.001 vs. control, #, p<0.001 vs. control, +, p=0.01 vs. control, n=4-14. Triceps - Tr, *, p<0.001 vs. control, #, p=0.002 vs. control, +, p=0.007 vs. C-26, n=4-14.). (도 7H) sham 또는 rAAV6:Smad7을 투여한 대조군 및 종양 보유 마우스의 이미지. (도 7I) sham 또는 rAAV6:Smad7을 투여한 대조군 및 종양 보유 마우스로부터의 TA 근육의 헤마톡실린 및 에오신(Hematoxylin & eosin) 염색된 절편(cryosections). (도 7J) rAAV6:Smad7 주입 4주 후 inhibin-null 마우스(inha-KO)에서 TA 근육량(*, p<0.001 vs. groups, n=4) 및 (도 7K) 근섬유 지름(*, p=0.02 vs. control, #, p=0.004 vs. control, +, p=0.006 vs. inha-KO). 데이터가 표시되지 않은 경우 two-way ANOVA로 분석된다. 스케일 바, 100 μm.
도 8A-8K는 특정 측면에 따라, 전신 rAAV6:Smad7 투여가 내장 기관(visceral organ) 질량 또는 지방량에 영향을 미치지 않는 것을 보여준다. (도 8A-8B) 건강 및 종양 보유 마우스로부터 Smad7 단백질 및 유전자 발현을 심장(*, p=0.001 vs. control, n=3, one-way ANOVA), 대퇴 사두근(*, p=0.02 vs. control, n=3, one-way ANOVA) 및 TA 근육(+, p=0.008 vs. control, n=3, one-way ANOVA)에서 확인하였다. (도 8C) TA 근육량은 전신 rAAV6:Smad7 투여에 의해 보존되었다(*, p<0.001 vs. control, #, p<0.001 vs. control, +, p<0.001 vs. C-26, n=8-14, two-way ANOVA). (도 8D) 대표적인 이미지는 rAAV6:Smad7이 삼두근 및 대퇴사두근 근육량을 보존한다는 것을 입증한다. (도 8E) 가짜 벡터(sham vector)를 갖는 C-26 종양 보유 마우스 또는 rAAV6:Smad7 사이에서는 종양 질량이 상이하지 않았다(ND = 그룹간에 차이 없음, n= 8-14, t-test). (도 8F-8G) 전신 rAAV6:Smad7 투여는 종양에 의한 간(*, p=0.004 vs. control, n=8-14, two-way ANOVA), 신장(*, p<0.001 vs. control, n=4-7, two-way ANOVA) 또는 부고환 지방 질량(epididymal fat mass)의 손실을 예방하지 않았다. (도 8H-8U) 전신 rAAV6:Smad7 투여는 종양 보유 마우스에서 심장 위축(cardiac atrophy)(경골 길이에 대해 표준화된 질량)을 예방하였다(*, p<0.001 vs. control, #, p<0.001 vs. control, +, p<0.001 vs. C-26, n=7-11, two-way ANOVA). 헤마톡실린 및 에오신 스케일 바, 100 μm. 사진 스케일, 0.2cm. (도 8J) 심방 무게(Atrial weight)는 경골 길이(tibial bone length) 이상으로 정상화되었다. (도 8K) Smad7은 심방 무게 또는 폐 질량에 영향을 미치지 않았다(경골 길이로 표준화, ND= 차이 없음, n=4-11, two-way ANOVA).
도 9A-9C는 특정 측면에 따라, inhibin-null 마우스가 제지방(lean) 및 지방량의 점진적인 감소를 나타낸다는 것을 보여준다. (도 9A) 6주령의 inhibin-αnull mice 및 이들의 동성 대조군(littermate controls)에서, 지방량(*, p=0.001 vs. 11 week old WT control, +, p<0.001 vs. 12 week old WT control), 제지방량(*, p=0.04 vs. 9 week old WT control, +, p=0.005 vs. 10 week old WT control, #, p<0.001 vs. 11-12 week old WT controls) 및 총 체중(*, p=0.008 vs. 10 week old WT control, +, p<0.001 vs. 11-12 week old WT controls)을 평가하였다(n=4, Data analyzed by two-way ANOVA). (도 9B) 한배새끼(litter mates) 야생형과 비교하여, inhibin-αnull 마우스에서 생식선 종양 질량(Gonadal tumor mass)이 증가하였다(*, p=0.008 vs. WT controls, t-test, n=4). (도 9C) inhibin-αnull 마우스의 대퇴사두근 질량은 WT 대조군에 비해 감소하였다(*, p=0.001 vs. WT controls, t-test, n=4).
도 10A-10F는 특정 측면에 따라, Smad7은 암 악액질에서 근육 위축을 예방하기 위한 표준(canonical) TGFβ 신호 전달 경로 및 E3 리가아제 발현을 조절함을 보여준다. (도 10A) 악액질 마우스에서 액티빈 A 및 액티빈 B의 혈청 수준을 측정 하였다(UD= 미확인, *, p <0.001 vs. 대조군, n = 4-11, t-test). (도 10B) 종양을 주입하고 rAAV6:Smad7을 주입한 후 21일째에 혈청을 수집하고 C2C12 세포로 활성화 된 Smad2/3 리포터 검정에 사용하였다(*, p=0.01 vs. control, n=3, repeated three times, two-way ANOVA, ND= 차이 없음). (도 10C) Smad3^{S432 /435} 인산화는 rAAV6:Smad7로 처리한 C-26 종양 보유 마우스(*, p=0.01 vs. control, #, p=0.005 vs. control, +, p<0.001 vs. C-26, n=8-13, two-way ANOVA), inhibin-αnull 마우스(*, p=0.03 vs. control, #, p<0.001 vs. control, +, p<0.001 vs. inhibin-α null, n=4, two-way ANOVA)로부터 TA 근육에서 측정하였다. (도 10D) 총 Foxo 단백질 수준을 건강한 마우스 및 종양 보유 마우스에서 웨스턴 블로팅 Foxo1(*, p<0.001 vs. control, #, p=0.04 vs. C-26, n=5-6 per treatment, two-way repeated measures ANOVA) 및 Foxo3 (*, p<0.001 vs. control, #, p=0.04 vs. C-26, n=5-6 per treatment, two-way repeated measures ANOVA)으로 확인하였다. (도 10E-10F) Smad7은 Foxo1(*, p<0.001 vs. control, #, p<0.001 vs. C-26, n=5-8, two-way ANOVA) 및 Foxo3 (*, p=0.002 vs. control, #, p=0.004 vs. C-26, n=5, two-way ANOVA) 뿐만 아니라, MuRF1 (*, p<0.001 vs. control, #, p<0.01 vs. C-26, n=4-8, two-way ANOVA) 및 MAFbx의 전사를 억제하였다(*, p<0.001 vs. control, #, p<0.001 vs. C-26, n=4-8, two-way ANOVA).
도 11a-11e는 특정 측면에 따라, Smad7은 악액질에서 Foxo 인산화 또는 NF-κB 신호화를 변경시키지 않는다는 것을 보여준다. (도 11A) 종양을 이식하고 rAAV6:Smad7 또는 가짜 벡터(sham vector)를 주입한 21일 후에 혈청 액틴빈 A 수준을 ELISA를 통해 측정하였다(*, p<0.001 vs. control, n=4 per cohort, two-way ANOVA). (도 11B) rAAV6:Smad7 또는 가짜 벡터로 처리된 종양 보유 마우스에서의 혈청 IL-6 수준을 ELISA(n= 4-5)를 통해 측정하였다. C-26 종양을 보유하고 rAAV6:Smad7로 처리된 마우스의 TA 골격 근육에서의 (도 11C) Stat3, (도 11D) p65 및 (도 11E) Foxo1/3 인산화(*, p<0.02 vs. control, n=5-11, two-way ANOVA).

도 12는 Smad7 AAV 벡터, pAAV-MCS_smad7stp 081809.cep의 맵을 보여준다; 상응하는 서열은 서열번호 3(6108 염기쌍)으로 제공된다.

서열목록

수반되는 서열 목록에 기재된 핵산 및 아미노산 서열은 37 C.F.R. 1.822에서 정의된 바와 같이, 뉴클레오티드 염기에 대한 표준 문자 약어 및 아미노산에 대한 3 문자 코드를 사용하여 나타낸다. 각각의 핵산 서열의 단지 하나의 가닥만을 나타내지만, 상보적 가닥은 개시된 가닥에 대한 임의의 레퍼런스에 의해 포함되는 것으로 이해된다.

서열번호 1 및 2는 액티빈 A(F: GGAGTGTGATGGCAAGGTCAACA, R: GTGGGCACACAGCATGACTTA)를 검출하는데 사용되는 대표적인 순방향 및 역방향 프라이머이다.

서열번호 3 및 4는 미오스타틴 (F: CCCAGAGGTTCAGCAGGCCCT, R: TCATGAGCACCCACAGCGGTC)을 검출하는데 사용되는 대표적인 순방향 및 역방향 프라이머이다.

서열번호 5는 Smad7 AAV 벡터 pAAV-MCS_smad7stp 081809.cep의 서열이다.

I. 약어

AAV: 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus)

ActRIIB: 타입 IIB 액티빈 수용체(Type IIB activin receptor)

ALK: 액티빈 유사 키나아제(activin like kinase)

IEE: 통합 효율 요소(integration efficiency element)

ITR: 반전 말단 반복부(inverted terminal repeat)

CTGF: 결합 조직 성장 인자(connective tissue growth factor)

COL1A1: 콜라겐 1a1 형(collagen type 1a1)

FN: 피브로넥틴(fibronectin)

ND: 차이 없음(not different)

ORF: 오픈 리딩 프레임(open reading frame)

PAI1: 플라스미노겐 활성제 억제제 1(plasminogen activator inhibitor 1)

rAAV: 재조합 AAV(recombinant AAV)

SEM: 평균의 표준 오차(standard error of the mean)

TA: 전경골(tibialis anterior)

TRS: 터미널 해결 사이트(terminal resolution site)

WT: 야생형(wild type)

II. 용어 및 방법

달리 명시하지 않는 한, 기술 용어는 일반적인 사용법에 따라 사용된다. 분자 생물학의 일반적인 용어 정의는 Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)에서 찾을 수 있다.

본 명세서에서 개시된 다양한 실시예들의 검토를 용이하게 하기 위해, 특정 용어에 대한 다음의 설명이 제공된다:

아데노 관련 바이러스( Adeno -associated virus; AAV ): 인간 및 다른 영장류를 감염시키는 작고, 복제에 결함이 있고, 외피가 없는(non-enveloped) 바이러스. AAV는 질병을 일으키는 것으로 알려져 있지 않고 매우 경미한 면역 반응을 유발한다. AAV를 이용하는 유전자 치료 벡터는 분열(dividing) 세포와 정지(quiescent) 세포 모두를 감염시킬 수 있으며 숙주 세포의 게놈에 통합되지 않으면 염색체 외의 상태(extrachromosomal state)로 유지될 수 있다. 이러한 특징은 AAV를 유전자 치료법(gene therapy)을 위한 매력적인 바이러스 벡터로 만든다. 현재 11개의 인정 된 AAV(AAV1-AAV11)의 혈청형(serotype)이 존재한다.

투여(Administration/Administer): 임의의 효과적인 경로에 의해, 치료제(예: 재조합 AAV)와 같은 약제를 개체에 제공하는 것. 예시적인 투여 경로는 주사(피하, 근육내, 피내, 복강내 및 정맥내), 경구(oral), 관내(intraductal), 설하(sublingual), 직장(rectal), 경피(transdermal), 비내(intranasal), 질(vaginal) 및 흡입(inhalation) 경로를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.

코돈 최적화( Codon -optimized): "코돈-최적화된" 핵산은 코돈이 특정 시스템(특정 종 또는 종의 그룹)에서의 발현이 최적이 되도록 변경된 핵산 서열을 지칭한다. 예를 들어, 핵산 서열은 포유동물 세포 또는 특정 포유류종(예를 들어, 인간 세포)에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 암호화된 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는다.

증강인자 ( Enhancer ): 프로모터의 활성을 증가시킴으로써 전사 속도를 증가시키는 핵산 서열.

감염성(Infective): 바이러스 또는 벡터가 세포를 형질 전환하고, 복제하고, (상보적인 바이러스 또는 벡터의 도움을 받지 않고) 원래의 형질 전환 바이러스 또는 벡터와 동일한 유형의 자손 벡터 또는 바이러스를 유기체 또는 세포 배양물 내의 다른 세포에 퍼뜨리는 경우, 바이러스 또는 벡터는 "감염성"이며, 여기서 자손 벡터 또는 바이러스는 유기체 또는 세포 배양물 전체에서 번식하고 퍼뜨리는 같은 능력은 가진다. 따라서, 예를 들어, 핵산이 세포를 형질 감염시키는데 사용될 수 있다고 하더라도, 핵산을 포장할 수 없다면(예를 들어, 아데노 바이러스 입자의 포장 부위(packaging site)가 결여된 경우), 아데노 바이러스 입자를 암호화하는 핵산은 감염성이 아니다. 유사하게, 아데노 바이러스 입자에 의해 포장된 아데노 바이러스 핵산은 포장되는 아데노 바이러스 캡시드(capsid) 단백질을 코딩하지 않으면 감염성이 없다.

인트론 ( Intron ): 단백질에 대한 코딩 정보를 포함하지 않는 유전자 내의 DNA 범위(stretch). 인트론은 메신저(messenger) RNA가 번역되기 전에 제거된다.

반전 말단 반복부 (Inverted terminal repeat; ITR ): 효율적인 복제를 위해 필요한 아데노 관련 바이러스 게놈의 대칭 핵산 서열. ITR 서열은 AAV DNA 게놈의 각 말단에 위치한다. ITR은 바이러스성 DNA 합성을 위한 복제의 기점으로 작용하며 AAV 통합 벡터를 생성하는 데 필수적인 시스(cis) 구성 요소이다.

분리된(Isolated): "분리된" 생물학적 성분(핵산 분자, 단백질, 바이러스 또는 세포와 같은)은 생물체의 세포 또는 조직 내의 다른 생물학적 성분 또는 생물체 자체로부터 실질적으로 분리되거나 정제되어, 여기서 다른 염색체 및 여분 염색체(extra-chromosomal) DNA 및 RNA, 단백질 및 세포와 같이 발생한다. "분리된" 핵산 분자와 단백질에는 표준 정제 방법으로 정제된 단백질이 포함된다. 이 용어는 또한 화학적으로 합성된 핵산 분자 및 단백질뿐만 아니라 숙주 세포에서의 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 분자 및 단백질을 포함한다.

포유 동물(Mammal) : 이 용어는 인간 및 비인간 포유동물 모두를 포함한다. 유사하게, "개체(subject)"라는 용어는 인간 및 가축 개체(veterinary subjects)를 모두 포함한다.

작동 가능하게 연결된(Operably linked): 제 1핵산 서열은 제 1핵산 서열이 제 2 핵산 서열과 기능 관계에 있을 때 제 2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 주면 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 연속적이며, 필요한 경우 두 개의 단백질 코딩 영역을 동일한 판독 프레임(reading frame)에서 결합시킨다.

패키징 세포(Packaging cell): 전달 벡터로 세포에 도입된 유전자에 대해 패키징 기능을 제공하지만 자체 게놈을 캡슐화하지 않는 세포.

패키징 벡터(Packaging Vector): 패키징 벡터 핵산은 아데노 바이러스 캡시드 내로의 패키징 벡터 핵산에 상응하는 DNA의 패키징에 필요한 핵산이 결여되어 있다. 즉, 패키징 벡터 핵산은 그 자체가 암호화하는 바이러스 입자 내에 캡슐화되지 않으며, 즉 감염성이 아니다. 패키징 벡터는 임의로 바이러스 입자의 생산에 필요한 모든 성분을 포함하거나 선택적으로 바이러스 포장에 필요한 성분의 서브 세트(subset)를 포함한다. 예를 들어, 패키징 세포는 하나 이상의 패키징 벡터로 형질 전환될 수 있으며, 각각은 아데노 바이러스 입자의 생산에 보완적인 역할을 한다.

두 개(또는 그 이상)의 아데노 바이러스 기반 패키징 벡터는 아데노 바이러스 패키징에 필요한 모든 기능을 함께 인코딩할 때와 각각 개별적으로 패키징에 필요한 모든 기능을 인코딩하지 않을 때 "상보적"이다. 예를 들어, 두 벡터가 단일 세포를 형질 전환하고 아데노 바이러스 포장 입자를 생산하기 위한 정보를 함께 암호화할 때 두 벡터는 서로 상보적이다. 상보적인 벡터의 사용은 재조합 이벤트(recombination event)가 감염성 바이러스를 생성할 가능성을 줄임으로써 패키징 벡터로 형질 전환함으로써 제조된 모든 패키징 세포의 안전성을 증가시킨다.

약학적으로 허용 가능한 담체 (Pharmaceutically acceptable carrier): 본원에서 유용한 약학적으로 허용 가능한 담체(비히클)은 통상적이다. E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition(1975)에 의한 Remington's Pharmaceutical Sciences는 하나 이상의 치료 화합물, 분자 또는 제제의 약학적 전달에 적합한 조성물 및 제형을 기술한다.

일반적으로, 담체의 성질은 사용되는 특정 투여 방식에 의존할 것이다. 예를 들어, 비경구용 제형은 통상적으로 물, 생리 식염수, 평형 염용액(balanced salt solutions), 수성 덱스트로스(aqueous dextrose), 글리세롤 또는 비히클 등과 같은 약학적으로 및 생리학적으로 허용 가능한 유체를 포함하는 주사 가능한 유체를 포함한다. 고체 조성물(예: 분말, 환제, 정제 또는 캡슐 형태)의 경우, 통상적인 비독성 고체 담체는 예를 들어 약학 등급의 만니톨, 락토오스, 전분 또는 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate)를 포함할 수 있다. 생물학적으로 중성인 담체 이외에, 투여될 약제 조성물은 소량의 비 독성 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 방부제 및 pH 완충제 등, 예를 들어 소듐 아세테이트(sodium acetate) 또는 소르비탄 모노라우레이트(sorbitan monolaurate)를 함유할 수 있다.

질병의 예방, 치료 또는 개선: 질병(예: 암) 또는 질병(예: 암 악액질)과 관련된 증상을 "예방"하는 것은 질병이나 증상이 완전히 발달하지 못하게 하는 것을 의미한다. "치료"는 질병이나 병리학적 상태의 징후 또는 증상이 발전하기 시작한 후에 이를 완화시키는 치료적 개입을 의미한다. "개선"은 질병의 징후 또는 증상의 수 또는 중증도 감소를 의미한다.

프로모터(Promoter): 핵산(예: 유전자)의 전사를 지시/시작하는 DNA 영역. 프로모터는 전사의 개시 위치 부근에 필요한 핵산 서열을 포함한다. 전형적으로, 프로모터는 그들이 전사하는 유전자 근처에 위치한다. 프로모터는 선택적으로 전사의 개시 위치로부터 수천 염기쌍만큼 위치할 수 있는 말단 인핸서 또는 리프레서(repressor) 요소를 또한 포함한다.

정제됨(Purified): "정제된"이란 용어는 절대적인 순도를 요구하지 않는다; 오히려 그것은 상대적 용어로 의도된다. 따라서, 예를 들어, 정제된 펩타이드, 단백질, 바이러스 또는 다른 활성 화합물은 자연적으로 결합 된 단백질 및 다른 오염물로부터 전체 또는 부분적으로 분리된 화합물이다. 특정 실시양태에서, 용어 "실질적으로 정제된"은 세포, 세포 배양 배지 또는 다른 조질의 제조물(crude preparation)로부터 분리된 펩타이드, 단백질, 바이러스 또는 다른 활성 화합물을 지칭하고 분획화하여 초기 제조물의 단백질, 세포 잔해 및 기타 구성 요소와 같은 다양한 성분을 제거한다.

재조합체 (Recombinant): 재조합 핵산 분자는 자연 발생적이지 않은 서열을 갖는 것 또는 그렇지 않으면 분리된 두 서열의 인위적인 조합에 의해 만들어진 서열을 갖는 것이다. 이러한 인위적 조합은 화학적 합성 또는 유전자 공학 기술에 의한 것과 같이 핵산 분자의 분리된 단편의 인공 조작에 의해 달성될 수 있다.

유사하게, 재조합 바이러스는 자연적으로 발생하지 않거나 상이한 기원의 적어도 2개의 서열의 인공적 조합에 의해 만들어진 서열(게놈 서열과 같은)을 포함하는 바이러스이다. 용어 "재조합체"는 또한 천연 핵산 분자, 단백질 또는 바이러스의 일부의 첨가, 치환 또는 결실에 의해서만 변경된 핵산, 단백질 및 바이러스를 포함한다. 본 명세서에 사용된 "재조합 AAV"는 재조합 핵산 분자(Smad7을 코딩하는 재조합 핵산 분자와 같은)가 포장된(packaged) AAV 입자를 지칭한다.

서열 상동성 (Sequence Identity): 2개 이상의 핵산 서열 또는 2개 이상의 아미노산 서열 사이의 동일성 또는 유사성은 서열 간의 동일성 또는 유사성의 관점에서 표현된다. 서열 동일성은 퍼센트 동일성의 관점에서 측정될 수 있다; 비율이 높을수록 서열이 상동적이다. 서열 유사성(Sequence similarity)은 유사성 백분율 (보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)을 고려한 유사성)으로 측정할 수 있다; 비율이 높을수록 서열이 유사하다. 핵산 또는 아미노산 서열의 동족체(Homologs) 또는 오르소로그(ortholog)는 표준 방법을 사용하여 정렬될 때 비교적 높은 정도의 서열 상동성/유사성을 갖는다. 이 상동성은 매우 먼 친척인 종(인간 및 C. elegans)과 비교하여, 매우 밀접한 관련이 있는 종(인간 및 마우스 서열)으로부터 유래한 오르소로그한 단백질 또는 cDNA에서의 상동성이 매우 중요하다.

비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘은 Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992; and Pearson et al., Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990에서 서열 정렬 방법 및 상동성 계산에 대한 상세한 고려사항을 제시한다.

NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 : 403-10, 1990)은 국립 생물 정보 센터(NCBI)와 서열 분석 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx을 이용하여 사용하는 인터넷과 같은 다양한 출처에서 사용 가능하다. 추가 정보는 NCBI 웹 사이트에서 찾을 수 있다.

혈청형( Serotype ): 특징적인 항원 세트로 구별되는 밀접하게 관련된 미생물(바이러스와 같은) 군.

Smad ( SMAD ) 단백질: 척추 동물, 곤충 및 선충에서 발견되는 전사인자군. SMAD는 세포 외 신호 리간드를 핵에 전달하여 하류 유전자 전사를 활성화시키는 세포 내 단백질이다. 일반적으로, SMAD는 2개의 수용체 조절 SMAD 및 1개의 공동 -SMAD의 삼량체를 형성한다.

Smad7은 Drosophila gene Mothers against decapentaplegic의 homolog 7이다. 이것은 TGFβ 1형 수용체 길항제이다. SMAD2에 대한 접근을 막는, 수용체와 결합하는 TGFβ1과 액티빈을 차단한다. 이것은 억제성 SMAD(I-SMAD)이며 SMURF2에 의해 강화된다.

Smad7을 코딩하는 대표적인 뉴클레오타이드 서열은 다음을 포함한다: human (NM_005904.3); mouse/murine (NM_001042660.1); cattle/bovine (NM_001192865.1); dog/canine (XM_005623131.1); pig/porcine(NM_001244175.1); sheep/ovine (XM_012120929.1); 및 horse/equine (XM_001499061.5). 이 GenBank accession 번호의 내용은 2016년 4월 22일에 입수할 수 있는 참고 자료이다.

개체(Subject): 인간과 비(非)인간 포유동물을 포함하는 범주인, 살아있는 다세포 척추동물. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 치료용 조성물 또는 치료에 사용되는 Smad7 서열은 치료되는 종과 일치하도록 맞춤화될 수 있다(예를 들어, 인간 서열은 인간의 치료에 사용, 개 서열은 개체 사용 등).

합성(Synthetic): 실험실에서 인위적인 방법으로 생산되며, 예를 들어 핵산 합성은 실험실에서 화학적으로 합성될 수 있다.

치료 유효량(Therapeutically effective amount): 약제로 치료되는 대상 또는 세포에서 원하는 효과를 달성하기에 충분한 양의 특정 약제 또는 치료제(예: 재조합 AAV). 약제의 유효량은 치료하고자 하는 대상 또는 세포, 및 치료 조성물의 투여 방식을 포함 하나 이에 한정되지 않는 여러 인자에 좌우될 것이다.

치료(Treating or treatment): 질병 또는 상태를 치료(curing), 치유(healing), 완화(alleviating,), 완화(relieving), 변경(altering), 치료(remedying), 개선(ameliorating), 개선(improving) 또는 영향(affecting)을 주는 목적으로 암 악액질과 같은 근육 소모(muscle wasting) 증상, 질병 또는 상태의 징후, 또는 질병이나 상태의 위험을 가지는 피험자에 대한 조성물의 적용 또는 투여, 또는 피험자로부터의 세포 또는 조직에 대한 조성물의 적용 또는 투여를 포함한다.

벡터(Vector): 벡터는 숙주 세포에서 복제 및/또는 통합하는 벡터의 능력을 파괴하지 않으면서 외래 핵산의 삽입을 허용하는 핵산 분자이다. 벡터는 복제 기점과 같은 숙주 세포에서 복제를 허용하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자 및 다른 유전 요소를 또한 포함할 수 있다. 발현 벡터는 삽입된 유전자 또는 유전자의 전사 및 번역을 허용하기 위해 필요한 조절 서열을 함유하는 벡터이다. 본원의 일부 실시양태에서, 벡터는 AAV 벡터이다.

다르게 설명되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시 내용이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 단수의 용어 "a", "an" 및 "the"는 문맥에 달리 명시하지 않는 한 복수형을 포함한다. "A 또는 B 포함"은 A 또는 B 또는, A 및 B를 의미한다. 핵산 또는 폴리펩타이드에 대해 주어진 모든 기본 크기 또는 아미노산 크기 및 모든 분자량 또는 분자량 값은 근사치이며 설명을 위해 제공되는 것으로 이해해야 한다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 개시의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료는 하기에 기술된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참고 문헌으로 인용된다. 충돌이 있는 경우 용어의 설명을 포함하여 본 명세서를 우선시한다. 또한, 재료, 방법 및 실시 예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 것은 아니다.

예시적 측면의 상세한 설명

근육량(muscle mass) 및 근력(muscle strength)의 손실은 많은 암 환자에서 나쁜 예후를 예측할 수 있는 주요한 지표이다(Tisdale, Physiol Rev 89, 381-410, 2009; Fearon et al., Cell metabolism 16, 153-166, 2012; Dodson et al., Annu Rev Med 62, 265-279, 2011). 우리는 본 명세서에서 유전자 요법을 기반으로 하는 ActRIIB 신호 전달 타켓팅의 개입(Llovera et al., Biochem Biophys Res Commun 221, 653-655, 1996; Llovera et al., Mol Cell Endocrinol 142, 183-189, 1998; Cai et al., Cell 119, 285-298, 2004; Wyke et al., Br J Cancer 91, 1742-1750, 2004; Watchorn et al., Int J Oncol 27, 1105-1111, 2005; Wyke & Tisdale, Br J Cancer 92, 711-721, 2005)이 종양 진행과 관련된 근육 소모를 예방하는 효과적인 수단이라는 것을 처음으로 증명한다. 신경근 질환(neuromuscular disorders) 및 비 근육 질환(non-muscle-diseases)에 대한 유전자 기반 치료법이 현재 개발 중임에 따라(Mingozzi & High, Nat Rev Genet 12, 341-355, 2011), 본 명세서에서 설명되는 전략은 과도한 ActRIIB 신호와 함께 암 악액질 및 기타 질병의 설정에서 근육 소모와 관련된 이환율(morbidity) 및 사망률(mortality)을 감소시킬 수 있는 개입으로 해석될 수 있다고 주장한다 .

특정 측면에 따르면, 근육 내 미토스타틴(myostatin) 및 액티딘(activin)의 순환 농도가 상승하면 골격근 위축(skeletal muscle atrophy)을 일으킬 수 있고, 근육 소모가 발생하는 암, 노화 및 만성 질환의 상태와 관련되어 있다는 점을 감안할 때(Fearon et al., Cell metabolism 16, 153-166, 2012; Zimmers et al., Science 296, 1486-1488, 2002; Coerver et al., Mol Endocrinol 10, 534-543, 1996; Harada et al., J Clin Endocrinol Metab 81, 2125-2130, 1996; Costelli et al., Eur J Clin Invest 38, 531-538, 2008; Heineke et al., Circulation 121, 419-425, 2010; Penna et al., PLoS One 5, e13604, 2010; Ju & Chen, et al., Respir Med 106, 102-108, 2012; Otani et al., Gynecol Oncol 83, 31-38, 2001; Seder et al., Neoplasia 11, 388-396, 2009; Wildi et al., Gut 49, 409-417, 2001; Han et al., Int J Biochem Cell Biol, 45:2333-2347, 2013), 순환에서 원인이 되는 리간드(the responsible ligands)를 타겟팅함으로써, 과도한 ActRIIB 신호의 유해한 영향을 완화시킬 수 있는 개입 개발에 상당한 노력이 투자되었다(Fearon et al., Cell metabolism 16, 153-166, 2012; Benny Klimek et al., Biochem Biophys Res Commun 391, 1548-1554, 2010;Zhou et al., Cell 142, 531-543, 2010).

그러나, 세포 외 수준에서 다형성 리간드(pleiotropic ligands)를 억제하는 것과 관련된 잠재적인 부작용 때문에, 그러한 리간드 트랩에 기초한 치료법의 가능성은 의문의 여지가 있다(Massague, Nat Rev Mol Cell Biol 13, 616-630, 2012). 이러한 문제를 피하기 위해, 본 발명자들은 근육 섬유 내에서의 ActRIIB 신호 전달 억제가 리간드를 직접적으로 결합하지 않고 근육 소모를 억제하는 전략을 나타내는지를 조사했다. 본 발명자들은 rAAV6:Smad7로 처리된 근육이 미오스타틴 및 액티빈 A의 실험적인 과발현에 의해 공격받았을 때 위축(atrophy)으로부터 보호된다는 것을 발견했다. 또한 rAAV6:Smad7이 종양 부담과 무관하게 전신 근육 소모를 완화시키고 pro-악액질 리간드(pro-cachectic)의 순환 수준을 지속적으로 상승시킬 수 있다고 결론지었다. 이러한 결과는 근육 소모를 촉진하기 위해 이러한 경로를 이용하는 리간드의 효과로부터 근량을 유지하는 것과 관련된 주요 세포 내 신호 전달 과정의 활성을 분열시키는 본 발명의 접근 방법의 유용성을 입증한다. 또한, rAAV6:Smad7의 효능은 악액질성 마우스에서 가용성 ActRIIB 리간드 트랩에 대해 기술된 것(Zhou et al., Cell 142, 531-543, 2010)과 실질적으로 동일하지만, 본 결과에 따르면 rAAV6:Smad7은 줄무늬 근육에서 보다 특이적이며, 오프-타겟 효과를 생성할 가능성이 적다.

특정 측면에 따르면, 가장 중요한 것은, rAAV6:Smad7으로 처리된 임의의 마우스에서 ACE-031(ActRIIB의 세포 외 도메인으로 주로 구성된 펩티바디(peptibody) 리간드 트랩)과 관련된 오프-타겟 표지는 검출되지 않았다. 비 근육 조직 또는 Smad7 생체 활성 마커에서의 Smad7 발현도 없었다. 후자에는 폐 중량 및 형태의 변화와 같은 내부 마커, 또는 손상된 미세 혈관계의 증거뿐만 아니라 귀, 코 및 꼬리에 타박상과 같은 쉽게 보이는 외부 마커가 포함된다. 이러한 마커는 아마도 간헐적으로(intermittently) 존재할 수 있지만, 우리의 접근법과 검출 가능한 HHT 표지의 결여의 결합된 특이성은 rAAV6:Smad7이 ActRIIB 리간드 트랩의 안전하고 아마도 더 효과적인 대안이라는 것을 강력히 시사한다.

특정 측면에 따르면, 기계적으로 ActRIIB 신호 전달은 근육 단백질 합성을 억제하고 단백질 분해를 촉진함으로써 근육 이화 작용을 촉진시킬 수 있다(Amirouche et al., Endocrinology 150, 286-294, 2009; Trendelenburg et al., Am J Physiol Cell Physiol 296, C1258-1270, 2009; Durieux et al., Endocrinology 148, 3140-3147, 2007; Lokireddy et al., Mol Endocrinol 25, 1936-1949, 2011). 본 명세서에서 기술된 본 연구는 Smad7의 과발현이 단백질 합성과 관련된 S6K/S6RP 신호 전달을 증가시키지만, Akt 및 mTOR의 활성화에 좌우되는 메커니즘에 의한 것은 아니라는 것을 입증한다. 우리는 또한 악액질 근육에서 Smad7의 과다 발현이 E3 유비퀴틴 리가아제인 MuRF1 및 Atrogin-1의 전사를 감소시키는 것을 관찰하였으며, 이 활성은 골격근에서 프로테아좀 분해를 촉진한다. 동화 작용과 이화 작용 신호에 대한 Smad7의 효과는 Smad2/3 인산화의 억제에 달려 있지만, Smad7은 연구된 모든 마우스 모델에서 증가된 미오스타틴 및 액티빈 수준과 관련된 과도한 Smad2/3 인산화를 쉽게 방지했다. 이 결과는 Smad7의 증가된 발현이 과도한 ActRIIB:ActRI 매개 Smad2/3 인산화를 억제하는 강력한 방법임을 나타내며, 그렇지 않은 경우 중요한 근육 이화 작용에 기여한다.

특정 측면에 따르면, rAAV6:Smad7을 투여한 종양 보유 마우스에서 골격근 위축의 개선은 종양의 진행에도 불구하고 생존을 연장시키는, 용해성 ActRIIB로 유사한 마우스 모델을 반복적으로 치료하는 이전에 보고된 항-이화 작용과 유리하게 비교된다(Zhou et al., Cell 142, 531-543, 2010). 용해성 ActRIIB를 투여한 악액질 마우스(cachectic mice) 연구와 유사하게(Zhou et al., Cell 142, 531-543, 2010), 본 명세서에 기술된 바와 같은 rAAV6:Smad7의 전신 투여로 종양을 지닌 마우스는 가짜 처리(sham-treated) 종양 보유 대응 마우스와 비교하여 지방량의 보존을 향상시키지 않는 것으로 나타났다. 악액질에서 지방 분해를 개선하는 것은 TNFα와 같은 다른 악액질 관련 사이토카인을 공동으로 타겟팅함으로써 보다 효과적으로 달성될 수 있다(Llovera et al., Biochem Biophys Res Commun 221, 653-655, 1996; Llovera et al., Mol Cell Endocrinol 142, 183-189, 1998). 그러나 제지방(lean mass)의 보전을 나타내는 결과는 생존 기간 연장을 목표로 하는 개입의 주요 목표가 되어야 한다(Fearon et al., Cell Metabolism 16, 153-166, 2012; Lee & Glass, Skelet Muscle 1, 2, 2011; Zhou et al., Cell 142, 531-543, 2010).

특정 측면에 따르면, rAAV6:Smad7의 정맥 내 투여는 순환을 통해 rAAV6 벡터가 심근(cardiac muscle)을 변환시킬 수 있기 때문에, 종양 보유 마우스에서 심장 위축(cardiac atrophy)을 예방하였다. 미오스타틴과 액티빈 A의 발현 증가는 심장병과 관련이 있으며(Heineke et al., Circulation 121, 419-425, 2010; Yndestad et al.,Circulation 109, 1379-1385, 2004; Rodgers et al., J Physiol 587, 4873-4886, 2009), 생리적 비대화(physiological hypertrophy)와 심근 수축성(cardiac contractility) 및 Ca^{2 +} 처리(handling)가 모두 모스타틴-null 심장에서 발생하며(Rodgers et al., J Physiol 587, 4873-4886, 2009; Jackson et al., J Endocrinol 213, 263-275, 2012; Jackson et al., Endocrinology 155, 1771-1785, 2014) 이는 비교적 모욕적으로(with insult) 보호된다(Bish et al., PLoS One 5, e10230, 2010; Artaza et al., J Endocrinol 194, 63-76, 2007). 따라서, 심근 주화성을 가지는 rAAV:Smad7 벡터의 전신 투여는 심장 내에서의 ActRIIB 매개 위축 신호 전달을 억압하고, 악액질 환자에서 심장 기능을 보존하기 위한 매력적인 전망을 구성한다.

ActRIIB는 많은 비 근육 조직에서 발현되고 여러 TGFβ 수퍼패밀리 리간드가 상기 수용체에 관여하여 다양한 조직 특이적 작용을 발휘하기 때문에, 리간드 트래핑(ligand trapping) 접근법은 오프-타겟 효과를 유발할 수 있는 상당한 위험을 초래한다(Koncarevic et al., Endocrinology 153, 3133-3146, 2012). 본원에서 제시된 데이터는 가로무늬근(striated muscle)에서 우선적으로 ActRIIB 신호를 약화시키는 신규한 접근법으로서 rAAV6:Smad7을 도입한다(Gregorevic et al., Nat Med 10, 828-834, 2004; Gregorevic et al., Nat Med 12, 787-789, 2006). 골격 및/또는 심장 근육에서 유니크하게 Smad7 검출이 가능한 조직-특이적 프로모터의 인클루션(inclusion)은 특이성이 더욱 향상되고 이미 개발되었다(Salva et al., Mol Ther 15, 320-329, 2007). 이들의 인클루션(inclusion)은 잠재적으로 Smad7의 보다 강력한 제어 및 보다 강력한 Smad7 발현을 제공함으로써 특이성을 더욱 향상시킬 수 있다. 따라서 우리의 접근법을 최적화하고 근육 소모 또는 심부전의 다른 조건에서 그 효능을 결정하기 위한 추가적인 연구가 필요합니다.

AAV는 Parvoviridae 및 Dependovirus 속에 속한다. AAV는 선형의 단일 가닥 DNA 게놈을 패키징하는 작은 비 외피성(non-enveloped) 바이러스이다. AAV DNA의 센스 및 안티센스 가닥은 동일한 빈도로 AAV 캡시드(capsids)에 패키징된다.

AAV 게놈은 2개의 오픈 리딩 프레임(ORFs)에 인접한 2개의 역전된 말단 반복(ITRs)을 특징으로 한다. 예를 들어, AAV2 게놈에서, ITR의 처음 125개 뉴클레오타이드는 염기쌍(pindindrome)이며, 염기쌍을 최대화하기 위해 접히고 T 자 모양의 헤어핀 구조를 형성한다. D 서열이라 불리는 ITR의 다른 20개의 염기는 짝이 없다. ITR은 AAV DNA 복제에 중요한 cis-작용 서열이다; ITR은 복제의 근원이며, DNA 중합 효소에 의한 제 2가닥 합성을 위한 프라이머로서 작용한다. 이 합성 중에 형성된 복제형 단량체(replicating-form monomer)라 불리는 이중 가닥 DNA는 자가 프라이밍 복제(self-priming replication)의 두 번째 라운드에 사용되며 복제형 이량체(replicating-form dimer)를 형성한다. 이 이중 가닥 중간체는 가닥 변위 메커니즘(strand displacement mechanism)을 통해 가공되어 패키징에 사용되는 단일 가닥 DNA와 전사에 사용되는 이중 가닥 DNA를 생성한다. ITR 내에는 Rep 바인딩 요소와 터미널 해결 사이트 (TRS; terminal resolution site)가 있다. 이러한 특징은 이중 가닥 중간체를 처리하기 위해 AAV 복제 동안에 바이러스 조절 단백질 Rep에 의해 사용된다. AAV 복제에서의 역할 외에도 ITR은 AAV 게놈 패키징, 전사, 비허용 조건 하에서의 음성 규제(negative regulation) 및 현장 특이적 통합(site-specific integration)에도 필수적이다(Daya and Berns, Clin Microbiol Rev 21(4):583-593, 2008).

AAV의 왼쪽 ORF에는 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40의 4가지 단백질을 암호화하는 Rep 유전자가 들어있다. 오른쪽 ORF에는 Cap 유전자가 들어 있는데, 이 단백질은 세 개의 바이러스 캡시드 단백질(VP1, VP2 및 VP3)을 생성한다. AAV 캡시드는 정20면체 대칭(icosahedral symmetry)으로 배열된 60개의 바이러스 캡시드 단백질을 함유한다. VP1, VP2 및 VP3은 1:1:10의 몰비로 존재한다(Daya and Berns, Clin Microbiol Rev 21(4):583-593, 2008).

AAV는 현재 유전자 치료에 가장 많이 사용되는 바이러스 중 하나이다. AAV는 사람과 다른 영장류에 감염되지만 질병을 일으키는 것으로 알려져 있지 않으며 매우 경미한 면역 반응을 유발한다. AAV를 이용하는 유전자 요법 벡터는 분열(dividing) 세포와 정지(quiescent) 세포 모두를 감염시킬 수 있고 숙주 세포의 게놈에 통합되지 않으면 염색체 외의 상태로 유지될 수 있다. AAV의 유익한 특징으로 인해, 본 명세서에서 개시되는 재조합 핵산 분자 및 방법을 위한 AAV의 용도를 고려한다.

AAV는 표적 세포에 결합하여 표적 세포로 들어가고, 핵 내로 들어가며, 장기간 동안 핵에서 발현되며, 낮은 독성을 가지는 능력을 포함하는, 유전자 치료 벡터에 대한 몇 가지 바람직한 특징을 보유한다. 그러나, AAV 게놈의 작은 크기는 통합 될 수 있는 이형(heterologous) DNA의 크기를 제한한다. 이 문제를 최소화하기 위해 Rep와 통합 효율성 요소(integration efficiency element; IEE)를 인코딩하지 않는 AAV 벡터가 생성되었다. ITR은 패키징(packaging)에 필요한 시스(cis) 신호이므로 그대로 유지된다(Daya and Berns, Clin Microbiol Rev 21(4):583-593, 2008).

유전자 치료에 적합한 rAAV를 생산하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며(예를 들어, U.S. Patent Application Nos. 2012/0100606; 2012/0135515; 2011/0229971; and 2013/0072548; 및 Ghosh et al., Gene Ther 13(4):321-329, 2006), 본원에 개시된 재조합 핵산 분자, 벡터 및 방법과 함께 사용될 수 있다.

하기 실시예는 특정 특징 및/또는 양태를 설명하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 개시된 특정 특징 또는 실시 양태로 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

재료 및 방법

항체(Antibodies) - Smad7에 대한 항체(Imgenex, San Diego, CA), pSmad3에 대한 항체(Epitomics, Burlingame, CA) 및 GAPDH에 대한 항체(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX)을 제외하고는 모든 항체는 Cell Signaling (Danvers, MA)으로부터 얻었다.

rAAV6 벡터의 생산 - 마우스 cDNA 라이브러리, 액티빈 A, 미오스타틴 및 Smad3-CA(모두 GenScript, Piscataway, NJ에 의해 합성됨)로부터 PCR 증폭된, Smad7(GenBank 참조번호# NM_001042660.1)을 코딩하는 cDNA 구조물을, CMV 프로모터/인핸서 및 AAV2 말단 반복이 측면에 위치하는 SV40 폴리-A 영역을 포함하는 rAAV 발현 플라스미드에 클로닝 하였다. 생성된 벡터의 서열은 서열번호 5에 제공되고; 벡터의 지도는 도 12에 제공된다. HEK293 세포에 pDGM6 패키징 플라스미드(AAV6 캡 유전자, AAV2 rep 유전자 및 아데노 바이러스 헬퍼 유전자를 포함하는; Gregorevic et al., Nat. Med. 10, 828-834, 2004; incorporated herein by reference)로 이들 플라스미드를 형질 감염시켜 수확 및 정제된 6형 슈도 타이프 바이러스 벡터(type-6 pseudotyped viral vectors)를 생성시켰다(Gregorevic et al., Nat Med 10, 828-834, 2004). 간략하게, 슈도타입 6 벡터를 생성하기 위한 인산칼슘 침전법에 의해, HEK293 세포를 벡터-게놈-함유 플라스미드(vector-genome-containing plasmid) 10 ㎍ 및 패키징/헬퍼 플라스미드 pDGM6(packaging/helper plasmid pDGM6) 20 ㎍으로 트랜스펙션하기 8-16 시간 전에 10 cm 배양 접시에 3.2-3.8 x 10⁶ 세포의 밀도로 플레이팅 하였다. 트랜스펙션 72시간 후, 배양액과 세포를 수집하고 0.22 μm 정화(clarification)(Merck Millipore, Billerica, MA) 전에 미세유동화기(microfluidizer)(Microfluidics, Westwood, MA)를 통해 균질화시켰다. Heparin 어피니티 컬럼(HITRAP ™, GE Healthcare, Pittsburgh, PA)을 통한 친화 크로마토그래피에 의해 정화된 용해물로부터 벡터를 정제하고, 무균 생리학적 링거 용액에서 재현탁시키기 전에 밤새 초원심분리하였다. 정제된 벡터 제제를 주문형 서열 특이적 PCR 반응(Life Technologies, Grand Island, NY)으로 적정하였다.

동물 실험 - 모든 실험은 과학적 목적을 위해 동물의 보살핌과 사용을 위한 관련 실행 규범에 따라 수행되었다(National Institutes of Health, USA, 1985; the National Health & Medical Council of Australia, 2013).

국소적인 벡터 전달을 위해, 마우스를 이소플루란(isoflurane), 또는 케타민(ketamine)(100 mg/kg) 및 자일라진(xylazine)의 혼합물로 깊게 마취시켰다(10 mg/kg; 복강 내 주사, VM Supplies, Chelsea Heights, VIC, AU). 주어진 벡터의 1-10 × 10⁹개의 벡터 게놈을 경골 전방부(TA; tibialis anterior) 및 긴발가락폄근(EDL; extensor digitorum longus) 근육으로 점유되는 후근(hind limb)의 전방 구획으로 Hank’s 완충 식염수 용액(HBSS; Hank’s buffered saline solution) 30 μL를 통해 직접 투여하였다. 대측성 사지(contralateral limb)의 대조군 주사(Control-injections)는 기능적 유전자가 결여된 벡터(rAAV6:MCS)를 사용하였다(Han et al., Int J Biochem Cell Biol, 45:2333-2347, 2013). 전신 전달 연구를 위해 꼬리 정맥을 통해 HBSS 200 μL 부피로 3 ~ 5 × 10¹²개의 벡터 게놈을 투여했다. 라파마이신 실험을 위해, 앞서 기술한 바와 같이, 라파마이신을 0.2% 카르복시 메틸 셀룰로오스 나트륨염(Sigma, St. Louis, MO) 및 0.25 % 폴리소르베이트-80 (Sigma, St. Louis, MO)을 물에 용해시킨 용액에 밤새 용해시켰다(Bourdeau et Am. J. Pathol 156, 911-923, 2000). 이 실험에서 마우스는 rAAV6:Smad7 주사 3시간 전부터 시작하여 14일 동안 매일 복강 내 주사로 2 mg/kg/day의 라파마이신(Calbiochem®, Merck Millipore, Darmstadt, Germany) 또는 비히클(vehicle)을 투여받았다. 조직 수확을 위해 마우스를 경부탈구(cervical dislocation)를 통해 안락사시켰고, 근육을 신속하게 절제하고 이후 처리하기 전에 무게를 재었다. C-26 유래 종양 조직의 이식은 CD2F1 또는 BALB/c 마우스를 사용하여 수행되었다. 이전에 설명한 대로 세포 또는 조직을 등의 옆구리에 이식했다(Bourdeau, et al., Trends Cardiovasc Med 10, 279-285, 2000; Bourdeau et al., Am J Pathol 158, 2011-2020, 2001). 간략하게, 세포를 이식 직전에 계대시키고 10% DMEM 배지에서 재구성하고 종양 조각을 액체 질소로부터 해동시켰다. 그 후, 트렁카(trocar) 바늘을 사용하여 1 mm³ 이상의 세포를 뒤쪽의 작은 절개부를 통해 이식하고 마우스를 21 일 후에 종결시켰다. Echo-MRI 기술을 사용하여, 쥐의 inhibin-null 마우스의 지방, 제지방 및 총 전신무게를 분석했다(Echo Medical Systems, Houston, TX).

Real Time PCR - Trizol을 이용하여 TA 근육 세포로부터 총 RNA를 수집하였다(Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). High Capacity RNA-cDNA 키트(Life Technologies)를 사용하여 500-1000 ng의 RNA를 역전사 시켰다. 그런 다음 Smad7, Foxo1, Foxo3, MAFbx 및 MuRF1에 대한 cDNA를 demand 키트 및 검출 소프트웨어(Life Technologies)의 Taqman™ 중합 효소 검정을 사용하여 RT-PCR로 분석했다. cDNA 농도를 표준화하기 위해 18S를 사용하였다. 데이터는 ΔΔCT 분석 방법을 사용하여 분석하였다. SYBR® Green 실시간 PCR 검출 방법을 통해 액티빈 A(F: GGAGTGTGATGGCAAGGTCAACA, 서열번호 1; R: GTGGGCACACAGCATGACTTA, 서열번호 2) 및 미오스타틴(F: CCCAGAGGTTCAGCAGGCCCT, 서열번호 3; R: TCATGAGCACCCACAGCGGTC, 서열번호 4).

ELISA - 마우스 혈청 내 액티빈 A의 농도는 이전에 기술된 변형을 사용하여 제조자의 지시(Oxford Bio-innovations, Oxfordshire, UK)에 따라 ELISA에 의해 측정 하였다(Satomi, et al., Stroke 34, 783-789, 2003). 대조군 및 악액질 마우스로부터의 혈청 IL-6을 제조자의 지시에 따라 측정하였다(R & D Systems, Minneapolis, MN).

루시퍼라제 ( Luciferase ) 실험 - C2C12 세포를 Lipofectamine 2000(Life Technologies)을 사용하여 웰 당 0.35 μg Smad7 플라스미드, 0.25 μg pCAGA-luc 플라스미드 또는 0.25 μg LacZ 플라스미드로 24-웰 플레이트에서 트랜스펙션하였다. 16시간 후, 배지를 변경하고 24시간 동안 대조군 또는 C-26 종양 보유 마우스의 혈청을 보충하였다. 이어서, 세포를 세포 용해 완충액(Promega, Madison, WI)으로 용해시키고 루미노미터(luminometer)(Berthold, Bad Wildbad, Germany)를 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 루시퍼라제 활성은 β-갈락토시다아제(β-galactosidase) 리포터 활성에 대한 pCAGA-루시퍼라제 활성의 비율로서 제시되며, 데이터는 3가지 독립적인 실험을 대표한다. 상업적 β-gal 검출 분석법(Promega)을 사용하여 β-갈락토시다제를 검출하였다. 간단히 말해, 용해물(lysate)은 37℃에서 1시간 동안 2X β-갈락토시다아제 완충액으로 배양하였다. 이어서, β-gal 발현을 420 nm에서 측정하였다.

조직학(Histology) - 수확된 근육을 OCT 동결 방지제(cryoprotectant)에 넣고 액체 질소 냉각된 이소펜탄(isopentane)으로 동결시켰다. 냉동된 샘플을 이어서 10 μm 두께로 동결절편시키고 형태를 검사하기 위해 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin)으로 염색 하였다. IX71 현미경에 장착된 U-TV1X-2 카메라와 PlanC 10×/0.25 대물렌즈(Olympus)를 사용하여 섹션을 DePeX 봉입제(mounting medium)(BDH, VWR International, Radnor, PA)를 사용하여 장착하고 염색된 섹션의 이미지를 촬영했다. DP2-BSW 획득 소프트웨어(Olympus)를 사용하여 이미지를 획득했다. 섬유형 분석을 위해, 연속적인 횡경간 절편(serial transverse cryosections)을 TA 근육의 중배(mid-belly)에서 얻었다(-20˚C, CTI Cryostat; IEC, Needham Heights, MA). 섹션(Sections)은 다음과 같이 물들었다: 근섬유(myofiber) 직경과 단면적(CSA)을 측정하기 위한 laminin(# L9393, Sigma-Aldrich) 및/또는 Type I(Torsney et al., Circulation 107, 1653-1657, 2003) 및 Type IIa(Durieux et al., Endocrinology 148, 3140-3147, 2007) myosin isoform 각각의 비율을 평가하기 위한 N2.261(developed by Dr. H.M. Blau, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank developed under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biology, Iowa City, IA). 이전에 보았듯이(Lokireddy et al., Mol Endocrinol 25, 1936-1949, 2011), 마우스 TA 근육에서 비 N2.261 반응 섬유는 모두 IIx/b 유형의 섬유를 나타내는 것으로 가정되었다. 디지털 이미지는 AxioVision AC 소프트웨어(AxioVision AC Rel. 4.7.1, Carl Zeiss)에 의해 제어되고 정량화된 카메라가 있는 직립 현미경(Axio Imager D1, Carl Zeiss, Wrek, Gottingen, Germany)을 사용하여 얻었다. Feret의 최소 직경과 근섬유 면적은 Image TA 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD)를 사용하여 마우스 TA 근육 당 최소 500개의 근섬유를 측정하고 그룹당 최소 3마리의 마우스를 사용하여 이러한 변수를 정량화했다.

웨스턴 블랏팅 (Western blotting) - TA 근육을 COMPLETE ™ EDTA가 없는 프로테아제와 포스파타제 억제제 칵테일(Roche, Basel, Switzerland)을 사용하여 RIPA 기반의 용해 완충액(Merck Millipore)에서 균질화시켰다. 용해는 4℃에서 13000g에서 10분간 원심 분리한 후 샘플을 95℃에서 5분 동안 변성시켰다. 단백질 농도는 Pierce 단백질 분석 키트(Thermo Scientific, Rockford, IL)를 사용하여 결정하였다. 이어서, 단백질 분획물을 프리캐스트(pre-cast) 4-12% Bis-Tris 겔(Life Technologies)을 사용하여 SDS-PAGE로 분리하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인(Bio-Rad, Hercules, CA)에 블로팅하고 적절한 항체로 밤새 항온 배양하였다. ImageJ 픽셀 분석(National Institutes of Health)을 사용하여 표지된 웨스턴 블롯의 정량화를 수행하고, 데이터를 대조값 1로 정규화하였다. 웨스턴 블롯의 농도 측정 분석은 로딩 대조군에 대해 표준화된 밴드 밀도로서 제시되며 적어도 3회의 독립적인 실험을 대표한다.

Akt 키나아제 분석( Akt kinase assay) - 비 방사성 Akt 키나아제 분석(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)을 제조자의 지시에 따라 수행하였다. rAAV6:Smad7 또는 rAAV6:MCS가 주입된 TA 근육을 수집하고 균질화한 다음 단백질 샘플을 Akt의 Ser473 부위에 대한 항체를 사용하여 밤새 면역 침전시켰다. 단백질 용해물의 일부를 총 세포 용해물로 따로 보관했다. 면역침강 구슬(Immunoprecipitated beads)은 다음 펠렛화, 세척 및 30℃에서 30분 동안 키나아제 버퍼, ATP 및 GSK3α 융합 단백질과 함께 배양되었다. 이어서, 반응을 불활성화시키고 샘플을 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. Akt 키나아제 활성은 총 Akt 수준에 대해 표준화되었다.

생체 외(Ex vivo ) 단백질 합성 - EDL 근육을 손상되지 않은 힘줄로 제거하고, 보온시킨(30℃) 변형된 Kreb's-Henseleit 완충액(KHB) 2.0 mL에 30분 동안 전배양(pre-incubated)하였고, 상기 KHB는 4.5% NaCl, 5.75% KCl, 6.1% CaCl₂, 10.55% KH₂PO₄, 19.1% MgSO₄.7H₂O, 16% v/v NaHCO₃(pH = 7.4) supplemented with 4% bovine serum albumin(Bovostar, Bovogen, East Keilor, VIC, Australia), 및 5 mM glucose before gassing with 95:5% O₂:CO₂으로 구성된다. 세포 내 단백질 풀(protein pool)은 EDL 근육을 5 μCi/mL의 3H-티로신(GE Healthcare) 및 500 mM L-티로신(in KHB)을 포함하는 2.0 mL 펄스(방사성) 완충액을 함유하는 바이알에 1시간 동안 옮김으로써 라벨링되었다. 라벨을 부착한 후 근육을 비 방사성 KHB로 씻어서 건식 블롯(dry blotted)하고 무게를 재고 액체 질소에서 급속 냉동시키고 -80℃에서 보관했다. 동결된 근육을 500μL의 10% 트리클로로초산(Trichloroacetic acid)에서 균질화시키고 10,000g에서 15분간 원심 분리하였다(4℃). 불용성 단백질 분획에 상응하는 펠렛을 1 M NaOH 500 ㎕에 재현탁하고 실온에서 밤새 용해시켰다. 티로신 결합(tyrosine incorporation)을 평가하기 위해, 재현탁한 시료 각각 100 μL를 5 mL의 신틸레이션 유체(scintillation fluid)에 첨가하고, 3H 방사능을 섬광 계수기(Beckman Coulter, Brea, CA)에서 각 샘플의 3 배로 측정하였다.

근기능 (muscle function) 평가 - 이전에 설명한 바와 같이(Han et al., Int J Biochem Cell Biol, 45:2333-2347, 2013; Lokireddy et al., Mol Endocrinol 25, 1936-1949, 2011), 마우스의 TA 근육의 수축 특성을 관상 전극(percutaneous electrodes)을 통해 경골 운동 신경에 일련의 전기 자극을 전달하고, 수축 중에 발생한 장력을 외과용 실크 봉합사(surgical silk suture)로 말단 텐돈(distal tendon)에 부착된 힘 변환기(force transducer)를 통해 기록함으로써 측정하였다. 마우스는 시험 전에 복강 내 주입을 통해 소듐 펜토바르비톤(sodium pentobarbitone)(NEMBUTAL®; 60 mg/kg; Sigma-Aldrich)으로 마취시키고, 여전히 마취를 하면서 심폐 절단(cardiac excision)을 통해 안락사 하였다. 프로토콜의 결론에서, 근육은 신속하게 절제하고, 힘줄(tendon)과 결합 조직을 제거하고, 무게를 쟀다.

통계 분석(Statistical Analysis) - 통계적 차이는 일원(one-way) 또는 이원(two-way) ANOVA 테스트를 사용하여 여러 조건에서 평가되었으며 그룹-평균 사이의 비교에 Student-Newman-Keuls post hoc test가 사용되었다. 두 조건의 비교는 Students' t-test만 활용했다. 그룹 간 차이는 p <0.05의 값에 대해 통계적으로 유의하다고 보고되었다. 데이터는 평균±SEM으로 나타내었다.

Smad7의 발현 증가는 골격근 비대를 촉진시킨다 .

본 실시예에서, Smad7 발현 카세트(rAAV6:Smad7)를 운반하는 rAAV6 벡터 (Gregorevic et al., Nat Med 10, 828-834, 2004; Gregorevic et al., Nat Med 12, 787-789, 2006)를 갖는 쥐의 경골 전방(TA) 뒷다리 근육의 주사는 주사 28일 이내에 근육 질량이 약 45% 증가하는 것을 도출하였고(도 1A), Smad7 단백질 발현(도 1B) 및 근섬유 직경(도 1C-1D)의 증가와 병행하였다. rAAV6:Smad7의 꼬리 정맥 투여를 통한 생쥐의 근육 조직의 전신적 전달은 골격근의 신체 비대를 촉진시켰다(도 1E-1F). rAAV6 벡터가 가로무늬근에 대한 굴성을 나타내기 때문에(Gregorevic et al., Curr Opin Mol Ther 6, 491-498, 2004), 우리는 Smad7 단백질이 내장 근육 또는 지방이 아닌 가로무늬근에서 용이하게 발현되고(도 1F), Smad2/3 유전자 표적(CTGF, COL1A1, PAI1, FN1)도 신장, 비장, 간 및 폐를 포함하는 비-근육 조직 샘플에서 변화되지 않았다(도 2A-2B). 혈관 완전성(Blood vessel integrity)은 또한 전신성 "리간드 트랩(ligand traps)"을 사용하여 ActRIIb 시그널링을 길항하여 유전성 출혈성 모세 혈관 확장증(heredity hemorrhagic telangiectasia; HERT)의 징후를 나타낼 수 있다고 평가되었다(Smith & Lin, Curr Opin Support Palliat Care 7, 352-360, 2013; Bourdeau et al., J Clin Invest 104:1343-1351, 1999). 중요하게도, 조직 내 rAAV6:Smad7 투여는 조직학적 분석(histological analysis) 또는 전체 형태학적 평가(gross morphological assessments)에서 HHT의 징후를 나타내지는 않았지만 근육 내 주사로 얻은 것과 비교되는 근육 섬유 크기의 증가를 반복하였다(도 2C-2D).

추가적인 예로서, 우리는 rAAV6:Smad7 투여의 효과가 Smad2/3 시그널링의 억제에 기인하는지 여부를 조사하였고, Smad7을 발현하는 근육에서 Smad3S432/435 인산화가 강력하게 억제됨을 발견하였다(도 1G). 더욱이, Smad7의 효과는 Smad3의 구성 적 활성 형태의 존재하에서 폐지되었다(Liu et al., Proc Natl Acad Sci U S A 94, 10669-10674, 1997) (CA-Smad3, 도 1H-1I). 우리는 Smad7 발현이 단백질 합성을 촉진시키는 핵심 메커니즘인 Akt와 mTOR의 신호 전달에 영향을 미치는지 평가했다(Bodine et al., Nat Cell Biol 3, 1014-1019, 2001). 근육에서의 Smad7의 과발현은 S6RPS235/236 및 4EBP1T37/46을 포함하는 mTOR 하류 표적의 인산화의 증가와 함께 분획 단백질 합성 속도를 증가시키지만, 우리는 Akt의 인산화 또는 활성(도 3A-3C)의 변화를 검출할 수 없었고, 라파마이신(Akt 표적의 억제제, mTOR) 투여는 rAAV6:Smad7에 대한 근육의 비대 반응을 억제하지 않았다(도 3D-3E). 이것은 mTOR 신호 전달을 완전히 제거했음에도(ablating) 불구하고 Smad3 신호 전달을 억제하는 것이 단백질 합성을 부분적으로만 억제한다는 것을 이전에 입증했기 때문에(Winbanks et al., J Cell Biol 197, 997-1008, 2012) 특히 놀랍지는 않다. 다른 사람들은 S6RP가 mTOR 의존성 또는 비의존적 방식으로 상류 MEK/ERK 신호화에 의해 조절될 수 있음을 입증했다(Wu et al., Biochem Biophys Res Commun 400, 679-683, 2010; Iijima et al., J Biol Chem 277, 23065-23075, 2002). 따라서 우리는 rAAV6:Smad7의 동화 작용이 단백질 분해 메카니즘(proteolytic mechanisms)을 억제하는지 여부를 조사하였고, Smad7이 Smad3이 유도한 E3 유비퀴틴 리가아제인 MuRF1 및 MAFbx의 발현 및 기저(basal)를 약화시키는 것을 발견하였다(도 3F-3G). 따라서, Smad7은 Akt/mTOR 시그널링을 강화시키지 않고 E3 리가아제 활성을 억제함으로써 근육 질량을 조절하고, 이어서 단백질 합성 및 분해 사이의 균형을 이동시켜 근육 동화 작용을 촉진하는 단백질 분해(도 3F)를 조절한다.

Smad7은 미오스타틴 ( myostatin ) 및 액티빈(activin)이 유도하는 근육 위축을 예방한다.

본 실시예에서는 야생형(wild-type)과 미오스타틴 null(mstn-/-) 마우스에서 rAAV6:Smad7 효능을 비교했다.

rAAV6:Smad7이 근량의 유사한 절대 변화, 섬유 단면적 증가 및 Smad3 인산화를 유도하였지만, 근량의 상대적 변화는 mstn -/- 마우스에서 덜 두드러졌다(도 4A-4D). 이것은 이전에 ActRIIB 활동을 악화시키기 위한 접근법을 조합하여 인증된 근육 조직의 고유 한계와 유사하며(Lee, PLoS ONE 2, e789, 2007), 소과(bovids)에서 mstn -/- 마우스 및 소의 상대적 hypermuscularity를 긍정적인 선택으로 비교했을 때 현대 종(modern species)은 "부분적으로 null"이 되었다. 그럼에도 불구하고, mstn -/- 마우스의 rAAV6:Smad7의 비대화 작용은 ActRIIB 리간드(activin & GDF-11)의 과다한 작용을 입증하는 이전의 연구를 뒷받침하며(Lee, PLoS ONE 2, e789, 2007; Lee et al., Mol Endocrinol 24, 1998-2008, 2010), 엑티빈 A 및 미오스타틴이 유사하게 근육을 자극할 수 있다는 최근의 연구에 의해 뒷받침된다(Chen et al., FASEB J., 28(4):1711-1723, 2014). 실제로, 마우스에 rAAV6:activin 또는 rAAV6:myostatin을 동시에 투여하면 근육 위축이 유발되고 Smad3 인산화가 증가한다. 이러한 효과는 미오스타틴 또는 액티빈 A 발현에 영향을 미치지 않는 rAAV6:Smad7의 동시 투여에 의해 완전히 예방되었다(도 4E-4G;도 5A-5C). 따라서 Smad7은 근육에서 여러 ActRIIB 리간드의 과도한 작용을 억제할 수 있다.

증가하는 Smad7은 암 악액질(cancer cachexia )과 관련된 근육 소모(muscle wasting)를 방지한다.

본 실시예에서, ActRIIB 신호가 암 악액질의 발생 및 진행에 기여한다고 가정하기 때문에(Benny Klimek et al., Biochem Biophys Res Commun 391, 1548-1554, 2010; Zhou et al., Cell 142, 531-543, 2010; Zimmers et al., Science 296, 1486-1488., 2002; Coerver et al., Mol Endocrinol 10, 534-543, 1996; Lokireddy et al., Biochem J 446, 23-36, 2012), 우리는 rAAV6:Smad7이 악액질 유발성 C-26 결장암 종양을 갖는 마우스에서 근육 소모를 예방할 수 있는지 여부를 조사했다.

종양 보유 마우스에서 체질량, 골격근 질량, 심장 및 지방량이 모두 감소되었다(도 5A-5D). 대조적으로, 종양 보유 마우스의 TA 근육에 rAAV6:Smad7을 주사하는 것은 근량(도 7A), 최대 등척성 근력(peak isometric force)(도 7B,도 6E) 및 근육 섬유 단면적(CSA, FIG (도 7C)의 손실을 완전히 방지했다. 암 악액질 또한 IIa 형 섬유 분포를 감소시켰고, rAAV6:Smad7이 이러한 비율을 회복했지만 IIx/IIb 형을 증가시켰다(도 6F-6G). 근육 섬유의 수는 악액질 또는 rAAV6:Smad7 처리(도 6G-6I)에 따라 변하지 않았는데, 이는 종양 매개성 근육량 감소가 세포 사멸(apoptosis)이 아닌 위축(atrophy)에 기인한 것을 나타낸다. 근육 소모가 발생하기 전에 악액질에 대한 치료법을 투여하는 것이 항상 가능하지는 않을 수도 있으므로, 종양이 확립된 후 7일 또는 14일째에 rAAV6:Smad7의 주사가 보호적인지 여부도 검사했다. rAAV6:Smad7의 지연된 투여(delayed administration)를 받는 동물의 검사는 치료가 여전히 현저히 근육 위축을 완화시킨다는 것을 나타내었다(도 7E).

또 다른 예로, 암 악액질이 인체에 근육을 소모하게 만들 때 rAAV6:Smad7이 전신 수준에서 근육 위축을 예방할 수 있는지 테스트했다. rAAV6:Smad7의 정맥 주사는 종양 보유 마우스의 가로무늬근 조직 전체에 걸쳐 Smad7 발현을 강하게 증가시켰다(도 8A-8B). 계속적으로 종양 발생이 있었음에도 불구하고(도 8E), 치료는 신체 질량의 감소를 완전히 방지하지 못했지만, 신체 전체에 걸쳐 골격근의 질량을 보존 하였다(도 8F-7D,도 8F-7D,도 7F-7I). 우리는 근육 위축 및 신체 질량의 불완전한 보존 사이의 차이가 다른 조직(Fearon et al., Cell Metabolism 16, 153-166, 2012), 주로 지방에 악액질 영향을 미치는 것이라고 설명한다(도 8F-8G). 암 악액질도 심장에 영향을 미치므로, 전신성 rAAV6:Smad7 투여가 종양 보유 마우스의 심장 위축을 예방하고(도 8H-8I), 심부전(heart failure)과 관련된 심방 질량(atrial mass)이나 총 폐의 무게(gross lung weight) 증가를 유발하지 않았다는 점에 고무적이었다(도 8J-8K)(Bernardo 등, Proc Natl Acad Sci USA 109, 17615-17620, 2012). 악액질의 설정에서 rAAV6:Smad7의 치료 효과가 사용된 모델에 고유하지 않음을 확인하기 위해, 우리는 생식선 종양(gonadal tumor)에 이어 심각한 악액질을 나타내는 inhibin-α 녹아웃 마우스에서 rAAV6:Smad7 개입의 효능을 테스트했다(도 9A-9C) (Zhou et al., Cell 142, 531-543, 2010; Coerver et al., Mol Endocrinol 10, 534-543, 1996; Matzuk et al., Nature 360, 313-319, 1992). C-26 종양이 있는 마우스에서 얻은 결과와 일치하여, 우리는 inhibin-α null 마우스의 근육에 rAAV6:Smad7의 투여는 근육 위축이 방지되어 rAAV6:Smad7이 종양 기원의 악액질을 독립적으로 예방할 수 있음을 확인했다(도 7J-7K).

Smad7은 ActRIIB 신호 전달의 하류(downstream)에서 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligase) 활성화를 부분적으로 억제함으로써 근육 소모를 예방한다.

악액질 모델에서 Smad7은 액티빈 A 및 B의 순환 수준이 상승된 채로 남아있었지만 소모(wasting)로부터 가로무늬근을 보호했다(C-26 종양 보유 마우스로부터의 혈청은 C2C12 근육 형성 세포에서 Smad3-반응성 루시퍼라제 리포터를 활성화시킬 수 있었다, (도 10A-10B, 도 11A). 우리는 악액질 마우스에서 rAAV6:Smad7의 보호 효과가 가로무늬근에서의 Smad3 전사 및 인산화 억제에 있다고 보고했다(도 10C-10D). 그러나 종양 및 숙주 유래 interleukin-6 (IL-6)이 악액질의 병인과 관련되어 있기 때문에(Fearon et al., Cell metabolism 16, 153-166, 2012; Strassmann et al., J Clin Invest 89, 1681-1684, 1992; Fujita et al., Int J Cancer 68, 637-643, 1996; Bonetto et al., Am J Physiol Endocrinol Metab 303, E410-421, 2012) Smad7의 보호 효과가 IL-6 신호 전달의 변화와 관련이 있는지를 조사하였다. rAAV6의 투여: Smad7은 종양 보유 마우스의 근육에서 IL-6의 순환 수준 또는 인터루킨-반응성 Stat3의 인산화를 변화시키지 않았고(도 11B-11C), pro-cachectic 사이토카인에 의해 결합된 NFκB의 신호 전달의 주요 조절 인자인 p65 인산화에도 영향을 미치지 않았다(도 11D). 흥미롭게도 우리는 Smad7의 과발현이 총 Foxo1 또는 3에 대한 인산화된 비율(MuRF1 및 MAFbx의 전사 조절제(Sandri et al., Cell 117, 399-412, 2004; Stitt et al., Mol Cell 14, 395-403, 2004), 도 11E)을 변경시키지 않았지만, 종양 보유 마우스의 근육에서 Foxo1/3의 처리량이 감소하여 총 인산화된 형태의 수준이 감소되었다(도 10E-10F). Foxo1/3 전사를 억제하면 MuRF1 및 MAFbx 전사를 억제함으로써 근육 소모를 완화시킬 수 있으므로 (Reed et al., FASEB J 26, 987-1000, 2012), 종양 보유 마우스의 근육에서 MuRF1 및 MAFbx의 전사에 대한 치료 효과를 검사했다. 우리는 대조군 벡터를 받은 쥐와 비교하여 rAAV6:Smad7의 투여가 종양 보유 마우스의 근육에서 MuRF1 및 MAFbx 발현을 억제하는 것을 관찰하였다(도 10G).

Smad7을 이용한 근육 소모의 치료

본 실시예는 근육 소모의 치료를 위해 Smad7을 코딩하는 rAAV 벡터의 임상 적 사용을 위한 예시적인 방법을 기술한다.

근육 소모(암 악액질과 같은)로 진단된 대상이 치료를 위해 선택된다. 상기 대상은 본원에 개시된 바와 같은 Smad7을 발현할 수 있는 서열번호 5 또는 이의 등가물을 포함하는 rAAV와 같은 치료학적 유효량의 재조합 AAV를 발현하는 Smad7으로 투여된다. 구체예에서, Smad7은 대상과 동일한 종으로부터 선택된다. 재조합 AAV는 정맥 내로 투여될 수 있다. 적절한 치료 용량은 의사에 의해 선택될 수 있다. 일부의 경우, 치료 유효량은 1 x 10¹⁰ 내지 1 x 10¹⁴ 바이러스 입자(vp)/kg, 예컨대 약 1 x 10¹¹ 또는 1 x 10¹² p/kg의 범위이다. 대부분의 경우, 조성물은 단일 투여량(single dose)으로 투여된다. 면역 조절(immunomodulation)이 없는 경우, 환자는 rAAV의 단 한번의 주입만 견뎌낼 수 있다. 대상이 사전 노출 면역 조절(pre-exposure immunomodulation)을 한 경우, 2회 이상 투여할 수 있다. 치료의 효과를 판단하기 위해 환자의 건강 상태를 시간에 따라 모니터링할 수 있다.

Smad7을 이용한 근량(Muscle Mass) 및/또는 근력(Muscle Strength)의 향상

본 실시예는 근량 및/또는 근력을 증가시키거나 강화시키기 위해 Smad7을 코딩하는 rAAV 벡터의 미용적 사용(cosmetic use)에 대한 예시적인 방법을 기술한다. 본 명세서에 기술된 rAAV6:Smad7이 건강한 마우스에서 근량 및 근력을 증가시킨다는 것을 증명함으로써, 본원에 기술된 방법 및 조성물은 증가된 근량, 근력 또는 둘 모두를 원하는 건강한 피험자에서 선택적/미용적 절차에 사용될 수 있다.

증가된 근량 및/또는 근력을 원하는 대상은 치료를 위해 선택된다. 상기 대상은 본원에 개시된 바와 같은 Smad7을 발현할 수 있는 서열번호 5 또는 이의 등가물을 포함하는 rAAV와 같은 치료학적 유효량의 재조합 AAV를 발현하는 Smad7으로 투여된다. 구체 예에서, Smad7은 대상과 동일한 종으로부터 선택된다. 재조합 AAV는 정맥 내로 투여될 수 있다. 적절한 치료 용량은 의사에 의해 선택될 수 있다. 일부의 경우, 치료 유효량은 1 x 10¹⁰ 내지 1 x 10¹⁴ 바이러스입자(vp)/kg, 예컨대 약 1 x 10¹¹ 또는 1 x 10¹² vp/kg의 범위이다. 대부분의 경우, 조성물은 단일 투여 량으로 투여된다. 면역 조절이 없는 경우, 환자는 rAAV의 단 한번의 주입만 견뎌 낼 수 있다. 피험자가 사전 노출 면역 조절을 한 경우, 2회 이상 투여할 수 있다. 치료의 효과를 판단하기 위해 환자의 건강 상태를 시간에 따라 모니터링 할 수 있다.

개시된 발명의 원리가 적용될 수 있는 많은 가능한 실시예를 고려하여, 예시된 실시예는 본 발명의 바람직한 예일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 오히려, 본 발명의 범위는 다음의 청구 범위에 의해 한정된다. 따라서 우리는 이 주장의 범위와 정신에 나오는 모든 것을 우리의 발명으로 주장한다.

<110> WASHINGTON STATE UNIVERSITY BAKER IDI HEART AND DIABETES INSTITUTE HOLDINGS LIMITED Gregorevic, Paul <120> SMAD7 GENE DELIVERY AS A THERAPEUTIC <130> 2017FPI-10-006_US <150> US 62/151,147 <151> 2015-04-23 <150> PCT/US 2016/029018 <151> 2016-04-22 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 1 ggagtgtgat ggcaaggtca aca 23 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 2 gtgggcacac agcatgactt a 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 3 cccagaggtt cagcaggccc t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 4 tcatgagcac ccacagcggt c 21 <210> 5 <211> 6018 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smad7 AAV vector, pAAV-MCS_smad7stp 081809.cep; contains murine Smad7 encoding sequence <400> 5 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtggagc tagttattaa tagtaatcaa 180 ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 240 atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 300 ttcccatagt aacgtcaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 360 aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 420 tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 480 ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 540 agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 600 ttgacgtcaa tgggagtttg ttttgcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 660 caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 720 cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct 780 ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggattc gaatcccggc cgggaacggt 840 gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga gtgacgtaag taccgcctat agagtctata 900 ggcccacaaa aaatgctttc ttcttttaat atactttttt gtttatctta tttctaatac 960 tttccctaat ctctttcttt cagggcaata atgatacaat gtatcatgcc tctttgcacc 1020 attctaaaga ataacagtga taatttctgg gttaaggcaa tagcaatatt tctgcatata 1080 aatatttctg catataaatt gtaactgatg taagaggttt catattgcta atagcagcta 1140 caatccagct accattctgc ttttatttta tggttgggat aaggctggat tattctgagt 1200 ccaagctagg cccttttgct aatcatgttc atacctctta tcttcctccc acagctcctg 1260 ggcaacgtgc tggtctgtgt gctggcccat cactttggca aagaattggg attcgaacat 1320 cgattgaatt cgcccttgtc atgttcgctc cttagccggc aaacgacttt tctcctcgcc 1380 tcctcgcccc gcatgttcag gaccaaacga tctgcgctcg tccggcgtct ctggaggagc 1440 cgtgcgcccg gcggcgagga cgaggaggag ggcgtggggg gtggcggcgg aggaggcgag 1500 ctgcggggag aaggggcgac ggacggccgg gcttatgggg ctggtggcgg cggtgcgggc 1560 agggctggct gctgcctggg caaggcagtc cgaggtgcca aaggtcacca ccatccccat 1620 cccccaacct cgggtgccgg ggcggccggg ggcgccgagg cggatctgaa ggcgctcacg 1680 cactcggtgc tcaagaaact caaggagcgg cagctggagc tgctgcttca ggccgtggag 1740 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Claims (19)

1. 재조합 아데노 관련 바이러스(recombinantr adeno-associated virus; rAAV) 구조물(construct)에서 Smad7 유전자 또는 cDNA를 포함하는 조성물로, 상기 rAAV 구조물은 근육 세포에서 Smad7 유전자 또는 cDNA의 발현을 제공하는 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 rAAV 구조물은 혈청형(serotype) 6(rAAV6), 혈청형 8(rAAV8), 또는 혈청형 9(rAAV9)인, 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 Smad7 유전자 또는 cDNA는 인간(human), 마우스(mouse), 말(equine), 소(bovine), 양(ovine), 개(canine) 또는 돼지(porcine) 유래인 것인, 조성물.
   
4. 제 1항에 있어서, 상기 발현된 Smad7 유전자 또는 cDNA는 본질적으로(constitutively) 활성 돌연변이인, 조성물.
   
5. 제 1항에 있어서, 상기 rAAV 구조물은 근육세포에서 Smad7 유전자 또는 cDNA의 발현을 지시하는 조직 특이적 프로모터 또는 인핸서(enhancer)를 포함하는 것인, 조성물.
   
6. 제 5항에 있어서, 상기 rAAV 구조물은 심근 세포(cardiac muscle cells), 골격근 세포(skeletal muscle cells) 또는 둘 다에서 Smad7 유전자 또는 cDNA의 발현을 제공하는 것인, 조성물.
   
7. 제 1항에 있어서, 상기 rAAV 구조물이 근육세포 또는 심장세포에 Smad7 유전자 또는 cDNA의 발현을 제한하는 조직 특이적 사일렌서(silencer)를 포함하는 것인, 조성물.
   
8. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 조성물의 약학적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 근육량(muscle mass) 및/또는 근력(muscle strength)을 증진시키는 방법.
   
9. 제 8 항에 있어서, 상기 개체는 근육-소모(muscle-wasting) 장애 또는 질병으로 진단되지 않은 것인, 방법.
   
10. 암 악액질을 갖는 개체를 선택하는 단계 및 치료적 유효량의 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 악액질을 가진 개체의 근육 소모를 치료하는 방법.
    
11. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 조성물을 사용하여 근력 및/또는 근육량(muscle volume)을 증가시켜 근육 소모를 치료하는 방법.
    
12. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 조성물의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 근육 소모를 억제 또는 예방하는 방법.
    
13. 제 10항, 제11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 근육 소모는 만성 장애(chronic disorder)에 의해 유발되는 것인, 방법.
    
14. 제 13항에 있어서, 상기 만성 장애는 암, 노화(근육 감소증(sarcopenia)), 근육성 이영양증(muscular dystrophy), 근병증(myopathies), 신장 질환(kidney disease), 만성 폐색성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disorder), 만성 감염(chronic infection), 에이즈, 불용성 위축증(disuse atrophy), 신경 근육 부상(neuromuscular injury), 신경장해(neuropathies), 비만, 심혈관 질환(cardiovascular disease), 또는 이들 중 둘 이상의 조합을 포함하는 것인, 방법.
    
15. 제 10항, 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 근육 소모는 미세 중력 스트레스(microgravity stress)에 의해 유발되는 것인, 방법.
    
16. 제 10항, 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 근육 소모는 심장 근육의 소모, 골격근의 소모 또는 이들 모두의 소모를 포함하는 것인, 방법.
    
17. 제 8항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 근육 내(intramuscular) 또는 정맥 내(intravenous) 주사를 통해 조성물을 전달하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
    
18. 제 8항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV를 투여하는 단계는 rAAV의 단일 투여(single dose )를 포함하는 것인, 방법.
    
19. 제 8항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV를 투여하는 단계는 rAAV의 다회 투여(multiple doses)를 포함하는 것인, 방법.
    
    

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