CN102154369B - 一种重组慢病毒载体、重组慢病毒及含有该重组慢病毒的干细胞 - Google Patents

Abstract

本发明一种重组慢病毒载体、重组慢病毒及含有该重组慢病毒的干细胞，属于医学分子生物学领域。本发明的一种重组慢病毒载体，其特征在于：在慢病毒载体的多克隆位点顺序插入Survivin启动子、Apoptin基因和SV40Poly A序列，所述慢病毒载体为FG-12。本发明重组慢病毒的应用，如转染用于移植的干细胞，将使移植到患者体内的干细胞置于本发明重组慢病毒载体的启动子的监控之下，移植的干细胞一旦发生恶性转化，将立即启动重组慢病毒中自杀基因Apoptin的表达，使恶性转化的细胞凋亡而死。在临床使用中，本发明的重组慢病毒对转化干细胞起着即特异地起到预警、反应、示踪、清除的功能。

Description

一种重组慢病毒载体、重组慢病毒及含有该重组慢病毒的干细胞

技术领域

本发明涉及医学分子生物学领域，特别涉及不同长度的存活素(Survivin)启动子驱动能够诱导恶性转化细胞主动发生凋亡的凋亡素(Apoptin)的重组慢病毒载体及重组慢病毒，以及含有该重组慢病毒的干细胞。

背景技术

虽然胚胎干细胞具有多向分化潜能，但存在着治疗性克隆的技术、医学伦理、移植物排斥和致瘤性等问题，这使得更多的研究转向成体干细胞(Adult stem cell，ASC)基础和临床的相关问题。ASC存在于多种器官和组织中，能分化为多种组织细胞，有低免疫原性和可扩增性。或作为组织工程的种子细胞，或基因治疗的载体细胞，或兼而有之，ASC移植已用于骨/软骨缺损、心肌损伤、脑损伤、皮肤损伤和肝硬化等疾病的尝试治疗。ASC在成体组织中含量极少，经体外扩增才可达到治疗性应用的需要量。但ASC在体外扩增中和移植后，面临着衰老和恶性转化两个不可回避的问题。

ASC恶性转化的机理不详，以特异分子干预恶性转化为时尚早。因此，本发明将切入点选择在对ASC恶性转化事件的监控上。借鉴对肿瘤的研究措施，建立一套基于细胞自身的“监视-发现并反应-自我清除”系统，监视和控制ASC的恶性转化。

在国内外许多研究者均努力开发可在肿瘤细胞中特异性复制表达的病毒载体，例如试图通过改造慢病毒基因组本身达到此目的，或试图通过修饰慢病毒的纤毛结构来达到此目的。其中，以外源的肿瘤特异性启动子控制重组慢病毒特异性复制，是一种重要的技术手段。研究表明，前列腺特异性抗原启动子PSA和Probasin，可特异性的调控外源基因在雄激素依赖的前列腺癌细胞表达并摄取放射性碘[Spitzweg C.Cancer Res.2000；60：6526-6530；Kakinuma H.CancerRes.2003；63：7840-7844]；癌胚抗原CEA启动子在结肠癌细胞和甲状腺髓样癌细胞[ScholzIV.Gene Ther.2005；12：272-280；Spitzweg C.Hum Gene Ther.2007；18：916-24]，降钙素calcitonin启动子在甲状腺髓样癌细胞[Cengic N.J Clin Endocrinol Metab.2005；90：4457-4464]葡萄糖转运子Glut-1启动子和鼠白蛋白增强子和启动子mALb在鼠肝癌细胞[Sieger S Eur J Nucl MedMol Imaging.2003 May；30：748-756；Chen L.J Nucl Med.2006；47：854-862].MUC-1启动子在胰腺癌细胞[Dwyer RM.CIin Cancer Res.2005；11：1483-1489]以及甲胎蛋白AFP启动子在人肝癌细胞[Willhauck MJ.Gene Ther.2008；15：214-223]均可特异性的启动外源基因表达。上述结果表明特异性的启动子可调控外源基因表达从而杀伤靶细胞。但是，上述启动子作用范围均较窄，只能针对特异性表达该启动子基因的恶性转化细胞，限制启动子调控外源基因的应用。即目前有两个瓶颈问题，一是大多数选择的启动子都是限于特殊组织类型的肿瘤，不能被广泛地应用于不同来源的肿瘤，即缺乏泛组织性；二是大多数这些启动子比通常应用的病毒启动子弱得多。

对于载体的选择，目前大多数基因治疗仍以病毒载体介导为主，目前基因治疗的病毒载体，如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒和黄病毒，但受到不能转导非分裂细胞、不能稳定整合到宿主基因组、诱导宿主的免疫反应和/或依赖于辅助病毒来产生感染等限制。逆转录病毒载体尚存在容量有限、不易制备且稳定性差、病毒滴度低、转基因效率不高等缺点，这大大限制了逆转录病毒的使用[Tomanin R.Curr Gene Ther 2004；4：357-372]。

基因转染技术为肿瘤治疗提供了新的可能性，其一就是基于自杀基因的对肿瘤细胞的基因修饰。单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(TK)/丙氧鸟苷系统即是一例。自杀基因治疗是众多基因治疗策略中效果最明显、最有前途的策略之一，但是其毒性代谢产物的释放和生物可利用性是上述这些自杀基因系统应用中两个重要的限制因素，目前还没有好的解决办法。

综上所述，自杀基因治疗是基因治疗肿瘤的策略中比较有前途的一种治疗方式，但是需要构建出针对不同组织、不同肿瘤类型的自杀基因表达盒，并转染给肿瘤细胞，表达盒的元件的选择及元件之间的构建方式都决定了表达盒的表达效率，安全性，稳定性，其转染效率，这些都是自杀基因治疗中的关键问题。针对监控ASC恶性转化事件这个目的而构建的自杀基因表达盒，更是对病毒载体的选择、自杀基因及其它元件提出了更高的要求，由于成体干细胞具有多种细胞分化潜能，可能移植到各种器官或组织中。因此，构建的自杀基因表达盒须能够在多种组织中表达，且在移植的成体干细胞未恶心转化前处于沉睡状况且不产生毒性产物，而成体干细胞恶心转化后，自杀基因能够在恶心转化细胞特有的信号作用下在恶心细胞内启动表达而清除恶心细胞且不对正常细胞产生危害，这对于构建载体的骨架载体的选择，自杀基因，以及启动子等元件都提出了更高的要求。

发明内容

本发明针对成体干细胞ASC体外扩增中或移植后，容易恶性转化这一问题，提供一种监控ASC恶性转化并启动恶性转化细胞或肿瘤细胞自杀的重组慢病毒及含有该重组慢病毒的干细胞。本发明提供的重组慢病毒的应用能够对转化细胞特异地起到预警、反应、示踪、清除的功能。

一种重组慢病毒载体，其特征在于：在慢病毒载体的多克隆位点顺序插入Survivin启动子、Apoptin基因和SV40 Poly A序列，所述慢病毒载体为FG-12。

所述Survivin启动子、Apoptin基因和SV40 Poly A序列插入到慢病毒载体的Xho I与Xba I位点之间。

所述Apoptin基因与SV40Poly A序列之间插入有6个His标签序列。

所述Survivin启动子的核苷酸序列如Seq ID NO.1，Seq ID NO.2或Seq ID NO.3所示。

所述Apoptin基因序列上游插入有Kozak序列。

所述重组慢病毒载体为FG-161pSur-ApoH-pA、其核苷酸序列如Seq ID NO.4所示；FG-272pSur-ApoH-pA，其核苷酸序列如Seq ID NO.5所示或FG-990pSur-ApoH-pA，其核苷酸序列如Seq ID NO.6所示。

一种重组慢病毒，是上述重组慢病毒载体与慢病毒辅助包装质粒共转染宿主细胞后得到的包装体。

所述宿主细胞为293FT。

所述重组慢病毒为：Lenti-FG-161pSurAH，Lenti-FG-272pSurAH或Lenti-FG-990pSurAH。

转染有上述重组慢病毒的干细胞。

所述干细胞指造血干细胞或间充质干细胞，所述造血干细胞来源于骨髓、外周血或脐带血，所述间充质干细胞来源于骨髓、皮肤、脂肪、胎盘、脐带、脐带血或经血。

本发明的目的是提供了一种对ASC恶性转化细胞进行“监视-发现并反应-自我清除”的系统，系统的主要构件须有：1.泛肿瘤细胞特异表达基因的启动子；2.在细胞内表达并自杀恶性转化细胞的基因；3.同步显示恶性转化细胞及其清除；4.标记基因修饰的ASC并作为分离手段；5.高感染率和稳定整合性兼顾的外源基因导入途径。

为达到上述目的，本发明构建一种重组慢病毒载体和重组慢病毒以及转染了该重组慢病毒的各种成体干细胞。含有该载体的成体干细胞在恶性转化情况下将会启动该载体中自杀基因表达，从而清除恶性转化的细胞。由于多能ASC的恶性转化可以是多组织性的，因此所需启动子必须有多组织性和泛肿瘤特异性。而我们选取了Survivin基因的启动子(GenBank AccessionNumber：U75285)置换慢病毒载体中的启动子。该启动子在正常干细胞中表达低或检测不到，Survivin基因长度14.7kb，位于17q25染色体，编码142个氨基酸的蛋白。Survivin蛋白具有抑制凋亡和参与细胞周期调控的作用。Survivin基因在正常组织中仅表达于人类胚胎正在发育的组织和一些具有高增殖活性的细胞(Ambrosini GNat Med 1997；3：917-921)，其他分化的正常组织中几乎不表达(除外胸腺、结肠上皮基底细胞、血管形成时的内皮细胞和神经干细胞)，在100多种肿瘤特异性表达基因中，其表达特异性名列前4位，并与疾病的进展、预后密切相关(LiF.JCell Physiol 2003；97：8-29；Li F J Cell Physiol 2006；208：476-486)。它在各种肿瘤中的表达率高：子宫肿瘤阳性率100％，恶性黑色素瘤93％，肺肿瘤86％，乳腺癌71％，皮肤癌87％，膀胱癌78％，食管癌70.7％，结直肠癌63.5％，胰腺癌76.9％，肝癌70％，胃癌34～100％5。应用基因表达的连续分析，芯片分析(＞8000基因)以及启动子活性分析等均证实Survivin基因是肿瘤中过表达最高的基因之一，其启动子活性具有肿瘤特异性(Sato，F.，Abraham，J.M.，Yin，J.，Kan，T.，Ito，T.，Mori，Y.，Hamilton，J.P.，et al.，Polo-like kinase and survivin are esophageal tumor-specificpromoters，Biochem Biophys Res Commun，2006；Wang，Y.，Huso，D.L.，Harrington，J.，Kellner，J.，Jeong，D.K.，Turney，J.and McNiece，I.K.，Outgrowth of a transformed cell population derived fromnormal human BM mesenchymal stem cell culture，Cytotherapy，2005，7(6)：509-519.)survivin启动子在肿瘤组织中活性高、特异性强，而在正常组织中几乎不表达的特点，使其成为本发明以驱动自杀基因表达的理想起动原件。

本发明的构建的重组慢病毒载体中，选择Apoptin作为自杀基因，该基因克服了毒性代谢产物的释放和生物可利用性差方面的缺陷，在含有本发明的重组慢病毒载体的细胞中，外源性Apoptin被启动表达后，在肿瘤细胞中逐渐发生核转位，而在正常细胞中则留滞在细胞质中。研究表明Apoptin的核分布与它诱导肿瘤细胞凋亡的效率之间显著相关。研究发现引导Apoptin定位到内质网和线粒体几乎全部丧失其诱导细胞凋亡的能力(Tavassoli，M.，Guelen，L.，Luxon，B.A.and Gaken，J.，Apoptin：Specific killer of tumor cell，Apoptosis，2005，10(4)：717-724.；Noteborn，M.H.，Apoptin acts as a tumor-specific killer：potentials for an anti-tumor therapy，Cell Mol Biol(Noisy-le-grand)，2005，51(1)：49-60.)。绝大多数研究显示，即使Apoptin表达于正常细胞的细胞核中，并不诱导细胞凋亡。在肿瘤细胞系、转化细胞系、血液病细胞和移植瘤模型，Apoptin均显示肿瘤特异的杀伤作用。正常细胞同时表达Apoptin和大T抗原则发生凋亡，说明即使短暂表达病毒转化基因也可以使正常细胞对Apoptin诱导的凋亡易感，因此Apoptin基因是实现本发明目的的最佳选择。

对于载体的选择，本发明选用慢病毒载体，慢病毒是一种无包膜的双链DNA病毒，二十面体对称，蛋白外壳主要由240个六邻体和12个五邻体组成。五邻体是顶角壳粒，由基部和纤维组成，纤维的节区是慢病毒与其相应的细胞表面受体CAR结合的部位，介导慢病毒与受体细胞的接触。人类慢病毒共有51个血清型，目前应用的慢病毒载体主要是在人慢病毒亚群的Ad2和Ads的基础上构建的。慢病毒基因组长36kb.基因组两端各有长100bp-150bp的末端反向重复序列ITR，是病毒DNA复制的起始点，亦是复制包装必需的顺式作用元件。病毒体进入细胞后，基因组以病毒DNA是否开始复制为界限，分为早期和晚期基因表达两个时期。早期基因(Ei-Ea)编码不同的基因表达调节因子，调控病毒基因表达。晚期基因编码病毒结构蛋白，由晚期主要启动子MLP启动表达。野生型慢病毒最大外源基因容量约为2kb，将病毒非必需基因组缺失，则可增加携带外源基因容量，又不影响病毒在包装细胞中复制增殖。理论上除慢病毒基因组两端约500bp的顺式结构是复制和包装所必需的结构外，其他结构均可被替换成外源基因。慢病毒源性载体最主要的优点是安全性与稳定性好，易于制备、纯化；病毒滴度高，插入的外源基因片段长，宿主细胞种类广泛；可感染处于不同周期的细胞，转导效率较高，且无致突变的危险，本发明优选载体为，FG-12，缺失E1区和E3区，除具有上述优点外，自带EGFP示踪基因可以用于活体示踪移植的干细胞在体内的分布。

综合而言，本发明提供的一种重组慢病毒载体，以Survivin启动子置换慢病毒载体启动子，只有在表达Survivin蛋白的细胞环境中，才具有该启动子的激活因子，所以该启动子才被激活，Survivin启动子下游的自杀基因apoptin基因才开始被复制及表达。而在正常的细胞中，不存在这样的激活因子，目的基因不能被复制及表达，这样就造成了对恶性转化细胞和肿瘤细胞的选择性杀伤。本发明的实施例4的结果证明，将本发明构建的重组慢病毒用于体外感染，可使肿瘤细胞株Hela发生细胞凋亡。

本发明构建的重组慢病毒载体中，对Survivin启动子序列进行了优化选择，已有研究表明，survivin基因启动子的活性与ATG上游的序列和长度密切相关，2840bp和1430bp显示出高活性，6272bp、649bp和441bp显示中等活性[Li，F.Biochem J，1999；344 Pt 2：305-311]。另有报告，272bp长的survivin基因启动子的活性高于596bp、990bp和158bp长的启动子片段[Xu，R.BiochemBiophys Res Commun，2007；356(1)：286-292]。我们在构建survivin基因启动子驱动Apoptin基因表达的载体时，对survivin基因启动子紧靠ATG的kozak序列做了改动，以方便酶切和连接，即将GGCGGCATGG变为CGCGGCATGG。并选择Survivin启动子序列中如Seq ID No.1，Seq IDNo.2或Seq ID No.3所示的片段作为本发明重组慢病毒的启动子序列，经体外表达试验发现，272bp长的survivin基因启动子启动表达的基因表达量明显高于另外两个，如图12。

本发明构建的载体，优选在apoptin基因上游插入kozak序列，进一步增强apoptin基因的表达，实现更好的恶性细胞自杀效果。

本发明优选在重组慢病毒载体中插入标签蛋白基因His，用于离体检测apoptin的表达水平和细胞内分布。

本发明获得的重组慢病毒载体通过与慢病毒辅助包装系统共转染宿主细胞可包装成重组慢病毒，本发明优选Invitrogen公司的Virapower系统，，宿主细胞为293FT。

本发明获得重组慢病毒可用于侵染干细胞，获得含有本发明重组慢病毒载体的干细胞。该干细胞用于移植后，处于重组慢病毒载体的监控之下，一旦恶性转化，即启动外源自杀基因Apoptin的高度表达，且表达量随恶性程度增加而提高，最终清除恶性转化的干细胞。由于慢病毒的宿主细胞种类广泛的特性，可转染大多数种类的干细胞，其启动子为泛肿瘤特异性启动子，所以干细胞可以是人造血干细胞，包括骨髓、外周血和脐带血来源的造血干细胞以及骨髓、皮肤、脂肪、胎盘、脐带、脐带血和经血来源的间充质干细胞。

附图说明

图1：本发明不同片段长度Survivin启动子克隆(人基因组来源)；

A：PCR扩增的Survivin启动子的电泳鉴定图从左到右依次为161bp凋亡素启动子、272bp凋亡素启动子、990bp凋亡素启动子。

B：Survivin启动子TA克隆的双酶切鉴定从右到左依次为经Xho I/Not I双酶切后161bp凋亡素启动子、272bp凋亡素启动子、990bp凋亡素启动子的插入片段。

C：不同片段长度Survivin启动子的部分测序结果图中标有Xba I、Not I、Xho I酶切位点。

图2：本发明Survivin启动子驱动萤光素酶表达的质粒的酶切鉴定；

图3：本发明报告基因载体转染293FT细胞后荧光素酶分析；

图4：本发明apoptin-6×His PCR产物电泳鉴定图；

(1)Marker：DL4000；(2)Apoptin目的片段为400bp

图5：本发明重组质粒T-Apo-His酶切电泳图谱；

图中(1)Marker左为15000bp，右为2000bp；(2)Not I和Xba I双酶切T-Apo-His质粒；(3)T载体2694bp(质粒载体本身)+400kb(apoptin-6×His片段)

图6A：本发明T-161pSur-ApoH质粒构建的酶切电泳图谱；

图中(1)Marker左为15000bp，右为2000bp；(2)从左到右为1-5号克隆细菌；(3)XholI和Xba I双酶切；(4)T载体2694bp(质粒载体本身)+凋亡素启动子全长990+400bp(apoptin-6×His片段)

图6B：本发明T-272pSur-ApoH质粒构建的酶切电泳图谱；

(1)Marker左为15000bp，右为2000bp

(2)从左到右为1-4号克隆细菌；(3)Xhol I和Xba I双酶切；(4)T载体2694bp(质粒载体本身)+部分凋亡素启动子272bp+400bp(apoptin-6×His片段)

图6C：本发明T-990pSur-ApoH质粒构建的酶切电泳图谱；

(1)Marke左为15000bp，右为2000bp；(2)从左到右为1-4号克隆细菌；(3)Xhol I和Xba I双酶切；(4)T载体2694bp(质粒载体本身)+部分凋亡素启动子161bp+400bp(apoptin-6×His片段)

图7：本发明重组慢病毒质粒FG-12-pA构建的酶切电泳图谱；

图中(1)Marker右为2000bp；(2)从左到右为1-2号克隆细菌；(3)Xba I和Pst I双酶切；(4)10kb(质粒载体本身)+292bp+246bp。两个小片段的出现用于鉴定合成的polyA片段插入的方向，292bp+246bp为正向插入，353bp+185bp为反向插入。

图8A：本发明FG-990pSur-ApoH-pA慢病毒骨架构建的酶切电泳图谱；

(1)Marker左为15000bp，右为2000bp；(2)中间为1-3号克隆细菌；(3)Xhol I和Xba I双酶切；(4)10kbp(质粒载体本身)+1400bp片段(凋亡素启动子990bp+apoptin-6×His400bp片段)

图8B：本发明FG-272pSur-ApoH-pA慢病毒骨架构建的酶切电泳图谱；

(1)Marke左为15000bp，右为2000bp；(2)样本为1号克隆细菌；(3)Xhol I和Xba I双酶切；(4)10kbp(质粒载体本身)+670bp(凋亡素启动子272bp+apoptin-6×His片段)

图8C：本发明FG-161poH-pA慢病毒骨架构建的酶切电泳图谱；

(1)Marke左为15000bp，右为2000bp；(2)从左到右为1-5号克隆细菌；(3)Xhol I和Xba I双酶切；(4)10kbp(质粒载体本身)+560bp(凋亡素启动子161bp+apoptin-6×His片段)

图9：本发明Lenti-FG-161pSurAH、Lenti-FG-272pSurAH、Lenti-FG-990pSurAH慢病毒的包装；

左上，Lenti-FG-990pSurAH转染24h后(荧光)，右上，转染24h后(明光)；

左中：FG-272pSur-ApoH-pA转染24h后(荧光)，右中，转染24h后(明光)；

左下：FG-161pSur-ApoH-pA转染24h后(荧光)，右下，转染24h后(明光)

图10：本发明Lenti-FG-161pSurAH、Lenti-FG-272pSurAH、Lenti-FG-990pSurAH慢病毒上清的滴度测定；

上图：Lenti-FG-990pSurAH感染细胞后72小时的荧光照片(稀释10⁶倍)

中图：Lenti-FG-272pSurAH感染细胞后72小时的荧光照片(稀释10⁶倍)

下图：Lenti-FG-161pSurAH感染细胞后72小时的荧光照片(稀释10⁶倍)

图11：本发明Lenti-FG-272pSurAH慢病毒上清感染SW480细胞的结果；

左：慢病毒Lenti-FG-272pSurAH感染SW480细胞96h的结果，荧光

右：慢病毒Lenti-FG-272pSurAH感染SW480细胞96h的结果，明光

图12：以6×his的抗体检测三种长度的启动子启动下目的蛋白的表达区别；

图13：慢病毒Lenti-FG-272pSurAH感染Hela细胞和10T1/2细胞72h诱导细胞死亡的结果。

图14.FG-12结构示意图

具体实施方式

实施例1：重组慢病毒载体的构建。

本发明涉及到的生物材料来源：

T-apoptin载体：北京农林研究院杨兵研究员惠赠，可商购

FG-12：由David Baltimore教授(David Geffen School of Medicine，University of California，LosAngeles，USA)馈赠。该载体缺失E1区和E3区，可插入大片段的外源基因，除具有上述优点外，还自带EGFP示踪基因，可以用于活体示踪移植的干细胞在体内的分布，见图14。

辅助包装质粒：Invitrogen公司的Virapower系统。

293FT细胞：购自上海细胞生物学研究所。

以上生物材料本实验室均有保存，可向公众发放用于验证实验。

(1)Survivin启动子扩增：设计引物，以正常人骨髓基质细胞的基因组DNA为模板，PCR扩增不同长度的Survivin启动子片段，见图1.A，T/A克隆到PMD-18T载体，分别命名为T-161pSur、T-272pSur和T-990pSur，并进行测序。见图1.C。

扩增启动子的上游引物序列分别为：

SP161-S：5-TGCCTCGAGTACAACTCCCGGCCACAC-3′；

SP272-S：5-TGCCTCGAGCACGCGTTCTTTGAAAGC-3′；

SP990-S：5-TGCCTCGAGCCTGGCCATAGAACCAGAGAAGTG-3。

下游共同引物序列为：

SP-AS：5-GCCGCGGCCGCCACCTCTGCCAACG-3′。

(2)Apoptin cDNA扩增：以T-apoptin载体(北京农林研究院杨兵研究员惠赠)为模板，通过PCR扩增Apoptin cDNA。上游引物中包含Kozak序列，下游引物中带有6×His标签。PCR产物进行T/A克隆，插入到PMD-18Tfpo载体，命名为T-Apo-His，酶切鉴定结果见图5。连接产物转化DH-5α细菌，挑取单个菌落，提取质粒并进行测序。

上游引物序列为：

Apo-S：5-TGGCGGCCGCGGCATGAACGCTCTCCAAGAAG-3′；

下游引物序列为：

Apo-AS：

5-AAGAAGGTGTATAAGACTGCATCATCACCATCACCATTAATTCTAGATCTG-3′；

(3)在T载体上连接Survivin启动子和Apoptin：不同长度的Survivin启动子连接至ApoptincDNA的Kozak序列上游：以Not I和Xba I切下Apoptin-6×His片段，凝胶电泳检测，如图4；以Not I和Xba I双酶切线性化T-161pSur、T-272pSur和T-990pSur载体；将Apoptin-6×His片段连接于Survivin启动子下游，分别命名为T-161pSur-ApoH、T-272pSur-ApoH和T-990pSur-ApoH，酶切鉴定结果见图6A，6B，6C。连接产物转化DH-5α细菌，挑取单个菌落，提取质粒并进行测序。

(4)在慢病毒载体FG-12的多克隆位点处引入SV40polyA。

合成2条互补的SV40 polyA oligoDNA单链，

序列为POLYA-A：

5’-CTAGTATACAAAAAACCAACACACAGATCCAATGAAAATAAAAGATCCTTTATTGGATCCT；

POLYA-AS：

5’CTAGAGGATCCAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTATA

两条单链退火后两端形成与Xba I粘性末端匹配的粘性末端，连接到用Xba I线性化的FG-12载体，连接后PolyA片段5’端Xba I的酶切位点消失，3’端的BamHI和Xba I保留。连接产物转化DH-5α细菌，挑取单个菌落，提取质粒并进行酶切鉴定，见图7。命名为FG-12-pA。

(5)构建由Survivin启动子驱动Apoptin-6×His表达的慢病毒骨架：Xho I和Xba I线性化慢病毒骨架质粒FG-12-pA；Xho I和Xba I从T-161pSur-ApoH、T-272pSur-ApoH和T-990pSur-ApoH质粒上切下Survivin启动子和apoptin-6×His联合片段，连接到线性化的FG-12-pA骨架的多克隆位点上，分别命名为FG-161pSur-ApoH-pA、FG-272pSur-ApoH-pA和FG-990pSur-ApoH-pA，酶切鉴定如图8A，8B，8C所示。

(6)重组慢病毒的包装：分别将FG-161pSur-ApoH-pA、FG-272pSur-ApoH-pA和FG-990pSur-ApoH-pA慢病毒骨架与Virapower系统一起共转染293FT细胞，以脂质体为媒介；转染后16h换液，收集随后24h和48h的培养上清，分别获得含重组慢病毒Lenti-FG-161pSurAH、Lenti-FG-272pSurAH、Lenti-FG-990pSurAH的细胞上清，上清用0.25um的滤膜过滤，-80℃保存，转染24小时收集上清时的荧光图及明光下获得的图像见图9(使用的是奥林巴斯公司的1X71-FL荧光倒置显微镜)，说明重组病毒进程顺利。

(7)含病毒培养上清的病毒滴度测定：测定前4h，按每孔1×10⁴个细胞接种293细胞到96孔板；用新鲜培养基(5％的胎牛血清，4ug/ml polybrene，无抗生素)按1∶10倍比稀释含病毒上清，并用含病毒的稀释液替换96孔板中的原培养基，24h后，换新鲜全培养基，24h后观察FG12自带的绿色荧光蛋白表达阳性的细胞，计算病毒滴度，三种重组慢病毒的滴度分别为1.45X10⁸TU/ml、1.25X10⁸TU/ml和1.95X10⁸TU/ml(见图10)。

实施例2：三种启动子启动活性的比较(抗体检测目的蛋白表达量)

材料：实施例1获得的三种重组慢病毒上清Lenti-FG-161pSurAH、Lenti-FG-272pSurAH、Lenti-FG-990pSurAH，BIO-RAD电泳仪及电转仪(美国BIO-RAD公司)，一抗为鼠抗His抗体(碧云天公司)、二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(碧云天公司)、ECL发光试剂盒(碧云天公司)

方法：

1、将293FT传入24孔板，控制数量以保证第二天细胞密度在70～80％左右。

2、以Lip200为媒介，按常规操作，分别转染FG-161pSur-ApoH-pA、FG-272pSur-ApoH-pA和FG-990pSur-ApoH-pA三个质粒，每孔转染质粒量为800ng，质粒(ug)∶Lip2000(ul)＝1∶1.5，同时设立阴性对照组。

3、转染48h后吸弃培养液，加入RIPA细胞裂解缓冲液100ul，数分钟后收集裂解液入离心管内，12000rpm离心5min，收集上清，-80备用。

4、蛋白定量后，各取20ug加入上样缓冲液中，在100℃加热5-10分钟以使蛋白质变性后，上样、电泳、转膜。

5、将PVDF置于封闭液(TBST+5％脱脂奶粉)孵育2h，漂洗。

6、孵一抗(抗-His tag 1∶1000)，4℃过夜。

7、TBS-T漂洗5min，反复4次后加入HRP标记的二抗(1∶1000)，摇床上孵育2小时。

8、TBS-T漂洗后，使用ECL发光试剂盒经胶片曝光记录所有蛋白浓度信号。

9、His蛋白的浓度与β-actin内参修正后进行比较。

结果：272bp survivin基因启动子的活性明显高于990bp和161bp启动子(P＜0.01)，后两者之间没有显著差异。见图12

实施例3：重组慢病毒Lenti-FG-272pSurAH感染Hela细胞和10T1/2细胞诱导细胞死亡

材料：用将实施例1获得的重组Lenti-FG-272pSurAH慢病毒上清，奥林巴斯公司的1X71-FL荧光倒置显微镜，Hela细胞，10T1/2细胞

方法：用实施例1获得的重组慢病毒上清Lenti-FG-272pSurAH感染肿瘤细胞系Hela细胞和间充质干细胞系10T1/2细胞，72小时。

A.荧光显微镜观察

1、将肿瘤细胞系Hela细胞和间充质干细胞系10T1/2细胞于盖玻片上生长24小时。

2、用实施例1获得的重组慢病毒上清Lenti-FG-272pSurAH感染肿瘤细胞，继续培养72小时。

3、细胞用PBS洗涤两次。

4、在500ul的Binding Buffer中加入5ul 7-AAD染液混匀，加入上述培养细胞中。

5、避光，室温孵育反应5min，于荧光显微镜下(激发波长546nm，发射波长647nm)观察7-AAD荧光信号呈红色，为死亡细胞。

结果：Lenti-FG-272pSurAH病毒感染诱导肿瘤细胞系Hela细胞显著死亡，而间充质干细胞系10T1/2细胞只有很少部分发生死亡。见图13

实施例4：发明报告基因载体转染293FT细胞后荧光素酶分析

材料：293FT细胞株购自上海细胞生物学研究所，PMIR-report和pMIR-REPORT β-Galcontrol plasmid购自Invitrogen公司，荧光素酶活性检测试剂盒及β-Gal半乳糖苷酶检测试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所，萤光素酶活性检测使用Progmega公司的单管发光计。

方法：

(1)survivin基因启动子-荧光素酶报告基因表达载体的构建及鉴定：将测序正确的T-161pSur、T-272pSur和T-990pSur双酶切(Xba I/Pst I)后回收含启动子的大片段，将PMIR-report质粒双酶切(Xba I/Pst I)切下自带的CMV启动子后回收大片段骨架，两者经T4连接酶连接后产物分别命名为pMIR-T161、pMIR-T272、pMIR-T990并行Xba I/Pst I双酶切鉴定。

(2)细胞培养和质粒转染：293FT细胞用含10％小牛血清的DMEM培养液，于37℃，5％CO₂的条件下培养。24孔板中每孔接种4-8×10⁴细胞，培养24h后(细胞生长至80％-90％融合度)，报告质粒DNA(200ng/孔)与带有CMV启动子的内参质粒pMIR-REPORT β-Gal controlplasmid(200ng/孔)进行脂质体介导的DNA共转染。转染6h后用含10％小牛血清的DMEM培养液替换无血清培养液。48h后裂解细胞离心收获上清。

(3)荧光素酶活性的测定：采用碧云天的荧光素酶活性检测试剂盒及β-Gal半乳糖苷酶检测试剂盒测定细胞裂解液荧光素酶(Luc)和β-半乳糖苷酶(β-Gal)的活性，后者的活性反映每孔细胞的转染效率。Progmega公司的单管发光计检测的荧光素酶的相对活性以Luc/β-Gal的比值来进行比较。每次转染实验转3个孔，至少重复3次转染实验。

结果，见图2、3，说明不同片段长度的survivin基因启动子活性有差异，并可能与细胞类型和载体结构有关。

Claims (5)

1.一种重组慢病毒载体，其特征在于：在慢病毒载体的多克隆位点顺序插入Survivin启动子、Apoptin基因和SV40 Poly A序列，所述慢病毒载体为FG-12，

所述Survivin启动子、Apoptin基因和SV40 Poly A序列插入到慢病毒载体的Xho I与XbaI位点之间，

所述Apoptin基因与SV40 Poly A序列之间插入有6个His标签序列，

所述Survivin启动子的核苷酸序列如Seq ID NO.1，Seq ID NO.2或Seq ID NO.3所示，

所述Apoptin基因序列上游插入有Kozak序列，

所述重组慢病毒载体为FG-161pSur-ApoH-pA、其核苷酸序列如Seq ID NO.4所示，FG-272pSur-ApoH-pA，其核苷酸序列如Seq ID NO.5所示或FG-990pSur-ApoH-pA，其核苷酸序列如Seq ID NO.6所示。

2.一种重组慢病毒，其特征在于，是权利要求1所述重组慢病毒载体与慢病毒辅助包装质粒共转染宿主细胞后得到的包装体。

3.根据权利要求书2所述的重组慢病毒，所述宿主细胞为293FT。

4.转染有权利要求2或3所述的重组慢病毒的干细胞。

5.根据权利要求4所述的干细胞，指造血干细胞或间充质干细胞，所述造血干细胞来源于骨髓、外周血或脐带血，所述间充质干细胞来源于骨髓、皮肤、脂肪、胎盘、脐带、脐带血或经血。

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