CN101128592B - 含有核心蛋白聚糖基因的基因送递系统和用于治疗癌症的包含该系统的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的基因送递系统和包括编码核心蛋白聚糖的序列以增强转基因的转导效率的重组腺病毒，一种包括所述重组腺病毒的抗肿瘤药物组合物，一种具有改善的组织穿入效力的药物组合物和一种用于治疗与过量的细胞外基质累积相关的疾病或病症的药物组合物。

Description

含有核心蛋白聚糖基因的基因送递系统和用于治疗癌症的包含该系统的药物组合物
技术领域
本发明涉及一种新的基因送递系统和重组腺病毒，具体而言，本发明涉及一种新的基因送递系统和包括编码核心蛋白聚糖序列的重组腺病毒，一种包括该重组腺病毒的抗肿瘤药物组合物，一种特征为改善的组织穿入能力的药物组合物和一种用于治疗与过量细胞外基质累积相关的疾病或病症的药物组合物。
背景技术
早期基于腺病毒的基因治疗通常使用携带缺失对于腺病毒复制必需的E1基因的治疗基因的复制缺陷型腺病毒。然而，这些重组腺病毒仅在受感染细胞和很少量的周围细胞中诱导抗肿瘤活性，在临床应用中表现出严重的问题(Vile RG，Russell SJ，Lemoine NR.，Gene Ther，2000，7(1)：2-8)。为了克服此类问题，McCormick研究小组首先开发了在肿瘤细胞中选择性复制的溶瘤腺病毒，ONYX-015(dl1520)(BischoffJR，等，Science，1996，274(5286)：373-376；Heise C，等，Nat Med，1997，3(6)：639-645)。缺失E1B55kDa基因的腺病毒在缺乏功能性p53的肿瘤细胞中选择性复制。当重组腺病毒感染正常细胞时，因为没有诱导p53失活，所以其增殖受到抑制，导致溶瘤作用失败，而其在具有失活的p53的肿瘤细胞中活跃地增殖并最终引起肿瘤细胞的选择性死亡(Chang，F.，等，J Clin Oncol13：1009-22(1995))。
根据脑癌的II/III期临床试验的最近报道，肿瘤特异的溶瘤腺病毒表现出可观的治疗效能(Kim，D.，等，Nat Med4：1341-2(1998)；Nemunaitis，J.等，Cancer Res60：6359-66(2000)；和Ganly，I.等，ClinCancer Res6：798-806(2000))。虽然给予重组腺病毒诱导肿瘤生长的部分抑制作用，但是没有发现肿瘤完全根除，且经过一段时间后肿瘤的再生长快速发生。这些结果可能是因为局部注射到肿瘤的重组腺病毒在有限的周围部分扩散以引起有限的的抗肿瘤活性，从而使没有感染病毒的肿瘤细胞快速生长。根据最近的研究报道，给予到裸鼠中的人肿瘤中的重组腺病毒在晚至最初的病毒注射后100天持续复制并不保证完全根除肿瘤，但是从肿瘤组织可获得有活力病毒。根据随后的研究报道，已经清楚低抗肿瘤作用是因为细胞中存在的结缔组织和细胞外基质(ECM)在抑制重组腺病毒的病毒扩散中起显著作用。此外，当将腺病毒注射到肿瘤时，在早期阶段，通过先天性免疫反应将其从血流中快速根除；但是，在病毒注射后大约48周，可观察到推测在肿瘤中复制并释放到血流中的腺病毒又出现在血流中。考虑到这些连续的结果，可以认识到虽然给予的肿瘤特异性溶瘤腺病毒在肿瘤细胞中活跃地增殖，但是在肿瘤细胞间的如结缔组织和细胞外基质(ECM)的物理屏障可能抑制病毒扩散，于是高度降低了腺病毒的抗肿瘤作用。
因此，可以理解理想的肿瘤特异溶瘤腺病毒具有诱导更大的溶瘤活性和在遍布肿瘤组织扩散以及感染周围肿瘤细胞的能力。
近来，已经报道许多研究者克服了病毒基因载体在组织中由于其有限的扩散潜力引起的低转导效率。N.Kuriyama等报道消化胶原蛋白和细胞外基质的其它组分的胶原蛋白酶/分散酶或胰蛋白酶增强了病毒感染，表明蛋白酶预处理可能是用于增强病毒介导的基因转导的有用的策略(Kuriyama N，等，Hum Gene Ther，2000，11(16)：2219-2230)。此外，L Maillard等通过用为分解弹性蛋白的酶的弹性蛋白酶处理兔髂动脉，尝试提高腺病毒介导的基因转移的效率大约2倍，所述弹性蛋白为动脉的主要成分(Maillard，L，等，Gene Ther，1998，5(8)：1023-1030)。有报道为分解细胞外基质的酶的透明质酸酶在大鼠肌肉中可增强腺相关病毒的转导效率约2-3倍(Favre D，等，Gene Ther，2000，7(16)：1417-1420)。通过这些相继研究的结果，应该理解通过抑制细胞外组分的合成或促进细胞外组分的分解降低细胞外组分可增加组织中病毒的扩散，从而提高病毒的基因转导效率。此外，应该认识到阻碍细胞外基质组装可防止和治疗由皮肤结缔组织的异常增殖引起的如瘢痕疙瘩的纤维变性疾病。
贯穿本申请，参考了若干专利和出版物并在括号中提供引证。为了更全面地描述本发明和本发明涉及的本领域的状况，将这些专利和出版物的公开内容引入本发明。
发明内容
本发明人已进行深入研究以改善基因送递系统的转导效率，具体而言，以增强组织中基因送递系统的转导(或扩散)效率，结果，发现核心蛋白聚糖可以显著地改善基因送递系统的转导效率，并且表达核心蛋白聚糖的重组腺病毒可显著表现出穿入肿瘤组织的潜力和抗肿瘤作用。
因此，本发明的一个目的是提供一种包含具有改善的转导效率的编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列的基因送递系统。
本发明的另一个目的是提供一种向细胞中递送具有改善的转导效率的基因的方法。
本发明的又一目的是提供一种具有改善的肿瘤组织穿入和肿瘤特异性细胞凋亡能力的重组腺病毒。
本发明的另一目的是提供一种用于治疗癌症的抗肿瘤药物组合物。
本发明的又一目的是提供一种通过使用所述抗肿瘤药物组合物治疗癌症的方法。
本发明的另一目的是提供一种用于改善药物进入组织的穿入能力的药物组合物。
本发明又另一目的是提供一种用于治疗与过量细胞外基质累积相关的疾病或病症的药物组合物。
结合所附的权利要求书和附图，从以下详细描述中，本发明的其他目的和优点将变得显而易见。
在本发明的一个技术方案中，提供一种包含待递送到细胞中的目的核苷酸序列的基因送递系统，改善是其包含编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列以增强所述目的核苷酸序列进入细胞的转导效率。
本发明人已进行深入研究以改善基因送递系统的转导效率，具体而言，以增强组织中的基因送递系统的转导(或扩散)效率。此类研究基于我们的通过促进降解或抑制细胞外基质组分的合成而降低细胞外基质组分的水平可增强组织内基因送递系统的扩散的假设。令人惊奇地，本发明人已发现核心蛋白聚糖可以显著地提高基因送递系统的转导效率。
在此所用的术语“核心蛋白聚糖”包含实施例中示出和举例说明的核心蛋白聚糖以及提高为本发明目的的转导效率的其任意同系物。
核心蛋白聚糖(decorin，DCN)作为提高本发明的基因转导效率中的增强子起重要作用，其为SLRP(small leucine-rich proteoglycan，小分子富含亮氨酸蛋白聚糖)的扩展家族中的原型成员，包含10～12富含亮氨酸的重复序列。核心蛋白聚糖的核心区为弓形，以作为多种生长因子或细胞外基质中存在的核心蛋白聚糖受体的合适配体(Krusius T，Ruoslahti E.，Proc Natl Acad Sci U S A，1986，83(20)：7683-7687；DayAA，等，Biochem J，1987，248(3)：801-805；Fisher LW，Termine JD，Young MF.，J Biol Chem，1989，264(8)：4571-4576)。已知蛋白聚糖核心蛋白聚糖抑制TGF-β活性，使其抑制胶原蛋白的纤维变性以参与细胞外基质组装，并且作为针对肿瘤发生和肿瘤生长的天然存在拮抗剂(Iozzo RV.，Crit Rev Biochem MoI Biol，1997，32(2)：141-174；Isaka Y，等，Nat Med，1996，2(4)：418-423)。而且，核心蛋白聚糖与如生长因子和金属离子的细胞外组分一起诱导MMP-I(基质金属蛋白酶-1)和MMP-2的表达，降解细胞外基质(Yamaguchi Y，Mann DM，Ruoslahti E.，Nature，1990，346(6281)：281-284；Vogel KG，Paulsson M，Heinegard D.，Biochem J，1984，223(3)：587-597；Danielson KG，等，J Cell Biol，1997，136(3)：729-743)。
根据本发明的基因送递系统，核心蛋白聚糖促进多种MMP如MMP2和MMP9的表达，使得表达的核心蛋白聚糖诱导围绕细胞的细胞外基质的主要组分胶原蛋白的降解，以破坏结缔组织和基底膜，因此导致细胞外基质的降解。这种连续作用是在下述实施例中清楚地证实的通过核心蛋白聚糖提高转导效率下的机制之一。
因此，参考核心蛋白聚糖的上述作用，本基因送递系统的优点集中在由通过细胞外基质互相连接的细胞组成的组织内的细胞。具体而言，当用于由结缔组织紧密包围的肿瘤组织，与任何常规送递系统相比，本基因送递系统表现出提高的转导效率。
为了构建本发明的基因送递系统，优选在合适的表达构建体中包含编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列。根据所述的表达构建体，优选编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列与启动子可操作地连接。术语“可操作地连接”指的是核酸表达控制序列(如启动子、信号序列或转录因子结合位点的阵列)与第二个核酸序列之间的功能性连接，其中所述表达控制序列影响对应于第二序列的核酸的转录和/或翻译。根据本发明，与核心蛋白聚糖基因连接的启动子优选在动物细胞中、更优选在哺乳动物细胞中是可操作的，以控制核心蛋白聚糖基因的转录，包括来源于哺乳动物细胞基因组或哺乳动物病毒的启动子，例如，U6启动子、H1启动子、CMV(巨细胞病毒)启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV tk启动子、RSV启动子、EF1α启动子、金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人IL-2基因启动子、人IFN基因启动子、人IL-4基因启动子、人淋巴毒素基因启动子、人GM-CSF基因启动子、诱导型启动子、肿瘤细胞特异性启动子(例如，TERT启动子、PSA启动子、PSMA启动子、CEA启动子、E2F启动子和AFP启动子)以及组织特异性启动子(例如，白蛋白启动子)。最优选地，所述启动子为CMV启动子或肿瘤特异性启动子。作为肿瘤细胞特异性启动子，优选TERT启动子和E2F启动子。作为TERT(端粒反转录酶)启动子，可以使用本发明人研发的野生型人hTERT(人端粒反转录酶)启动子或m-hTERT启动子(参见WO2004/076668)。已经研发了本发明中使用的m-hTERT启动子以携带一个或多个(优选，一个)额外的c-Myc结合区和一个或多个(优选，五个)Sp1结合区，以及包括两个c-Myc结合区和五个Sp1结合区的人端粒反转录酶启动子。WO2004/076668中公开了m-hTERT启动子核苷酸序列的详细描述。本发明中使用的E2F启动子为参与细胞周期的启动子(Johnson，D.G.，MoI.Carcinog.27：151-157(2000)；Ngwenya，S.，和Safe，S.，Endocrinology144：1675-1685；Cam，H.，和Dynlacht，D.，Cancer Cell 3：311-316(2003))。
优选地，在本发明中使用的表达构建体包含聚腺苷酸化序列(例如，牛生长激素终止子和SV40-衍生的聚腺苷酸化序列)。
根据优选实施方式，用于编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列的表达构建体具有“启动子-编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列-多聚腺苷酸化序列”的结构。
在本基因送递系统中，待送递到细胞中的目的核苷酸序列可包含在与用于编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列具有相同结构的表达构建体内。
例如，待送递到细胞中的目的核苷酸序列可为包括编码具有抗肿瘤活性并最终使肿瘤细胞退化的癌治疗基因的蛋白质的任一序列，所述癌治疗基因如肿瘤抑制基因、免疫调节基因[例如，细胞因子基因、趋化因子基因和共刺激因子基因(对于T细胞活性如B7.1和B7.2)]、抗原基因、自杀基因、细胞毒基因、细胞生长抑制基因、前细胞凋亡基因(pro-apoptotic gene)和抗血管生成基因，但不局限于此。
所述自杀基因编码蛋白质能够赋予肿瘤细胞对化学治疗剂的敏感性，或能够诱导肿瘤细胞中毒性状况。最公知的自杀基因是单纯疱疹病毒-胸苷激酶(herpes simplex virus-thymidine kinase，HSV-TK)基因(美国专利号5,631,236和5,601,818)。表达HSV-TK的细胞对通过更昔洛韦(gancyclovir)的选择性细胞死亡敏感。所述肿瘤抑制基因编码多肽以抑制肿瘤发生。所述肿瘤抑制基因是哺乳动物细胞中固有的并且认为它们的缺失或失活是肿瘤发生的前提。肿瘤抑制基因的实例包括以APC、DPC4、NF-1、NF-2、MTS1、WT1、BRCA1、BRCA2、VHL、p53、Rb、MMAC-1、MMSC-2、成视网膜细胞瘤基因为例的肿瘤抑制基因INK4家族的成员(Lee等，Nature，329：642(1987))、腺瘤性结肠息肉病蛋白基因(Albertsen等，美国专利号5783，666)、在染色体3p21.3上作图的鼻咽癌肿瘤抑制基因(Cheng等，Proc.Natl.Acad.Sci.，95：3042-3047(1998))、结肠癌(deleted in colon carcinoma，OCC)缺失基因、MTS1、CDK4、VHL、p100Rb、p16和p21，和其治疗有效片段(例如，p56Rb、p94Rb)。本领域普通技术人员应理解可使用其它已知的抗肿瘤基因。
在此所用的术语“抗原基因”是指编码通过免疫系统识别的抗原细胞表面蛋白的核苷酸序列。所述抗原基因的实例包括癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、前列腺特异抗原(prostate specificantigen，PSA)、甲胎蛋白(α-feto protein，AFP)和p53(WO94/02167)。为了促进免疫识别，所述抗原基因可与MHC I型抗原融合。
在此所用的术语“细胞毒基因”是指其在细胞中的表达引起毒性作用的核苷酸序列。细胞毒基因的实例包括编码假单胞菌外毒素、蓖麻毒素、白喉毒素等的核苷酸序列。
这里所用的术语“细胞生长抑制基因”是指其在细胞中的表达诱导细胞周期的停滞的核苷酸序列。所述细胞生长抑制基因的实例包括但不限于p21、成视网膜细胞瘤基因，E2F-Rb融合蛋白基因，如p16、p15、p18和p19的编码依赖细胞周期蛋白的激酶抑制剂的基因、生长停滞特异性同源异型框(growth arrest specific homeobox，GAX)基因(WO97/16459和WO96/30385)。
此外，在本发明的基因送递系统中可以携带用于治疗多种疾病的各种治疗基因。所述治疗基因的非限制实例包括编码细胞因子(例如，干扰素-α、干扰素-β、干扰素-δ和干扰素-γ)、白细胞介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-19和IL-20)、集落刺激因子(例如，GM-CSF和G-CSF)、趋化因子基因[单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、单核细胞趋化蛋白2(MCP-2)、单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)、单核细胞趋化蛋白4(MCP-4)、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP-1β)、巨噬细胞炎性蛋白1γ(MIP-1γ)、巨噬细胞炎性蛋白3α(MIP-3α)、巨噬细胞炎性蛋白3β(MIP-3β)、趋化因子(ELC)、巨噬细胞炎性蛋白4(MIP-4)、巨噬细胞炎性蛋白5(MIP-5)、LD78β、RANTES、SIS-ε(p500)、胸腺和活化调节趋化因子(thymus and activation-regulated chemokine，TARC)、嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)、I-309、人蛋白HCC-1/NCC-2、人蛋白HCC-3和小鼠蛋白C10]的基因。此外，所述治疗基因包括编码组织型纤溶酶原激活因子(tissue-type plasminogen activator，tPA)或尿激酶型纤溶酶原激活因子的基因和LAL-产生基因以提供用于防止高胆固醇血症的持续的血栓溶解。此外，已知可获得的用于治疗包括囊性纤维化、腺苷脱胺酶缺陷、AIDS和其它感染性疾病以及恶性和炎性疾病的多种疾病的核苷酸序列可用作治疗基因。
这里所用的术语“前细胞凋亡基因”是指其表达导致程序性细胞死亡的核苷酸序列。所述前细胞凋亡基因的实例包括p53、腺病毒E3-11.6K(来源于Ad2和Ad5)或腺病毒E3-10.5K(来源于Ad)、腺病毒E4基因、Fas配体、TNF-α、TRAIL、p53通路基因和编码系列半胱天冬酶(caspase)的基因。
这里所用的术语“抗血管生成基因”是指其表达导致抗血管生成因子的细胞外分泌的核苷酸序列。抗血管生成因子包括血管他丁(angiostatin)、如Tie2的血管内皮生长因子(VEGF)的抑制剂(PNAS，1998，95，8795-8800)和内皮他丁(endostatin)。
从如GenBank和EMBL的DNA序列数据库可获得上述目的核苷酸序列。
本发明的基因送递系统以多种形式构建，优选地，(i)裸重组DNA分子，(ii)质粒，(iii)病毒载体，或(iv)含有裸重组DNA分子和质粒的脂质体或新核蛋白体。
编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列可应用于许多用于基因治疗的基因送递系统，优选质粒、腺病毒(Lockett LJ，等，Clin.Cancer Res.3：2075-2080(1997))、腺伴随病毒(AAV，Lashford LS.，等，Gene TherapyTechnologies，Applications and Regulations Ed.A.Meager，1999)、反转录病毒(Gunzburg WH，等，Retroviral vectors.Gene Therapy Technologies，Applications and Regulations编者A.Meager，1999)、慢病毒(Wang G.等，J.Clin.Invest.104(11)：R55-62(1999))、单纯疱疹病毒(ChamberR.，等，Proc.Natl.Acad.Sci USA92：1411-1415(1995))、痘苗病毒(Puhlmann M.等人，Human Gene Therapy10：649-657(1999))、脂质体(Methods in Molecular Biology，Vol199，S.C.Basu和M.Basu(编者)，Human Press2002)或新核蛋白体。最优选地，通过将编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列插入到腺病毒构建本发明的基因送递系统。
(i)腺病毒
因为腺病毒基因组中等大小、易于操作、高效价、宽靶细胞范围和高感染性，所以腺病毒已通常用作基因送递载体。病毒基因组的两端均含有100～200bp对于病毒DNA复制和包装必需的顺式元件ITR(反向末端重复序列)。E1区(E1A和E1B)编码负责调节病毒基因组和几种细胞基因的转录的蛋白质)。E2区(E2A和E2B)的表达导致用于病毒DNA复制的蛋白质的合成。
在至今开发的腺病毒载体中，通常使用具有缺失E1区的复制缺陷型腺病毒。腺病毒载体中缺失E3区可提供用于转基因的插入位点(Thimmappaya，B.等，Cell，31：543-551(1982)；和Riordan，J.R.等，Science，245：1066-1073(1989))。因此，优选将编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列插入到缺失的E1区(E1A区和/或E1B区，优选E1B区)或缺失的E3区，更优选地，缺失的E3区。优选将待送递的目的核苷酸序列插入到缺失的E1区(E1A区和/或E1B区，优选E1B区)或缺失的E3区，更优选缺失的E1区。关于病毒基因组序列的术语“缺失”包含全部缺失以及部分缺失。
根据最优选的实施方案，本发明的腺病毒基因送递系统包括“启动子-目的核苷酸序列-poly A序列”和“启动子-核心蛋白聚糖基因-poly A序列”。所述启动子-目的核苷酸序列-polyA序列优选存在于缺失的E1区(E1A区和/或E1B区，优选E1B区)或缺失的E3区，更优选缺失的E1区。所述启动子-核心蛋白聚糖基因-poly A序列优选存在于缺失的E1区(E1A区和/或E1B区，优选E1B区)或缺失的E3区，更优选缺失的E3区。此外，所述腺病毒基因送递系统可包括双顺反子表达系统，其中，目的核苷酸序列和编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列通过IRES(internal ribosome entry site，内部核糖体进入位点)互相连接以形成“启动子-目的核苷酸序列-poly A序列-核心蛋白聚糖基因-poly A序列”。
在自然界，腺病毒可包装约105％的野生型基因组，提供约额外2kbDNA的能力(Ghosh-Choudhury等，EMBO J.，6：1733-1739(1987))。在这方面，插入到腺病毒中的上述外源序列还可插入到腺病毒野生型基因组。
所述腺病毒可为42种不同的已知血清型或A-F亚类中的任一种。C亚类的5型腺病毒是用于构建本发明的腺病毒基因送递系统的最优选的原料。关于5型腺病毒的很多生物化学和遗传学的信息是已知的。
通过本腺病毒基因送递系统送递的外源基因是游离基因，所以，对宿主细胞具有低的遗传毒性。因此，使用本发明的腺病毒基因送递系统的基因治疗可相当安全。
(ii)反转录病毒
由于反转录病毒将其基因组整合到宿主基因组并具有宽宿主谱，所以能够携带相对大的外源基因的反转录病毒已用作病毒送递载体。
为了构建反转录病毒载体，在一定病毒序列的位置将编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列和待转移的目的核苷酸序列插入到病毒基因组中以产生复制缺陷型病毒。为了产生毒粒，构建了含有gag、pol和env基因但没有LTR(long terminal repeat，长末端重复序列)和ψ组分的包装细胞系(Mann等，Cell，33：153-159(1983))。当将含有编码核心蛋白聚糖的序列、目的核苷酸序列、LTR和ψ的重组质粒引入到该细胞系中时，ψ序列使重组质粒的RNA转录物包装进病毒颗粒中，然后将其分泌到培养基中(Nicolas和Rubinstein“Retroviral vectors，”In：Vectors：A survey of molecular cloning vectors and their uses，Rodriguez和Denhardt(编者)，Stoneham：Butterworth，494-513(1988))。然后收集含有重组反转录病毒的培养基，选择性地进行浓缩并用于基因送递。
已报道使用第二代反转录病毒载体的成功的基因转移。Kasahara等(Science，266：1373-1376(1994))制备了莫洛尼鼠(moloney murine)白血病病毒变体，其中，将EPO(红细胞生成素)序列插入包膜区的位置，因此产生具有新结合性质的嵌合蛋白质。同样，根据用于第二代反转录病毒载体的构建策略，可以构建本基因送递系统。
(iii)AAV载体
腺伴随病毒能够感染不分裂细胞和多种类型的细胞，使其可用于构建本发明的基因送递系统。美国专利号5,139,941和4,797,368中可以找到AAV载体的用途和制备的详细说明。
在LaFace等，Viology，162：483486(1988)，Zhou等，Exp.Hematol.(NY)，21：928-933(1993)，Walsh等，J.Clin.Invest.，94：1440-1448(1994)和Flotte等，Gene Therapy，2：29-37(1995)中公开了AAV作为基因送递系统的研究结果。最近，已批准AAV载体用于治疗囊性纤维化的I期人体试验。
一般地，通过共转染含有侧接两个AAV末端重复序列的目的基因(即，核心蛋白聚糖基因和待送递的目的核苷酸序列)的质粒(McLaughlin等，1988；Samulski等，1989)和含有野生型AAV编码序列而没有末端重复序列的表达质粒(McCarty等，J.Virol.，65：2936-2945(1991))制备重组AAV病毒。
(iv)其它病毒载体
其它病毒载体可以用作本发明的基因送递载体。在本发明的基因送递系统中可以使用来源于如痘苗病毒(Puhlmann M.等，Human GeneTherapy10：649-657(1999)；Ridgeway，″Mammalian expression vectors，″In：Vectors：A survey of molecular cloning vectors and their uses.Rodriguez和Denhardt，编者，Stoneham：Butterworth，467-492(1988)；Baichwal和Sugden，″Vectors for gene transfer derived from animal DNAviruses：Transient and stable expression of transferred genes，″In：Kucherlapati R，编者Gene transfer.纽约Plenum Press，117-148(1986)和Coupar等，Gene，68：1-10(1988))、慢病毒(Wang G.等，J.Clin.Invest.104(11)：R55-62(1999))和单纯疱疹病毒(Chamber R.，等，Proc.Natl.Acad.Sci USA92：1411-1415(1995))的源于病毒的载体用于将核心蛋白聚糖基因和目的核苷酸序列转移到细胞中。
(v)脂质体
当磷脂悬浮在过量的水性介质中时自发形成脂质体。如在Nicolau和Sene，Biochim.Biophys.Acta，721：185-190(1982)和Nicolau等，Methods Enzymol.，149：157-176(1987)中所述，脂质体介导的核酸送递已非常成功。用于用脂质体转染动物细胞的市售可得的试剂的实例包括脂转染胺(Lipofectamine)(Gibco BRL)。包封核心蛋白聚糖基因和目的核苷酸序列的脂质体与细胞通过如内吞、吸收和融合的机制相互作用，然后将所述序列转移到细胞中。
在本发明的另一技术方案中，提供一种用于送递基因的方法，所述方法包括将上述本发明的基因送递系统与含有细胞的生物样品接触。
当在病毒载体构建的基础上构建本基因送递系统时，如本领域已知的常规感染方法进行接触。在上面引用的出版物中很好地描述了使用病毒载体感染宿主。
当基因送递系统是裸重组DNA分子或质粒时，通过微注射(Capecchi，M.R.，Cell，22：479(1980)以及Harland和Weintraub，J.Cell Biol.101：1094-1099(1985))、磷酸钙共沉淀(Graham，F.L等，Virology，52：456(1973)以及Chen和Okayama，Mol.Cell.Biol.7：2745-2752(1987))、电穿孔(Neumann，E.等，EMBO J.，1：841(1982)以及Tur-Kaspa等，MoI.Cell Biol.，6：716-718(1986))、脂质体介导的转染(Wong，T.K.等，Gene，10：87(1980)以及Nicolau和Sene，Biochim.Biophys.Acta，721：185-190(1982)；和Nicolau等，Methods Enzymol.，149：157-176(1987))、DEAE-葡聚糖处理(Gopal，Mol.Cell Biol.，5：1188-1190(1985))和粒子轰击(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.，87：9568-9572(1990))将编码核心蛋白聚糖的序列和待送递的核苷酸序列引入到细胞中
在本发明的又另一技术方案中，提供包括腺病毒ITR(反向末端重复序列)核苷酸序列和编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列的重组腺病毒；其中表达的核心蛋白聚糖蛋白增强了重组腺病毒进入肿瘤组织的穿入能力和用重组腺病毒感染的肿瘤细胞的细胞凋亡。
在本发明的重组腺病毒中，表达的核心蛋白聚糖蛋白显著增强了重组腺病毒进入肿瘤组织的穿入能力和用重组腺病毒感染的肿瘤细胞的细胞凋亡，使腺病毒的治疗效能大大提高。
已知小部分腺病毒基因组作为顺式元件是必需的(Tooza，J.Molecular biology of DNA Tumor viruses，第2版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1981))，尤其是与如293的合适的细胞系一起使用，允许用外源序列替代大片段的腺病毒DNA。在本文中，所述重组腺病毒包括作为必需序列的腺病毒ITR序列以及编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列。
优选将编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列插入到缺失的E1区(E1A区和/或E1B区，优选E1B区)或缺失的E3区，更优选缺失的E3区。将待送递的目的核苷酸序列(例如，细胞因子基因、免疫共刺激因子基因、凋亡基因和肿瘤抑制基因)插入到重组腺病毒，优选插入到缺失的E1区(E1A区和/或E1B区，优选E1B区)或缺失的E3区，更优选缺失的E1区(E1A区和/或E1B区，最优选E1B区)。
在自然界，腺病毒可包装约105％的野生型基因组，提供了约额外2kb DNA的能力(Ghosh-Choudhury等，EMBO J.，6：1733-1739(1987))。在这方面，插入到腺病毒的上述外源序列还可插入到腺病毒野生型基因组。
根据优选实施方案，本发明的重组腺病毒包含灭活E1B19基因、灭活E1B55基因或灭活E1B19/E1B55基因。这里所用的与基因连接的术语“灭活”是指使基因的转录和/或翻译无功能地发生，因此不能产生基因编码的蛋白质的正确功能的条件。例如，灭活E1B19基因是通过突变(替代、添加、以及部分和全部缺失)不能产生功能性E1B19kDa蛋白的基因。E1B19缺失引起细胞凋亡发生率增加，并且缺失E1B55使重组腺病毒具有肿瘤特异性(参见韩国专利申请号10-2002-0023760)。
根据优选的实施方式，本发明的重组腺病毒包含活性E1A基因。携带活性E1A基因的腺病毒是增殖型的。更优选，本发明的重组腺病毒包括灭活E1B19/E1B55基因和活性E1A基因。最优选，所述重组腺病毒包括灭活E1B19/E1B55基因、活性E1A基因和替代缺失E3区的编码核心蛋白聚糖的序列。
根据优选的实施方式，本发明的重组腺病毒包含灭活E1B基因、突变的E1A基因和插入到缺失E3区的核心蛋白聚糖基因。上述的突变的E1A基因包括在Rb(成视网膜细胞瘤蛋白质)结合区的氨基酸45Glu由Gly替代和氨基酸121～127由Gly残基替代的突变。由于肿瘤细胞中存在突变的Rb和p53蛋白质以及Rb-相关信号级联受到显著损伤，所以，虽然腺病毒的复制在正常细胞中通过Rb作用受到抑制，但是缺乏与Rb的结合能力的腺病毒活跃地复制，然后选择性的杀死肿瘤细胞。因此，可极大地提高具有上述Rb结合区中的突变的重组腺病毒的肿瘤特异性。
根据最优选的实施方式，本发明的重组腺病毒包括“ITR-E1A-△E1B-启动子-核心蛋白聚糖基因-poly A序列”结构，其中，启动子-核心蛋白聚糖基因-poly A序列存在于缺失的E3区。
本溶瘤腺病毒的最优选的实例具有由图1b表示的遗传图。
与常规抗肿瘤腺病毒相比，本发明的重组腺病毒显示进入肿瘤的高度改善的转导(穿入)效率以及细胞凋亡潜力。这些改善的功效主要归于核心蛋白聚糖有效地降解细胞外基质和提高细胞凋亡潜力。因此，本发明的重组腺病毒表现出显著增强的溶瘤作用。
肿瘤组织不是单独由肿瘤细胞组成的结块，而是还包含血管和正常细胞的复杂结构。尤其是，肿瘤组织中的结缔组织通常是坚硬的并形成围绕肿瘤细胞的紧密的细胞外基质。因此，抗肿瘤药物以及病毒不能有效穿入到肿瘤中，从而它们通常显示有限的抗肿瘤作用。用含有所述核心蛋白聚糖基因的本发明的重组腺病毒可以克服此类障碍。
如在下述实施例所示，具有插入的核心蛋白聚糖基因的本发明的腺病毒活跃地扩散到肿瘤球状体的表面甚至进入到其中央。对于体内肿瘤组织，本发明的表达核心蛋白聚糖的腺病毒从注射位点(针迹)广泛并远距离地扩散到远端位点。通过表达核心蛋白聚糖的腺病毒实现的转导效率的提高是明显的，甚至用肉眼可以容易地区分。应当理解与如胶原酶/分散酶或胰蛋白酶、弹性蛋白酶的蛋白酶预处理以降解弹性蛋白或透明质酸酶预处理以降解细胞外基质的转导效率提高约2～3倍相比，提高的转导效率是非常显著的。
通过核心蛋白聚糖在组织中增强的扩散作用可以大大地提高肿瘤特异溶瘤腺病毒的抗肿瘤效力。这种提高的抗肿瘤效力可以在复制缺陷型腺病毒以及增殖型腺病毒中显示。通过核心蛋白聚糖增强腺病毒诱导细胞凋亡的能力是令人惊奇的和没有预料到的。
在本发明的另一技术方案中，提供一种用于治疗癌症的抗肿瘤药物组合物，所述抗肿瘤药物组合物包含(a)治疗有效量的上述重组腺病毒；和(b)可药用载体。
在本发明的又一技术方案中，提供一种用于治疗癌症的方法，所述治疗癌症的方法包括给予动物上述抗肿瘤药物组合物。
在药物组合物中作为活性成分的重组腺病毒为上文描述的本发明的腺病毒，因此以上描述可以适用于药物组合物的重组腺病毒。因此，为了避免导致本说明书复杂性的过度冗余，省略了它们之间的共有描述。
为了通过重组腺病毒有效地引发抗肿瘤作用，需要病毒增殖并扩散到邻近细胞快于癌细胞的生长率以诱导溶瘤作用。此外，使用腺病毒的成功的癌基因治疗需要增强安全性以及高治疗益处。本发明的表达核心蛋白聚糖的腺病毒提高了病毒扩散和细胞凋亡，从而显示显著提高的抗肿瘤作用。尤其是，具有缺失E1B55基因的本发明的重组腺病毒显示细胞毒性中的优异的肿瘤特异性。因此，本发明的表达核心蛋白聚糖的腺病毒使用于癌症治疗的剂量降低，显著降低了对正常细胞的毒性和不希望的体内免疫反应。
由于本发明的重组腺病毒对许多肿瘤细胞具有溶瘤作用，所以本发明的药物组合物可用于治疗肿瘤相关疾病，包括脑癌、胃癌、皮肤癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、支气管原癌、鼻咽癌、喉癌、食道癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、结肠癌和子宫颈癌。这里所用的术语“治疗”是指(i)预防肿瘤发生；(ii)通过根除肿瘤细胞抑制和治疗肿瘤相关疾病或病症；和(iii)通过根除肿瘤细胞减轻肿瘤相关疾病或病症。因此，这里所用的术语“治疗有效量”表示足够达到上述药学作用的量。
本发明的药物组合物中含有的在药物制剂中通常采用的可药用载体包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯橡胶(rubber arable)、磷酸钾、精氨酸盐(arginate)、明胶、硅酸钾、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。根据本发明的药物组合物还可以包括润滑剂、湿润剂、增甜剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。
根据本发明的药物组合物可以通过在基因治疗中常用的途径给药，并且优选肠道外给药，即通过静脉内、腹膜内、肌内、皮下或局部给药。例如，药物组合物可腹膜内给药以治疗卵巢癌和静脉内给药以治疗肝癌，直接注射到可见肿瘤块以治疗乳腺癌、脑癌和头颈癌，直接灌肠注射以治疗结肠癌，和直接注射到导尿管以治疗膀胱癌。
本发明的药物组合物的合适剂量可以根据药物制备方法、给药方法、患者的年龄、体重、性别、致病状态、饮食、给药时间、给药途径、排泄率和对所用药物组合物的敏感性而变化，并且本领域普通医师可以确定对于理想治疗的药物组合物的有效量。一般而言，本发明的药物组合物包括1×105～1×1015pfu/ml的重组腺病毒，并且一般隔日注射1×1010pfu的重组腺病毒两周。
根据本领域技术人员已知的常规技术，包含根据本发明的重组腺病毒的药物组合物可以与上述可药用载体和/或辅料进行配制，最终提供几种形式，单剂量形式和多剂量形式。剂型的非限制性实例包括但不限于溶液、在油或水介质中的混悬液或乳剂、浸膏(extract)、酏剂、粉剂、颗粒剂、片剂和胶囊，并且还可包含分散剂或稳定剂。
包括根据本发明的重组腺病毒的药物组合物可以单独应用或与一般的化学治疗或放射治疗组合应用。此种组合治疗在治疗癌症中可更加有效。可用于组合治疗的化学治疗剂包括顺铂、卡波铂、甲基苄肼、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、二硫烷(bisulfane)、尼克索优瑞(nikosourea)、更生霉素、柔红霉素、阿霉素(doxorubicin)、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、依托泊苷、他莫昔芬、紫杉醇、反铂(transplatinum)、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和氨甲蝶呤。用于组合治疗的放射治疗的实例包括X-射线照射和γ射线照射。
在本发明的另一技术方案中，提供一种用于提高药物对组织穿入潜力的药物组合物，所述药物组合物包括(a)提高药物组合物进入组织的穿入潜力的核心蛋白聚糖蛋白质；和(b)可药用载体。
本发明的药物组合物含有的核心蛋白聚糖蛋白质可以从天然来源和常规DNA重组技术获得。此外，其片段包含在本发明中，除非它们在细胞外基质的降解中无活性。
所述药物组合物可以在给予特定药物之前或同时给予。此外，所述药物组合物还可包括药物。本发明的药物组合物通过药物降解围绕靶组织的细胞外基质，显著提高药物的药理学效力。
参考如前讨论的用于本发明的抗肿瘤药物组合物的说明，描述了用于本药物组合物的可药用载体、给药途径和方法，以及剂型。尤其是，本药物组合物优选肠道外给药，例如通过静脉内、腹膜内、肌内、皮下、或经皮和局部(例如，直接注射到脑或乳腺肿瘤块)给药。一般而言，本发明的药物组合物可以以0.0001-100mg/kg的剂量给予。
通过本发明的药物组合物显示改善的组织穿入性的药物包括化学药物和生物药物，优选，组织穿入性被细胞外基质降低的药物，例如抗癌药物。
本发明的又一技术方案，提供一种用于治疗与过量细胞外基质累积相关的疾病或病症的药物组合物，所述药物组合物包含(a)治疗有效量的核心蛋白聚糖蛋白质或包括编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列的基因送递系统；和(b)可药用载体。
本发明的药物组合物有效降解围绕组织的细胞外基质以对与过量细胞外基质的累积或沉积相关的疾病或病症具有治疗效力。短语“过量细胞外基质的累积”表示如胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白和蛋白聚糖的细胞外基质的组分过量沉积，从而损伤组织或器官，最终引起纤维样变性。
待通过本药物组合物治疗的与细胞外基质的过量累积相关的疾病或病症包括纤维样变性相关疾病，但不限于瘢痕、肝硬化、肺纤维样变性、肾小球肾炎、成人或急性呼吸困难、肝纤维样变性、肾纤维样变性、心肌梗塞后的心肌纤维样变性、纤维囊肿病、纤维样变性癌、静脉闭塞综合征和肾基质纤维样变性。
由创伤、烧伤或手术引起的瘢痕和如瘢痕疙瘩的过度瘢痕可用本发明的药物组合物治疗。
参考如上文讨论的本发明的基因送递系统的说明可描述包含编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列的基因送递系统。本发明的药物组合物包含的核心蛋白聚糖蛋白可以从天然来源和常规DNA重组技术获得。此外，其片段包含在本发明中，除非它们在细胞外基质的降解中无活性。
参考如前讨论的对于本发明的抗肿瘤药物组合物的说明描述了本药物组合物的可药用载体、给药途径和方法以及剂型。尤其是，本药物组合物最优选通过经皮给药给予。适用于本发明药物组合物的剂型包括软膏、凝胶剂、乳剂、溶液、喷雾剂、贴片和洗剂。一般而言，本发明的药物组合物可以0.0001～100mg/kg的剂量给药。
本发明提供一种新的基因送递系统和包括编码核心蛋白聚糖序列的重组腺病毒、一种采用基因送递系统的基因送递方法、一种包括所述重组腺病毒的抗肿瘤药物组合物、一种特征为提高组织穿入潜力的药物组合物和一种用于治疗与过量细胞外基质累积相关的疾病或病症的药物组合物。根据本发明，核心蛋白聚糖负责提高转导效力和细胞凋亡能力，以显著提高肿瘤细胞杀伤力。
附图说明
图1a示意地表示实施例中所用的表达核心蛋白聚糖的复制缺陷型腺病毒(dl-LacZ、dl-LacZ-DCNG、dl-LacZ-DCNQ和dl-LacZ-DCNK)以及肿瘤特异性溶瘤重组腺病毒(Ad-△EIB、Ad-△E1B-DCNG、Ad-△EIB-DCNQ和Ad-△EIB-DCNK)的遗传图。ITR、ψ、LacZ、IX、CMV和Pol A分别表示反向末端重复序列、包装序列、lac Z序列、蛋白质IX基因、CMV启动子和poly A序列。DCNG表示野生型核心蛋白聚糖基因，以及DCNQ和DNCK表示野生型核心蛋白聚糖核心蛋白质的富含亮氨酸重复序列区中E180氨基酸分别点突变为E180Q和E180K的突变基因。
图1b示意地表示本发明的肿瘤特异性溶瘤腺病毒Ad-△E1B-DCNG的更特异的遗传图。
图2为示出表明本发明的表达核心蛋白聚糖的肿瘤特异性溶瘤腺病毒(Ad-△E1B-DCNG、Ad-△E1B-DCNQ和Ad-△E1B-DCNK)感染的肿瘤细胞系Hep3B表达核心蛋白聚糖蛋白的蛋白质印迹分析结果的照片。
图3a和3b为证实本发明的表达核心蛋白聚糖的复制缺陷型腺病毒(dl-lacZ-DCNG、dl-lacZ-DCNQ和dl-lacZ-DCNK)感染的人肿瘤细胞系(图3a)和人正常细胞系(图3b)中的核心蛋白聚糖基因转导效率的X-gal染色图像。
图4为表示本发明的表达核心蛋白聚糖的复制缺陷型腺病毒(dl-lacZ、dl-lacZ-DCNG、dl-lacZ-DCNQ和dl-lacZ-DCNK)透入如U343、U87MG、C33A和A549的肿瘤块的体外组织的照片。左侧为X-gal染色肿瘤块的光学显微镜图像(×38)，以及右侧为X-gal染色的冻干肿瘤块部分的光学显微镜图像(×40)。
图5表示证实本发明的复制缺陷型腺病毒(dl-lacZ、dl-lacZ-DCNG、dl-lacZ-DCNQ和dl-lacZ-DCNK)进入如U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549的肿瘤块的体内组织穿入效力的LacZ染色结果。
图6表示证实本发明的肿瘤特异性溶瘤腺病毒(Ad-△E1B、Ad-△E1B-DCNG、Ad-△E1B-DCNQ和Ad-△E1B-DCNK)在人肿瘤细胞系(U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549)以及人正常细胞系(CBHEL、IMR90、MRC5和W138)的溶瘤效力的CPE(cytopathic effect，致细胞病变效应)分析结果。
图7a和7b表示噬斑发生测定结果。图7a为证明感染本发明的肿瘤特异性溶瘤腺病毒(Ad-△E1B、Ad-△E1B-DCNG、Ad-△E1B-DCNQ和Ad-△E1B-DCNK)人肿瘤细胞系Hep3B的噬斑形成的板的照片，以及图7b为证明噬斑形成率的曲线图。
图8a和8b示出证实本腺病毒在人肿瘤细胞系(U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549)中细胞凋亡诱导效力的PI染色的流式细胞术分析结果。图8a和8b分别表示肿瘤特异性溶瘤腺病毒(Ad-△E1B、Ad-△E1B-DCNG、Ad-△E1B-DCNQ和Ad-△E1B-DCNK)和复制缺陷型腺病毒(dl-LacZ和dl-lacZ-DCNG)的结果。数目表示subG1细胞群的比率。
图9a和9b示出证实重组腺病毒诱导人肿瘤细胞系(U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549)的细胞凋亡和坏死能力的膜连蛋白-V-PI双重染色和流式细胞术分析结果。图9a和9b分别表示肿瘤特异性溶瘤腺病毒(Ad-△E1B、Ad-△E1B-DCNG、Ad-△E1B-DCNQ和Ad-△E1B-DCNK)和复制缺陷型腺病毒(dl-LacZ和dl-lacZ-DCNG)的结果。膜联蛋白V+/PI-的比率以右下象限处的斜粗体字表示。
图10a和10b表示证实重组腺病毒诱导人肿瘤细胞系(U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549)中的细胞凋亡能力的TUNEL测定结果。图10a和10b分别表示肿瘤特异性溶瘤腺病毒(Ad-△E1B、Ad-△E1B-DCNG、Ad-△E1B-DCNQ和Ad-△E1B-DCNK)和复制缺陷型腺病毒(dl-LacZ和dl-lacZ-DCNG)的结果。DNA断裂表示为棕色。
图11a和11b为表示用本发明的肿瘤特异性溶瘤Ad-△E1B-DCNQ腺病毒注射的荷瘤(U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549)小鼠的肿瘤尺寸(图11a)和存活率(图11b)变化的曲线图。
图12a、12b、12c、12d和12e示出本发明的肿瘤特异性溶瘤腺病毒Ad-△E1B-DCNQ感染的荷瘤小鼠中U343(图12a)、U87MG(图12b)、C33A(图12c)、Hep3B(图12d)和A549(图12e)的H&E、IHC(immunohistochemical，免疫组织化学)染色和TUNEL分析结果。
图13表示证明本发明的肿瘤特异性溶瘤腺病毒(Ad-△E1B或Ad-△E1B-DCNG)注射的荷瘤小鼠中U343(A部分)和U87MG(B部分)肿瘤的细胞外基质中胶原蛋白分布的Masson三色染色结果。
图14用数字表示示出用Ad-△E1B或Ad-△E1B-DCNG感染的人肿瘤细胞系U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549中MMP表达模式明胶酶谱电泳的结果。
图15表示使用B16BL6自发性肿瘤转移模型(上部分)和转移性肺肿瘤的重量(下部分)，核心蛋白聚糖的表达对肿瘤转移作用的结果。
图16表示示出表达核心蛋白聚糖的复制缺陷型腺病毒(dl-lacZ-DCNG)在来自乳腺癌患者的肿瘤组织和邻近的正常组织中的组织穿入效力和基因转导效率的X-gal染色结果。
图17表示证实表达核心蛋白聚糖的复制缺陷型腺病毒(dl-LacZ-DCNG)在原发性斑痕疙瘩细胞中的转导效率的X-gal染色结果。
图18为证实表达核心蛋白聚糖的复制缺陷型腺病毒(dl-LacZ-DCNG)对斑痕疙瘩细胞球形体(A部分)和组织(B部分)的转导效率的X-gal染色照片。
图19a为证实复制缺陷型腺病毒(dl-GFP或dl-GFP-DCNG)进入体内建立的C33A肿瘤块的病毒穿入效力的荧光显微镜(×10)照片。
图19b为证实dl-GFP或dl-GFP-DCNG在自乳腺癌患者获得的肿瘤组织中的转导效率和组织穿入效力的荧光显微镜(×40)照片。
以下具体实施例意对本发明进行举例说明，并不视为限制如所附的权利要求书限定的本发明的范围。
具体实施方式
实施例
材料和方法
1.细胞系和细胞培养
用于实验的细胞系为如人脑癌细胞系(U343、U87MG)、子宫颈癌细胞系(C33A)、肝癌细胞系(Hep3B)、肺癌细胞系(A549)和小鼠黑素瘤(B16BL6)、人正常细胞系(CBHEL、MRC5、IMR90和WI38)和携带腺病毒早期基因E1区的293细胞系的肿瘤细胞系。除B16BL6细胞系外的所有细胞系从ATCC(美国标准培养物保藏中心；马纳萨斯市，维吉尼亚洲，美国)获得，以及B16BL6小鼠黑素瘤细胞系为韩国延世大学Dr.Y.S.Park的研究组赠送。
除B16BL6细胞系外的所有细胞系在添加10％胎牛血清(GibcoBRL)、青霉素和链霉素的杜尔贝科改良的伊格尔培养基(Dulbecco’smodified Eagle’medium，DMEM；Gibco BRL)中培养并保持在37℃5％CO2气氛中。B16BL6细胞系在添加10％胎牛血清(Gibco BRL)、青霉素和链霉素的RPMI培养基(Gibco BRL)中培养并保持在37℃5％CO2气氛中。
2.实验动物
使用自韩国的Charles River(韩国，首尔)购买的6～8周龄雄性裸鼠(BALB/c-nu)和C57BL/6小鼠进行体内抗肿瘤实验。所述小鼠在控制的光照周期(12小时光照：12小时黑暗)、温度(22±2℃)和湿度(55～60％)下饲养，并自由采食辐射灭菌的固体食物(韩国，首尔，Orient)和水。
3.表达核心蛋白聚糖的重组腺病毒的形成和滴定
(1)复制缺陷型腺病毒的产生
我们形成了表达核心蛋白聚糖基因和报道基因lac Z的缺失E1/E3-基因的复制缺陷型腺病毒。通过在vmd1324Bst载体(由瑞士Fribourgh大学Verca博士赠予；Heider，H.等，Biotechniques，28(2)：260-265，268-270(2000))的缺失E1区中插入lac Z基因作为报道基因制备pdl-LacZ病毒载体。为了制备该载体，用HindIII和NaeI消化pcDNA-hygro-LacZ质粒(Invitrogen，卡尔斯班市，加利福尼亚州，美国)以分离CMV启动子、lacZ基因和polA，并将分离的三个序列插入到E1腺病毒穿梭载体p△E1splA以制备p△ElsplA/CMV-LacZ穿梭载体。用XmnI消化制备的p△E1splA/CMV-LacZ穿梭载体，并与用BstBI线性化的vmd1324Bst腺病毒共转化到大肠杆菌(E.coli)BJ5183(瑞士Fribourgh大学Verca博士)中以诱导同源重组，得到pdl-LacZ腺病毒。
为了构建表达核心蛋白聚糖的腺病毒，我们通过将核心蛋白聚糖基因(DCNG，D.G.Seidler，University Hospital of Munster，德国)插入到表达载体pcDNA3.1中构建了pcDNA3.1-DCNG(含有野生型核心蛋白聚糖cDNA)。然后，通过在野生型核心蛋白聚糖核心蛋白质的第6个富含亮氨酸的重复序列中的E180氨基酸诱导点突变为E180Q，制备对胶原蛋白具有较弱结合亲和力的的核心蛋白聚糖突变体DCNQ，接着将突变的基因插入到pcDNA3.1载体以得到表达载体pcDNA3.1-DCNQ。此外，通过在野生型核心蛋白聚糖核心蛋白质的E180氨基酸诱导点突变为E180K制备缺乏胶原蛋白结合亲和力的核心蛋白聚糖突变体DCNK，接着将突变的基因插入到pcDNA3.1载体以得到表达载体pcDNA3.1-DCNK。上述制备的各载体用EcoRI和XbaI消化以得到1kb的DNA片段，将所述DNA片段插入到pCA14载体(加拿大，安大略，Microbix)以产生pCA14-DCNG、pCA14-DCNQ和pCA14-DCNK载体。
将如此制备的pCA14-DCNG、pCA14-DCNQ和pCA14-DCNK载体各用BglII消化以得到在CMV启动子控制下的表达核心蛋白聚糖基因的CMV-DCN-polA表达盒，然后将所述的表达盒插入到腺病毒E3穿梭载体pSP72△E3，以得到腺病毒E3穿梭载体pSP72△E3-DCNG、pSP72△E3-DCNQ和pSP72△E3-DCNK。
将如此制备的腺病毒E3穿梭载体用PvuI或XmnI线性化并与用SpeI线性化的腺病毒总载体pdl-LacZ共转化到大肠杆菌BJ5183中用于同源重组，产生同时表达lac Z基因和核心蛋白聚糖的腺病毒载体dl-LacZ-DCNG、dl-LacZ-DCNQ和dl-LacZ-DCNK(图1a)。
(2)肿瘤特异性溶瘤腺病毒的形成
我们形成了表达核心蛋白聚糖基因的肿瘤特异性溶瘤腺病毒。具体地，将各dl-LacZ-DCNG、dl-LacZ-DCNQ和dl-LacZ-DCNK用PvuI或XmnI线性化，并与用SpeI(KFCC11288)线性化的缺失E1B19kDa/E1B55kDa的pAd△E1B19/55腺病毒载体一起共转化到大肠杆菌BJ5183中用于同源重组，分别产生Ad-△E1B-DCNG、Ad-△E1B-DCNQ和Ad-△E1B-DCNK腺病毒载体(图1a和1b)。为了证实同源重组的发生，用HindIII消化所述重组的腺病毒载体。将适当的同源重组的腺病毒载体用PacI消化并转染到293细胞系中以产生腺病毒载体(图1a和1b)。
所有的腺病毒在293细胞中增殖并根据有限稀释或噬斑分析(Hitt，M.等，Construction and propagation of human adenovirus vectors.Cellbiology：a laboratory handbook.纽约：Academic Press Inc，479-490(1994))进行其滴定，接着用CsCl梯度浓缩和纯化。
4.核心蛋白聚糖表达模式的检验
为了检查由本发明的重组腺病毒诱导的核心蛋白聚糖表达模式，将具有核心蛋白聚糖基因的肿瘤特异性溶瘤腺病毒(Ad-△E1B-DCNG、Ad-△E1B-DCNQ和Ad-△E1B-DCNK)以及作为对照的Ad-△E1B腺病毒以3MOI感染人肝癌细胞Hep3B。感染后48小时回收使用的培养基并进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)。然后，将凝胶上的蛋白质电转移到PVDF膜上，与一级抗核心蛋白聚糖抗体(D.G.Seidler，University Hospital of Munster，德国)和抗β-肌动蛋白抗体(Sigma，圣路易斯，密苏里州，美国)孵育，然后与HRP(辣根过氧化物酶)-结合的二级抗体(sc-2004；Santa Cruz Biotech.，Santa Cruz，CA)孵育，随后使用ECL检测试剂盒(sc-2004；Santa Cruz Biotech)显示核心蛋白聚糖的表达模式。
5.转导效率的比较评价
为了评价表达LacZ的复制缺陷型腺病毒的转导效率，将多种人肿瘤细胞系(U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549)以及人正常细胞系(CBHEL、IMR90和WI38)置于24-孔板上，并以0.1～100的MOI(multiplicity of infection，感染复数)用dl-LacZ、dl-LacZ-DCNG、dl-LacZ-DCNQ或dl-LacZ-DCNK病毒感染。感染后第2天，将细胞系与X-Gal试剂(含1mg/ml的PBS、5mM K3Fe(CN)6、5mM K4Fe(CN)6和2mM MgCl2)37℃孵育6小时用于X-gal染色，以确定由核心蛋白聚糖基因的表达诱导的LacZ基因的转导效率。
6.肿瘤球形体中腺病毒的扩散和穿入的评估
通过将细胞皮下注射到6～8周龄裸鼠的腹部建立U343、U87MG、C33A和A549异体移植，并且一旦肿瘤体积达到150～200mm3时，将新鲜的肿瘤组织用手术除去。将肿瘤组织切成1～2mm碎片。将这些外植块各个置于涂布0.75％琼脂糖的板上并在添加5％FBS(Gibco BRL)和青霉素/链霉素(Gibco BRL)的DMEM(Gibco BRL)中37℃，5％CO2气氛下培养。培养基每周更新一次。用腺病毒感染前，将直径2mm的球形体转移到涂布0.75％琼脂糖的48-孔板上，并加入150μl DMEM(含有5％FBS)，然后加入1×106、1×107或1×108PFU(plaque-forming unit，噬斑形成单位)的病毒。3天后，将培养基吸出并将球形体在固定液中固定用于X-gal染色。在立体显微镜(日本东京奥林巴斯光学有限公司)下观察X-gal染色的球形体的表面。为了观察腺病毒穿入肿瘤球形体，将X-gal染色的肿瘤球形体包埋在O.C.T.化合物(Sakura Finetec，Torrance，CA)中并快速冷冻。然后将10μm冷冻切片置于涂布明胶的载玻片上。此外，采用MetaMorph程序(Meta imaging series，Version6.1，Universalimaging corporation TM，Downingtown，PA)给出肿瘤球形体中X-gal染色部分的比率。
7.体内腺病毒的扩散和穿入的评估
通过将细胞皮下注射到6～8周龄裸鼠的腹部建立了U343、U87MG、C33A和Hep3B异体移植，并且一旦肿瘤体积达到150～200mm3时，将小鼠随机分为两组，并5次以5×107～1×108PFU将dl-LacZ、dl-LacZ-DCNG腺病毒瘤内注射到肿瘤中。对于A549异体移植模型，将A549细胞系皮下注射到小鼠中，并且一旦肿瘤体积达到150～200mm3时，5次以5×108PFU将各dl-LacZ、dl-LacZ-DCNG、dl-LacZ-DCNQ和dl-LacZ-DCNK瘤内注射到肿瘤中。最后注射后3天，将动物处死并取肿瘤，然后将它们在4℃的4％低聚甲醛(PFA)中固定4～8小时并在30％的蔗糖溶液中脱水12小时。将脱水的肿瘤组织包埋在O.C.T.化合物中并快速冷冻，接着如上所述进行X-gal染色。
8.致细胞病变效应(CPE)分析
为了评估表达核心蛋白聚糖的腺病毒的溶瘤活性，将人肿瘤细胞系(U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549)和人正常细胞系(CBHEL、MRC5、IMR90和WI38)置于24-孔板上，然后用MOI为0.1～100的Ad-△E1、Ad-△E1B、Ad-△E1B-DCNG、Ad-△E1B-DCNQ或Ad-△E1B-DCNK腺病毒感染。当用任一所述病毒感染的细胞在低滴度显示完全的细胞溶解时，将死细胞洗去并将板上的细胞用50％甲醇中的0.5％结晶紫染色。
9.噬斑发生测定
为了观察核心蛋白聚糖表达的噬斑尺寸的变化，将3×105个Hep3B细胞置于6-孔板，并在细胞生长1天后以1×104MOI的Ad-△E1B、Ad-△E1B-DCNG，Ad-△E1B-DCNQ和Ad-△E1B-DCNK腺病毒感染。孵育4小时后，将感染细胞用37℃的2×DMEM(含有10％FBS和青霉素/链霉素)和42℃的1.4％UltraPureTM琼脂糖(Invitrogen，Carsbad，CA)的琼脂糖-DMEM混合物覆盖，然后孵育。孵育约14～16天后，观察板上形成的噬斑尺寸，通过用1ml的10％三氯乙酸浸泡30分钟将琼脂糖覆盖层除去，并将剩余细胞用50％甲醇中的0.5％结晶紫染色。计算形成的噬斑数。
10.细胞凋亡潜力的流式细胞术分析
为了检验由核心蛋白聚糖诱导的细胞凋亡，将人肿瘤细胞系U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549引入到25T培养瓶，且24小时后，用MOI为0.5～50的各腺病毒感染。用0.1～1μM CPT-11(camptothecin，喜树碱)处理的细胞作为阳性对照并且用PBS处理的细胞作为阴性对照。感染48小时、72小时和96小时后，收集感染细胞并用70％乙醇在4℃固定24小时。固定后，将细胞与PI(碘化丙锭，50μg/μl)和RNA酶(核糖核酸酶)的混合物在4℃孵育15分钟，然后进行FACS分析。
此外，为了检验由核心蛋白聚糖诱导的早期细胞凋亡，如上述用各腺病毒感染几种人肿瘤细胞系。收集感染细胞，然后根据ApoAlertV-FITC(异硫氰酸荧光素)细胞凋亡检测试剂盒(Clontech，帕洛阿图，加利福尼亚州)中出厂说明，进行膜连蛋白V/PI双重染色，接着进行流式细胞术分析。
11.TUNNEL分析
将U343(5×104)、U87MG(5×104)、C33A(5×105)、Hep3B(4×105)和A549(5×104)细胞置于腔室玻片上，然后用MOI为0.2～20的腺病毒感染。感染24小时和48小时后，除去培养基并根据ApopTag试剂盒(Intergen，Purchase，纽约)的出厂说明书进行TUNNEL(末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)-介导的dUTP缺口末端标记)分析。为了显色，将细胞与过氧化物酶结合的抗生物素蛋白和DAB(二氨基联苯，DAKO，Carpinteria，CA)孵育。细胞的颜色变成棕色时，将细胞用0.5％的甲基绿复染10分钟并在显微镜下观察4个以上选定的视野。计算染色细胞与总细胞的比率。
12.表达核心蛋白聚糖的腺病毒的体内抗肿瘤作用和存活率
评估了表达核心蛋白聚糖的腺病毒对裸鼠中形成的人肿瘤球形体生长的作用。通过皮下注射100μl HBSS(Hanks′缓冲盐水溶液，GibcoBRL)中1×107个人癌细胞系(U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549)，将肿瘤植入到6～8周龄裸鼠(Charles River Japan Inc.)腹部。当肿瘤体积达到50～80mm3时，隔日3次以1×108～5×108PFU瘤内给予腺病毒，并观察肿瘤的生长模式和存活率。用卡尺测量长轴和短轴计算肿瘤的体积：肿瘤体积＝(短轴mm)2×(长轴mm)×0.523。
13.由给予表达核心蛋白聚糖的增殖型腺病毒诱导的肿瘤特征变 化的观察
当在裸鼠腹部形成的U343、U87MG、C33A、Hep3B或A549肿瘤达到约50～80mm3的范围时，以1×108～5×108PFU的腺病毒瘤内给予3次。注射3天后，取出肿瘤组织并制备其石蜡块。将石蜡块切成3μm切片，并在二甲苯中然后在分级乙醇(100％、95％、80％和70％)中脱蜡，接着用苏木精和伊红染色。为了观察为结缔组织组分的胶原蛋白的分布，将3μm石蜡包埋的切片用布安氏液(bouin)、苏木精和猩红酸性品红(biebrich’s scarlet acid fuchsin)染色。染色试剂从DAKOARK(Dako，Carpinteria，CA)购得。此外，进行腺病毒六联体区的免疫组织化学染色。将切片如上所述脱蜡并与一级抗腺病毒六联体抗体(MAB8052chemicon，德美古拉镇，加利福尼亚州)孵育，然后与二级山羊抗-大鼠IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)培养。用DAB(DAKO，Carpinteria，CA)进行显色。
为了观察肿瘤中细胞凋亡的发生，根据ApopTag试剂盒(Intergen，Purchase，NY)出厂说明书进行TUNNEL分析。为了显色，将细胞与过氧化物酶结合的抗生物素蛋白孵育，然后与DAB(DAKO，Carpinteria，CA)孵育。当细胞的颜色变为棕色时，将细胞用0.5％的甲基绿复染10分钟并在显微镜下观察。
14.通过酶谱法检查MMP表达模式
为了观察MMP活性的变化，将多种人肿瘤细胞系(U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549)引入到75T培养瓶中，并在24小时后以MOI为1～100的PBS、Ad-△E1B或Ad-△E1B-DCNG腺病毒感染，然后孵育48小时。细胞另外在更新的无FBS的DMEM中孵育24小时，然后收集并浓缩培养基。使用蛋白质分析试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA，美国)对培养基中存在的蛋白质进行定量，并将其相同量在明胶-底物凝胶上电泳。电泳后，将凝胶在37℃下凝胶溶解18小时，并用考马斯亮蓝染色以观察MMP-2和MMP-9的表达。此外，各实验独立地进行3次并通过QuntityOne2.1程序(BIO-Rad Laboratories，Hercules，CA)比较形成的条带的厚度。
15.使用自发性转移模型的核心蛋白聚糖表达的转移潜力的变化
为了评估核心蛋白聚糖过表达的转移潜力的变化，向6～8周龄雄性C57BL/6小鼠(韩国首尔CharlesRiver)右后足垫皮下给予B16BL6细胞(2×105个/小鼠)以形成原发性肿瘤。一旦原发性肿瘤体积达到100～200mm3，隔日3次将PBS、Ad-△E1B或Ad-△E1B-DCNG直接注射到肿瘤中。最后注射后第5天，在温和麻醉下通过在膝下切断手术取下原发性肿瘤。在取下原发性肿瘤后第20天，评估小鼠肺中转移性肿瘤灶的重量。
16.使用来自乳腺癌患者的肿瘤组织评价表达核心蛋白聚糖的腺 病毒的转导效率和组织穿入效力
收集来自乳腺癌患者的肿瘤组织和邻近的正常组织，切成1～2mm碎片然后置于24-孔板上，然后在添加5％FBS、10μM/L胰岛素和1μM/L氢化可的松的IMDM(Isocove′s改良的Dulbecco′s培养基)中培养4小时。以1×108PFU的各dl-LacZ和dl-LacZ-DCNG腺病毒加入到含有乳腺肿瘤和正常组织的板上，并在37℃、5％CO2培养箱中孵育5天。孵育后，将培养基从板上除去，将乳腺肿瘤和正常组织在固定溶液中固定并用X-gal染色。在立体显微镜(日本东京奥林巴斯光学有限公司)下观察X-gal染色的肿瘤组织表面。
17.原发性瘢痕疙瘩细胞中表达核心蛋白聚糖的腺病毒的转导效率 的评估
将从瘢痕疙瘩患者获得的第二代的原发性瘢痕疙瘩细胞系置于24-孔板上，然后以MOI为0.1～50的dl-LacZ或dl-LacZ-DCNG腺病毒感染，接着在37℃下、5％CO2培养箱中孵育。病毒感染48小时，将细胞用X-gal染色以显示腺病毒的转导效率。
18.使用瘢痕疙瘩球形体模型评价扩散和穿入效力
将从瘢痕疙瘩患者获得的第二代的原发性瘢痕疙瘩细胞(1×105)加入15ml离心管(falcontube)，并以500×g离心5分钟以得到瘢痕疙瘩球形体，接着在37℃下培养5天。将瘢痕疙瘩球形体转移到涂敷0.75％琼脂糖的48-孔板，并加入150μl DMEM(含有5％FBS)，然后向培养基中加入1×107PFU的dl-LacZ或dl-LacZ-DCNG腺病毒。病毒感染后3天，将瘢痕疙瘩在固定溶液中固定并用X-gal染色。在立体显微镜下观察X-gal染色的球形体。
19.对来自瘢痕疙瘩患者的组织的扩散和穿入效力评价
从瘢痕疙瘩患者取下瘢痕疙瘩组织并将其切成1～2mm碎片。将该碎片在含有5％FBS和青霉素/链霉素的DMEM中在涂敷0.75％琼脂糖的培养箱中培养。每周一次或两次更新使用的培养基，并将瘢痕疙瘩组织培养一周以上。将直径为2mm的瘢痕疙瘩组织转移到涂敷0.75％琼脂糖的48-孔板并加入150μl的DMEM(含有5％FBS)，接着以1×108pFU的dl-LacZ或dl-LacZ-DCNG腺病毒感染。病毒感染后3天，将瘢痕疙瘩在固定溶液中固定并用X-gal染色。在立体显微镜下观察X-gal染色组织的表面。为了评价腺病毒进入组织的扩散和穿入效力，将X-gal染色的瘢痕疙瘩组织包埋在O.C.T.化合物中并快速冷冻。然后将10μm的冷冻切片置于涂敷明胶的载玻片上用于显微镜观察。
结果
1.表达核心蛋白聚糖的腺病毒的构建和核心蛋白聚糖的表达模式
为了真实评估依赖于核心蛋白聚糖表达的进入组织的穿入效率的变化，构建了表达作为报道基因的LacZ的复制缺陷型的dl-LacZ--DCNG、dl-LacZ-DCNQ和dl-LacZ-DCNK腺病毒。此外，构建了肿瘤特异性溶瘤Ad-△E1B-DCNG、Ad-△EIB-DCNQ和Ad-△EIB-DCNK腺病毒以增强增殖型腺病毒进入组织的转导效率(图1a和1b)。复制缺陷型dl-LacZ在CMV启动子的控制下表达插入到缺失的E1区的LacZ基因。肿瘤特异性溶瘤Ad-△E1B腺病毒包含正常的E1A基因；然而，其缺乏E1B19kDa和E1B55kDa基因。复制缺陷型dl-LacZ-DCNG、dl-LacZ-DCNQ和dl-LacZ-DCNK腺病毒和肿瘤特异性溶瘤Ad-△E1B-DCNG、Ad-△E1B-DCNQ和Ad-△E1B-DCNK腺病毒在CMV启动子的控制下表达插入到E3区的核心蛋白聚糖基因。核心蛋白聚糖基因的点突变体DCNK和DCNQ在结合I型胶原纤维中起重要作用的区域包含替代的核苷酸。
为了评估构建的腺病毒的核心蛋白聚糖表达模式，以3MOI的肿瘤特异性溶瘤腺病毒Ad-△E1B、Ad-△E1B-DCNG、Ad-△E1B-DCNQ和Ad-△E1B-DCNK感染Hep3B，并回收培养基用于蛋白质印迹。用作肿瘤特异性溶瘤腺病毒的阴性对照的Ad-△E1B感染的细胞显示不表达核心蛋白聚糖，而所有感染Ad-△E1B-DCNG、Ad-△E1B-DCNQ和Ad-△E1B-DCNK的细胞显示表达核心蛋白聚糖(图2)。
2.转导效率的可比评价
为了评价复制缺陷型病毒的转导效率，以MOI为0.1～100的各dl-LacZ、dl-LacZ-DCNG、dl-LacZ-DCNQ和dl-LacZ-DCNK病毒感染多种人肿瘤细胞系(U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549)以及人正常细胞系(CBHEL、IMR90和WI38)，然后在感染后48小时，我们通过进行X-gal染色观察LacZ基因的表达模式。与感染dl-LacZ相比，感染dl-LacZ-DCNG的所有肿瘤细胞系中LacZ的表达高度增加，证实核心蛋白聚糖的表达显著提高了腺病毒的转导效率。令人感兴趣的是，高滴度的复制缺陷型病毒显示诱导细胞死亡。特别是，以MOI低于10的dl-LacZ-DCNG病毒感染导致C33A细胞中完全的细胞死亡，表明核心蛋白聚糖的过表达可成功地诱导细胞死亡(图3a和3b)。表达了参与结合I型胶原纤维的区域具有突变序列的DCNK和DCNQ。与dl-LacZ相比，对胶原蛋白具有较弱结合亲和力的表达DCNQ的dl-LacZ-DCNQ表现轻微提高的转导效率；对胶原蛋白完全缺乏结合亲和力的表达DCNK的dl-LacZ-DCNK显示与dl-LacZ的转导效率几乎相同的水平。这些结果使我们推断野生型核心蛋白聚糖的表达极大地增强了腺病毒的转导效率。相反，由核心蛋白聚糖引起的转导效率的增强在正常细胞中不明显，表明核心蛋白聚糖具有肿瘤特异性。
3.使用肿瘤球形体的腺病毒进入体外肿瘤组织的扩散和穿入效力 的评价
为了评价重组腺病毒对肿瘤球形体的转导效率和组织穿入，将多种人肿瘤细胞系皮下注射到裸鼠中，并且一旦肿瘤体积达到150～200mm3，将新鲜的肿瘤组织取出。将取出的肿瘤组织切成1～2mm碎片并用1×106、1×107或1×108PFU的腺病毒感染。感染48小时后进行X-gal染色。与用1×106PFU的dl-LacZ、dl-LacZ-DCNK和dl-LacZ-DCNQ处理相比，相同剂量的dl-LacZ-DCNG在肿瘤球形体表面显示更强的X-gal染色。用低于1×107PFU的腺病毒处理导致在肿瘤球形体的所有表面更深的X-gal染色。为了准确研究腺病毒进入肿瘤球形体的穿入效率，将X-gal染色的肿瘤球形体切开用于观察。1×106、1×107或1×108PFU的dl-LacZ、dl-LacZ-DCNK和dl-LacZ-DCNQ在肿瘤组织中显示弱LacZ表达，且其扩散局限于肿瘤球形体的表面。相反，与dl-LacZ、dl-LacZ-DCNK和dl-LacZ-DCNQ相比，相同剂量的dl-LacZ-DCNG显示高很多的LacZ表达水平，并且其扩散延伸到肿瘤球形体的内部(图4)。认识到与dl-LacZ-DCNG相比，dl-LacZ-DCNK和dl-LacZ-DCNQ的组织穿入效力显著降低。穿入效力随对胶原蛋白的结合亲和力的降低而降低。这些结果清楚地表明与dl-LacZ、dl-LacZ-DCNQ和dl-LacZ-DCNK相比，dl-LacZ-DCNG对肿瘤球形体的转导效率和组织穿入效力极大地增强。
4.体内肿瘤块中dl-LacZ-DCNG腺病毒转导效率的评估
为了研究在体外肿瘤球形体中观察到的dl-LacZ-DCNG的增强的转导效率和病毒扩散是否引起体内基因送递到肿瘤块的提高，使用了肿瘤异种移植模型。将1×108～5×108PFU的dl-LacZ或dl-LacZ-DCNG腺病毒各瘤内注射到在裸鼠腹部形成的U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549肿瘤块中。3天后，取出肿瘤并进行切片用于X-gal染色。dl-LacZ显示低水平的LacZ表达并且染色区集中在病毒注射部位，而dl-LacZ-DCNG显示高很多的LacZ表达并且发现染色区广泛分布在病毒注射部位之外的其它区域(图5)。尤其是，由于在所有肿瘤组织强烈的LacZ表达，所以用dl-LacZ-DCNG感染的U87MG和C33A肿瘤块显示深蓝色。在A549肿瘤异体移植模型中，与dl-LacZ-DCNQ和dl-LacZ-DCNK腺病毒相比，dl-LacZ-DCNG显示高很多的LacZ表达水平和更深和更广泛的扩散/穿入。这些表达模式说明与没有表达核心蛋白聚糖的dl-LacZ相比，在体内肿瘤块中dl-LacZ-DCNG的穿入和扩散极大地增强。
此外，表达GFP(绿色荧光蛋白)的dl-GFP和dl-GFP-DCNG腺病毒以5×108PFU瘤内注射到在裸鼠腹部形成的C33A肿瘤块中。3天后，取出肿瘤并进行冷冻切片用于在荧光显微镜下观察。在注射dl-GFP的肿瘤块中，GFP限制性地沿着由病毒感染形成的针迹表达；然而，GFP在注射dl-GFP-DCN的肿瘤块中强烈和广泛地表达(图19a)。
5.表达核心蛋白聚糖的溶瘤腺病毒的肿瘤细胞杀伤作用的评估
为了揭示表达核心蛋白聚糖的腺病毒的穿入和扩散的提高有助于提高肿瘤特异性溶瘤腺病毒的肿瘤细胞杀伤作用，进行了CPE分析。用MOI为0.1～100的dl-LacZ(阴性对照)、Ad-△E1B、Ad-△E1B-DCNG、Ad-△E1B-DCNQ和Ad-△E1B-DCNK腺病毒感染各人肿瘤细胞系(U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549)和人正常细胞系(CBHEL、MRC5、IMR90和WI38)，并对肿瘤细胞杀伤作用进行分析。如图6所示，阴性对照dl-LacZ在各种肿瘤细胞系中引起很小的或不引起细胞杀伤作用，而Ad-△E1B-DCNG显示比不表达核心蛋白聚糖的Ad-△E1B的肿瘤杀伤作用高约10～20倍。尤其是，在Hep3B和U87MG细胞系中，Ad-△E1B-DCNG腺病毒显示比Ad-△E1B高约20倍的杀肿瘤作用，并且在U343、C33A和A549细胞系中，Ad-△E1B-DCNG显示比Ad-△E1B高约10倍的杀肿瘤作用。根据所述结果，可理解核心蛋白聚糖的表达没有破坏腺病毒的复制能力并且有助于显著提高腺病毒的杀肿瘤作用。与Ad-△E1B-DCNG相比，分析的Ad-△E1B-DCNQ和Ad-△E1B-DCNK的杀肿瘤作用降低。在降低对胶原蛋白的结合亲和力时杀肿瘤作用降低。相反，与Ad-△E1B相比，Ad-△E1B-DCNG在正常细胞中显示很小的或没有杀肿瘤作用。总之，应该理解由核心蛋白聚糖表达引起的杀肿瘤作用的增强仅在肿瘤细胞中，而不在正常细胞中诱导，这表明其肿瘤特异性。
6.表达核心蛋白聚糖的溶瘤腺病毒的噬斑形成
为了显现核心蛋白聚糖表达对致细胞病变能力和病毒扩散到周围细胞的作用，比较了含有琼脂糖的固体培养基中的噬斑形成。用Ad-△E1B、Ad-△E1B-DCNG、Ad-△E1B-DCNQ和Ad-△E1B-DCNK腺病毒感染Hep3B细胞，然后分析噬斑形成。如图7a和7b所示，用Ad-△E1B-DCNG感染的Hep3B细胞形成噬斑的时间短于用Ad-△E1B、Ad-△E1B-DCNK和Ad-△E1B-DCNQ感染的细胞。此外，在用Ad-△E1B-DCNG感染的Hep3B细胞中形成的噬斑的尺寸大于用Ad-△E1B感染的Hep3B细胞。更具体而言，对用Ad-△E1B，感染后13～16天观察到噬斑，而对于Ad-△E1B-DCNG感染后早至4天就形成噬斑。此外，观察到与Ad-△E1B-DCNG相比，Ad-△E1B-DCNQ和Ad-△E1B-DCNK的空板形成速度大大降低。在降低对胶原蛋白的结合亲和力时噬斑形成的速度降低。这些结果表明，由于增强的溶瘤活性和病毒向周围细胞扩散，所以表达核心蛋白聚糖的腺病毒导致噬斑形成在较短时间内且尺寸大很多。
7.由表达核心蛋白聚糖的腺病毒诱导的细胞凋亡
显示高滴度的复制缺陷型腺病毒dl-LacZ-DCNG诱导如结果2所示的从培养板底部分离的细胞的死亡。因此，我们检验核心蛋白聚糖的表达是否是细胞毒性效应的原因。首先，为了确定核心蛋白聚糖是否诱导细胞凋亡，在PI染色后进行了流式细胞术分析以测定由于细胞凋亡引起的含有随机片段DNA的subG1细胞群的增加率。将多种人肿瘤细胞系用Ad-△E1B、Ad-△E1B-DCNG、Ad-△E1B-DCNQ和Ad-△E1B-DCNK腺病毒感染，并在感染后48～96小时采集用于测定subG1细胞群的增加。CPT用作诱导细胞凋亡的阳性对照。感染Ad-△E1B的A549细胞显示约3.11％的subG1细胞群，而感染Ad-△E1B-DCNG的A549细胞显示约26.52％的subG1细胞群。在其它细胞系(U343、U87MG、C33A和Hep3B)中也观察到此种通过腺病毒感染增加的subG1细胞群(图8a和表1)。此外，与感染Ad-△E1B-DCNG相比，感染Ad-△E1B-DCNQ和Ad-△E1B-DCNK的细胞中subG1细胞群减少；在降低核心蛋白聚糖对胶原蛋白的结合亲和力时，subG1细胞群的增加较少。
将人肿瘤细胞系的代表细胞用复制缺陷型腺病毒dl-LacZ或dl-LacZ-DCNG腺病毒感染并采集用于测定subG1细胞群的增加。如上述溶瘤腺病毒中观察到的结果，dl-LacZ-DCNG使subG1细胞群的增加比dl-LacZ更大(图8b和表2)。
表1
Figure S06806164920070829D000401
表2
Figure S06806164920070829D000402
此外，为了准确检验核心蛋白聚糖表达对细胞杀伤效力的作用，通过膜连蛋白V-FITC和PI双重染色评估由溶瘤腺病毒诱导的细胞凋亡的进程。膜连蛋白V-FITC作为细胞凋亡的早期标记用于检测磷脂酰丝氨酸(PS)到外膜小叶的易位，和PI作为细胞凋亡的晚期标记用于通过与核染色质结合鉴定坏死。因此，膜连蛋白V-FITC-/PI-、膜连蛋白V-FITC+/PI-和PI+分别表示健康、凋亡和坏死细胞。在CPT处理的U343中，32.15％(膜连蛋白V-FITC+/PI-)的细胞是凋亡的，而用Ad-△E1B或Ad-△E1B-DCNG感染的细胞分别显示24.15％和44.85％的凋亡率，表明与Ad-△E1B相比，Ad-△E1B-DCNG腺病毒诱导增强的凋亡率(图9a)。对于包括U87MG、C33A、Hep3B和A549的其它细胞系，表达核心蛋白聚糖的腺病毒较Ad-△E1B腺病毒显示更高的凋亡率。此外，说明反映全部细胞死亡的总细胞凋亡和坏死(膜连蛋白V-FITC+/PI-和PI+)对于Ad-△E1B-DCNG比Ad-△E1B高得多。总之，这些结果促使我们推论Ad-△E1B-DCNG腺病毒引起比Ad-△E1B更高的凋亡率，从而通过Ad-△E1B-DCNG比Ad-△E1B更经常发生细胞死亡。此外，我们发现与△E1B-DCNG相比，由Ad-△E1B-DCNQ和Ad-△E1B-DCNK引起的凋亡率降低；在降低对胶原蛋白的结合亲和力时，凋亡率降低。
为了检查由表达核心蛋白聚糖的复制缺陷型腺病毒诱导的凋亡率，将包括U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549的多种细胞用PBS、CPT、dl-LacZ或dl-LacZ-DCNG处理，然后通过膜联蛋白V-FITC和PI双重染色评估细胞凋亡的进程。如图9b所示，在CPT处理的U343细胞中，19.41％(膜联蛋白V-FITC+/PI-)的细胞是凋亡的，而感染dl-LacZ和dl-LacZ-DCNG的细胞分别显示3.93％和13.18％的凋亡率，表明与dl-LacZ相比，dl-LacZ-DCNG腺病毒诱导增强的凋亡率。对于包括U87MG、C33A、Hep3B和A549的其它细胞系，表达核心蛋白聚糖的dl-LacZ-DCNG腺病毒显示更高的凋亡率。总之，应该认识到表达核心蛋白聚糖的复制缺陷型腺病毒以及表达核心蛋白聚糖的溶瘤腺病毒可以更高的速度诱导细胞凋亡。
进行了TUNNEL分析以鉴定作为早期细胞凋亡特征的DNA片段。图10a和表3中显示几乎所有用CPT处理作为阳性对照的细胞染色为深棕色，表明发生了活跃的细胞凋亡。32.5±12.5％的感染Ad-△E1B的U343细胞显示浅棕色，以及69.7±5.40％的感染Ad-△E1B-DCNG的细胞显示深棕色，证明Ad-△E1B-DCNG比Ad-△E1B具有更高的诱导细胞凋亡的效力(表3)。在其它肿瘤细胞系中(U87MG、C33A、Hep3B和A549)中也发现这种由表达核心蛋白聚糖导致的细胞凋亡增加。我们发现与Ad-△E1B-DCNG相比，Ad-△E1B-DCNQ和Ad-△E1B-DCNK诱导的DNA片段的频率较低；随核心蛋白聚糖对胶原蛋白的结合亲和力降低，DNA片段的频率降低。由于根据对胶原蛋白的结合亲和力充分分析和评估了由核心蛋白聚糖表达引起的多种作用，对胶原蛋白具有最高结合亲和力的表达野生型核心蛋白聚糖的腺病毒用于体内或体外效力检验。
表3
Figure S06806164920070829D000421
Figure S06806164920070829D000431
将人肿瘤细胞系的代表细胞用复制缺陷型腺病毒(dl-LacZ或dl-LacZ-DCNG)或肿瘤特异性溶瘤腺病毒(Ad-△E1B或Ad-△E1B-DCNG)感染，并在感染后48～96小时采集用于TUNNEL分析。如从溶瘤腺病毒获得的结果，表达核心蛋白聚糖的dl-LacZ-DCNG和Ad-△E1B-DCNG腺病毒表现出比dl-LacZ腺病毒高得多的细胞凋亡(图10a、10b，表3)。
8.表达核心蛋白聚糖的溶瘤腺病毒体内抗肿瘤作用的评估
为了研究表达核心蛋白聚糖的Ad-△E1B-DCNG的体内抗肿瘤作用，隔日3次用1×108～5×108PFU的Ad-△E1B或Ad-△E1B-DCNG感染裸鼠中形成的肿瘤异种移植，并且观察肿瘤的生长模式。对于人脑肿瘤U87MG，阴性对照PBS引起肿瘤显著生长至1089.22mm3，而Ad-△E1B和Ad-△E1B-DCNG分别引起肿瘤生长至115.70mm3和11.87mm3的显著抑制(图11a)。换言之，参照PBS的结果，Ad-△E1B和Ad-△E1B-DCNG腺病毒显示显著的体内抗肿瘤作用。
处理后25天后，用PBS处理的9只小鼠全部死亡(图11b)。感染后33天后，Ad-△E1B和Ad-△E1B-DCNG腺病毒分别导致肿瘤体积为399.68mm3和23.38mm3，推论表达核心蛋白聚糖的腺病毒比Ad-△E1B具有更强的抗肿瘤效力。令人惊奇地，在病毒感染后19天，Ad-△E1B-DCNG腺病毒完全根除7只小鼠中的4只小鼠的肿瘤，并且在感染后41天消灭6只小鼠的肿瘤。并且，甚至在感染后60天没有观察到用Ad-△E1B-DCNG处理的肿瘤的再生长(图11b)。为了检验Ad-△E1B-DCNG的这种优异的抗肿瘤作用是否在其它人肿瘤细胞系中也是真实的，对C33A、A549、Hep3B和U343异体移植进行了抗肿瘤作用分析。如图11a所示，给予肿瘤特异性溶瘤Ad-△E1B或Ad-△E1B-DCNG腺病毒的组比用PBS处理的组显示更显著的抗肿瘤作用。此外，用Ad-△E1B-DCNG处理比用Ad-△E1B处理的肿瘤的体积显著减小，表明核心蛋白聚糖表达有助于优异的体内抗肿瘤作用。
检验了表达核心蛋白聚糖的腺病毒处理的荷瘤小鼠的存活率。对于C33A荷瘤小鼠，处理开始后80天，用Ad-△E1B-DCNG处理的动物100％仍能存活，而同期用Ad-△E1B处理的小鼠只有50％能存活(小鼠死亡；对于C33A肿瘤体积>2000mm3)(图11b)。对于C33A异种移植模型，以1×108PFU的Ad-△E1B-DCNG处理以及以5×108PFU处理U343、U87MG、Hep3B和A549异种移植模型。在U343、U87MG、Hep3B和A549异种移植模型中也测得了这种由Ad-△E1B-DCNG引起的增加的存活率。这些结果证实Ad-△E1B-DCNG可赋予显著的存活益处和体内肿瘤减少。
9.由表达核心蛋白聚糖的增殖型腺病毒诱导的肿瘤特征的变化
用Ad-△E1B和Ad-△E1B-DCNG感染在裸鼠腹部形成的多种人肿瘤细胞系(U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549)3次。注射3天后，取出肿瘤组织并用苏木精和伊红染色用于组织学特性。如图12a～12e所示，Ad-△E1B-DCNG处理的肿瘤中的坏死灶主要在肿瘤块的外周发现，而Ad-△E1B处理的肿瘤的坏死灶几乎不能检测到，如果存在，在肿瘤块的中央发现。然后通过使用对腺病毒六联体蛋白特异的抗体的免疫组织化学证实肿瘤块内的病毒持续性和分布。如图12a～12e所示，主要在遭遇坏死的肿瘤的外周检测到Ad-△E1B-DCNG腺病毒。TUNNEL分析显示在与坏死相同的区域活跃地发生细胞凋亡。相反，如果可检测到，Ad-△E1B在肿瘤中央诱导坏死。
总之，可认识到Ad-△E1B-DCNG腺病毒在病毒注射部位活跃地复制并广泛扩散，有助于诱导细胞凋亡和坏死。
10.采用Masson三色染色的肿瘤块中胶原蛋白分布研究
用Ad-△E1B或Ad-△E1B-DCNG注射裸鼠中形成的人脑肿瘤细胞系U3433次，注射3天后，取出肿瘤组织并用Masson三色染色以分析细胞外基质的主要组分胶原蛋白的分布(染成蓝色)。常常观察到用Ad-△E1B处理的U343肿瘤块在其内部部分染成蓝色；然而，用Ad-△E1B-DCNG处理的U343肿瘤块在其内部部分没有蓝色染色。而在围绕肿瘤的正常组织中观察到囊状形式的胶原蛋白(图13，A部分)。这些结果表明溶瘤Ad-△E1B-DCNG腺病毒以肿瘤特异的方式表达核心蛋白聚糖，然后显著降低肿瘤块中胶原蛋白的含量，对周围正常组织中的胶原蛋白含量没有影响。
对于U87MG异种移植模型，由于注射Ad-△E1B-DCNG肿瘤块与注射Ad-△E1B一样的非常低水平的胶原蛋白，所以注射Ad-△E1B-DCNG的肿瘤块显示非常少或没有蓝色染色区(图13，B部分)。因此，应该理解在肿瘤组织中胶原蛋白的水平低的情况下，核心蛋白聚糖的表达不可能影响胶原蛋白的含量。
11.通过酶谱法的MMP表达模式的检查
为了检查细胞外基质的降低是否是由MMP诱导的，通过酶谱法证实了MMP-2和MMP-9的活性(图14)。以多种滴度的Ad-△E1B或Ad-△E1B-DCNG腺病毒感染多种人肿瘤细胞系(U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549)。结果，与作为对照的PBS和Ad-△E1B相比，当感染Ad-△E1B-DCNG腺病毒时，MMP-2和MMP-9的活性显著升高。在所有的U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549细胞系中发现相似程度的MMP-2和MMP-9的升高的活性。因此可以理解MMP-2和MMP-9的活性可通过腺病毒的核心蛋白聚糖表达而升高。
12.通过表达核心蛋白聚糖的溶瘤腺病毒抑制肿瘤转移
核心蛋白聚糖与细胞外基质组分反应以促进MMP-1和MMP-2的表达，从而降解细胞外基质是通常为人所知的。使用自发性肿瘤转移模型检查了核心蛋白聚糖表达在转移潜力中的变化。将B16BL16细胞(2×105个/小鼠)皮下给予到C57BL/6小鼠的右后足垫，并且一旦肿瘤体积达到100～200mm3，隔日3次将PBS、Ad-△E1B或Ad-△E1B-DCNG直接注射到肿瘤中。最后注射后第5天，在温和麻醉下通过膝盖以下切除手术去除原发性肿瘤。原发性肿瘤除去后第20天，评估小鼠肺中转移肿瘤灶的重量。如图15所示，与PBS-处理对照组(250±140mg)相比，来自用Ad-△E1B或Ad-△E1B-DCNG处理的小鼠的肺中平均肿瘤负荷分别为200±140mg和130±160mg，说明小得多的模式。此外，虽然所有7只用PBS处理的小鼠显示严重的肺癌转移，但是在7只处理小鼠的1和2只中，Ad-△E1B和Ad-△E1B-DCNG分别完全抑制转移性病灶的形成。这些数据表明，在原发性肿瘤部位核心蛋白聚糖的表达可抑制远端部位转移性病灶的形成。
13.使用来自乳腺癌患者的肿瘤组织评价表达核心蛋白聚糖的腺 病毒的转导效率和组织穿入效力
为了检查上述实施例中证实的表达核心蛋白聚糖的腺病毒的增强的转导效率和组织穿入效力是否也表现在原发性人肿瘤组织中，收集来自乳腺癌患者的肿瘤组织和邻近的正常组织，切成1～2mm直径的碎片并在涂敷0.75％琼脂糖的板上培养，接着以1×108PFU的dl-LacZ或dl-LacZ-DCNG感染。病毒注射后第5天，进行X-gal染色。与注射dl-LacZ的相比，用dl-LacZ-DCNG注射的肿瘤组织的表面显示深蓝色(图16)。与此相反，用dl-LacZ-DCNG或dl-LacZ感染的正常组织显示很少或没有X-gal染色。
将来自乳腺癌患者的乳腺肿瘤球形体(<1cm3)置于含有添加胰岛素(10μmol)和氢化可的松(1μmol)的5％IMDM的12孔板中，并以1×107PFU的dl-GFP或dl-GFP-DCNG感染。病毒感染后第5天，在荧光显微镜下观察肿瘤球形体。在注射dl-GFP的肿瘤球形体中，GFP限制性地在肿瘤球形体的表面表达；然而，在注射dl-GFP-DCN的肿瘤球形体的大部分组织中，GFP强烈和广泛地表达(图19b)。
14.表达核心蛋白聚糖的腺病毒对原发瘢痕疙瘩细胞的穿透率评 估
瘢痕疙瘩是由细胞外基质广泛形成引起的病症的一种。为了评价表达核心蛋白聚糖的腺病毒对瘢痕疙瘩的治疗效力，将来自瘢痕疙瘩患者的原发性瘢痕疙瘩细胞系用MOI为0.1～50的dl-LacZ或dl-LacZ-DCNG腺病毒感染，然后进行X-gal染色。观察到dl-LacZ-DCNG比dl-LacZ诱导更强的LacZ表达，表明核心蛋白聚糖表达引起进入瘢痕疙瘩细胞的转导效率显著提高(图17)。
15.使用瘢痕疙瘩球形体模型评价转导效率
为了证实表达核心蛋白聚糖的腺病毒进入瘢痕疙瘩组织的提高的转导效率，用1×107PFU的dl-LacZ或dl-LacZ-DCNG腺病毒感染斑痕疙瘩细胞球形体并进行X-gal染色用于显微镜观察，所述斑痕疙瘩球形体使用来自瘢痕疙瘩患者的第二代原发性瘢痕疙瘩细胞制备。在瘢痕细胞球形体的表面对dl-LacZ-DCNG比对dl-LacZ显示更强的染色(图18，A部分)。
16.对来自瘢痕疙瘩患者的组织的扩散和穿入效力评价
为了检验用瘢痕疙瘩细胞球形体显示的dl-LacZ-DCNG的增强的转导效率是否在来自患者的瘢痕疙瘩组织中也能重复，将来自患者的瘢痕组织用1×108PFU的dl-LacZ或dl-LacZ-DCNG感染并进行X-gal染色用于显微镜观察。dl-LacZ处理的瘢痕组织显示弱LacZ表达，而dl-LacZ-DCNG处理的瘢痕疙瘩组织为强烈的X-gal染色(图18，B部分)。此外，为了评价腺病毒进入瘢痕疙瘩组织的穿入效率，将感染的组织包埋在O.C.T.化合物中并快速冷冻。用dl-LacZ感染的瘢痕疙瘩组织的内部与它们的表面为非常弱的染色。明显相反，对于用dl-LacZ-DCNG感染的组织，LacZ表达的分布广泛得多并在不局限于在注射部位的整个球形体观察到(图18，B部分)。这些数据清楚地显示诱导细胞外基质破坏的表达核心蛋白聚糖的腺病毒的转导效率在瘢痕疙瘩组织中显著增强，表明表达核心蛋白聚糖的腺病毒是治疗瘢痕疙瘩病症的有前途的治疗剂。
已描述本发明的优选实施方案，应该理解落入本发明的精神中的其变化和修饰对于本领域技术人员可为显而易见的，并且通过所附权利要求书及其等同物确定本发明的范围。

Claims (6)

1.一种包括待送递到细胞中的目的核苷酸序列的重组腺病毒基因送递系统，其特征在于，其包括增强目的核苷酸序列进入细胞的转导效率的编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列，其中，（i）所述编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列增强了目的核苷酸序列进入细胞的转导效率；（ii）所述细胞为由通过细胞外基质互相连接的细胞构成的组织中的细胞；以及（iii）所述重组腺病毒包括缺失的E3和E1区，并将编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列插入到该缺失的E3区中以及将待送递的目的核苷酸序列插入到该缺失的E1区中。
2.根据权利要求1所述的基因送递系统，其中所述组织为肿瘤组织。
3.一种重组腺病毒，其包括腺病毒ITR（反向末端重复序列）核苷酸序列和编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列，其中i)表达的核心蛋白聚糖蛋白增强重组腺病毒进入肿瘤组织的穿入效力和重组腺病毒感染的肿瘤细胞的细胞凋亡，ii）所述重组腺病毒包含灭活E1B 19基因、灭活E1B 55基因、或灭活E1B 19和E1B 55基因，以及iii）所述重组腺病毒包括其中插入了编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列的缺失的E3区以及用于插入待送递的目的核苷酸序列的缺失的E1区。
4.根据权利要求3所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包括活性E1A基因。
5.一种用于治疗癌症的抗肿瘤药物组合物，其包括(a)治疗有效量的根据权利要求3或4所述的重组腺病毒；和(b)可药用载体。
6.用于治疗与过量细胞外基质累积相关的疾病或病症的药物组合物，其包含：包含编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列的基因送递系统，该基因送递系统用于制备治疗与过量细胞外基质累积相关的疾病或病症的药物组合物，其中，所述基因送递系统为一种重组腺病毒，该重组腺病毒包括其中插入了编码核心蛋白聚糖的核苷酸序列的缺失的E3区，和其中插入了待送递到细胞中的目的核苷酸序列的缺失的E1区，并且该重组腺病毒包含灭活E1B 19基因、灭活E1B 55基因、或灭活E1B 19和E1B 55基因；其中，所述与过量细胞外基质累积相关的疾病或病症为瘢痕、肝硬化、肺纤维样变性、肾小球肾炎、成人或急性呼吸困难、肝纤维样变性、肾纤维样变性、心肌梗塞后的心肌纤维形成、纤维囊肿病、纤维样变性癌、静脉闭塞综合征或肾基质纤维样变性。
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