KR20030081187A - 엘아이피에 대한 엘에이피 비율 조절방법 - Google Patents

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KR20030081187A
KR20030081187A KR10-2003-0023231A KR20030023231A KR20030081187A KR 20030081187 A KR20030081187 A KR 20030081187A KR 20030023231 A KR20030023231 A KR 20030023231A KR 20030081187 A KR20030081187 A KR 20030081187A
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스미토모덴키고교가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 LIP(전사 저해 단백질)의 전사/번역을 줄이거나 감소시키거나 또는 억제할 수 있고, 몇몇의 실시예에서는 LAP(전사 활성 인자)의 전사/번역에 영향없는 재조합 유전자 벡터와 핵산 작제물을 제공한다. 전기 벡터와 작제물은 세포에서 LIP 활성에 대한 LAP의 비율을 증가시키기 위한 방법과, LIP에 대한 LAP 비율에 연관되어 나타나는 질병이나 상태를 치료 및/또는 개선시키는 방법에 사용된다. 또한, 본 발명은 세포나 개체에서 LIP 활성에 대한 LAP의 비율을 변용할 수 있는 약물을 선별하는 방법을 제공한다.

Description

엘아이피에 대한 엘에이피 비율 조절방법{Control of the Ratio of LAP to LIP}
본 발명은 세포에서 LIP(전사저해 인자)에 대한 LAP(전사활성 인자) 비율을 조절하는 조성물과 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 LAP 활성을 암호화하는 재조합 벡터를 제공하는데, LIP 활성의 발현이 억제되며, LIP가 LAP 활성을 억제하지 않도록 LIP 활성의 발현이 억제된다. 본 발명은 또한 주어진 약물이 C/EBPβ유전자에서 발현되는 LIP에 대한 LAP 발현수준의 비율을 조절하는지 여부를 선별하는 방법을 제공한다.
광범위한 의학 발달과 수많은 진보에도 불구하고, 미국에서 암은 2번째 사망원인으로 남아있다. 암 형성에는 끊임없는 유전자 결함이 수반된다. 유전자 결함으로 보고된 대부분의 경우, 우세한 암 유전자의 형질전환 기능획득이나 p53같은 암 억제 유전자의 암 억제 기능손실에서 비롯된다. 우세한 암 유전자나 암 억제 유전자의 음성변이체(negative variant), 이를테면 p53이 통합된 레트로바이러스 벡터를 이용하여, 암세포로 도입함으로써 암의 증상이 개선되고/개선되거나 치료될 수 있다(참조: Alavi J. B. et aL., 2001,Expert. Opin. Biol. Ther.,1:239-252).
암치료를 위한, 세포나 조직으로의 싸이토카인(cytokine) 도입 역시 시도되어 왔다. 예를 들어, 다음과 같은 시도들이 있었다: 림프구에 싸이토카인 유전자 도입(즉, 림포카인(lymphokine) 활성 킬러세포(LAK), 세포독성 T림프구(CTL) 및 종양-침투 림프구(TIL))과 수동면역을 증진시키기 위해, 형질도입된 세포로부터 분비된 싸이토카인을 이용해 림프구를 활성화; 또는, 직접 항 종양 활성을 지닌 IFN 또는 TNF 유전자를 TIL에 도입함으로써 종양자리의 항 종양활성을 증진(참조: Treisman J. et al., 1994,Cell Immunol.,156:448-457; Hwu et al., 1993,J. Immunol.,150:4104-4115).
더욱이, 싸이토카인 유전자가 레트로바이러스 벡터 등를 통해 종양세포로 도입되고, 형질도입된 세포를 종양백신으로 사용하여 종양 특이적인 숙주의 면역세포가 유도되는 시도가 보고되었다(참조: Adris S. et al., 2000,Cancer Res., 60:6696-6703; Hiroishi K. et al., 1999,Gen. Ther., 12:1988-1994).
CCAAT/인핸서 결합 단백질 β(C/EBPβ) 유전자는 많은 발달과정 중에 영향을주는 것으로 알려져 왔다(참조: Hirai et al., 2001,J. of Cell Biol., Vol. 153:785-794). 두개의 전사 개시자리가 C/EBPβ유전자의 뉴클레오티드내에 존재하고, LAP(전사 활성인자)와 LIP(전사 저해인자)는 각 전사자리로부터 번역을 통해 생성된다(참조: Descombes et al., 1991,Cell, 67:569-579). LAP/LIP 비율이 증가함에 따라서, 표적 유전자의 전사활성은 증진되고, LAP/LIP 비율은 랫트(rat) 간의 분화 중 최종단계에 증가한다. 데스컴베스와 벅 등은 간세포의 분화단계와 휴지단계가 LAP/LIP 비율에 의해서 조절될 수 있다고 개시했다(참조: Descombes et al., 1994,EMBO Journal, 13(4):851-860). 히라이(Hirai) 등은 미오상피(myoepithelial) 세포와 유선(mammary gland) 섬유아세포의 표면에 발현되며 유선의 형태발생에 관련된 단백질인 에피몰핀(epimorphin)으로 세포가 처리될때, C/EBPβ의 발현이 증가하고 암호화된 LAP/LIP 비율이 변한다고 보고했다.
암 증상 치료의 진보에도 불구하고, 암 증상을 치료 및/또는 개선할 수 있는 약물과 방법을 선별할 수 있는 방법의 요구가 있어 왔다.
여기 개시된 모든 특허와 간행은 그대로 인용문헌에 의해 통합된다.
발명의 요약
본 명세서에 개시된 발명은 세포 또는 개체에서 LIP 활성에 대한 LAP 활성 비율을 조절하는 조성물과 방법을 제공한다. 본 발명은 LAP(전사활성 인자)활성을 암호화하는 재조합 벡터를 재공하는데, LIP 활성의 발현이 억제되며, LIP가 LAP 활성을 억제하지 않도록 LIP 활성의 발현이 억제된다. 몇몇의 실시예에서, 재조합 벡터는 CCAAT/인핸서 결합 단백질 β(C/EBPβ) 유전자 일부 또는 전부의 뉴클레오티드를 포함하는데, 전기 뉴클레오티드는 LIP 전사억제 단백질의 ATG 개시코돈의 주변 염기서열과 돌연변이를 포함한다. 다른 실시예에서, 개시코돈 주변의 돌연변이는 ATG가 다른 아미노산의 코돈으로 치환된 것이며, 치환된 코돈은 TTG가 아니다. 다른 실시예에서는, 돌연변이는 ATG가 알라닌, 글리신 및 프롤린 아미노산 중 하나를 암호화하는 코돈으로 치환된 것이다. 또 다른 실시예에서, 돌연변이는 ATG가 아르기닌을 암호화하는 코돈으로 치환된 것이다. 몇몇 실시예에서 재조합 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 벡터이다. 다른 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 제공한다.
본 발명은 또한 LIP의 ATG 개시 코돈이 다른 아미노산으로 치환된 LAP 폴리펩티드 변이체를 제공하는데, 치환된 코돈은 TTG가 아니고 몇몇 실시예에서는 번역 종결코돈이 아니다. 몇몇 실시예에서 LAP 폴리펩티드 변이체는 LIP의 ATG 개시코돈이 알라닌, 글리신, 프롤린 또는 아르기닌을 암호화하는 코돈으로 치환된 것을 포함한다. 본 발명은 그러한 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산을 또한 제공한다. 본 발명은 또한 C/EBPβ유전자의 뉴클레오티드 서열내 또는 그것의 상보적 서열내 LIP(전사 억제인자 단백질) ATG 개시코돈 주변의 약 10에서 100 뉴클레오티드 길이를 가진 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공하는데, 전기 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 상보적 서열은 LIP 발현을 감소시킬 수 있다.몇몇 실시예에서 올리고뉴클레오티드는 약 10에서 80 뉴클레오티드 길이이다. 다른 실시예에서 올리고뉴클레오티드는 약 15에서 50 뉴클레오티드 길이이다.
본 발명은 또한 숙주세포, 조성물과 재조합 벡터, 올리고뉴클레오티드 또는 변형된 LAP 폴리펩티드(또는 전기 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산)를 포함하는 킷트, 및 그의 제조 방법 등을 제공한다.
또한, 본 발명은 세포에서 LIP에 대한 LAP의 발현수준을 변용하는 방법을 제공하는데, 세포를 적당한 조건하에서 본 발명의 재조합 벡터, 올리고뉴클레오티드 또는 LAP 폴리펩티드 변이체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시예에서 세포는 유방암 또는 간암세포같은 암세포이다. 본 발명은 또한 개체내 질병의 증상 및/또는 LIP에 대한 LAP의 비정상적인 발현수준에 연관된 상태를 치료하고/치료하거나 개선시키는 방법을 제공하는데, 개체에 본 발명의 재조합 벡터, 또는 올리고뉴클레오티드, 또는 LAP 폴리펩티드 변이체를 투여하는 과정을 포함한다. 몇 몇 실시예에서 질병이나 상태는 암이다. 또한, 본 발명은 C/EBPβ유전자로부터 발현된 LIP에 대한 LAP의 발현수준의 비율을 변용할 수 있는 약물을 선별하는 방법을 제공하는데, C/EBPβ유전자에 전기 약물을 접촉시키는 단계와 LIP 발현에 대한 LAP 발현의 비율을 측정하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시예에서 약물은 저분자량 화합물이며; 다른 실시예에서는 자연계에 존재하는 물질의 추출물이고; 또 다른 실시예에서 비율은 노던 블롯(Northern blot)에 의해 측정된다. 몇몇 실시예에서 포유류의 세포는 전기 C/EBPβ유전자를 포함한다. 몇몇 실시예에서 방법은 세포에서 LAP의 발현수준을 증가시키는 약물나 세포에서 LIP의 발현수준을 감소시키는 약물을동정하는 과정을 포함한다.
본 발명은 또한 암 증상의 치료 및/또는 개선을 위한 의약제조에 있어 본 발명의 재조합벡터의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암 증상의 치료 및/또는 개선을 위한 의약제조에 있어 본 발명의 LAP 폴리펩티드 변이체의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암 증상의 치료 및/개선을 위한 의약제조에 있어 본 발명의 올리고폴리펩티드 사용에 관한 것이다.
본 명세서에 개시된 발명은 세포에서 LIP 대한 LAP 비율을 조절하는 조성물과 방법을 제공한다. 본 발명은 세포에서 LIP에 대한 LAP비율을 변용하고, 몇몇 실시예에서는 LIP에 대한 LAP의 비율을 증가시키는 조성물과 방법을 제공한다. 본 명세서에 개시된 발명은 질병의 증상 및/또는 C/EBPβ유전자로부터의 전사저해 인자 LIP에 대한 전사 활성인자 LAP의 비율과 연관된 상태를 치료 및/또는 개선시키는 조성물과 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 LIP에 대한 LAP 비율을 변용하는 약물을 선별하는 조성물과 방법을 제공한다.
본 발명은 LAP 활성을 암호화하는 재조합 벡터를 제공하는데, LIP 활성의 발현이 억제된다. 몇몇의 실시예에서, 본 발명은 LAP 활성을 암호화하는 재조합 벡터를 제공하는데, LIP활성의 발현이 억제되고. LIP 활성이 LAP 활성을 억제하지 않도록 LIP 활성의 발현이 억제된다. 본 발명은 LAP의 변형된 형태를 암호화하는 분리된 핵산을 제공하는데, LIP의 ATG 개시코돈은 TTG가 아닌, 몇몇 실시예에서는 종결코돈은 아닌, 다른 코돈으로 치환되어 있다. 본 발명은 변형된 LAP 폴리펩티드를 제공하는데, LIP의 개시코돈(ATG)은 다른 코돈으로 치환되어 왔고, 치환된 서열은 TTG가 아니고, 몇몇 실시예에서는 종결코돈이 아니다. 몇몇 실시예에서 그렇게 변형된 LAP 폴리펩티드는 항암활성을 나타낸다.
특히, 본 발명은 C/EBPβ유전자 전부 또는 일부의 핵산을 포함한 재조합 벡터를 제공하고, 전기 핵산은 C/EBPβ뉴클레오티드중 LIP 개시코돈 주변 뉴클레오티드 서열의 돌연변이를 포함한다. 몇몇의 실시예에서는 재조합 벡터들이 항암활성을 나타내고 유전자 치료에 사용될 수 있는데, 즉, 질병이나, LIP에 대한 LAP 비율과 연관된 상태에 있는 세포나 개체로의 투여나 전달에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 재조합 벡터는 LAP 활성을 발현하는 재조합 벡터의 세포로의 투여나 전달을 위해 사용될 수 있다. 전기 재조합 벡터들은 세포에서 LIP에 대한 LAP의 비율을 증가시키는 방법; 개체의 질병의 증상 및/또는 LIP에 대한 LAP의 비율에 연관된 상태를 치료하고/치료하거나 개선시키는 방법; 및, LIP에 대한 LAP 비율을 변용할 수 있는 약물의 선별방법 등에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 올리고뉴클레오티드, 안티센스(antisense) 핵산, 및 LIP 수준을 감소시키고, 줄이거나 억제할 수 있는 간섭 RNA(iRNA)를 제공한다.
본 명세서에 개시된 발명은 세포에서 LIP에 대한 LAP 발현수준의 비율을 변용할 수 있는 방법을 제공하는데, 세포에, 본 발명의 벡터, 또는 올리고뉴클레오티드, 안티센스 핵산 또는 LIP 수준을 감소시키고, 줄이거나 억제할 수 있는 iRNA 등을 접촉시키는 단계를 포함한다. 몇몇의 실시예에서 에피몰핀(epimorphin)과 조합하여 본 발명의 재조합 벡터, 또는 올리고뉴클레오티드, 안티센스 뉴클레오티드 또는 iRNA 등이 세포에 접촉된다. 또한, 본 발명은 암과 같은 질병의 증상 및/또는 개체에서 LIP에 대한 LAP 발현수준의 비율에 연관된 상태를 치료 및/또는 개선시키기 위한 방법을 제공하는데, 본 발명의 재조합 벡터, 또는 올리고뉴클레오티드, 안티센스 핵산 또는 본 발명의 iRNA 등을, 독자적으로 또는 다른 치료, 에피몰핀 등과의 조합을 통해 암에 걸린 개체에 투여하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 약물이 C/EBPβ유전자로부터 발현된 LIP에 대한 LAP의 발현수준의 비율을 변환시킬 수 있는지 여부를 선별하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 특정 암이나 악성세포가 본발명의 재조합 벡터 또는 올리고뉴클레오티드, 안티센스 핵산 또는 본발명의 iRNA에 의한 치료에 대해 감수성을 가지는지 결정하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 재조합 벡터나 올리고뉴클레오티드, 안티센스 핵산 또는 본 발명의 iRNA 등을 포함하는 킷트를 제공한다. 몇몇 실시예에서, 본 발명의 킷트는 암세포의 치료에 대한 감수성을 시험하는데 사용되는 재조합 벡터를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 재조합 벡터나 올리고뉴클레오티드, 안티센스 핵산 또는 본 발명의 iRNA 등을 포함하는 조성물을, 그의 제조 방법과 마찬가지로 제공한다.
본 발명의 실행은 특별한 언급이 없는 한, 당업계내의 종래의 분자생물학,바이러스학, 미생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기술 등을 차용한다. 이러한 기술들은 여러 문헌에서 자세히 설명되어 있다(참조: Maniatis et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual(1982);DNA Cloning: A Practical Approach, vols. I & II(D. Clover, ed.);Oligonucleotide Synthesis(N. Gait, ed.(1984));Nucleic Acid Hybridization(B. Hames & S. Higgins, eds.(1985));Transcription and Translation(B. Hames & S. Higgins, eds.(1984));Animal Cell Culture(R. Freshney, ed.(1986)); Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984); Ausubel, et al.,Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995, 1996); 및, Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd Edition); vols. I, II & III(1989)).
I. CCAAT/인핸서 결합 단백질 β( C/EBPβ); LAP와 LIP
CCAAT/인핸서 결합 단백질 β( "C/EBPβ")는 인핸서 코어 서열 모티프 또는 몇몇 바이러스 프로모터의 인핸서 부위인 CCAAT 서열 모티프(예를 들어, transferrin과 ApoB에서 발견되는)를 선호적으로 인지하고 결합할 수 있는 구성원으로 이루어진 클래스의 인핸서 결합 단백질(EBP)을 포함한다(참조: Landschultz, W. H. et al.,Genes Dev., 2:786-800(1989); Brunel, F. et al.,J. Biol. Chem.,263:10180-10185(1988); Metzger, S. et al.,J. Biol. Chem.,265:9978-9983(1990)).
포유류에서 유래된 C/EBPβ유전자는 데스컴베스 등과 아키라 등에서 알려져 있고 개시되어 있다(참조: Descombes et al., 1990,Genes Dev., Vol. 4. 1541-1551; Akira et al., 1990,EMBO J., 9, 1897-1906). 랫트에서 유래된 C/EBPβ유전자의 뉴클레오티드 서열과 아미노산 서열은 각각 서열번호 1과 2에 기재되어 있다. 사람에서 유래된 C/EBPβ유전자의 뉴클레오티드 서열과 아미노산 서열은 각각 서열번호 3과 4에 기재되어 있다.
C/EBPβ유전자는 두개의 번역 생성물이 있는데, 그것은 LAP(전사활성 인자)와 LIP(전사저해 인자)이다. 두 형태의 번역 생성물 존재는 C/EBPβ유전자의 뉴클레오타이드 서열상의 두개 또는 그 이상의 전사개시 위치의 존재에 기인할 수 있다. 이 전사 개시 위치 중 하나에서 전사/번역을 개시함으로해서 LAP또는 LIP가 생성된다. LAP은 전사 조절위치와 N 말단에 DNA 결합위치를 가지는 단백질인 반면, LIP는 LAP의 DNA 결합 위치만을 가지고 전사조절 위치를 가지지 않는 단백질이다. 두 단백질 모두 동일한 프레임을 가지고 있는데, 즉, LIP는 C 말단의 145 아미노산 부분을 LAP와 공유한다. 이론에 얽매이지 않고, 데스컴베스 등은 LAP와 LIP는 동일한 mRNA로부터 리키 리보좀 스캐닝(leaky ribosome scanning) 메카니즘에 의해서 번역된다고 제안하였다(참조: Descombes et al., 1991,Cell, vol. 67:569-579). LIP의 개시코돈인 ATG는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열중 457에서 459번째 뉴클레오티드에 해당하고 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열중 595에서 597번째 뉴클레오티드에 해당한다.
Buck 등은 LAP발현과 S-기는 간암세포에서 상호배타적이라는 것을 보고했다. 그들은 LAP가 G1/S 기 전환 전에 간암세포의 증식를 억제한다는 것과 세포가 S기로 진입하는 것을 방해한다는 것을 발견하였다. 데스컴베스 등은 LAP와 LIP가 기본적인 DNA 결합 도메인과 류신지퍼 이중합 나선을 포함하는 145개의 C 말단 아미노산을 공유한다는 것을 개시한다(Descombes et al., 1991,Cellvol. 67:569-579). Buck 등은 LAP 류신지퍼의 통합은 간암세포가 S기로 진입하는 것을 방해하는 데에 필요하다는 것을 개시한다. Buck 등은 또한 LIP(LAP의 N말단 활성화 도메인이 없는)는 간암세포 증식을 방해하는 데에는 비효과적이고 세포주기중 LAP 의 억제자 역할을 방해한다라는 것을 개시한다. 이론에 얽매이지 않고, Buck등은, LIP의 145 아미노산은, 류신지퍼와 기본도메인을 포함하고 있어, DNA결합 위치에 직접적으로 경쟁하거나 간접적으로 LIP/LAP이 중합체를 형성함으로서 LAP의 길항제로 작용한다고 제안한다. 따라서, 본 발명은 LIP의 발현이 억제되고 LAP(전사활성 인자) 활성을 암호화하는 재조합 벡터를 제공한다. 다른 실시예에서 본 발명은 LIP 발현이 억제되고 LAP 활성을 암호화하는 재조합 벡터를 제공하는데, LIP 발현이 억제되어 LIP가 LAP 활성을 감소시키지 않는다. LAP 활성은 Buck 논문에 개시된 측정법을 통한 LAP의 간암세포 증식을 억제하는 능력에 의하거나 본 실시예에 개시된 시험관내 모델에서 암형성을 억제하는 것에 의해 측정될 수 있다.
데스컴베스 등은 LAP mRNA에는 프레임이 맞는 세 개의 AUG이 있다고 개시한다(참조: Descombes et al., 1991, Cell, vol. 67:569-579). LAP는 첫번째 프레임AUG(39kd 단백질)에서 시작되고; 세번째 프레임 AUG(20kd 단백질)에서도 시작된다. 몇몇 실시예에서, 재조합 벡터는 N말단 LAP 활성화 도메인 및/또는 DNA 결합 도메인 및/또는 류신지퍼를 포함하고 LIP가 억제되며 LAP활성이 발현된다. 본 발명은 LAP활성을 암호화하는 재조합 벡터를 제공하는데, LIP 개시코돈이 다른 코돈으로 치환되고, 그 다른 코돈은 TTG가 아니며 어떤 실시예에서는 종결코돈이 아닌, 변형된 LAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함한다. 본 발명은 또한 변형된 LAP폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산을 제공하는데, LIP 개시코돈은 다른 코돈으로 치환되고, 그 다른 코돈은 TTG가 아니며, 어떤 실시예에서는 종결코돈이 아니다. 본 발명은 또한 변형된 형태의 LAP폴리펩티드를 제공하는데, LIP 개시코돈은 다른 코돈으로 치환되고, 그 다른 코돈은 TTG가 아니며, 어떤 실시예에서는 종결코돈이 아니다. 여기서 사용되었듯이, "LAP 폴리펩티드 변이체(variant LAP polypeptide) "는 LIP의 ATG 개시코돈에 돌연변이를 포함하는 것이어서, LAP 폴리펩티드 변이체가 적어도 하나의 LAP 생물학적 활성을 유지하는 동안 LIP 활성이 감소되거나 억제된다.
본 발명은 재조합 유전자 벡터, 어떤 실시예에서는, 바이러스 입자를 제공하는데, 그것들은 C/EBPβ 유전자의 일부 또는 전부를 포함하고, LIP(전사저해 인자)의 ATG 개시코돈 주변 뉴클레오티드에 돌연변이가 도입된 부위를 포함한다. 여기서 사용되었듯이, "돌연변이(mutation)"란 용어는 핵산 삽입, 결실 및 치환 등을 포함한다. 몇몇의 실시예에서, 돌연변이는 LIP의 ATG 개시코돈이 다른 코돈으로 치환된 것이다. 몇몇의 실시예에서, 돌연변이는 LAP를 암호화하는 핵산에 프레임이동 돌연변이 없이 LIP의 전사/번역을 감소시키거나, 줄이거나, 억제한다. 다른 실시예에서, 돌연변이는 LAP의 생물학적 활성을 유지하면서 LIP의 전사/번역을 감소시키거나, 줄이거나, 억제한다. 다른 실시예에서, 재조합 벡터는 LAP활성을 가지는 생성물을 암호화하는 핵산 절편 또는 C/EBPβ의 부분을 포함한다. LAP 활성은 당업계에 알려진 방법과 본 명세서에 개시된 방법을 통해 측정될 수 있다. 몇몇 실시예에서, LIP의 ATG 개시코돈은 다른 아미노산을 암호화하는 코돈으로 치환되는데, 치환된 코돈은 TTG가 아니며, 어떤 예에서는 종결코돈이 아니다. 몇몇 예에서, 치환된 코돈은 보존된 도메인이고 TTG가 아니다. 몇몇 예에서, 코돈은 알라닌, 글리신 또는 프롤린을 암호화한다. 본 명세서에 개시된 다른 실시예에서, LIP의 개시코돈 ATG는 CGC로 치환된다. 이러한 재조합 유전자 벡터가 세포나 조직에 전달되면, C/EBPβ유전자로부터의 LAP의 전사/번역에는 영향없이 LIP의 전사/번역이 감소하여, 멈추고, 억제된다. 몇몇 실시예에서, 적어도 하나 이상의 LAP 생물학적 활성은 유지된다. 몇몇 실시예에서, 본 발명의 재조합 벡터가 세포로 전달되면, LAP가 우세하게 발현된다. 더욱이, 선행 명세서의 실시예에서 기술되었듯이, C/EBPβ돌연변이를 포함한 벡터가 누드 마우스로 아이피(IP) 주사되었을 때, 마우스는 대조구와 비교해 어떤 암형성도 없었고, 전이도 보이지 않았다. 즉, 선행 발명에서 단지 LAP의 우세한 발현에 의해 생체내의 암세포가 정상화 될 수 있다는 것을 발견하였다.
선행 발명에서 사용될 수 있는 C/EBPβ의 기원은 특별히 제한되는 것은 아니고, 모든 살아있는 개체의 어떤 유전자라도 사용될 수 있다. 본 발명은 어떤 기원의 C/EBPβ유전자라도 포함한다. 몇몇 실시예에서, 포유동물에서 수득할 수 있는 C/EBPβ유전자가 사용될 수 있다. "포유류(mammal)"라는 용어는 포유류종의 어떤 개체라도 가르킬 수 있고, 큰 동물들(소, 양, 말 등), 변종 동물(개, 고양이를 포함하는) 및 영장류(구세계 원숭이, 신세계 원숭이, 유인원, 인간 등)를 포함한다. 다른 실시예에는 사람의 C/EBPβ가 사용된다. 특히, 인간에서 된 C/EBPβ유전자의 뉴클레오티드 서열과 아미노산 서열은 각각 서열번호 3, 4에 기재되어 있다.
선행 발명에서 사용된 C/EBPβ유전자는 배양된 포유류 세포의 cDNA이거나 당업계의 자명한 기술, 예를 들어 PCR 등을 이용한 것일 수 있다. C/EBPβ를 수득할 수 있는 배양된 포유류 세포의 예는 간 유조직세포, 포유류의 상피세포 및 지방세포 등을 포함한다. 이러한 세포주는 공공의 재원에서 입수가능하다. 대신에, C/EBPβ유전자, 또는 그것의 절편이나 부분, 즉 LIP의 개시코돈 ATG를 포함하는 절편이나 부분은 본 발명의 서열번호 1-4의 뉴클레오티드 서열과 아미노산 서열의 정보를 기초로 화학적으로 합성된 유전자일 수 있다.
더욱이, C/EBPβ유전자의 일부 또는 전부를 포함하는 본 발명의 재조합 유전자 벡터가 인간에 대한 유전자 치료 약물로 사용될 때, 즉 인간에게 투여 또는 전달할 때, 잠재적인 면역거부를 줄이고, 최소화하고, 억제하기 위해, 그리고 치료효과를 증진시키기 위해, 인간 유전자가 선호적으로 사용된다.
C/EBPβ유전자 뉴클레오티드 서열중 LIP의 개시코돈 ATG 주변의 뉴클레오티드에 돌연변이를 도입하는 방법은 당업계에 숙련된 사람들에게 자명하고, 종래의 재조합 기술, 예를 들어 적합하게 구상된 프라이머를 이용한 PCR 방법을 이용해 수행된다. PCR 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.
LIP의 개시코돈 ATG 주변의 뉴클레오티드에 돌연변이의 도입은 LIP의 전사/번역을 감소시키고, 줄이고, 중지시키고, 억제하도록 수행되거나 설계되는데, 몇몇 실시예에서는 LAP의 전사/번역에는 영향을 끼치지 않는다. "LAP의 전사/번역에는 영향없이(without affecting the transcription/translation of LAP)"라는 구문은 생물학적 활성을 가진 LAP가 LAP의 전사/번역의 프레임 이동을 발생시키는 돌연변이 도입없이 발현된다는 의미이다. LAP는 FGF 수용체와 IL-8을 포함한 다양한 단백질의 전사를 조절한다. LAP는 HepG2 세포의 증식을 지연시키는 것으로 알려져 왔고c-jun프로모터로부터의 전사를 감소시킨다(참조: Buck et al, 1994,The EMBO J., vol 13: 851-860). 당업계의 숙련된 사람이라면, LIP의 개시코돈 ATG주변에 도입된 돌연변이가, 이를테면 Buck 논문에 게시된대로 HepG2 증식이나c-jun프로모터로부터의 전사를 측정을 함으로써, LAP의 생물학적 활성에 영향을 끼치는지 결정할 수 있을 것이다. 또한, "LIP의 전사/번역을 감소, 감축, 중단 또는 억제시킨다(to decrease, reduce, stop or suppress the transcription/translation of LIP)"라는 구문은 생물학적 활성을 가진 LIP가 대조구와 비교해서 적은 수준으로 발현된다는 것이나, LIP 발현이 검출되지 않는 것, 또는 LIP가 돌연변이 C/EBPβ유전자로부터 발현되지 않는다는 것을 의미한다. LAP와 LIP의 전사/번역을 동정하는 방법은 노던 블롯과 PCR 등, 당업계에 숙련된 사람에게 자명하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 "LIP의 개시코돈 ATG주변의 뉴클레오티드 서열(a nucleotide sequence around the initiation codon, ATG, of LIP)"이란 구문은 LIP의 개시 ATG 뉴클레오티드(서열번호 1의 457번째부터 459번째의 뉴클레오티드에 해당) 앞(3') 뒤(5')로 약 100뉴클레오티드 범위내의 뉴클레오티드 서열을 포함한다; 그리고 몇몇 실시예에서는, ATG 앞뒤로 90뉴클레오티드; ATG 앞뒤로 80 뉴클레오티드; ATG 앞뒤로 70 뉴클레오티드; ATG 앞뒤로 60 뉴클레오티드; ATG 앞뒤로 50 뉴클레오티드; ATG 앞뒤로 40 뉴클레오티드; ATG 앞뒤로 30 뉴클레오티드; ATG 앞뒤로 20 뉴클레오티드; ATG 앞뒤로 10 또는 5 뉴클레오티드; 그리고 몇몇의 실시예에서 ATG는 다른 아미노산의 코돈으로 치환되어 있다. 다른 실시예에서, ATG는 왼쪽이 그대로이며 ATG 주변의 핵산과 몇몇의 실시예에서 ATG의 3' 부분이 돌연변이 되어서 LIP로부터의 전사 및/또는 번역이 없다.
실례로서, LIP의 개시코돈 ATG는 다른 코돈으로 치환될 수 있는데, TTG가 아니며, 몇몇의 실시예에서는 종결코돈이 아니다. 코돈이 종결코돈이 아니고 LAP번역의 프레임 이동을 유발시키지 않는 한, ATG를 대신하는 코돈의 종류는 특별히 제한되지 않는다. Buck 등은 LAP 류신지퍼(C말단 145 아미노산에서 발견되는)의 통합은 간암세포가 S기로 진입하는 것을 방해하는 데에 필요하다는 것을 개시한다. 암호화된 단백질의 성질에 아무 영향이 없는 아미노산을 암호화하는 코돈이 선호된다. 이러한 아미노산의 예는 알라닌, 글리신 및 프롤린을 포함한다. 본 명세서에 개시된 실시태양에서, LIP의 개시코돈 ATG는 아르기닌을 암호화하는 코돈으로 치환된다. 실시예에서 보여지듯이, g6 유방암 세포가 이러한 치환을 포함하는 벡터로 형질전환 되어 누드 마우스로 도입되었을 때, 누드 마우스는 대조구와 비교하여 암형성 능력이 상실되었다.
본 발명의 재조합 유전자 벡터는 상기한 돌연변이가 도입된 C/EBPβ유전자의 부분 또는 전체를 포함하는 벡터이다. 본 발명의 재조합 유전자 벡터는 돌연변이가 도입된 뉴클레오티드 서열을 가지는 C/EBPβ유전자를 리가아제 등을 통해 적당한 벡터의 프로모터 하위에 도입함으로써 작제된다. 유전자 서열에 돌연변이를 도입하는 기술과 재조합 벡터를 작제하는 기술은 당업계에 숙련된 자라면 자명할 것이다.
몇몇의 실시예에서, 재조합 유전자 벡터가 세포내로 도입될 때, 그것은 또한 세포내의 유전자 산물로서 LAP의 부분 또는 전부를 발현할 수 있는 발현벡터이다. 몇몇의 실시예에서, LAP의 부분 또는 전부는 적어도 하나의 LAP 활성을 가진다. 에피몰핀은 C/EBPβ의 발현을 증가시킨다고 알려져 있다(참조: Hirai et al., 2001, J. of Cell Biol., Vol. 153:785-794). 그러므로, 본 발명의 몇몇 실시예에서는, 본 발명의 재조합 유전자 벡터와 함께, 특히 적어도 하나의 LAP 활성을 가지는 LAP 유전자 산물의 일부 또는 전부를 발현하는 재조합벡터와 함께, 에피몰핀의 부분 또는 전부를 암호화하는 핵산 또한 세포내로 도입된다. 이러한 단백질이나 에피몰핀 활성을 가지는 펩티드의 예는 완전한 에피몰핀(즉 전체 길이 단백질), 에피몰핀의 활성을 가지며 부분적인 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 및 거기서 변용된 펩티드를 포함한다. 에피몰핀과 부분적인 펩티드는 유럽특허 제 0698666호, 미국특허 제 5,726,298 호, 미국특허 제 5,837,239 호 및 국제특허공개 제 WO98/22505호와 WO01/94382 호에 상세히 개시되어 있고, 이러한 에피몰핀과 기재된 부분 펩티드는 또한 사용될 수 있다. 에피몰핀을 암호화하는 핵산은 본 발명의 재조합 벡터 도입 전, 후 또는 동시에 세포로 도입되고, 동일한 재조합 벡터나 다른 벡터에 있을 수 있다.
상술하였듯이, 본 발명은 LIP의 개시코돈 ATG가 다른 코돈(TTG는 아님)으로 치환되어 본 발명의 재조합 벡터로 통합된 C/EBPβ유전자를 제공한다. 본 발명은, 본 발명의 재조합 벡터를 숙주세포로 도입하는 방법을 포함한다. 몇몇의 실시태양에서는, 벡터는 재조합 바이러스 벡터이고 숙주세포는 전기 벡터와 함께 감염된다. 그러므로, 본 발명은 세포로의 유전자 도입과 세포내에서 유전자 발현이 벡터로 세포를 감염시킴으로서 수행되는 특성을 가진 본 발명의 재조합 벡터를 포함한다. 예를 들어 본 발명의 재조합 벡터 같은, 유전자 작제물의 세포로의 도입은, 칼슘 포스페이트-매개 형질전환, 일렉트로포레이션, 지질-매개 형질전환, 네이키드 DNA 통합, 일렉트로트랜스퍼 및 바이러스(DNA 바이러스와 레트로바이러스-매개)형질전환 등의 당업계의 어떤 기술을 통해서도 수행될 수 있다. 세포로의 유전자 도입을 수행하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
II. 바이러스 벡터
동물용, 즉 사람 같은 포유류를 위한 발현벡터가 사용될 수 있다. 몇몇의 실시예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 선행발명에 사용된 벡터의 예는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 배큘로바이러스(baculovirus) 벡터 및 백시니아바이러스(vaccinia virus)같은 바이러스 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터들 중, 레트로바이러스를 사용하는 것이 특히 바람직한데, 세포가 레트로바이러스 벡터에 감염된 이후 바이러스 게놈은 숙주 염색체에 통합되고 벡터는 통합된 외래 유전자가 오랜 기간동안 안정적으로 발현되게 해주기 때문이다. 레트로바이러스 재조합 벡터의 작제와 시험관내 또는 생체내에서의 사용은, 다양한 문헌에서 기재되어 왔다(참조: Breakfield et al.,New Biologist3, (1991) 203; EP 453242, EP 178220, Bernstein et al. Genet. Eng., 7 (1985) 235; McCormick,BioTechnology 3,(1985) 689). 복제능력없는 레트로바이러스에 의한 표지 유전자 전달 방법론은 잘 확립되어 있다(참조: Correll, et al., (1989)PNAS,86:8912; Bordignon (1989),PNAS,86:6748-52; Culver, K. (1990),PNAS,88:3155; 및, Rill, D.R. (1991)Blood79(10):2694-700).
아데노바이러스는 고효율의 형질전환을 할 수 있고 또 그것을 위해 세포를 증식시킬 필요가 없다는 장점이 있다. 아데노바이러스와 아데노바이러스 벡터 시스템의 개발에 관한 일반적인 다양하게 개시되어 있다(참조: Graham et al. (1973)Virology,52:456-467; Takiff et al. (1981)Lancet, 11:832-834; Berkner et al. (1983)Nucleic Acid Research,11:6003-6020; Graham (1984)EMBO J.,3:2917-2922; Bett et al. (1993)J. Virology,67:5911-5921; 및, Bett et al. (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA,91:8802-8806. 아데노바이러스 벡터는 시험관내에서 유전자의 클로닝과 발현을 위해(Gluzman et al., Cold Spring Harbor, N.Y. 11724, p. 187), 형질전환동물을 생산하기 위해(국제특허공개 제 WO95/22616호), 생체외(ex vivo) 세포에 유전자를 전달하기 위해(국제특허공개 제 WO95/14785호;제 WO95/06120호) 또는 생체내 세포에 유전자를 전달하기 위해 (국제특허공개 제 WO93/19191호, 제 WO94/24297호 및 제 WO94/08026호)사용되어 왔다.
아데노-연관 바이러스(AAV)는, 대략 5kb길이의 단일 선형 DNA가닥을 가지고 복제를 위해선 보조 바이러스(아데노바이러스 등)가 필요한 바이러스인 파보바이러스(parvovirus)이다(참조: B.J. Carter, in "Handbook of Parvoviruses" ed., P. Tijsser, CRC Press, pp.155-168). 생체내와 시험관내 유전자 전달을 위한 AAV에서 유래된 벡터의 사용은 문헌에 기재되어 왔다(참조: 국제특허공개 제 WO91/18088호; 제 WO93/09239호; 미국특허 제 4,797,368호, 제 5,139,941호, 및 유럽특허 제 488,528호). 아데노-연관 바이러스는, 바이러스 게놈의 양쪽 말단에 존재하고 T 형태의 헤어핀(hairpin) 구조를 가지는 ITR(역 말단 반복 서열)을 통해, 숙주세포 염색체의 특정위치로 통합된다라고 알려져 왔다. 바이러스 단백질에 관하여, 게놈의 좌측 반은 비구조성 단백질(조절 단백질)인 렙(Rep)을 암호화하는 반면, 게놈의 우측 반은 구조성 단백질인 캡시드 단백질 캡(Cap)을 암호화한다. AAV 벡터는 양 말단에 ITR을 포함하고, 그 사이에 관심있는 유전자나 그것을 포함하는 핵산를 삽입하여 가지는 플라스미드(AAV 벡터 플라스미드)를 포함하도록 생산되었다. 바이러스 복제나 바이러스 입자형성에 필요한 바이러스 단백질은 다른 보조 플라스미드로부터 공급된다. 전기 플라스미드 모두 HEK293 세포에 형질도입된 후, 아데노바이러스(보조 바이러스)로 감염시켜서, 비증식성 재조합 AAV(AAV 벡터)를 생산한다. 대신, 숙주세포가 보조 바이러스 기능을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 이러한 AAV 벡터는 핵내에 존재함으로서, 세포의 동결-해동과 수집후의 아데노바이러스오염은 가열에 의해 비활성화되거나, CsCl 구배에 의해서 AAV로부터 제거된다. 또한 벡터는 CsCl 밀도-구배 원심 분리 방법에 의해 정제된다.
배큘로바이러스(baculovirus)는 포유류 세포에서 단백질 발현에 사용되어 왔다(참조: 미국특허 제 5,731,182호). 배큘로바이러스의 게놈은, 리간드 삽입에 의해 변형될 수 있는데, 배큘로바이러스가 포유류 세포에 결합하여 들어갈수 있도록 특정 수용체 단백질을 암호화하는 유전자를 포함한다.
백시니아 바이러스는 미국특허 제 6,103,244호에 기술되어 있다. 외래 유전자를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스의 작제는 기술되어 왔다(참조: Panicali & Paoletti, 1982,Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A., 79:4927-4931 & Mackett et al., 1982,Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A., 79:7415-7419; 및 미국특허 제 4,769,330호).
레트로바이러스 벡터가 사용될 때, 그 예는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(moloney murine leukemia virus: MoMLV)와 같이 온코바이러스(oncovirus)에서 유래된 것들과 사람 면역결핍 바이러스(HIV)와 같이 렌티바이러스(lentivirus)에서 유래된 것들을 포함한다.
보편적으로 사용되는 레트로바이러스 벡터는 RNA 바이러스인 MoMLV의 구조를 이용하는 것이고, 다양한 숙주 범위를 가지며, 유전자 도입에 상대적으로 높은 효율을 가진다. 레트로바이러스 벡터의 제조방법은 당업계에서 자명하다. 그 제조방법을 요약하자면, 먼저 LTR(긴 말단 반복 서열)의 개그(gag), 폴(pol) 및 엔브(env) 대부분이 바이러스 게놈에서 삭제되고, 그것들 대신에 관심있는 유전자가 삽입된다. 이 벡터 플라스미드가 유전자 산물, 바이러스 단백질(gag, pol 및 env)의 발현을 위해 개그 폴 및 엔브의 핵산을 포함하는 군집의 세포주으로 도입될 때, 유전자 산물(레트로바이러스 벡터)을 발현하는 재조합 레트로바이러스가 배양 상층액에 생산된다. 대체로, 높은 타이터의 레트로바이러스 벡터를 생산하는 세포주가 클로닝되고 그 세포주가 오랜 기간 사용된다. 표적세포는 일반적으로 상술한 바이러스 벡터를 생산하는 세포의 배양 상층액을 이용하여 감염된다.
아데노바이러스는 대략 36kb 길이의 선형 이중 가닥 DNA를 가진 바이러스이다. 아데노바이러스 벡터를 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있고 다음과 같이 요약할 수 있다. 몇몇의 실시예에서, 필수적인 E1 기능의 부분 또는 전부가 없는 아데노바이러스와 같은 복제 능력이 없는 아데노바이러스가 사용된다. 아데노바이러스 벡터의 제조방법은 이하 간단히 기술한다. 요약하자면, 아데노바이러스에서 E1유전자가 제거되고, 그 부위에 삽입될 관심 있는 유전자를 가진 코스미드(cosmid)가 작제된다. 전기 코스미드는 E1유전자 부위가 삭제된 모 바이러스 DNA(말단 단백질이 부착된 것을 이용)와 함께 HEK293 세포에 도입된다. 그후, 세포내에서 동형재조합이 일어나 비증식성 아데노바이러스 벡터를 생산한다. 이러한 바이러스 벡터들은 세포의 동결-해동을 통해 수집되며 CsCl 밀도-구배 원심분리 기법을 통해 정제된다. 아데노바이러스 벡터의 특징은 높은 타이터의 벡터를 생산할 수 있다는 것, 다양한 범위의 세포에 효과적으로 도입될 수 있다는 것 및, 비분열 세포에 도입될 수 있다는 것이다. 유전자가 암세포로 도입될 때, 미량의 독성은 문제가 되지 않는다(참조: Horowitz J. 1999,Curr. Opin. Mol. Ther.,4:500-509). 또한, 순간적인 유전자 발현이 치료효과를 성취할 수 있다는 실례들이 있고, 따라서, 아데노바이러스 벡터는 암의 유전자 치료에 특별히 적합하다.
동물세포가 숙주로 사용되므로, SV40에서 유래된 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터 또는 β액틴 프로모터가 사용될 수 있다. 또한, 필요하면 인핸서가 사용될 수 있다. 세포나 조직 특이적인 발현은 세포-특이적 인핸서 및/또는 프로모터 사용에 의해 이루어질 수 있다(참조: Huber et al. (1995)Adv. Drug Delivery Reviews,17:279-292). 본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 발현벡터는, 벡터가 종양세포를 표적으로 삼기 위해 종양-표지 단백질이나 종양에서 발현이 증가한 다른 요소의 하나 또는 그 이상의 프로모터 및/또는 인핸서를 포함할 수 있다. 예를 들어, ErbB2 프로모터는, 포유류 종양세포에서 발현이 늘어나므로, 본 발명의 재조합 벡터가 포유류 종양세포를 표적으로 삼는 데에 사용될 수 있다.
동물에서의 발현을 위한 플라스미드의 숙주로서, 대장균(Escherichia coli)K12HB101 균주, DH5a 균주 또는 유사한 것들이 사용될 수 있다. 이러한 균주들은 공용 재원에서 입수할 수 있다.E. coli를 형질전환하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 바이러스 벡터의 숙주로서, 바이러스를 생산할 수 있는 동물세포, COS-7 세포, CHO 세포, BALB/3T3 세포 및 HeLa 세포 등이 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는 복제 가능하거나 불가능할 수 있다. 복제-불가능한 바이러스 벡터는 적합한 보조 세포주에서 배양되는데, 이러한 세포주는 복제에 필요한 바이러스 기능들을 암호화하는 핵산을 포함한다. 레트로바이러스 벡터의 숙주로서, ψCRE,ψCRIP, MLV 또는 그와 유사한 것들이 사용될 수 있다. 아데노바이러스와 아데노-연관 바이러스 벡터의 숙주로서, 사람 배발생 단계의 신장에서 유래한 HEK293 세포나 그와 유사한 것들이 사용될 수 있다. 동물세포로의 바이러스 벡터의 도입은 칼슘 포스페이트 방법이나 당업계에 자명한 다른 방법에 의해 수행될 수 있다.
수득된 형질전환체들은 재조합 벡터를 생산하기 위해 다음과 같이 배양된다.
E. coli형질전환체의 배양은 탄소원, 질소원, 무기기질 및 다른 필수 생장요소 등을 포함하는 pH 5에서 8사이의 액체배지를 이용해 수행될 수 있다. 배양은 대체로15 에서 43℃ 사이에서 약 8 에서 24 시간동안 수행된다. 배양 후에, 본 발명의 재조합 유전자 벡터를 종래의 DNA 분리 및 정제방법을 사용해 수득할 수 있다.
동물세포 형질전환체의 배양은 199 배지, MEM 배지 및 DMEM 배지 등을 사용해 수행될 수 있는데, 이러한 배지들은 약 5 에서 20% 소태아혈청(fetal bovine serum) 을 포함한다. 배지의 바람직한 pH 값은 대략 6 에서 8 사이이다. 배양은 대체로 30 에서 40℃ 사이에서 대략 18 에서 60 시간 동안 수행된다. 본 발명의 재조합 유전자 벡터를 포함하는 바이러스 입자들은 배양 상층액으로 분비된다. 바이러스 입자의 농축과 정제는 당업계의 자명한 방법, 즉 CsCl 원심분리법, 폴리에틸렌글리콜 침전법 및 필터 농도법 등으로 수행되어, 본 발명의 재조합 유전자 벡터를 수득한다.
III. LIP의 조절
본발명은 숙주세포의 LIP전사 및/또는 번역을 감소시키고, 줄이며, 억제하는 조성물과 방법을 제공한다. 이러한 조성물은 안티센스 핵산, 올리고뉴클레오티드 등을 포함하는데, 그것은 숙주세포의 LIP전사를 감소시키고, 줄이며, 억제할 수 있는 올리고뉴클레오티드 미끼(decoy), 라이보자임(ribozyme) 및 간섭 RNA(iRNA) 등이다. 따라서, 본 발명은, 세포를 숙주세포의 LIP전사 및/또는 번역을 감소시키고 억제할 수 있는 안티센스 핵산, 올리고뉴클레오티드, 라이보자임 및/또는 iRNA 등에 접촉시켜, 세포의 LIP전사 및/또는 번역을 감소시키고 억제하는 방법을 제공한다. LIP의 전사와 번역은 PCR과 노던 블롯 등의 당업계에 자명한 방법들을 통해 측정될 수 있다.
본 발명은, C/EBPβ유전자나 그 상보적인 서열에서 약 10에서 100뉴클레오티드 길이의 LIP 개시코돈 ATG의 주변 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 몇몇의 실시예에서, 올리고뉴클레오티드는 세포에서 LIP기능을 줄이고, 감소시키거나 억제한다.
몇몇의 실시예에서, 올리고뉴클레오티드는 약 10에서 50뉴클레오티드길이를 가지며, 다른 실시예에서는 15에서 50, 다른 실시예에서는 20에서 80, 다른 실시예에서는 15에서 40, 다른 실시예에서는 15에서 30, 다른 실시예에서는 15에서 25 뉴클레오티드 길이를 가진다. 다른 실시예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 길이나 적어도 20 뉴클레오티드 길이이다. 다른 실시예에서, 올리고뉴클레오티드는 약 30, 40, 50, 60, 70, 또는 80뉴클레오티드 길이이다. LIP의 ATG 개시코돈의 주변 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 LIP발현을 줄이고, 감소시키거나 억제하는 데에 사용된다. 또한, 전기 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드는 LIP발현을 줄이고, 감소시키거나 억제하기 위해 안티센스 올리고뉴클레오티드로 사용된다. 예를 들어, 서열번호 1의 427번째 G부터 489번째 C까지의 서열(63염기)이나 그것의 상보적 서열을 포함하는 핵산 및, 서열번호 3의 565번째 G부터 627번째까지의 서열(63염기)이나 그것의 상보적 서열을 포함하는 핵산 등은 올리고뉴클레오티드 미끼 및/또는 안티센스 핵산이 설계될 수 있는 부위이다. 올리고뉴클레오티드(DNA 또는 RNA), 올리고뉴클레오티드 미끼나 안티센스 핵산으로서, 세포의 발현수준을 줄이거나 감소시키기 위해 벡터에 삽입되어 세포에 형질도입된다. 이론에 얽매이지 않고, LIP의 프로모터 또는 다른 것이 올리고뉴클레오티드에 결합한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 단독으로, 또는 본 발명의 재조합 벡터와 함께, 또는 다른 치료와 함께 사용될 수 있다.
상술한 두가지 경우에, LIP의 발현이 줄어들고, 감소하거나 억제되고, 결과적으로 C/EBPβ유전자에서 발현되는 LIP에 대한 LAP의 발현수준의 비율이 증가한다. 본 발명의 실시예에서 기술되었듯이, 암의 생체내 모델에서 LIP 발현의 감소, 결과적인 LIP에 대한 LAP 발현 비율의 증가는 대조구에 비해 암 형성과 전이를 감소시키는 결과를 가져온다. 그러므로, LIP의 발현을 줄이거나, 감소시키거나, 억제할 수 있는 올리고뉴클레오티드나 안티센스 핵산 또는iRNA의 세포로의 투여나 도입은, 암 형성 및/또는 전이 및 종양성장을 느리게 하는 등의 증상완화와 밀접한 관련이 있다.
iRNA는 억제될 유전자에 동형인 이중가닥의 RNA에 의한 서열특이적, 전사후 유전자 발현억제(post-transcriptional gene silencing) 메커니즘이다(참조: Sharp, P., 2001, Genes & Development, 15:485-490). mRNA와 그 상보적 가닥으로 이루어진 이중가닥 RNA는 RNA-RNA듀플렉스를 형성한다. 이 듀플렉스 부위는 RNAse III같은 효소에 의해서 분해되고 mRNA는 번역될 수 없다. 세포내로 도입되었을 때, 짧은 이중가닥 RNA(small interfering RNA 또는 siRNA)는 그 서열을 포함하는 mRNA를 분해하는 데에 또한 효과적이다. 이론과 상관없이, 여러 증거들은, 바이러스나 트랜스포존 RNA의 침입에 대항하기 위해, 이중가닥 RNA에 의해 촉진되는 세포 RNA 분해 시스템이 세포내에 존재한다는 것을 제안한다. 본 발명은 LIP의 개시코돈 ATG 주변의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 iRNA 서열을 포함하고 그것은 LIP발현을 줄이거나 감소 및/또는 억제할 수 있다. 몇몇 실시예에서, iRNA는 LIP의 개시 ATG를 표적으로 삼도록 설계되는데, 서열번호 1 뉴클레오티드 서열의 457에서 459; 서열번호 3 뉴클레오티드 서열의 595에서 597에 해당된다. iRNA를 설계하는 수단은 당업계에 자명하다. 본 발명의 iRNA는 단독으로 또는 본 발명의 재조합 벡터 및/또는 LAP활성을 가지는 돌연변이 LAP 폴리펩티드 및/또는 다른 치료와 함께 사용될 수 있다.
대안으로, 본 발명은 LIP전사를 줄이고, 감소시키고/감소시키거나 멈추게 하거나, 억제하는 라이보자임의 사용을 포함하고 몇몇의 실시예에서는 LAP 발현에 영향을 끼치지 않는다. LIP를 줄이고, 감소시키거나 억제할 수 있는 라이보자임은단독으로 또는 본 발명의 재조합 벡터 및/또는 LAP활성을 가지는 돌연변이 LAP 폴리펩티드 및/또는 다른 치료와 함께 사용될 수 있다.
LIP발현을 줄이고, 감소시키고/거나 억제할 수 있는 특정한 올리고뉴클레오티드, 안티센스 핵산 및 iRNA를 선별하는 동정법은 당업계에 알려져 있고 본 명세서에 기술되어 있다. 실시예에서 개시된 동정법은 간단히, g6 유방암 세포주가, 본 발명의 재조합 벡터, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 iRNA와 같은 테스트 샘플들에 접촉되고 조직학적으로 형태와 세포부착이 검사된다. LIP발현을 줄이고, 감소시키고/감소시키거나 억제할 수 있는 재조합 벡터, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 핵산 및 iRNA에 접촉된 세포에서, 형태는 정상적인 비암세포와 유사할 것이다. 또한 이러한 세포들은 누드 마우스에 도입될 수 있고 암 형성능력과 전이가 동정될 수 있다. LIP의 개시코돈 ATG 주변의 핵산을 포함하는 C/EBPβ유전자의 부분이나 전부의 뉴클레오티드 서열, 그리고 전기 LIP의 ATG에 돌연변이를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터 같은 재조합 벡터가 대조구로 사용될 수 있다. 본 실시예에 기술된 재조합 벡터는 선별동정에서 대조구로 사용될 수 있다.
IV. 조성물과 사용
조성물
본 발명은 재조합 백터, 재조합 바이러스 벡터 또는 바이러스 입자, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 RNA 또는 iRNA 조성물을 포함한다. 몇몇의 실시예에서, 조성물은 약학적으로 사용가능한 첨가제나 담체 또는 완충액을 추가로 포함할 수 있다.
몇몇의 실시예에서, 이러한 조성물은, 암이나 종양성장 같은 질병이나 세포 또는 개체의 LIP에 대한 LAP의 비율과 연관된 상태의 증상을 치료 및/또는 개선하기 위한 방법에 사용된다. 몇몇의 실시예에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 암억제 활성을 보여준다. 여기서 사용되었듯이, "치료(treating 또는 treatment)"란 단어는 암같이 하나 또는 그 이상의 질병이나 바람직하지 않은 상태에 의한 증상을 개선, 호전, 절감 또는 안정시키는 것, 마찬가지로 질병이나 바람직하지 않은 상태의 하나 또는 그 이상의 증상의 진행을 지연시키는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물은, 당업계에 알려진 화학치료에 국한되지 않는 방사선 요법 및/또는 면역요법과 같은 다른 치료양식과 같이 사용될 수 도 있고 사용되지 않을 수도 있다. 몇몇 실시예에서, 본 발명의 조성물은 에피몰핀의 일부나 전부와 같이 투여된다.
여기서 사용된, "악성(malignant)", "악성세포(malignant cell)", "종양(tumor)", "종양세포(tumor cell)","암(cancer)" 및 "암세포(cancer cell)" 등의 단어들(서로 혼용 가능한)은, 상대적으로 자발적인 생장을 해서, 세포증식 조절의 상당한 결핍으로 특징지어지는 비정상적인 생장 표현형을 보이는 세포를 의미한다. "종양(tumor)"이란 단어는 비전이성 종양과 전이성 종양을 포함한다.
여기서 사용된 "암분해 활성(oncolytic activity)"은 종양 및/또는 악성 및/또는 암세포 생장의 억제; 종양 및/또는 악성 및/또는 암세포 생장의 퇴화; 종양 및/또는 악성 및/또는 암세포 생장의 세포괴사 또는 추가적인 종양 및/또는 악성 및/또는 암세포 형성의 방지를 의미한다. 여기서 사용된 "종양생장을 방해하거나 억제하는 것"은 조성물을 포함하는 VSV투여 또는 본 발명의 방법에 의해, 종양생장 속도를 줄임, 종양생장을 완전히 멈춤, 기존의 종양크기의 퇴보를 유발시킴, 기존의 종양을 제거 및/또는 추가적인 종양의 발생을 방지한다는 것을 의미한다. 종양생장을 "억제(suppressing)"한다는 것은 본 발명의 조성물과 접촉없는 생장과 비교하여 감축된 생장상태를 의미한다. 종양세포 생장은 종양크기 측정,3H-thymidine incorporation assay를 이용한 종양세포 증식 유무 결정 또는 종양세포의 개수 측정과 같은, 그렇지만 여기에만 국한되지 않는, 당업계의 어떤 방법으로도 측정될 수 있다. 종양 및/또는 악성 및/또는 암세포 생장의 억제; 종양 및/또는 악성 및/또는 암세포 생장의 "억제"는 다음 상태 중 어떤것 또는 모든 것을 의미한다: 종양생장의 지체, 지연, 중단과 종양 축소. 종양 및/또는 악성 및/또는 암세포의 지연된 발달은 질병의 발달을 지연, 방해, 늦춤, 지체, 안정화, 및/또는 연기시킨다는 것을 의미한다. 이러한 지연은 병력 및/또는 치료된 개인에 따라 시간의 길이가 다양할 수 있다.
본 발명은, LIP 발현, 특히 여기 기술된 악성세포 및/또는 종양세포에 연관된 LIP 발현을 줄이거나 감소 및/또는 억제할 수 있는 본 발명의 재조합 벡터나 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 핵산이나 iRNA를 이용하여 LIP에 대한 LAP비율을 증가시키는 조성물과 방법을 포함한다. 치료를 위한 개체는 암, 종양 또는 악성세포가 발달할 위험성이 있다고 여겨지는 개체들, 이를테면 과거 암, 종양 또는 악성세포를 포함하는 병력이 있는 개체들이나 그러한 암, 종양 또는 악성세포 병력의 가족, 친지가 있는 개체들이다. 발명의 조성물을 투여하는 적합성 결정은 세포, 조직 또는 종양 생체검사에서의 혈액검사 및 조직검사 등의 측정가능한 임상의 매개변수에 의존할 것이다. 일반적으로, 약학적으로 사용가능한 첨가제내의 조성물이 투여된다.
따라서, 본 발명은 암 또는 종양 생장을 억제하는 방법을 제공하는데, 암 또는 종양 세포를, 본발명의 재조합 벡터나 돌연변이 LAP 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 핵산이나 iRNA같은 핵산 작제물에 접촉시켜서, 종양이나 세포의 LIP에 대한 LAP를 증가시키는 단계를 포함한다.
다른 실시예에서, 이러한 조성물은 숙주세포에서 LIP에 대한 LAP의 비율을 변화시키는 약물을 선별하는 방법에 사용된다. 몇몇 실시예에서 선별방법은 숙주세포내의 LIP 발현을 줄이고, 감소시키거나 억제하는 약물을 동정하기 위해 사용된다. 다른 실시예에서, 선별방법은 숙주세포내의 LAP 발현이나 생물학적 활성을 증가시키는 약물을 동정하기 위해 사용된다. 다른 실시예에서, 약물, 재조합 벡터 또는 핵산 작제물은, 여기서 개시된 선별 동정법에서 측정되었듯이, 암억제 활성을 가진다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 암세포, 악성세포 또는 종양세포가 본 발명의 조성물에 의한 치료에 민감한지 결정하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 (a) 암세포, 악성세포 또는 종양세포을 포함한 샘플을 첫번째 부분과 두번째 부분으로 나눔; (b) 첫번째 부분을, LIP의 개시코돈 ATG 주변의 부위를 지니고, 전기 LIP의 개시코돈 ATG의 돌연변이를 지니거나, LIP발현을 감소시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드, 안티센스 핵산, 또는 iRNA, 또는 본 명세서에 개시된 선별방법에 의해 동정된 약물을 포함하는 C/EBPβ유전자 일부 또는 전부의 뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터나 재조합 벡터 같은 조성물으로 치료; 및, (c) 첫번째 부분에서 죽은 세포의 비율이 두번째 부분보다 높은지를 결정하는 단계를 포함하는 데, 그 비율이 높으면 암, 악성세포 또는 종양은 조성물의 치료에 민감하다.
몇몇 실시예에서, 본 발명은 또한 유전자 치료의 약물, 즉 세포로 투여되거나 전달될 수 있는 약물에 관한 것인데, 약물은 LIP의 개시코돈 ATG가 TTG가 아닌 다른 코돈으로 치환된 C/EBPβ유전자 일부 또는 전부의 뉴클레오티드 서열 또는 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 안티센스 핵산, iRNA를 포함하는 재조합 유전자 벡터를 포함한다. 이러한 조성물은 종양 생장의 억제나 지연과 같은 암 증상의 치료 및/또는 개선에 사용될 수 있다. 몇몇의 실시예에서, 이런 약물은 종양세포나 악성세포 근처와 먼 부위 또는 다른 경로를 통해 투여 되었을 때, 암 억제 활성을 가질 것이다. 몇몇의 실시예에서, 본 발명의 재조합 벡터, 돌연변이 LAP 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드, 안티센스 핵산 또는 iRNA와 같은 핵산 작제물의 투여는, 치료후에 치료된 세포를 개체로 복귀시키는 ex vivo로 수행된다.
치료될 암의 예는 악성 흑색종, 악성 림프종, 소화기관암, 폐암, 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 결장암, 요도 종양, 담낭암, 담관암, 담도암, 유방암, 간암, 췌장암, 고환암, 상악암, 설암, 순암, 구강암, 인두암, 후두암, 난소암, 자궁암,전립선암, 갑상선암, 뇌종양, 카포시육종, 혈관종, 백혈병, 진성다혈증, 신경아세포종, 망막아세포종, 골수종, 방광암, 육종, 골육종, 근육암, 피부암, 기저세포암, 피부부속기암, 피부전이암, 피부흑색종 등을 포함하지만, 여기에만 국한된 것은 아니다. 치료될 암의 바람직한 실시예는 유방암과 간암을 포함한다.
본 발명의 방법에서 사용을 위한 조성물은 바이러스 벡터(또는 올리고뉴클레오티드, 안티센스 핵산 또는 iRNA)와 같은 재조합 유전자 벡터들을 주약과 함께 활성성분으로, 섞어서 준비될 수 있다.
또한, 재조합 벡터가 바이러스 벡터로 통합될 때, 재조합 DNA를 포함하는 바이러스 입자를 제조하고 그것들을 주약과 섞음으로해서 유전자 치료의 조성물, 즉 세포로의 전달 약물은 생산될 수 있다.
주입을 위해서 통상적으로 사용되는 어떤 주약이라도 유전자 치료의 약물로 사용될 수 있고, 그 예는 증류수와 NaCl 또는 NaCl과 무기염의 혼합물, 만니톨 용액, 젖당, 덱스트란, 포도당 또는 유사물, 글리신이나 아르기닌 또는 유사물의 아미노산 용액, 유기산 용액 또는 염용액과 포도당 요액의 혼합물 등과 같은 염용액을 포함한다. 아니면, 이러한 주약에 첨가해서, 당업계의 숙련된 자라면 알 수 있는 방법에 따라, 주입은, 삼투조절기, pH조절기, 식물성 유분 또는 계면 활성제 등의 어쥬번트를 이용하여 용액, 현탁액 또는 소산액(dispersion) 등으로 준비될 수 있다. 이러한 주입은 또한 사용전의 형태를 만들기 위해 분말화와 동결건조 등의 조작에 의해 준비될 수 있다. 또한 본 발명의 약물은, 투여전에 필요하다면 리포좀 또는 다른 것들의 캡슐로 존재할수 있고 암 증상의 치료 및/또는 개선에 사용될수 있다.
본 발명의 조성물을 생물개체에 도입하는 방법으로, 다음의 방법들이 알려져 있다: 유전자의 화학적 또는 물리적 도입법(transfection); 및, 바이러스를 이용한 방법(transduction).
유전자의 생물 개체로의 물리적 도입(transfection)의 실시예는 생체내 일렉트로포레이션과 진 건(gene gun)방법을 포함한다. 생체내 일렉트로포레이션은 생체 조직에 직접 전압 펄스를 적용해서 DNA를 도입하는 방법이다. DNA는 적당한 완충 용액(예를 들어, 1mM Tris, 25μM EDTA, 150mM NaCl) 에 용해되고, 그 용액은 유리 전극(glass electrode)을 이용하여 조직으로 주입된다. 진 건 방법에서는 금입자에 부착된 DNA가 가속되어 세포내로 도입된다. 대기압하에서, 바이오래드에 의해 개발된 손에 들고 쓰는 헬리오스 건(Helios gun)은 생체내 방법으로서, 높은 효울로 손쉽게 유전자가 직접 개체로 도입되게 한다(참조: Kuo C. F. et al. 2002,Methods of Mol. Med.,69:137-147). 진 건 방법은 엔도좀과 같은 분해 시스템에 의한 효과가 없다는 점, 어떤 종류의 조직이라도 도입될 수 있다는 점, 및 특정위치로 도입될 수 있다는 장점을 가진다.
생물 개체에 유전자를 화학적으로 도입하는 실시예는 리포좀 방법, 막 융합 단백질-리포좀 방법 및 리포펙션(lipofection)을 포함한다(참조: Nidome T and Huang L, 2002,Gene Ther.,24: 1647-1652).
리포좀은 수용액에서 인지질 같은 극성지질에 의해 형성된 소낭이다. 리포좀을 형성하는데 있어서, 리포좀으로 통합된 유전자는 막에 있게 된다. 또한, 미사일 치료를 수행하는 것이 가능한데, 특정 단백질이 리포좀에 화학적으로 결합하여 목적 세포에 집중하게 하는데, 그것이 목적 세포로의 표적 수송이다.
막 융합 단백질-리포좀 방법에서, 다양한 바이러스가 세포로 들어가는 통로수단인 바이러스의 외피가 리포좀에 부착된다. 예를 들어, 중성환경에서 높은 융합능력을 가지고 세포융합에 의해서 다핵세포를 생산하는 센다이 바이러스의 막 융합 단백질이 사용될 수 있다.
리포펙션 방법은 양전하를 띤 지질을 사용하는 방법이다. 양전하를 띤 지질은 도입된 유전자의 음전하는 중화시키고, 동시에 원형질막 표면의 음전하를 중화시켜, 지질의 소수성 때문에 막에 융합 할수 있으므로, DNA를 도입할 수 있다고 여겨진다. 양전하를 띤 특정한 상업적인 제품은 리포펙틴(lipofectin), 리포펙타민(lipofectamine), 및 트랜스펙탐(transfectam)을 포함한다. 이러한 양전하를 띤 지질은 리포좀 유사 구조를 가지고 있을 거라고 예상되어 지고, 도입된 유전자는 리포좀 표면에 부착된다.
트랜스덕션(transduction)은 바이러스를 사용해 생명체에 유전자를 도입하는 방법으로서, 높은 효율로서 유전자가 도입되도록 한다. 특히, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 또는 유사한 것들이 사용될 수 있다.
약학적으로 사용가능한 담체는 당업계에 잘 알려져 있고 생리식염수(saline), 완충된 생리식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 멸균된 등장 수용완충액 및 그것들의 조성물 등을 포함하지만 국한되지는 않는다. 이러한 가능한 담체의 실시예는 하나 또는 그 이상의 안정화된, 가수분해된 단백질, 락토스 등의 안정화 약물을 포함하는 물리적으로 균형잡힌 배양배지이다. 담체는 멸균되는 것이 바람직하다. 형태는 투여 방식에 적합해야 한다.
조성물은, 필요하다면, 미량의 습윤제, 유화제 또는 pH 완충제를 또한 포함할 수 있다. 조성물은 액체 용액, 현탁액, 유상액, 정제, 환약, 캡슐, 지연방출형태, 또는 분말 등일 수 있다. 경구복용 형태는 제약형태의 만니톨, 락토스, 녹말, 마그네슘 스테아르산염, 소디움 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 탄산염 등의 표준담체를 포함한다.
일반적으로, 성분들은 분리되거나 단일 유닛 복용 형태로 섞어서 공급되는데, 동결건조 분말이나 활성 약물양을 알 수 있는 앰플 또는 (사켓)sachette 과 같은 밀폐된 용기안의 방수 농축액이 그 예이다. 조성물이 주입에 의해 투여될 때, 성분들이 투여전에 혼합될 수 있도록 멸균된 희석제의 앰플이 공급될 수 있다.
조성물이나 조성물내에 사용될 약물의 정확한 투여량은 투여경로와 치료될 세포 또는 인간 같은 개체의 특징에 의존 할 것이고, 의사의 판단과 표준 임상기술에 따른 상태에 따라서 결정되어야 한다. 암 억제활성 같은 원하는 활성을 생성하기에 충분한 조성물의 최소량이 제공된다면, 주어진 처방에 샤용되는 약물의 정확한 양은 중요하지 않다. 적어도 약 10 mg에서 1mg 또는 더 많은 양의 투여량 범위가 예기된다.
본 발명의 벡터, 바이러스 입자 또는 핵산 조성물의 효과적인 복용량은, 동물 모델 시험 시스템에서 유래된 복용-반응 곡선으로부터 외삽법에 의해 추정될 수있다.
본 발명의 유전자 치료를 위한 약물의 복용량은 나이, 성별, 환자의 상태, 투여의 경로와 횟수, 약물복용 형태에 따라 다르다. 대체로, 재조합 벡터의 성인 하루 복용량은 약 1 mg/kg 에서 1000 mg/kg 범위이고, 다른 실시예에서는 약 10 mg/kg 에서 100 mg/kg 범위이다. 투여횟수는 특별히 제한되지 않는다. 바이러스로서 투여된다면, 약 102에서 107p.f.u.정도, 다른 실시예에서는 약 103에서 106p.f.u.정도, 그리고 또 다른 실시예는 약104에서 105p.f.u. 정도가 투여될 수 있다. 재조합 벡터(바이러스의 패키지가 아닌)같은 폴리뉴클레오티드 작제물로 투여된다면, 본 발명의 작제물 약 0.01㎍에서 약 100㎍ 정도가 투여될 수 있고, 다른 실시예에서는 약 0.1㎍에서 500㎍, 그리고 또 다른 실시예에서는 약 0.5㎍에서 200㎍ 정도가 투여될 수 있다. 하나 이상의 조합들이 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 몇몇의 실시예에서, 본 발명의 조성물은 에페몰핀의 부분 또는 전부와 함께 투여된다. 통상적으로 투여는 반응을 모니터링하며 주기적으로 이루어진다. 투여는 예를 들어, 종양내, 정맥내 또는 복막내에 이루어질 수 있다.
많은 방법들이 바이러스 벡터 또는 바이러스 입자와 같은 본 발명의 조성물들을, 경구, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 종양내, 피하 및 비강내 경로를 통해 개체로 투여하거나 도입하기 위해 사용될 수 있다. 조성물이 투여될 개체는 영장류 또는 다른 실시에에서 포유류, 또는 다른 실시예에서 인간이지만, 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 햄스터, 마우스 및 랫트을 포함하지만 국한되지는 않게, 인간이아닌 포유류도 될 수 있다. 본 발명의 약물의 투여형태로는, 정맥내 또는 동맥내 투여와 같은 종래 침투성의 투여가 채용될 수 있거나, 발암성의 조직장애나 전이 가능한 위치에 대항한 국소 주입 또는 경구 투여 같은 국소 투여가 채용될 수 있다. 또한 본 발명 약물의 투여를 위해, 카데터 기술, 유전자 도입기술, 외과적 기술, 또는 그와 유사한 기술을 조합한 투여형태가 채용될 수 있다.
더욱이, 에피몰핀은 C/EBPβ의 발현을 증가시키는 기능을 가진다고 알려져 있다(참조: Hirai et al., Journal of Cell Biology, Vol.153, No.4, 2001, 785-794). 그러므로, 본 발명의 유전자 치료를 위한 약물은, 에피몰핀 활성을 가진 단백질이나 펩티드와 조합하여 사용함으로서, 치료효과를 더욱 증진시킬 수 있다.
용도
LIP에 대한 LAP 발현수준 비율의 변용
LIP 발현을 줄이거나 감소시키거나 억제할 수 있거나 LAP 발현을 증가시킬 수 있는, 여기서 기술한 재조합 유전자벡터나 올리고뉴클레오티드, 안티센스 핵산 또는 iRNA를 포함한 조제한 본 발명의 조성물을 이용하여, 세포에서 발현되는 LIP 활성에 대한 LAP 활성의 발현수준 비율은 변화될 수 있다. 따라서, 본 발명은 세포에서 LIP에 대한 LAP 발현수준의 비율을 변용하는 방법을 제공하는데, 세포를 여기서 기술된 재조합 벡터나 적당한 조건하의 올리고뉴클레오티드, 안티센스 핵산 또는 iRNA로 접촉시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 또한 본 발명의 범주에 속한다. 특히, 본 발명에 따라서, 항암 활성, 암분해 활성 또는 예를 들어 본 발명 조성물의 종양 억제활성은, LIP에 대한 LAP의 발현 비율을 높이도록 변화시켜 성취될 수 있다. 즉, 암환자의 LIP에 대한 LAP발현수준의 비율을 정상인의 비율로 회복시키는 단계를 포함하여 종양생장을 억제하는 것처럼, 암과 연관된 증상을 치료 및/또는 개선시키는 방법은 본 발명의 범주에 포함된다.
항암 약물의 선별 방법
본 세포주 또는 C/EBPβ유전자에서 들다 발현되는 LIP에 대한 LAP 발현수준의 비율을 지수로 이용하여 약물을 선별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 선별방법에 의해, 암환자의 LIP에 대한 LAP 발현수준의 비정상적인 비율을 정상으로 회복시키는 물질이 선택될 수 있다. 이렇게 선택된 암환자의 LIP에 대한 LAP 발현수준의 비정상적인 비율을 정상으로 회복시키는 물질은, 예를 들어 종양 생장을 지연시키는 등의, 암 증상의 치료 및/또는 개선을 위해 유용하다.
C/EBPβ유전자에서 둘다 발현되는, LIP에 대한 LAP 발현수준의 비율은, 노던 블롯, RT-PCR 또는 웨스턴 블롯과 같은, 당업계의 숙련된 자에게 알려져 있는 종래의 방법에 의해 결정될 수 있다. 이러한 방법들에서 LIP와 LAP를 검출하기 위해 사용되는 탐침, 프라이머 또는 항체는, 본 명세서에 기술되어 있는 LAP와 LIP 아미노산 서열을 이용한, 당업계의 숙련된 자라면 알수 있는 종래의 방법에 의해 적합하게 수득하거나 제조될 수 있다.
본 발명의 선별방법에 적용되는 시험 물질은 특별히 제한되지 않고, 어떤 물질이라도 사용될 수 있다. 시험 물질은 올리고뉴클레오티드, 안티센스 핵산,iRNA, 작은 분자량의 화합물 또는 자연 생성물의 추출물에 존재하는 화합물이거나, 화합물 라이브러리, 파지 전시 라이브러리(phage display library) 또는 조합된 라이브러리일 수 있다. 몇몇의 실시예에서, 시험 물질은 작은 분자량의 화합물 및 작은 분자 화합물의 화합물 라이브러리가 선호된다. 화합물 라이브러리의 제작은 당업계의 숙련된 기술을 가진 자에게 자명하고, 상업적으로 유용한 화합물 라이브러리도 사용될 수 있다.
도 1은 g6 세포와 g6 LAP세포의 형태를 도시한다.
도 2는 돌연변이된 LAP에 의해 E-cadherin의 발현이 유도된 결과를 도시한다.
본 발명은 다음의 실시예에서 구체적으로 설명될 것이지만, 이러한 실시예에 의해서 본 발명의 범주가 제한되지 않는다.
실시예 1: 벡터의 제작
pTetT-splice(GIBCO BRL)에 랫트 LAP의 전체서열을 삽입하여 얻은 벡터(참조: Hirai et al J. Cell Biol., Vol.153, No.4, 2001, 785-794)가 주형으로 사용되었고, 다음의 프라이머(프라이머 1: GGG GGA TCC CGC CAT GGA AGT GGC CAA CTT CTA CTAC (서열번호 5); 및, 프라이머 2: ATA TGC TAG CGC GGG CGC GTC GTC CGC GCG CTT GCA (서열번호 6)) 와 LATag (TAKARA)이 사용되어 LIP부위에 결실이 생긴 LAP cDNA를 수득하였고,BamHI 과NheI 처리로 양말단에 제한효소자리가 생성되었다. pTARGET(PROMEGA)이NheI 와BamHI으로 처리되었고, 라이게이션키트(TAKARA)를 이용하여 전기 제작된 cDNA(a)를 이 벡터에 삽입하였다.
PtetLAP가 주형으로 사용되었고, 다음의 프라이머(프라이머 3: ATA TGC TAG CGG CCG GCT TCC CGT TCG CCC TGC GCG (서열번호 7); 및, 프라이머 4: ATA TGC TAG CAG TGA CCC GCC GAG GCC AGC AGC GGC (서열번호 8)) 및 LATag (TAKARA)을 이용해 LIP부위의 cDNA를 제작하였고,NheI처리를 하여 말단이NheI 제한효소 자리가 되었다.
미리E. coli에서 증식되어 정제된 전기 플라스미드(b)는NheI에 의해 절단되어, 말단은 알칼라인 포스파타아제(TAKARA BAP)에 의해 인산기가 제거된다. 타카라 라이게이션 키트를 사용하여, 전기 DNA(c)는 거기에 삽입되었다.
서열을 결정하여, 플라스미드 LAP내의 LIP번역 개시코돈 ATG가 CGC로 치환되어 있는 것을 확인하였다(돌연변이 도입의 확인).
pTet-splice 벡터(GIBCO BRL)의EcoRI 제한자리가 잘려지고 BAP으로 처리된 후에, 전기 DNA(e)로부터 절제된 돌연변이가 도입된 LAP를 포함한EcoRI 제한절편이 삽입된다(pTet-splice 돌연변이가 도입된 LAP).
실시예 2: 세포 배양과 유전자 도입
g6 세포(유방암 세포 라인)(참조: Desprez et al., 1993, Mol. Cell Differ. 1:99-110: Roskelley et al. 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 91, 12378-12382; Hirai et al., 1998, J. Cell. Biol., 140:159-169)는 생장배지(5% FBS[Hyclone], 5 ㎍/ml 인슐린 [Sigma-Aldrich], 및 50㎍/ml 젠타마이신(gentamicin)이 첨가된 DME/F12 [GIBCO BRL])에서 유지되었다. g6 세포(5 X 105)는 실시예 1에서 수득한 벡터(5mg), pTet.tTAK 벡터(Life Technologies) (5mg), 및 pSV40neo(Schmidhauser et al., 1992,Mol. Biol. Cell. 3:699-709) (0.5mg)에 의해, 생산자가 제공한 매뉴얼에 따른 리포펙타민(lipofectamin, Life Technologies)을 이용하여 형질도입되었다. 계속된 테트라사이클린 존재하에서, 네오마이신 저항성 클론이 선택되었고, 5 mg/ml의 테트라사이클린 유무에 따른 LAP의 발현이 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다. g6LAP, g6LAP' 및 g6LAP"세포주가 이 방법에 의해서 분리되었다.
실시예 3: 돌연변이가 도입된 LAP에 의한 세포의 형태적 변화
g6 세포와 g6 LAP 세포의 형태는 도 1에서 볼 수 있다. 테트라사이클린 없이 배양되었을 때, 돌연변이가 도입된 LAP의 발현에 의해 세포부착이 유도되었으며 세포는 형태적으로 정상 세포와 유사하였다.
실시예 4: 돌연변이가 도입된 LAP에 의한 E-cadherin 발현의 유도
종래의 방법에 의해 웨스턴 블롯이 수행되었다. 500 ml 의 SDS 샘플 완충액이 24-well 플레이트에서 배양된 세포에 첨가되었다. 세포들은 수집되어서 초음파 분쇄되었다. 수득한 샘플은 4 에서 20% 젤 전기영동되었고, PVDF 막에 블롯팅 된 후, 5% skim milk (TBST)를 포함한 TBS로 1시간 동안 봉쇄시킨 다음, TBST에 500배로 희석시킨 항 E-cadherin 항체(ECCD2, TAKARA)와 1시간 동안 반응시켰다. 10분동안의 TBS 세척을 두 번 실시하였다. 결과물을 TBST에 1000배로 희석시킨 항 랫트 Ig HRP 라벨(Amersham Pharmacia)과 1시간 동안 반응시켰다. 결과물은 각각 10분씩 세번 TBS로 충분히 세척되었다. 그런 후, 방사능 사진법이 ECL(Amersham Pharmacia)를 이용하여 수행되었다(참조: 도 2).
도 2에서 알 수 있듯이, 테트라사이클린이 없는 배지에서 돌연변이가 도입된 LAP(3가지의 다른 클론들, g6LAP, g6LAP' 및g6LAP" 의 발현을 유도한 결과에 의해 E-cadherin의 발현이 유도되었다.
실시예 5: 누드 마우스로의 이식
g6 세포, g6 LAP 세포, g6 LAP'세포, 및 g6 LAP"세포들은 테트라사이클린없이 배양되었고, 각 세포주의 107개의 세포들이 수집되어서 PBS에 두 번 세척하였다. 5마리의 구입한 누드 마우스(Bal b/c)를 가지고 시험하였다: 107개의 g6 세포들이 2마리 마우스의 복막내에 주입되었고, 각각 107개의 g6 LAP 세포, g6 LAP'세포 또는 g6 LAP"세포가 나머지 3마리의 마우스의 복막내에 주입되었다. 30일 후에,모든 마우스를 죽이고 개복하였다. g6 이 이식된 마우스는 눈에 띄는 암 형성과 전이가 있었다. 반면에, g6 LAP, g6 LAP', 또는 g6 LAP"이식된 마우스는 아무런 암 형성이나 전이가 없었다. 이러한 결과에 따라, 돌연변이가 도입된 모든 g6 LAP 세포, g6 LAP'세포, 및 g6 LAP"세포는 암 형성 능력이 손실되었다는 것이 증명되었다.
본 세포주 또는 C/EBPβ유전자에서 들다 발현되는 LIP에 대한 LAP 발현수준의 비율을 지수로 이용하여 약물을 선별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 선별방법에 의해, 암환자의 LIP에 대한 LAP 발현수준의 비정상적인 비율을 정상으로 회복시키는 물질이 선택될 수 있다. 이렇게 선택된 암환자의 LIP에 대한 LAP 발현수준의 비정상적인 비율을 정상으로 회복시키는 물질은, 예를 들어 종양 생장을 지연시키는 등의, 암 증상의 치료 및/또는 개선을 위해 유용하다.

Claims (38)

  1. LIP 활성의 발현이 억제되고, LIP이 LAP 활성을 감소시키지 않도록 LIP 활성의 발현이 억제되는 LAP(전사 활성인자) 활성을 암호화하는 재조합 벡터.
  2. 제 1항에 있어서,
    재조합 벡터는 CCAAT/인핸서 결합 단백질 β(C/EBPβ) 유전자의 전부 또는 일부의 염기서열을 포함하는데, C/EBPβ 유전자의 전부 또는 일부는 LIP 전사 저해 단백질의 개시코돈(ATG) 주변의 염기서열을 포함하고, 전기 염기서열은 LIP 전사 저해 단백질의 개시코돈(ATG) 주변의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는
    재조합 벡터.
  3. 제 2항에 있어서,
    전기 돌연변이는 ATG를 TTG가 아닌, 다른 아미노산을 암호화하는 코돈으로 치환하는 것을 특징으로 하는
    재조합 벡터.
  4. 제 3항에 있어서,
    전기 돌연변이는 알라닌, 글리신 및 프롤린으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 아미노산을 암호화하는 코돈으로 ATG가 치환된 것을 특징으로 하는
    재조합 벡터.
  5. 제 4항에 있어서,
    전기 아미노산은 알라닌인 것을 특징으로 하는
    재조합 벡터.
  6. 제 4항에 있어서,
    전기 아미노산은 글리신인 것을 특징으로 하는
    재조합 벡터.
  7. 제 4항에 있어서,
    전기 아미노산은 프롤린인 것을 특징으로 하는
    재조합 벡터.
  8. 제 3항에 있어서,
    전기 아미노산은 아르기닌인 것을 특징으로 하는
    재조합 벡터.
  9. 제 1항 내지 제 8항의 어느 한 항에 있어서,
    전기 재조합 벡터는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는
    재조합 벡터.
  10. 제 9항에 있어서,
    전기 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는
    재조합 벡터.
  11. 제 1항 내지 제 8항 및 제 10항의 어느 한 항에 개시된 재조합 벡터를 포함하는 항암제.
  12. 제 11항에 있어서,
    약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는
    항암제.
  13. TTG가 아닌 다른 코돈으로 LIP의 개시코돈, ATG가 치환된 것을 포함하는 LAP 폴리펩티드 변이체.
  14. 제 13항에 있어서,
    전기 치환된 코돈은 종결코돈으로 번역되지 않는 것을 특징으로 하는
    LAP 폴리펩티드 변이체.
  15. 제 13항 내지 제 14항의 어느 한 항에 개시된 LAP 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 분리된 핵산.
  16. 제 1항 내지 제 8항 및 제 10항의 어느 한 항에 개시된 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포.
  17. 제 13항 내지 제 14항의 어느 한 항에 개시된 폴리펩티드 변이체를 포함하는 숙주세포.
  18. 제 15항의 분리된 핵산을 포함하는 숙주세포.
  19. 제 10항의 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 입자.
  20. LIP(전사 저해 단백질)의 개시코돈(ATG) 주변에서 유래된 10 내지 100개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열 또는 그들의 상보적인 서열을 포함하고, LIP 발현을 감소시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드.
  21. 제 20항에 있어서,
    전기 뉴클레오티드 서열은 약 10 내지 80개의 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는
    올리고뉴클레오티드 서열.
  22. 제 20항 내지 제 21항의 어느 한 항에 있어서,
    전기 뉴클레오티드 서열은 약 10 내지 약 50개의 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는
    올리고뉴클레오티드 서열.
  23. 제 20항 내지 제 21항의 어느 한 항에 개시된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항암제.
  24. 제 23항에 있어서,
    약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는
    항암제.
  25. 적절한 조건하에, 제 1항 내지 제 8항 및 제 10항의 어느 한 항에 개시된 재조합 벡터, 제 13항 내지 제 14항의 어느 한 항에 개시된 LAP 폴리펩티드 변이체 또는 제 20항 내지 제 21항의 어느 한 항에 개시된 올리고뉴클레오티드를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 LIP(전사 저해 단백질)에 대한 LAP(전사 활성인자)의 발현수준의 비율을 변용시키는 방법.
  26. 제 25항에 있어서,
    전기 세포는 암세포인 것을 특징으로 하는
    방법.
  27. 제 26항에 있어서,
    전기 세포는 유방암 세포 또는 간암 세포인 것을 특징으로 하는
    방법.
  28. 약물을 C/EBPβ 유전자에 접촉시키고 LIP(전사 저해 단백질) 발현수준에 대한 LAP(전사 활성인자) 발현수준의 비율을 측정하는 단계를 포함하는, 약물이 C/EBPβ 유전자에서 발현된 LIP에 대한 LAP의 발현수준의 비율을 조절하는지의 여부를 선별하는 방법.
  29. 제 28항에 있어서,
    전기 약물은 저분자량의 화합물인 것을 특징으로 하는
    방법.
  30. 제 28항에 있어서,
    전기 약물은 자연계에 존재하는 물질의 추출물인 것을 특징으로 하는
    방법.
  31. 제 28항에 있어서,
    전기 비율은 노던블롯에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는
    방법.
  32. 제 28항에 있어서,
    포유동물세포는 전기 C/EBPβ 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는
    방법.
  33. 제 28항에 있어서,
    세포에서 LAP의 발현수준을 증가시키는 약물을 동정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는
    방법.
  34. 제 28항에 있어서,
    세포에서 LIP의 발현수준을 감소시키는 약물을 동정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는
    방법.
  35. 제 28항에 있어서,
    전기 비율은 PCR에 의하여 측정되는 것을 특징으로 하는
    방법.
  36. 제 1항 내지 제 8항 및 제 10항의 어느 한 항에 개시된 재조합 벡터를 사용하여 암 증상의 치료 및/또는 개선을 위한 의약을 제조하는 방법.
  37. 제 13항 내지 제 14항의 어느 한 항에 개시된 LAP 폴리펩티드 변이체를 사용하여 암 증상의 치료 및/또는 개선을 위한 의약을 제조하는 방법.
  38. 제 20항 내지 제 21항의 어느 한 항에 개시된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 암 증상의 치료 및/또는 개선을 위한 의약을 제조하는 방법.
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