KR100528727B1

KR100528727B1 - 종양 특이적이며 세포 고사를 유발하여 개선된 종양 살상효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스 및 이를 포함하는약제학적 항종양 조성물

Info

Publication number: KR100528727B1
Application number: KR10-2002-0023760A
Authority: KR
Inventors: 윤채옥; 김재성; 김주항
Original assignee: 윤채옥; 김주항
Priority date: 2002-04-30
Filing date: 2002-04-30
Publication date: 2005-11-15
Also published as: KR20030085361A

Abstract

본 발명은 개선된 종양 살상효과를 가지며 종양 특이적으로 살상 가능한 아데노바이러스 및 이를 포함하는 약제학적 항종양 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 아데노바이러스의 E1B 19 kDa 단백질 및 E1B 55 kDa 단백질의 발현이 억제되도록 E1B 19 및 E1B 55 유전자에 변이를 유발하여 종양 특이적 세포 괴사 및 고사를 동시에 유도하여 개선된 종양 특이적 세포 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스 및 이를 포함하는 약제학적 항종양 조성물에 관한 것이며, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 종양 억제 단백질인 p53 단백질의 기능이 억제된 암 세포 내에서 특이적으로 살상 가능하고 종양 세포 살상능이 크게 향상되어 종래의 재조합 아데노바이러스에 의한 종양 치료 방법의 한계를 극복할 수 있으며 더욱이 본 발명의 약제학적 조성물은 종래의 암 치료방법, 특히 세포 고사를 유도하는 암 치료 방법과 병행 이용되는 경우에는 치료 효과를 극대화 할 수 있다.

Description

종양 특이적이며 세포 고사를 유발하여 개선된 종양 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스 및 이를 포함하는 약제학적 항종양 조성물 {Tumor-Specific Replication Competent Recombinant Adenovirus with Enhanced Tumoricidal Effect Inducing Apoptosis}

본 발명은 재조합 아데노바이러스에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 종양 세포 내에서 특이적으로 증식 가능하고 개선된 종양 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스 및 이를 포함하는 약제학적 항종양 조성물에 관한 것이다.

최근 분자생물학의 발전으로 유전자 수준에서의 암을 비롯한 여러 가지 난치성 질환들의 원인이 규명되었고, 이를 질병의 치료에 응용한 유전자 치료 (gene therapy)가 새로운 치료 분야로 발전되고 있다. 예를 들어, 1990년, 레트로바이러스 시스템을 이용한 첫 유전자 치료 임상시험이 ADA (adenosine deaminase) 결핍증 환자를 대상으로 시행된 후 유전자 치료에 대한 연구가 활발해 졌으며 아데노바이러스, 아데노부속바이러스 및 리포좀과 같은 유전자 전달체를 이용한 유전자 치료가 새로운 치료분야로 각광받고 있다.

이 중 아데노바이러스는 기존의 다른 전달체 시스템에 비해 고농도로 농축될 수 있고, 유전자 전달 효율이 높으며, 완전 분열된 신경 세포에까지 전달 효과가 있는 등 여러 장점들 때문에 점차 많은 빈도로 이용 되고 있다. 그러나, 이러한 아데노바이러스는 1차 감염된 세포에서만 그 치료 효과를 보이고 생체 내에서는 원하는 만큼의 유전자 전달 효율을 나타내지 않으며, 면역체계에 의한 아데노바이러스의 비활성화 등으로 인하여 치료 효과에 한계가 있다.

한편, 종양 억제 유전자로 잘 알려진 p53 유전자가 코딩하는 p53 단백질은 (a) 세포 내의 DNA 손상이 유발되었을 경우 세포를 세포 주기 G1기에서 멈추게 하여 DNA 손상 복구 과정이 이루어지게 함으로써 암세포가 생성되지 못하도록 하며, 또한 (b) 이미 암세포가 성장한 경우에는 형질 전환된 세포가 사멸 (death)되도록 함으로써 이상 세포를 조직 내에서 스스로 제거시키는 세포 고사 (apoptosis)에 관여한다고 알려져 있다.

p53 유전자 및 이들이 위치하는 17p 염색체 상의 대립 유전자의 결실에 따른 돌연변이는 인간의 암에서 가장 빈번한 변형 (alteration)에 속한다. p53 단백질은 폐암, 난소암, 유방암, 직장암, 두경부암 등 전체 환자 종양의 50% 정도에서 비활성화되어 있음이 보고되어 있고, p53 단백질이 정상형으로 밝혀진 종양 세포 중에서도 mdm2의 과다 발현 또는 바이러스 감염 등으로 p53 단백질이 비활성화되는 경우가 빈번함은 이미 잘 알려진 사실이다 (Talis, A. L. et al. J. Biol. Chem. 273:6439-6445(1998)).

아데노바이러스의 경우에는 초기 유전자인 E1B 유전자가 코딩하는 E1B 55kDa 단백질이 p53 단백질과 결합하여 그 기능을 저해한다고 알려져 있는데, 이러한 사실을 바탕으로 1996년, McCormick 등은 아데노바이러스 초기 유전자인 E1B 55가 부분적으로 결실된 재조합 아데노바이러스 dl1520 (ONYX-015)을 개발하였다. 이와 같은 재조합 아데노바이러스는 p53 유전자가 돌연변이 되거나 결실된 종양 세포 내에서만 선택적으로 증식이 가능하여 암세포를 특이적으로 살상할 수 있음이 보고 되었다 (Bischoff, J. et. al. Science 274:373-376(1996)). 이는 기존의 복제 불능 아데노바이러스의 여러 한계를 극복할 수 있는 유전자 치료 벡터 개발에 있어 새롭고 획기적인 시도로 평가된다.

이후 아데노바이러스 벡터 개발 연구는 낮은 유전자 도입 효율의 한계를 갖는 복제 불능 재조합 아데노바이러스 대신, 복제에 있어 필수적인 E1A 유전자를 재도입하여 복제 가능 재조합 아데노바이러스를 개발하려는 방향으로 계속 이루어지고 있다. 이에 따라, 본 발명자들도 암세포를 살상 할 수 있는 복제 가능 재조합 아데노바이러스인 YKL-1 및 YKC-1을 제작하고 이를 항종양 실험에 응용하여 상당히 긍정적인 결과를 보고한 바 있다 (Lee, H. et al. Int J Cancer 88:454-463(2000)).

한편, 아데노바이러스 지놈은 약 36 kb 크기의 선형 이중가닥 DNA이며, 특히 각 말단은 역 반복 서열 (ITR)를 포함하며, 캡시드화 서열 (psi : Ψ), 초기 유전자 및 말기 유전자로 구성되어 있다. 초기 유전자는 E1, E2, E3 및 E4 영역에 포함되어 있으며, 특히 아데노바이러스의 E1 유전자는 표적 세포에 감염 후, 가장 먼저 발현되는 유전자로서 두 개의 전사단위, 즉 E1A 및 E1B로 구성되어 있다.

E1A 유전자에 의해 발현되는 단백질은 감염된 세포 내에서 세포 주기를 활발히 진행시키며 E1B 유전자 및 다른 초기 유전자들의 전사를 촉진시켜 바이러스의 복제 및 생장을 조절한다. 그러나, 아데노바이러스에 의해감염된 세포 내에서는 이를 저지시키기 위한 방어 기작으로 세포 주기의 과도 진행을 억제시키거나 세포 고사를 유발시킨다 (Shenk, T. Adenviridae: the viruses and their replication 3rd ed. New York: Lippincott-Raven 2111-2148(1996) 및 Shenk, T. et al. Adv Cancer Res 57:47-85(1991)).

한편, E1B 유전자는 E1B 19 kDa 단백질 및 E1B 55 kDa 단백질을 코딩한다. 이들 중 E1B 19 kDa 단백질은 E1A 단백질에 의해 유도되는 세포 고사를 억제하는 역할을 하며, Bcl-2와 염기 서열 및 그 기능이 유사하다 (Imazu, T. et al. Oncogene 18:4523-4529(1999)). 그리고, E1B 55 kDa 단백질은 p53 단백질과 결합하여 p53 단백질에 의해 유발되는 세포 고사 및 여러 기작을 억제하며, 아데노바이러스의 mRNA들을 세포질로 이동시켜 단백질 합성을 촉진하는 기능을 한다 (Babiss, L. et al. Mol Cell Biol 5:2552-2558(1985) 및 Leppard, K. et al. EMBO J 8:2329-2336(1989)).

최근 E1B 55 kDa 단백질이 결실된 아데노바이러스가 p53 단백질의 기능이 비활성화된 종양 세포 내에서 선택적으로 증식 가능하다는 보고들이 있었으며 (Bischoff, J. et al. Science 274:373-376(1996); 및 Heiss, C. et al. Nature Medicine 3:639-645(1997)), 현재 제 3상 임상 시험이 시행되고 있다 (Kirn, D. et al. Nature Medicine 7:781-787(2001)).

그러나, 이같이 E1B 55 유전자가 결실된 복제 가능 재조합 아데노바이러스는 p53 단백질의 기능이 저하된 종양 세포 내에서 선택적으로 증식 가능하기는 하지만, 바이러스 증식이 제한적으로 일어나 세포 살상능이 저하되고 이로 인해 항종양 효과가 현저히 떨어진다는 보고가 있었다. 이를 보안하기 위하여 임상에서는 바이러스를 반복 투여하거나 또는 투여량을 증가시키는데 이것은 바이러스에 의한 독성을 증가시키는 위험을 동반한다. 또한, 암 치료 효율을 배가시키기 위하여 시스플라틴 (cisplatin)이나 파클리탁셀 (paclitaxel)과 같이 세포 고사를 유도하는 항암제를 함께 투여하는 경우, 아데노바이러스의 E1B 19 kDa 단백질의 세포 고사 억제 기능으로 인해 항암제에 의해 유도되는 세포 고사에 의한 암 치료 효율이 오히려 상쇄될 수 있다.

그러므로, 이와 같은 문제점들을 극복하기 위하여 아데노바이러스의 종양 세포에 대한 선택적 증식을 가능하게 하면서 세포 고사를 보다 촉진시킴으로써 결과적으로 암세포의 효과적인 살상을 유도할 수 있으며, 기존의 세포 고사를 유발하는 항암제와 병용 치료 시 상승효과를 기대할 수 있는 재조합 아데노바이러스의 개발이 요구된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌 및 논문이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌 및 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

따라서, 본 발명의 목적은 종양 세포 살상 효과가 개선된 재조합 아데노바이러스를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기한 재조합 아데노바이러스를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 E1B 55 유전자 및 E1B 19 유전자의 발현이 억제되도록 E1B 55 유전자 및 E1B 19 유전자가 변이되어, 종양 세포에서만 특이적으로 증식하며 세포 괴사 및 고사를 동시에 유도하여 종양 세포 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스를 제공한다.

본 발명자들은 종래의 항종양 아데노바이러스가 갖고 있는 종양 세포 내 특이적 증식 능력을 유지하면서도 세포 고사를 유발하여, 보다 효율적으로 종양 세포를 살상할 수 있는 재조합 아데노바이러스를 개발하고자 하였다. 결국, 본 발명자들은 E1B 영역의 유전자 중 세포 고사 억제 단백질인 E1B 19 kDa 단백질과, 종양 억제 단백질인 p53 단백질과 결합하는 E1B 55 kDa 단백질을 코딩하는 E1B 19 유전자 및 E1B 55 유전자의 발현을 억제하면 상기한 목적에 적합한 재조합 아데노바이러스가 생성됨을 확인하였다.

본 명세서에서 용어 "E1B 19 kDa 유전자", "E1B 19 유전자", 혹은 "E1B 55 kDa 유전자", "E1B 55 유전자"는 모두 아데노바이러스의 E1B 19 단백질, 혹은 E1B 55 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.

본 발명에 있어서, E1B 19 유전자 및 E1B 55 유전자에서의 변이는 아데노바이러스 ElB 19 유전자 및 E1B 55 유전자의 발현이 억제되도록 하는 것이다. E1B 55 유전자의 변이로 인하여 E1B 55 kDa 단백질의 발현이 억제된 아데노바이러스는 p53 단백질의 발현이 저하된 세포에서 선택적으로 증식 가능하게 되고, 이와 더불어 E1B 19 유전자의 변이로 인하여 E1B 19 kDa 단백질의 발현이 억제된 아데노바이러스는 세포 고사 효율이 증대된다.

E1B 19 유전자 및 E1B 55 유전자에서의 변이 (mutation)는 당업계에 공지된 어떠한 변이 방법을 통해서도 이루어 질 수 있으며, 예컨대, 염기의 치환, 결실 또는 추가 등을 통해 변이를 발생시킬 수 있다. 이러한 유전자의 변이는 E1B 19 유전자 및 E1B 55 유전자의 발현을 억제 또는 완전히 제거한다.

염기를 치환하여 변이를 발생시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 무작위 변이 (random mutagenesis) 및 위치 지정 변이 (site-directed mutagenesis)에 의해 변이를 발생시킬 수 있다. 상기 무작위 변이는, 예컨대, 에러 유발 (error prone) PCR (Cadwell, R. C. and Joyce, G. F., PCR Methods Appl., 2:28-33(1992)), 포인트 돌연변이법 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989)) 등을 통하여 발생시킬 수 있고, 위치 지정 변이는 올리고뉴클레오티드- 지정 변이유발법 (oligonucleotide-directed mutagensis; Zoller M.J. et al., Nucleic Acids Res. 10:6487(1982)), 링커 변이유발법, TAB-링커 변이유발법 등을 통하여 발생시킬 수 있다. 또한, 상기 위치 지정 변이는 PCR에 의해서 고속으로 실시할 수 있다 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N. Y., (2001)).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, E1B 19 유전자 및 E1B 55 유전자에서의 변이는 염기의 결실을 통해 이루어진다. 염기의 결실은 전체 서열 중 일부분, 또는 전장 서열을 결실하여 이루어진다. 보다 바람직하게는, E1B 19 유전자 및 E1B 55 유전자에서의 변이는 전장 서열의 결실을 통하여 이루어진다. 이와 같은 결실은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시될 수 있고, 예컨대, 하기의 실시예에서 예시된 바와 같이, 결실에 적합하게 디자인된 프라이머를 이용하여 PCR 방법을 통해 실시될 수 있다.

한편, 상기 변이는 조절 서열에서의 변이 유발 및 코딩 서열에서의 변이 유발을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, E1B 19 유전자 및 E1B 55 유전자에서의 변이는 아데노바이러스 E1B 19 유전자 또는 E1B 55 유전자가 결실되도록 한 것이며, 보다 바람직하게는 E1B 19 유전자 및 E1B 55 유전자 모두가 결실되는 것이다. 따라서, E1B 19 유전자 및 E1B 55 유전자의 전사나 단백질 합성 개시가 거의 일어나지 못하거나 전혀 일어나지 못한다. 한편, E1 부위의 단백질은 E1A만 합성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 정상적인 E1A 유전자를 포함한다. 상기 유전자는 아데노바이러스의 복제 및 증식에 필수적인 역할을 하는 것으로서, 이러한 유전자를 갖는 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 종양 세포 내에서 선택적으로 증식하며 세포 고사를 유발하여 보다 개선된 살상효과를 가지게 된다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 E3 유전자가 제거되어 있다. 상기 E3 유전자는 통상적으로 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다 (Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989)). 따라서, 본 발명의 아데노바이러스는 외래 유전자를 운반 및 발현할 수 있는 벡터로서의 용도도 갖게 된다.

한편, 본 발명의 가장 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 YKC-2 (KFCC-11288)이다.

본 발명의 재조합 아데노바이러스는 다양한 종양 세포, 예컨대 간암 세포, 자궁암 세포, 뇌종양 세포 및 폐암 세포 등에 대하여 살상능을 가질 뿐만 아니라, 살상 효율도 기존에 발표된 다른 재조합 아데노바이러스보다 월등하다. 또한, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 감염된 세포 주위로 확산되는 속도가 매우 크다. 본 발명이 상기한 이점을 나타내는 것은, 본 발명의 재조합 아데노바이러스가 종양 특이적 세포 사멸뿐만 아니라 세포 고사도 동시에 유도하기 때문이다.

또한, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 개별적 세포 수준에서의 인 비트로 종양 살상 효과도 우수하지만, 개체 수준에서의 인 비보 종양 살상 효과도 우수하다. 종래에 개발된 다수의 재조합 아데노바이러스가 인 비트로에서만 종양 살상 효과를 나타내고, 인 비보에서는 명확한 효과를 발휘하지 못하였다는 점을 고려하면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 우수성을 파악할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) E1B 55 유전자 및 E1B 19 유전자의 발현이 억제되도록 E1B 55 유전자 및 E1B 19 유전자가 변이되어, 종양 세포에서만 특이적으로 증식하며 세포 괴사 및 고사를 동시에 유도하여 종양 세포 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 항종양 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 재조합 아데노바이러스는 상술한 바와 같이, 다양한 종양 세포에 대하여 살상 효능을 나타내므로, 본 발명의 약제학적 조성물은 종양과 관련된 다양한 질병 또는 질환, 예컨대 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암 및 경부암 등의 치료에 이용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "치료"는 (ⅰ) 종양 세포 형성의 예방; (ⅱ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 억제; 및 (ⅲ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 경감을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 "치료학적 유효량"은 상기한 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, E1B 19 유전자 및 E1B 55 유전자에서의 변이는 바람직하게는 아데노바이러스 E1B 19 유전자 또는 E1B 55 유전자가 결실되도록 한 것이며, 보다 바람직하게는 E1B 19 유전자 및 E1B 55 유전자 모두가 결실되는 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 정상적인 E1A 유전자를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 E3 유전자가 제거되어 있다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 YKC-2 (KFCC-11288)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 난소암에서 복강 내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주입 방법으로 투여할 수 있고, 유방암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결정암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있고, 방광암의 경우에는 카테테르 내로 직접 주사하여 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 5×10¹⁰ ~ 5×10¹¹ pfu/㎖의 재조합 아데노바이러스를 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin), 프로카르바진 (procarbazine), 메클로레타민 (mechlorethamine), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실 (chlorambucil), 비술판 (bisulfan), 니트로소우레아 (nitrosourea), 디악티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 독소루비신 (doxorubicin), 블레오마이신 (bleomycin), 플리코마이신 (plicomycin), 미토마이신 (mitomycin), 에토포시드 (etoposide), 탁소시펜 (tamoxifen), 택솔 (taxol), 트랜스플라티눔 (transplatinum), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 빈크리스틴 (vincristin), 빈블라스틴 (vinblastin) 및 메토트렉세이트 (methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실시예 1: 재조합 아데노바이러스 YKC-2의 제조 및 확인

실시예 1-1: 재조합 아데노바이러스 YKC-2의 제조

재조합 아데노바이러스 셔틀 벡터 pΔE1B19/55를 제작하기 위해, 우선 E1A 유전자만을 포함시킬 수 있는 프라이머 세트를 제작해 아데노바이러스 E1 셔틀 벡터인 pXC1 (Microbix, 캐나다국)을 주형 DNA로 하고, 센스 프라이머 5'-TTATTGGATCCTTTGTCTAGGGCCGCGGG-3' 및 안티센스 프라이머 5'-CCAGGATCCAGATCTCCCCATTTAACACGCCATGC-3'을 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 주형 10 ng, 프라이머 100 ng 및 pfu DNA 중합효소 (Stratagene) 2 유니트를 사용하여 94℃에서 2분 동안 예열한 후 94℃ 30초, 55℃ 1분 및 72℃ 1분을 주기로 하여 총 30 사이클을 실시하고, 72℃에서 5분 동안 최종 신장 반응을 실시 하였다.

생성된 PCR 생성물은 BamHI으로 절단한 후, pCA14 (Microbix, 캐나다국)의 BglⅡ 부위에 삽입시켜 pΔE1B19/55 플라스미드를 제작하고, 염기 서열 분석 (ABI Prism 377, Perkin Elmer)으로 확인 하였다. 제작된 셔틀 벡터 pΔE1B19/55를 XmnI 제한효소로 절단한 후, BstBI 제한효소로 단일가닥화한 아데노바이러스 dl324Bst (스위스국의 Fribourgh 대학의 Verca 박사로부터 구입; Heider, H. et al. Biotechniques 28(2):260-265, 268-270(2000))와 함께 대장균 BJ5183 (스위스국의 Fribourgh 대학의 Verca 박사로부터 구입)에 42℃ 순간 열처리 방법으로 동시 형질 전환시켜 유전자 상동 재조합 (homologous recombination)을 유도 하였다.

재조합된 아데노바이러스 플라스미드를 PacI으로 절단한 다음, 293 세포주 (Microbix, 캐나다국)에 트랜스펙션하여 바이러스를 생산 하였다. 생산된 재조합 아데노바이러스를 "YKC-2"이라 명명하고, 기탁기관 한국 미생물보존센터에 2001년 11월 17일자로 기탁하고, 기탁번호 KFCC-11288을 부여 받았다.

도 1은 본 발명의 YKC-2 바이러스의 제조방법을 나타내는 개략도이다. 도 1에서 ITR (inverted terminal repeat)은 역 반복 서열이며 Ψ는 패키지 시그널을 나타낸다. 또한 기호 Ad는 아데노바이러스의 축약어이고, Δ는 서열의 제거(deletion)에 대한 기호이다.

한편, 대조군 바이러스들인 복제 불능 아데노바이러스 Ad-ΔE1 (E1 영역 전체가 결실된 것) 및 복제 가능 아데노바이러스 Ad-ΔE1B 55 (E1B 55가 결실된 것)의 제조 과정은 본 연구팀에서 발명한 재조합 아데노바이러스 YKL-1에 대한 논문에 명시되어 있다 (Lee, H. et. al. Int J Cancer 88:454-463(2000)). 각각의 재조합 아데노바이러스는 293 세포주에서 증식시킨 다음 한계 희석 방법 또는 플라크 분석 방법을 이용하여 바이러스의 역가를 결정 하였다 (Hitt, M. et al. Construction and propagation of human adenovirus vectors. Cell biology: a laboratory handbook New York: Academic Press Inc 479-490(1994)).

실시예 1-2: 재조합 아데노바이러스 DNA의 분리와 PCR 분석

인체 간암 세포주인 Hep3B (ATCC, 미합중국)에 상기 실시예 1-1의 Ad-ΔE1, YKC-2 및 YKL-1 바이러스를 MOI (Multiplicity of infection) 10으로 각각 감염 시키고, 2일이 경과한 다음 지놈 분리 키트 (Qiagen, 미합중국)로 바이러스 지놈을 회수 하였다. 이어, 분리한 바이러스 지놈을 주형으로 하고, E1A, E1B 19 kDa 또는 E1B 55 kDa의 증폭에 유용한 각각의 프라이머 세트를 이용하여 상기 실시예 1-1과 동일하게 PCR을 수행 하였다. 이용된 프라이머는 E1A의 PCR의 경우, 센스 프라이머 5'-GATCGAAGAGGTACTGGCTGATA-3', 안티센스 프라이머 5'-CCACAGGTCCTCATATAGCAAAG-3', E1B 19 kD의 경우, 센스 프라이머 5'-ATCTGACCTCATGGAGGCTTGG-3', 안티센스 프라이머 5'-GCGGACGGAAGACAACAGTAGC-3', 그리고 E1B 55 kD의 경우, 센스 프라이머 5'-GATAGATACGGAGGATAGGGTGG-3', 안티센스 프라이머 5'-TGGAGTTACCCTCAGACAGGATA-3'이다.

도 2는 증폭되는 서열을 야생형 아데노바이러스 지놈으로 나타낸 개략도이다.

상기 각각의 PCR 생성물들을 혼합한 다음, 아가로스 겔에 로딩하여 전기영동 하였다 (참조: 도 3). 도 3에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 YKC-2 바이러스는 E1A 유전자를 포함하고 있으나 E1B 19 및 E1B 55에 대한 유전자는 결실되어 있음을 알 수 있다.

실시예 1-3: 재조합 아데노바이러스 감염 세포주의 단백질 발현 확인

U343 뇌암 세포주 (ATCC 미합중국)에 상기 실시예 1-1의 Ad-ΔE1, YKC-2, YKL-1 그리고 야생형 아데노바이러스 (Ad-wt)를 MOI 10으로 감염 시키고, 24시간이 경과한 다음 감염된 세포를 회수하여 용해 완충액 (0.15 M NaCl, 0.5 % Nonidet P-40 및 프로테아제 억제제 (PMSF, TLCK 및 TPCK)를 포함하는 50 mM HEPES, pH 7.5)으로 용해시키고, SDS-PAGE (sodium-dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 전기영동 하였다. 이어, PVDF 막에 단백질들을 이동시킨 후 E1A, E1B 19 kDa 및 E1B 55 kDa 를 특이적으로 인지하는 항체 (E1A에 대한 항체: sc-430, Santacruz, 미합중국; E1B 19 kDa에 대한 항체: DP17, Oncogene, 미합중국; E1B55 kDa에 대한 항체: 2A6, 독일 Rogenberg 대학의 Thomas Dobner박사로부터 받음)를 각각 일차 항체로 반응 시키고 각 일차 항체에 대한 이차 항체 (Pierce, 미합중국)를 다시 반응 시켰다. 그런 다음, ECL (Enhanced Chemi-Luminescence: RPN 2108, Amersham, 미합중국) 방법으로 X-선 필름에 감광시켜 막 상의 단백질과 항체와의 결합 여부를 조사하여 각 단백질의 발현 양상을 확인 하였다. (참조: 도 4).

도 4는 본 발명의 YKC-2 바이러스의 E1A 및 E1B 단백질 발현 양상을 나타내는 웨스턴 블롯팅 결과 사진이다. 도 4에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 YKC-2 바이러스는 E1A 단백질은 정상적으로 발현을 하나, E1B 19 kDa 와 E1B 55kDa 단백질은 발현하지 못함을 알 수 있다.

실시예 2: YKC-2의 종양 특이적 세포 살상 능력 규명

실시예 2-1: 다양한 세포에서의 살상능 비교

본 발명의 재조합 아데노바이러스 YKC-2의 정상 세포와 종양 세포에 대한 세포 살상 능력을 규명하기 위하여, 인간 정상 세포주 Chang 및 173WE (ATCC, 미합중국), 간암 세포주 Hep3B 및 SK-Hep1 (ATCC, 미합중국), 그리고 자궁암 세포주 C33A (ATCC, 미합중국)를 준비하고, 이들 각각에 본 발명의 YKC-2 재조합 아데노바이러스 MOI 10, 1 및 0.1을 처리 하였다. 상기 다섯 종류의 세포 중 MOI 0.1에서 암세포를 완전히 사멸시킨 시점에 모든 배지를 제거한 다음, 50% 메탄올에 함유되어 있는 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 잔존한 세포들을 고정시키고 염색하여 분석 하였다 (참조: 도 5). 도 5는 본 발명의 YKC-2 바이러스의 정상 세포 및 종양 세포에 대한 살상 효과를 비교한 세포 병변 분석 사진이다. 도 5에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 YKC-2는 종양 억제 단백질인 p53 단백질의 기능이 없거나 돌연변이 되어 그 기능이 상실된 Hep3B 및 C33A 세포주에서는 현격히 높은 종양 세포 살상 효과를 보였다. 그러나, p53 단백질이 정상인 Chang 및 173WE 세포주에서는 그 살상효과가 거의 나타나지 않음을 확인할 수 있었으며, 종양 세포라 할지라도 p53 단백질의 기능이 정상적으로 발현되는 SK-Hep1 세포주에서도 살상 효과가 거의 나타나지 않음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 YKC-2 바이러스는 p53 단백질의 기능이 상실된 종양 세포주에 대해서 특이적으로 높은 살상 효과를 나태냄을 알 수 있다.

실시예 2-2: E1A 단백질의 세포 특이적 발현

본 발명의 YKC-2 바이러스가 p53 단백질 의존적으로 감염된 세포 내에서 복제되는지를 확인하기 위하여, p53 단백질의 기능이 저하된 종양 세포 내에서 아데노바이러스 복제에 필수적으로 요구되는 E1A 단백질의 발현이 특이적으로 조절되는지를 실험 하였다. p53 단백질이 돌연변이되어 그 기능이 비정상적으로 발현되는 인간 자궁암 세포주 C33A (ATCC, 미합중국)와 p53 단백질이 정상적으로 발현되는 정상 세포주 173WE (ATCC, 미합중국)에 Ad-ΔE1, YKC-2, YKC-1 및 YKL-1을 MOI 10으로 감염시키고 48시간 후 감염된 세포들을 회수 하였다. 용해 완충액 (0.15 M NaCl, 0.5 % Nonidet P-40 및 프로테아제 억제제 (PMSF, TLCK 및 TPCK)를 포함하는 50 mM HEPES, pH 7.5)으로 용해시키고, SDS-PAGE로 전기영동 하였다. PVDF 막에 전기영동으로 분리된 단백질들을 이동시킨 후 E1A 및 β-액틴을 특이적으로 인지하는 항체 (E1A에 대한 항체: sc-430, Santacruz, 미합중국; 및 β-actin에 대한 항체: A-5441, Sigma, 미합중국)를 각각 일차 항체로 반응 시키고 각 일차 항체에 대한 이차 항체 (Pierce, 미합중국)를 다시 반응 시켰다. 그리고, ECL (Enhanced Chemi-Luminescence : RPN 2108, Amersham, 미합중국) 방법으로 X-선 필름에 감광시켜 막 상의 단백질과 항체와의 결합 여부를 조사하여 각 단백질의 발현 양상을 확인 하였다 (참조: 도 6).

도 6은 본 발명의 YKC-2 바이러스의 E1A 단백질의 C33A 세포주 및 173WE 세포주에서의 발현 양상을 나타내는 웨스턴 블롯팅 결과 사진이다. 도 6에서 볼 수 있듯이, E1B 19 및 E1B 55 유전자가 결실된 본 발명의 YKC-2 바이러스와 E1B 55 유전자가 결실된 YKL-1 바이러스는 p53 단백질이 돌연변이형으로 발현되는 자궁암 세포주 C33A에서는 바이러스의 복제가 활발히 일어나 이에 따른 E1A의 단백질이 다량으로 발현되었지만, 정상 세포주 173WE에서는 바이러스의 복제가 일어나지 않아 E1A 단백질이 발현되지 않음을 확인할 수 있었다.

반면, E1B 19 kDa 단백질만을 발현하지 못하는 YKC-1은 p53의 돌연변이 여부에 관계없이 두 세포주 모두에서 바이러스의 복제가 일어나 E1A 단백질이 발현됨을 관찰 하였다. 또한, 음성 대조군인 복제 불능 아데노바이러스 Ad-ΔE1으로 감염된 세포들 내에서도 바이러스의 복제가 일어나지 않아 E1A 단백질이 전혀 발현되지 않음을 확인 하였다.

따라서, 본 발명의 YKC-2 바이러스는 p53 단백질 의존적으로 감염된 세포 내에서 복제되어 E1A 단백질을 발현함을 알 수 있다.

실시예 2-3: p53 단백질 상태가 정상형 또는 비정상형인 종양 세포에서의 살상 효과 비교

본 발명의 YKC-2 바이러스가 p53 상태에 따라 세포 살상 효과가 달라지는지 확인하기 위하여, p53 유전자의 돌연변이로 p53 단백질의 기능이 비정상적인 자궁암 세포주 C33A (ATCC, 미합중국), p53 유전자가 결실된 간암 세포주 Hep3B (ATCC, 미합중국), p53 단백질이 정상적으로 발현되는 자궁암 세포주 HeLa (ATCC, 미합중국) 및 p53 단백질이 정상적인 간암 세포주 HepG2 (ATCC, 미합중국)에 MOI 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.2 및 0.1의 Ad-ΔE1, YKC-2, YKC-1, YKL-1, 그리고 야생형인 Ad-WT 재조합 아데노바이러스를 각각 처리 하였다. 상기 다섯 종류의 바이러스 중 어느 한 종류의 아데노바이러스에 의해 MOI 0.1에서 암세포를 완전히 사멸시킨 시점에 모든 배지를 제거한 다음, 50% 메탄올에 함유되어 있는 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 잔존한 세포들을 고정시키고 염색하여 분석 하였다 (참조: 도 7 및 도 8).

도 7은 본 발명의 YKC-2 바이러스가 야생형 바이러스에 비하여 p53 단백질이 돌연변이된 암세포주에서 빠른 살상 효과를 보임을 나타내는 세포 병변 분석 사진이며, 도 8은 본 발명의 YKC-2 바이러스가 야생형 바이러스에 비하여 p53 단백질이 정상형인 암세포주에서 살상 효과가 감소됨을 나타내는 세포 병변 분석 사진이다.

도 7에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 YKC-2는 상기한 세포주 중 p53 단백질이 기능적으로 저하된 Hep3B 및 C33A 세포주에서 YKL-1이나 야생형인 Ad-WT에 비하여 높은 수준으로 종양 세포들을 살상 하였다. 반면, 도 8에서는 p53 단백질이 정상형인 HeLa 및 HepG2 세포주에서는 YKC-2 바이러스의 살상효과가 Ad-WT보다 5-10배 이상 저하되는 결과를 확인할 수 있었다. 한편, 음성 대조군으로 사용한 복제 불능 아데노바이러스인 Ad-ΔE1으로 감염된 세포들에는 바이러스가 복제되지 않아 살상 효과가 일어나지 않음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 YKC-2 바이러스는 p53 단백질의 기능이 저하된 종양 세포에서는 야생형보다도 빠른 살상 효과를 보이지만, p53 단백질의 기능이 정상적인 종양 세포주에서는 그 살상 효과가 훨씬 감소되는 개선된 종양 특이적 살상 결과를 나타냄을 알 수 있다.

결론적으로 상기 실시예 2-1, 2-2, 및 2-3을 종합해 보면, 본 발명의 YKC-2 바이러스는 세포 내 p53 단백질의 상태에 의존적으로 세포 살상 효과를 보이는 p53 관련-종양 특이적 복제 가능 아데노바이러스임을 확인할 수 있다.

실시예 2-4: 재조합 아데노바이러스로 감염된 종양 세포의 형태학적 변화

상기 실시예 1-1의 Ad-ΔE1, YKC-2 및 YKL-1를 폐암 세포주 A549 (ATCC, 미합중국)에 MOI 10으로 감염시킨 다음, 세포 살상 과정을 광학 현미경 (Axiovert25; Zeiss, 독일)으로 관찰 하였다 (참조: 도 9).

도 9는 Ad-ΔE1, YKL-1 및 본 발명의 YKC-2 바이러스가 A549 종양 세포를 살상할 때의 세포 형태 관찰 사진이다. 광학 현미경적 관찰 (400배 배율)에 따르면, YKL-1에 의해 사멸되는 세포들은 배양 플라스크 표면으로부터 둥글게 형성되어져 떨어져 나가고 핵이 음성 대조군에 비해 상당히 비대해진 형태를 취하였으며 전반적으로 전형적인 아데노바이러스에 의한 세포 살상 형태를 보였다. 이와 대조적으로, 본 발명의 YKC-2 바이러스로 감염된 세포들은 크기가 상대적으로 작아지며 세포막이 찢겨진 형태로 사멸되어 가는 것을 관찰할 수 있었다.

실시예 2-5: DNA 분절화와 FACS 분석을 통한 YKC-2의 세포 고사 유발 검증

아데노바이러스가 숙주세포 내로 감염되면, 감염된 세포 내에서는 아데노바이러스의 초기 발현 단백질인 E1A 단백질이 발현되어 세포 성장 중지 (G_o-G₁ arrest) 또는 세포 고사 등을 초래하게 된다. 이때 아데노바이러스의 또 다른 초기 발현 단백질인 E1B 19 kDa 단백질이 발현되어 백스 (Bax) 및 카스파아제 (caspase)와 같이 세포 고사를 직접 또는 간접적으로 유도하는 단백질들에 E1B 19 kDa 단백질이 결합하거나 또는 백스 및 카스파아제 단백질의 발현을 유도하는 기전을 방해하여 세포 고사를 억제한다는 실험 결과들이 보고된 바 있다 (Pearson, A.S. et al. Clinical Cancer Research 6:887-890(2000)).

E1B 19 kDa 단백질을 선택적으로 발현하지 못하도록 E1B 19 유전자를 결실 시킨 본 발명의 YKC-2 바이러스를 세포에 감염시킨 뒤, 세포 내에서 진행되는 DNA 사다리현상 (DNA ladder)과 FACS 분석을 통한 세포사 진행 정도, 즉 PI (propidium iodide)가 핵 내의 DNA와 정량적으로 결합함으로써 나타나는 세포 내 염색체의 조성의 변화를 측정 하였다.

먼저, 인체 뇌암 세포주 U343 (ATCC, 미합중국)에 Ad-ΔE1, YKC-2 및 YKL-1을 MOI 10으로 감염 시켰으며, 양성 대조군으로 세포 내 고사를 유발하는 항암제인 캄토테킨 (camptothecin)을 1μM로 처리한 다음 3일 후 감염된 세포를 회수 하였다. 20mM EDTA (pH 8.0), 5mM Tris (pH 7.2) 및 0.5% Triton X-100으로 세포를 용해 시키고, RNase와 프로테나아제 K를 처리한 후, DNA를 회수하여 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동 하였다(참조: 도 10).

도 10은 본 발명의 YKC-2 바이러스에 의해 유도되는 세포 고사를 확인하기 위한 DNA 분절화 사진이다. 도 10에서 확인할 수 있듯이, Ad-ΔE1 또는 YKL-1으로 감염된 세포에서는 무처리 (untreated) 샘플처럼 DNA 분절화 현상이 관찰되지 않았지만, YKC-2로 감염된 세포 및 캄토테킨을 양성 대조군으로 처리한 세포에서는 DNA 분절화에 의한 사다리 현상(ladder)이 뚜렷이 나타남을 확인할 수 있었다.

FACS 분석에 의한 세포사 진행 정도를 관찰하기 위하여, 인간 폐암 세포주 A549 (ATCC, 미합중국)에 Ad-ΔE1, YKC-2 및 YKL-1을 10 MOI로 감염시켰으며, 양성 대조군으로는 세포 내 고사를 유발하는 항암제인 캄토테킨 (camptothecin) 1μM을 처리 하였다. 감염 또는 캄토테킨 처리 후 1일, 2일, 3일 및 4일째 되는 날 각 세포들을 회수 하였다. 그리고, 인산염 완충 염수로 세척하고 70% 에탄올로 고정시킨 후 형광 물질인 PI로 염색시키고 RNase를 처리하여 FACS 분석 (FACS Calibur, Beckton Dickinson, 미합중국)을 하였다 (참조: 도 11).

도 11은 본 발명의 YKC-2 바이러스에 의해 DNA 분절화가 유도되는 현상을 FACS 분석으로 확인한 그래프이다. 도 11에서 볼 수 있듯이, 아무 처리도 하지 않은 세포와 Ad-ΔE1 또는 YKL-1으로 감염된 세포들은 바이러스 감염 후 4일까지 세포 고사가 완전히 진행되지 않아 DNA 조성이 거의 변화 없음을 확인할 수 있었으나, 본 발명의 YKC-2로 감염된 세포 및 캄토테킨으로 처리된 세포는 세포 고사가 진행되어 이에 의해 형성된 분절화된 DNA 함량 조성비가 처리한 시간에 비례하여 증가함을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 YKC-2 바이러스가 세포 고사를 유도함으로써 보다 빠른 살상 효과를 나타냄을 알 수 있다.

실시예 2-6: Bcl2 단백질이 과다 발현되는 A549/Bcl2 세포주에서의 살상 효과 확인

본 발명의 YKC-2 바이러스가 세포 고사를 동반한 세포 사멸을 유도한다는 결과를 보다 면밀히 증명하기 위하여, 폐암 세포주 A549 (ATCC, 미합중국) 및 세포 고사 억제 단백질로 잘 알려진 Bcl2 단백질이 과다 발현되는 세포주인 A549/Bcl2에서의 세포 살상 효과를 비교해 보았다. 각 세포주에 MOI 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.2 및 0.1의 Ad-ΔE1, YKC-2, YKC-1, YKL-1, 그리고 야생형인 Ad-WT 재조합 아데노바이러스를 각각 처리하였다. 상기 다섯 종류의 바이러스 중 어느 한 종류의 아데노바이러스에 의해 MOI 0.1에서 암세포를 완전히 사멸시킨 시점에 모든 배지를 제거한 다음, 50% 메탄올에 함유되어 있는 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 잔존한 세포들을 고정시키고 염색하여 분석하였다 (참조: 도 12).

도 12는 본 발명의 YKC-2 바이러스의 A549 세포주 및 A549/Bcl2 세포주에서의 살상 효과를 나타내는 세포 병변 분석 사진이다. 도 12에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 YKC-2 바이러스는 A549 세포주에서 YKC-1보다는 느린 속도로 세포들을 살상시켰지만, YKL-1보다는 훨씬 빠른 속도의 세포 살상 효과를 보였다. 도 12는 앞서 제시한 도 7, 8과 유사한 속도로 각각의 바이러스들이 증식되고 있음을 보여준다. 그러나, Bcl2가 과다 발현됨으로써 아데노바이러스 감염 시 유도되는 세포 고사를 억제할 수 있는 A549/Bcl2 세포주에서는 E1B 19 kDa 단백질이 발현되는 YKL-1 또는 야생형 아데노바이러스에 의한 세포 살상 효과가 A549에서의 세포 살상 효과와 거의 동일하지만, E1B 19 kDa 단백질을 발현시키지 못하는 YKC-1 또는 YKC-2에 의한 세포 살상 효과는 A549 세포주에서의 세포 살상 효과보다 약 10배-100배 정도로 현격히 감소하였다. 즉, YKC-2 바이러스의 E1B 19 유전자의 제거로 인해, A549 세포에서는 세포 살상 효과가 증가되었으나 Bcl2가 과다 발현되는 A549/Bcl2 세포주에서는 세포 고사로의 진행 경로가 차단되어 상당히 감소된 살상 효과를 보여주었다.

따라서, 세포 고사 억제 (antiapoptotic) 기능을 하는 것으로 잘 알려진 E1B 19kDa 단백질의 존재 유무에 따라, 아데노바이러스의 세포 고사 진행 경로가 달라짐을 알 수 있으며, 본 발명의 YKC-2 아데노바이러스가 암세포 내에서 증식할 뿐만 아니라 세포 고사까지 유도함으로써 보다 빠른 살상 효과를 초래한다는 것을 확인할 수 있다.

실시예 2-7: 누드 마우스를 모델로 한 YKC-2의 항종양 효과 확인

상기한 실시예는 재조합 아데노바이러스 YKC-2의 종양세포 살상 효과가 다른 복제 가능 아데노바이러스들 뿐만 아니라 야생형 아데노바이러스보다 훨씬 우수함을 인 비트로 수준에서 보여 준다. 본 실시예는 실제로 누드 마우스를 모델로 하여, 본 발명의 YKC-2 바이러스가 인 비보 수준에서도 항종양 효과가 우수한지를 확인하기 위한 것이다.

우선, 5-6주령의 누드 마우스 (Charles River Japan Inc., 일본)의 복부 피하에 인체 자궁암 세포주 C33A (ATCC, 미합중국)를 주사하여 종양의 크기가 5 × 5 ㎜ 정도에 도달했을 때, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 YKC-2 (초원심분리로 회수하여 PBS로 투석한 바이러스) 5 ×10⁸ pfu/50 ㎕를 종양 내에 주사한 다음, 2-3일에 한번씩 캘리퍼스로 종양의 크기를 측정 하였다 (참조: 도 13).

도 13은 본 발명의 YKC-2 바이러스가 누드 마우스에서 형성된 C33A 종양 세포의 성장을 억제시킴을 나타내는 그래프이다. 도 13에서 볼 수 있듯이, 음성 대조군으로 복제 불능 아데노바이러스인 Ad-ΔE1을 주사한 경우에는 종양의 크기가 시간이 지남에 따라 계속 성장해 나가는 반면, 본 발명의 YKC-2 바이러스를 주사한 경우에는 종양의 성장이 현저히 억제되었으며, 6마리의 실험 쥐들 중 4마리는 종양이 완전히 사멸되어 없어지는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, YKL-1 재조합 아데노바이러스를 주사한 경우에도 YKC-2 바이러스를 주사한 경우처럼 종양의 성장이 억제되었으나 재조합 아데노바이러스 YKC-2에 비해 항 종양 효능이 떨어짐을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 YKC-2는 인 비보 수준에서도 우수한 항 종양 효과를 나타냄을 알 수 있고, 세포 고사를 동시에 유발하는 특성 때문에 기존의 세포 고사를 유도하는 시스플라틴 (cisplantin)과 같은 항암제와 함께 병행 요법을 실시할 때 보다 상승적인 항암 효과를 기대할 수 있게 된다.

이상으로, 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 종양 특이적 세포 살상 효과를 나타내며 그 살상능이 보다 개선된 재조합 아데노바이러스를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기의 재조합 아데노바이러스를 포함하는 약제학적 항종양 조성물을 제공한다.

본 발명의 재조합 아데노바이러스는 종양 특이적으로 살상 가능하고 감염된 세포에서 세포 괴사 및 세포 고사를 동시에 유도함으로써 종양 세포 살상능이 크게 향상되어 종래의 재조합 아데노바이러스에 의한 종양 치료 방법의 한계를 극복할 수 있으며, 더욱이 본 발명의 약제학적 조성물은 종래의 암 치료 방법, 특히 세포 고사를 유도하는 암 치료 방법과 병행하여 이용되는 경우에는 치료 효과를 극대화할 수 있다.

도 1은 본 발명의 YKC-2 바이러스의 제조방법을 나타내는 개략도;

도 2는 실시예 1-2에서 증폭되는 서열을 야생형 아데노바이러스 지놈으로 나타낸 개략도;

도 3은 실시예 1-2에서 증폭된 서열의 전기영동 결과를 나타내는 사진;

도 4는 본 발명의 YKC-2 바이러스의 E1A 및 E1B 단백질 발현 양상을 나타내는 웨스턴 블롯팅 결과 사진;

도 5는 본 발명의 YKC-2 바이러스의 정상 세포 및 종양 세포에 대한 살상 효과를 비교한 세포 병변 분석 사진;

도 6은 본 발명의 YKC-2 바이러스의 E1A 단백질의 C33A 세포주 및 173WE 세포주에서의 발현 양상을 나타내는 웨스턴 블롯팅 결과 사진;

도 7은 본 발명의 YKC-2 바이러스가 야생형 바이러스에 비하여 p53 단백질이 돌연변이된 암세포주에서 빠른 살상 효과를 보임을 나타내는 세포 병변 분석 사진;

도 8은 본 발명의 YKC-2 바이러스가 야생형 바이러스에 비하여 p53 단백질이 정상형인 암세포주에서 살상 효과가 감소됨을 나타내는 세포 병변 분석 사진;

도 9는 Ad-ΔE1, YKL-1 및 본 발명의 YKC-2 바이러스가 A549 종양 세포를 살상할 때의 세포 형태 관찰 사진;

도 10은 본 발명의 YKC-2 바이러스에 의해 유도되는 세포 고사를 확인하기 위한 DNA 분절화 사진;

도 11은 본 발명의 YKC-2 바이러스에 의해 DNA 분절화가 유도되는 현상을 FACS 분석으로 확인한 그래프;

도 12는 본 발명의 YKC-2 바이러스의 A549 세포주 및 A549/Bcl2 세포주에서의 살상 효과를 나타내는 세포 병변 분석 사진; 및

도 13은 본 발명의 YKC-2 바이러스가 누드 마우스에서 형성된 C33A 종양 세포의 성장을 억제시킴을 나타내는 그래프.

Claims

E1B 55 유전자 및 E1B 19 유전자의 발현이 억제되도록 E1B 55 유전자 및 E1B 19 유전자가 변이되어, 종양세포에서만 특이적으로 증식하며 세포괴사 및 고사를 동시에 유도하고, 간암 세포주, 뇌종양 세포주, 폐암 세포주 및 자궁암 세포주에 대하여 종양 세포 살상 효과를 나타내며, 정상적인 E1A 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
제 1 항에 있어서, 상기 E1B 55 유전자의 변이는 E1B 55 유전자의 결실임을 특징으로 하는 종양 세포 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스.
제 1 항에 있어서, 상기 E1B 19 유전자의 변이는 E1B 19 유전자의 결실임을 특징으로 하는 종양 세포 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 E3 유전자가 결실되어 있음을 특징으로 하는 종양 세포 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스.
제 1 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 YKC-2 (KFCC-11288)임을 특징으로 하는 종양 세포 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스.
(a) E1B 55 유전자 및 E1B 19 유전자의 발현이 억제되도록 E1B 55 유전자 및 E1B 19 유전자가 변이되어, 종양세포에서만 특이적으로 증식하며 세포괴사 및 고사를 동시에 유도하고, 간암 세포주, 뇌종양 세포주, 폐암 세포주 및 자궁암 세포주에 대하여 종양 세포 살상 효과를 나타내며, 정상적인 E1A 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 세포 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량; 및

(b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 항종양 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 E1B 55 유전자의 변이는 E1B 55 유전자의 결실임을 특징으로 하는 종양 세포 살상 효과를 나타내는 약제학적 항종양 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 E1B 19 유전자의 변이는 E1B 19 유전자의 결실임을 특징으로 하는 종양 세포 살상 효과를 나타내는 약제학적 항종양 조성물.
삭제
제 7 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 E3 유전자가 결실되어 있음을 특징으로 하는 약제학적 항종양 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 YKC-2 (KFCC-11288)임을 특징으로 하는 약제학적 항종양 조성물.