JP2002525063A - 細胞状態特異的反応エレメントを含むアデノウイルスベクター及びその使用方法 - Google Patents
細胞状態特異的反応エレメントを含むアデノウイルスベクター及びその使用方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、アデノウイルス遺伝子上に細胞状態特異的転写制御を付与する細胞状態特異的転写制御エレメントを含むアデノウイルスベクターを提供する。「細胞状態」は一般に可逆的な生理学的及び／又は環境状態である。本発明は更に本ベクターを含む組成物及び宿主細胞、ならびに本ベクターを使用する方法も提供する。
Description
【０００１】 関連出願に関する相互参照 本出願は1998年９月10日出願の米国仮出願、特許出願番号60/099,791の優先権
を主張する。従って、先出願はその全てが参照され、ここに取り込まれている。
を主張する。従って、先出願はその全てが参照され、ここに取り込まれている。
【０００２】 政府後援研究により成された発明に関する権利状態 （適用外） 発明の分野 本発明はアデノウイルスベクターを用いる細胞トランスフェクションに関する
。より具体的には、それは組織又は細胞の型に関係しない、細胞内でのアデノウ
イルスベクターの細胞状態特異的複製に関する。
。より具体的には、それは組織又は細胞の型に関係しない、細胞内でのアデノウ
イルスベクターの細胞状態特異的複製に関する。
【０００３】 従来の技術 多くの医学研究の進歩にも関わらず、癌はいまだに米国内に於ける第２の死因
である。工業化国では、おおよそ５人に１人が癌によって死亡している。手術に
よる切除、放射線治療や化学療法といった従来の臨床治療は失敗率が高く、特に
固形癌での失敗率が高い。良性腫瘍を生ずる新生物は通常手術による病巣の除去
によって完全に治癒できる。周辺組織の浸潤により明らかとなる様に、腫瘍が悪
性化すると、根治は極めて困難になる。悪性腫瘍が転移した場合、根治すること
は殆どない。
である。工業化国では、おおよそ５人に１人が癌によって死亡している。手術に
よる切除、放射線治療や化学療法といった従来の臨床治療は失敗率が高く、特に
固形癌での失敗率が高い。良性腫瘍を生ずる新生物は通常手術による病巣の除去
によって完全に治癒できる。周辺組織の浸潤により明らかとなる様に、腫瘍が悪
性化すると、根治は極めて困難になる。悪性腫瘍が転移した場合、根治すること
は殆どない。
【０００４】 基底細胞癌を除き、米国だけでも毎年百万人以上が新たに癌になり、米国内で
は毎年50万人以上が癌で死亡している。世界中で最も一般的な５つの癌は肺癌、
胃癌、乳癌、結腸／直腸癌及び子宮頚癌であり、その毎年の新規患者合計数は６
百万人以上である。 肺癌は、手術不能率が60％にも達すること、そして５年生存率が13％に過ぎな
いことなどから、最も難治性である固形癌の一つである。具体的には、全肺癌の
ほぼ半数が相当する腺癌は、大部分が化学−放射線耐性である。結腸直腸癌は３
番目に多い癌であり、２番目の癌死の原因である。膵臓癌は実際的には常に致死
的である。即ち、これら癌にかかった多くの患者にとって現在の治療は満足でき
ないものであり、そして予後は不良である。
は毎年50万人以上が癌で死亡している。世界中で最も一般的な５つの癌は肺癌、
胃癌、乳癌、結腸／直腸癌及び子宮頚癌であり、その毎年の新規患者合計数は６
百万人以上である。 肺癌は、手術不能率が60％にも達すること、そして５年生存率が13％に過ぎな
いことなどから、最も難治性である固形癌の一つである。具体的には、全肺癌の
ほぼ半数が相当する腺癌は、大部分が化学−放射線耐性である。結腸直腸癌は３
番目に多い癌であり、２番目の癌死の原因である。膵臓癌は実際的には常に致死
的である。即ち、これら癌にかかった多くの患者にとって現在の治療は満足でき
ないものであり、そして予後は不良である。
【０００５】 肝細胞癌（ＨＣＣ又は悪性肝癌）は世界中で最も多く見られる癌の一つであり
、特にアジアで問題である。肝細胞癌患者に関する治療法は明瞭ではない。治療
法が改善され、肝臓移植が利用可能になっても、切除または移植による腫瘍除去
によって治癒する患者は極一部である。大部分の患者にとっては、現行治療法は
不満足であり、その予後も不良である。
、特にアジアで問題である。肝細胞癌患者に関する治療法は明瞭ではない。治療
法が改善され、肝臓移植が利用可能になっても、切除または移植による腫瘍除去
によって治癒する患者は極一部である。大部分の患者にとっては、現行治療法は
不満足であり、その予後も不良である。
【０００６】 乳癌は米国内に於ける最も一般的な癌の一つであり、毎年約182,000名が新た
に発症し、ほぼ50,000名が死亡している。工業国では、約８人に１人の女性が乳
癌になると予想されている。乳癌の死亡率は1930年来変わっていない。平均で毎
年0.2%増加しているが、65歳以下の年齢の女性では平均0.3%/年減少している。
Ｍａｒｃｈａｎｔ（１９９４）のＣｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ｍａｎａｇｅｍｅ
ｎｔ ｏｆ Ｂｒｅａｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ＩＩ：Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅ
ｒ、「Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｃｙｎｅｃｏｌｏｇｙ Ｃｌｉｎｉｃｓ
ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ」２１：５５５−５６０及びＣｏｌｄｉｔ
ｚ（１９９３）の「Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．」７１：１４８０−１４８９参
照。
に発症し、ほぼ50,000名が死亡している。工業国では、約８人に１人の女性が乳
癌になると予想されている。乳癌の死亡率は1930年来変わっていない。平均で毎
年0.2%増加しているが、65歳以下の年齢の女性では平均0.3%/年減少している。
Ｍａｒｃｈａｎｔ（１９９４）のＣｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ｍａｎａｇｅｍｅ
ｎｔ ｏｆ Ｂｒｅａｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ＩＩ：Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅ
ｒ、「Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｃｙｎｅｃｏｌｏｇｙ Ｃｌｉｎｉｃｓ
ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ」２１：５５５−５６０及びＣｏｌｄｉｔ
ｚ（１９９３）の「Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．」７１：１４８０−１４８９参
照。
【０００７】 病気の理解は進んだにも関わらず、乳癌は医療介入に対し耐性を維持している
。臨床上の最優先事項は早期診断であり、続いて通常型の介入、特に手術と化学
療法である。この様な介入での成功は限定的であり、特に腫瘍が転移した患者で
は限定的である。より正確かつより効果的な、侵襲性の低い治療を提供に利用で
きる治療法の集積の改良が求められている。
。臨床上の最優先事項は早期診断であり、続いて通常型の介入、特に手術と化学
療法である。この様な介入での成功は限定的であり、特に腫瘍が転移した患者で
は限定的である。より正確かつより効果的な、侵襲性の低い治療を提供に利用で
きる治療法の集積の改良が求められている。
【０００８】 前立腺癌は、1995年に米国内にて新たに約244,000名が診断され、そのうち約4
4,000が死亡すると考えられる、男性に於ける最も増加の著しい新生物である。
今日、男性では前立腺癌は最も多く診断される癌である。前立腺癌は潜在的であ
る；多くの男性は病気の明瞭な徴候を示さない状態で前立腺癌を有している。こ
れに伴い死亡率が高くなる。骨への癌転移（後期）は一般的であり、また殆ど致
死的である。
4,000が死亡すると考えられる、男性に於ける最も増加の著しい新生物である。
今日、男性では前立腺癌は最も多く診断される癌である。前立腺癌は潜在的であ
る；多くの男性は病気の明瞭な徴候を示さない状態で前立腺癌を有している。こ
れに伴い死亡率が高くなる。骨への癌転移（後期）は一般的であり、また殆ど致
死的である。
【０００９】 現在の治療には、放射前立腺切除術、放射線治療、ホルモン枯渇及び化学療法
が含まれている。残念なことに患者のおよそ80％では、前立腺癌の診断が確立し
た時点では既に骨転移が起こっており、従って外科的治療の効果は限定的である
。ホルモン治療は失敗することが多く、時間と共にホルモン耐性癌細胞が生ずる
。前立腺癌の治療には化学療法剤が利用されているが、その副作用を越える効果
を持つものは無く、特に有効な薬剤併用治療も無いようである。一般に多くの前
立腺癌は薬剤耐性で、ゆっくり増殖する性質を持っており、これが標準的な化学
療法に対し非反応性にしている。
が含まれている。残念なことに患者のおよそ80％では、前立腺癌の診断が確立し
た時点では既に骨転移が起こっており、従って外科的治療の効果は限定的である
。ホルモン治療は失敗することが多く、時間と共にホルモン耐性癌細胞が生ずる
。前立腺癌の治療には化学療法剤が利用されているが、その副作用を越える効果
を持つものは無く、特に有効な薬剤併用治療も無いようである。一般に多くの前
立腺癌は薬剤耐性で、ゆっくり増殖する性質を持っており、これが標準的な化学
療法に対し非反応性にしている。
【００１０】 主要な、そして圧倒的な癌治療の障害は選択性の問題である；即ち正常細胞の
機能には影響せずに腫瘍細胞の増幅を阻害する能力である。例えば、前立腺癌治
療では、通常の化学療法の治療比率、又は殺滅された正常細胞に対する殺滅され
た腫瘍細胞の割合は1.5：１に過ぎない。この様なことから、新生物の治療と予
防に適したより効果的な治療法及び医薬組成物が求められている。
機能には影響せずに腫瘍細胞の増幅を阻害する能力である。例えば、前立腺癌治
療では、通常の化学療法の治療比率、又は殺滅された正常細胞に対する殺滅され
た腫瘍細胞の割合は1.5：１に過ぎない。この様なことから、新生物の治療と予
防に適したより効果的な治療法及び医薬組成物が求められている。
【００１１】 固形癌は、腫瘍細胞が血管を形成する内皮細胞に比べ早く増殖することを一因
とし、血管新生が不良な領域を含むことが多い。腫瘍細胞はこの様な低酸素条件
下でも生存が可能であり、しばしば化学療法及び放射線治療に対し不応性である
。子宮頸癌の最近の研究では、腫瘍の酸素状態は、患者年齢、閉経状態、臨床段
階、大きさや組織学よりも重要な、単独の最重要予後因子であることを示してい
る。Hoeckelら、(1996）Semin. Radiat. Oncol. 6:1-8. 特に関心深いことは、より特異的な、狙いを定めた癌治療法であり、特に治療
成功が難しい癌に適したものである。比較的非特異的であり、しばしば重い毒性
をもたらす通常の癌治療に対し、特異的治療法は、健康な細胞をその無傷な状態
に残しながら悪性細胞を選択的に阻害又は殺滅しようとするものである。放射線
耐性及び化学療法耐性腫瘍は特に難題であり、このタイプの腫瘍を治療する方法
が求められている。
とし、血管新生が不良な領域を含むことが多い。腫瘍細胞はこの様な低酸素条件
下でも生存が可能であり、しばしば化学療法及び放射線治療に対し不応性である
。子宮頸癌の最近の研究では、腫瘍の酸素状態は、患者年齢、閉経状態、臨床段
階、大きさや組織学よりも重要な、単独の最重要予後因子であることを示してい
る。Hoeckelら、(1996）Semin. Radiat. Oncol. 6:1-8. 特に関心深いことは、より特異的な、狙いを定めた癌治療法であり、特に治療
成功が難しい癌に適したものである。比較的非特異的であり、しばしば重い毒性
をもたらす通常の癌治療に対し、特異的治療法は、健康な細胞をその無傷な状態
に残しながら悪性細胞を選択的に阻害又は殺滅しようとするものである。放射線
耐性及び化学療法耐性腫瘍は特に難題であり、このタイプの腫瘍を治療する方法
が求められている。
【００１２】 これら癌に関する一つの可能な方法は、所望する遺伝子を悪性細胞内に導入す
る遺伝子治療である。アデノウイルスベクターを含む様々なウイルスベクターが
遺伝子治療の為の媒介体として開発されている。遺伝子治療を目的としたアデノ
ウイルスベクター開発に於ける専らの関心事はアデノウイルスを所望する遺伝子
を導入するための媒介体として利用することであり、それ自体をエフェクターと
して利用することではない。アデノウイルスの複製は、主に宿主免疫反応の観点
から望ましくない結果と見られている。複製欠損アデノウイルスによる癌治療で
は、宿主免疫反応は繰り返し投与期間を２つのレベルで制限している。第１の問
題はアデノウイルス供与媒介体のカプシド蛋白質が免疫原性であることである。
第２の問題は、ウイルスの後期遺伝子が形質導入された細胞においてしばしば発
現し、それが細胞性免疫を惹起することである。即ち、繰り返し投与されるサイ
トカイン、腫瘍抑制遺伝子、リボザイム、自殺遺伝子、又はプロドラッグを活性
薬物に変換する遺伝子の能力は、遺伝子運搬媒介体と運搬媒介体両方のウイルス
遺伝子産物の持つ免疫原性、ならびに遺伝子発現の一過性の性質により制限され
ている。
る遺伝子治療である。アデノウイルスベクターを含む様々なウイルスベクターが
遺伝子治療の為の媒介体として開発されている。遺伝子治療を目的としたアデノ
ウイルスベクター開発に於ける専らの関心事はアデノウイルスを所望する遺伝子
を導入するための媒介体として利用することであり、それ自体をエフェクターと
して利用することではない。アデノウイルスの複製は、主に宿主免疫反応の観点
から望ましくない結果と見られている。複製欠損アデノウイルスによる癌治療で
は、宿主免疫反応は繰り返し投与期間を２つのレベルで制限している。第１の問
題はアデノウイルス供与媒介体のカプシド蛋白質が免疫原性であることである。
第２の問題は、ウイルスの後期遺伝子が形質導入された細胞においてしばしば発
現し、それが細胞性免疫を惹起することである。即ち、繰り返し投与されるサイ
トカイン、腫瘍抑制遺伝子、リボザイム、自殺遺伝子、又はプロドラッグを活性
薬物に変換する遺伝子の能力は、遺伝子運搬媒介体と運搬媒介体両方のウイルス
遺伝子産物の持つ免疫原性、ならびに遺伝子発現の一過性の性質により制限され
ている。
【００１３】 癌治療ベクターとしてのアデノウイルスベクターの使用が報告されている。こ
れら方法の幾つかは、アデノウイルスを選択的に複製させる（結果として細胞毒
性を発揮させる）、組織（即ち細胞型）特異的転写制御エレメントを利用してい
る。米国特許第5,698,443号；又WO95/11984号；WO96/17053号；WO96/34969号；W
O98/35028号を参照。この方法は有用かつ有望であるが、組織特異的複製が不十
分であるという別の治療上の問題が残っている。
れら方法の幾つかは、アデノウイルスを選択的に複製させる（結果として細胞毒
性を発揮させる）、組織（即ち細胞型）特異的転写制御エレメントを利用してい
る。米国特許第5,698,443号；又WO95/11984号；WO96/17053号；WO96/34969号；W
O98/35028号を参照。この方法は有用かつ有望であるが、組織特異的複製が不十
分であるという別の治療上の問題が残っている。
【００１４】 癌性細胞以外にも、特定の望ましくない細胞又は組織を選択的に破壊すること
が望ましいことがしばしばある。しかし、侵襲的な手術以外に利用できる方法は
少なく、特にこの様な選択的細胞傷害性及び／又は抑制を可能にする非侵襲的方
法は少ない。 ベクターに対する特異的な免疫学反応がその後の治療を妨げる前に、最少回数
の投与により実質的に全癌性細胞を排除でき、そして特異的な、狙いを定めた癌
根治治療での利用に好適なベクター構築体が求められている。更に、細胞のタイ
プ及び／又は解剖学的局在部位に関わらず、不要の細胞を選択的に破壊し、又は
傷害する能力も求められている。
が望ましいことがしばしばある。しかし、侵襲的な手術以外に利用できる方法は
少なく、特にこの様な選択的細胞傷害性及び／又は抑制を可能にする非侵襲的方
法は少ない。 ベクターに対する特異的な免疫学反応がその後の治療を妨げる前に、最少回数
の投与により実質的に全癌性細胞を排除でき、そして特異的な、狙いを定めた癌
根治治療での利用に好適なベクター構築体が求められている。更に、細胞のタイ
プ及び／又は解剖学的局在部位に関わらず、不要の細胞を選択的に破壊し、又は
傷害する能力も求められている。
【００１５】 発明の要約 細胞状態特異的ＴＲＥの転写制御下のポリヌクレオチド発現を可能、又は誘導
する所定の、又は特定の生理状態にある細胞に特異的な複製可能なアデノウイル
スベクター、又はそれらの使用方法が提供される。これら複製可能アデノウイル
スベクターでは、１またはそれ以上のアデノウイルス遺伝子が細胞特異的転写制
御エレメント（ＴＲＥ）の転写制御下にある。好ましくは、細胞状態特異的ＴＲ
Ｅの転写制御下にあるアデノウイルス遺伝子は、アデノウイルスの増殖に必須な
遺伝子である。細胞状態特異的ＴＲＥの制御下にあるトランス遺伝子も存在する
だろう。本発明のアデノウイルスベクターでは、細胞状態特異的ＴＲＥは、異常
な生理学的状態、即ち正常な生理状態では分裂していないか、又は制御された分
裂を行っている同一細胞の典型的又は正常な生理学的状態からはずれている、特
定の可逆性の生理学的状態にある細胞に於いて活性である。
する所定の、又は特定の生理状態にある細胞に特異的な複製可能なアデノウイル
スベクター、又はそれらの使用方法が提供される。これら複製可能アデノウイル
スベクターでは、１またはそれ以上のアデノウイルス遺伝子が細胞特異的転写制
御エレメント（ＴＲＥ）の転写制御下にある。好ましくは、細胞状態特異的ＴＲ
Ｅの転写制御下にあるアデノウイルス遺伝子は、アデノウイルスの増殖に必須な
遺伝子である。細胞状態特異的ＴＲＥの制御下にあるトランス遺伝子も存在する
だろう。本発明のアデノウイルスベクターでは、細胞状態特異的ＴＲＥは、異常
な生理学的状態、即ち正常な生理状態では分裂していないか、又は制御された分
裂を行っている同一細胞の典型的又は正常な生理学的状態からはずれている、特
定の可逆性の生理学的状態にある細胞に於いて活性である。
【００１６】 従って１つの観点では、発明は細胞状態特異的ＴＲＥの転写制御下にあるアデ
ノウイルス遺伝子を含むアデノウイルスベクターを提供する。別の実施態様では
、細胞状態特異的ＴＲＥはヒト型である。別の実施態様では、細胞状態特異的Ｔ
ＲＥは細胞状態特異的プロモーター及びエンハンサーを含む。更に別の実施態様
では、細胞状態特異的ＴＲＥは細胞型特異的ＴＲＥに並列しており、又２つの要
素は一緒にアデノウイルス遺伝子を制御する。即ち、発明は細胞状態特異的ＴＲ
Ｅ及び細胞型特異的ＴＲＥを含むＴＲＥを具備するアデノウイルスベクターを提
供する。
ノウイルス遺伝子を含むアデノウイルスベクターを提供する。別の実施態様では
、細胞状態特異的ＴＲＥはヒト型である。別の実施態様では、細胞状態特異的Ｔ
ＲＥは細胞状態特異的プロモーター及びエンハンサーを含む。更に別の実施態様
では、細胞状態特異的ＴＲＥは細胞型特異的ＴＲＥに並列しており、又２つの要
素は一緒にアデノウイルス遺伝子を制御する。即ち、発明は細胞状態特異的ＴＲ
Ｅ及び細胞型特異的ＴＲＥを含むＴＲＥを具備するアデノウイルスベクターを提
供する。
【００１７】 幾つかの実施態様では、細胞状態特異的ＴＲＥの転写制御下にあるアデノウイ
ルス遺伝子は、複製に必須なアデノウイルス遺伝子である。幾つかの実施態様で
は、複製に必須なアデノウイルス遺伝子は初期遺伝子である。別の実施態様では
、初期遺伝子はＥ１Ａである。別の実施態様では、初期遺伝子はＥ１Ｂである。
更に別の実施態様では、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂは共に細胞状態特異的ＴＲＥの転写制
御下にある。別の実施態様では、複製に必須なアデノウイルス遺伝子は後期遺伝
子である。
ルス遺伝子は、複製に必須なアデノウイルス遺伝子である。幾つかの実施態様で
は、複製に必須なアデノウイルス遺伝子は初期遺伝子である。別の実施態様では
、初期遺伝子はＥ１Ａである。別の実施態様では、初期遺伝子はＥ１Ｂである。
更に別の実施態様では、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂは共に細胞状態特異的ＴＲＥの転写制
御下にある。別の実施態様では、複製に必須なアデノウイルス遺伝子は後期遺伝
子である。
【００１８】 別の実施態様では、細胞状態特異的ＴＲＥは低酸素反応性エレメントを含む。
別の実施態様では、細胞状態特異的ＴＲＥは配列番号１のヌクレオチドを含む。 細胞状態特異的ＴＲＥは細胞周期特異的ＴＲＥを含む。細胞周期特異的ＴＲＥ
はＥ２Ｆ１５’フランキング領域に由来する。実施態様の一つでは、細胞周期特
異的ＴＲＥは、配列番号２記載のヌクレオチド配列を含む。
別の実施態様では、細胞状態特異的ＴＲＥは配列番号１のヌクレオチドを含む。 細胞状態特異的ＴＲＥは細胞周期特異的ＴＲＥを含む。細胞周期特異的ＴＲＥ
はＥ２Ｆ１５’フランキング領域に由来する。実施態様の一つでは、細胞周期特
異的ＴＲＥは、配列番号２記載のヌクレオチド配列を含む。
【００１９】 別の実施態様では、アデノウイルスベクターは更に、遺伝子が細胞状態特異的
ＴＲＥの転写制御下にあるトランス遺伝子を含む。幾つかの実施態様では、トラ
ンス遺伝子は細胞傷害性遺伝子である。 別の実施態様では、アデノウイルスベクターは第１細胞状態特異的ＴＲＥの制
御下のアデノウイルス複製に必須なアデノウイルス遺伝子、及び第２細胞状態特
異的ＴＲＥの制御下のアデノウイルス複製に必須な第２アデノウイルス遺伝子を
具備する。第１及び第２細胞状態特異的ＴＲＥは互いに同一、実質同一、あるい
は異なってもよい。
ＴＲＥの転写制御下にあるトランス遺伝子を含む。幾つかの実施態様では、トラ
ンス遺伝子は細胞傷害性遺伝子である。 別の実施態様では、アデノウイルスベクターは第１細胞状態特異的ＴＲＥの制
御下のアデノウイルス複製に必須なアデノウイルス遺伝子、及び第２細胞状態特
異的ＴＲＥの制御下のアデノウイルス複製に必須な第２アデノウイルス遺伝子を
具備する。第１及び第２細胞状態特異的ＴＲＥは互いに同一、実質同一、あるい
は異なってもよい。
【００２０】 別の実施態様では、アデノウイルスベクターは第１細胞状態特異的ＴＲＥの制
御下のアデノウイルス複製に必須なアデノウイルス遺伝子及び第２細胞状態特異
的ＴＲＥの制御下にあるトランス遺伝子を含む。第１及び第２細胞状態特異的Ｔ
ＲＥは相互に実質同一、又は異なってもよい。 別の実施態様では、アデノウイルスベクターは細胞状態特異的ＴＲＥの転写制
御下にあるアデノウイルス遺伝子及び細胞型特異的ＴＲＥ転写制御下にある第２
アデノウイルス遺伝子を含む。別の実施態様では、アデノウイルスベクターは細
胞状態特異的ＴＲＥの転写制御下にあるアデノウイルス遺伝子及び細胞型特異的
ＴＲＥの転写制御下にあるトランス遺伝子を含む。
御下のアデノウイルス複製に必須なアデノウイルス遺伝子及び第２細胞状態特異
的ＴＲＥの制御下にあるトランス遺伝子を含む。第１及び第２細胞状態特異的Ｔ
ＲＥは相互に実質同一、又は異なってもよい。 別の実施態様では、アデノウイルスベクターは細胞状態特異的ＴＲＥの転写制
御下にあるアデノウイルス遺伝子及び細胞型特異的ＴＲＥ転写制御下にある第２
アデノウイルス遺伝子を含む。別の実施態様では、アデノウイルスベクターは細
胞状態特異的ＴＲＥの転写制御下にあるアデノウイルス遺伝子及び細胞型特異的
ＴＲＥの転写制御下にあるトランス遺伝子を含む。
【００２１】 別の観点では、本発明はここに記載のアデノウイルスベクターを含む宿主細胞
を提供する。 別の観点では、本発明はここに記載のアデノウイルスベクターを含む医薬組成
物を提供する。 別の観点では、本発明はここに記載のアデノウイルスベクターを含むキットを
提供する。
を提供する。 別の観点では、本発明はここに記載のアデノウイルスベクターを含む医薬組成
物を提供する。 別の観点では、本発明はここに記載のアデノウイルスベクターを含むキットを
提供する。
【００２２】 別の観点では、細胞をここに記載のアデノウイルスに接触せしめ、それによっ
て該ベクターが細胞に侵入するこをと含む、標的細胞（即ち細胞状態特異的ＴＲ
Ｅが機能することを可能にする、または誘導する細胞）内に選択的細胞傷害性を
付与する方法を提供する。 別の本発明の実施態様は、その細胞の状態が細胞状態特異的ＴＲＥを機能させ
る、又は機能を誘導する哺乳動物細胞内にて優先的に複製するアデノウイルスで
ある。
て該ベクターが細胞に侵入するこをと含む、標的細胞（即ち細胞状態特異的ＴＲ
Ｅが機能することを可能にする、または誘導する細胞）内に選択的細胞傷害性を
付与する方法を提供する。 別の本発明の実施態様は、その細胞の状態が細胞状態特異的ＴＲＥを機能させ
る、又は機能を誘導する哺乳動物細胞内にて優先的に複製するアデノウイルスで
ある。
【００２３】 別の観点では、ここに記載のアデノウイルスベクターと、その細胞の状態が細
胞状態特異的ＴＲＥの機能を可能とする哺乳動物細胞とを組み合わせることによ
りアデノウイルスが増殖されることを具備する方法である、その細胞状態が細胞
状態特異的ＴＲＥの機能を可能にする哺乳動物細胞特異的アデノウイルス増殖法
である。
胞状態特異的ＴＲＥの機能を可能とする哺乳動物細胞とを組み合わせることによ
りアデノウイルスが増殖されることを具備する方法である、その細胞状態が細胞
状態特異的ＴＲＥの機能を可能にする哺乳動物細胞特異的アデノウイルス増殖法
である。
【００２４】 本発明は更に、そのアデノウイルスベクターが腫瘍細胞内に入り、そして腫瘍
細胞に関する選択的細胞傷害性を発揮するように本発明のアデノウイルスと腫瘍
細胞とを接触せしめることを含む、腫瘍細胞、より具体的には標的腫瘍細胞（即
ち、細胞状態特異的ＴＲＥが機能することを可能にする、または誘導する腫瘍細
胞）の増殖を抑制する方法を提供する。
細胞に関する選択的細胞傷害性を発揮するように本発明のアデノウイルスと腫瘍
細胞とを接触せしめることを含む、腫瘍細胞、より具体的には標的腫瘍細胞（即
ち、細胞状態特異的ＴＲＥが機能することを可能にする、または誘導する腫瘍細
胞）の増殖を抑制する方法を提供する。
【００２５】 別の観点では、生物学的サンプルの細胞をここに記載のアデノウイルスベクタ
ーと接触せしめ、そしてアデノウイルスの複製が有る場合にはそれを検出するこ
とを含む、その細胞状態が生物サンプル中の細胞状態特異的ＴＲＥの機能を可能
にする細胞を検出するための方法を提供する。 （発明の詳細な説明） 我々は、その細胞状態が細胞状態特異的転写制御反応エレメント（ＴＲＥ）の
機能を可能にする状態にある細胞に於いて、優先的に転写されるように細胞状態
特異的ＴＲＥ転写制御下にあるアデノウイルス遺伝子を含んでいる複製可能アデ
ノウイルスベクターを発見し、また構築し、そしてこれらアデノウイルスベクタ
ーを用いる方法を開発した。幾つかの好ましい実施態様では、本発明のアデノウ
イルスは細胞状態特異的ＴＲＥにより制御される転写に必要な転写因子及び／又
は補助因子の結合によって特異的に制御されるＴＲＥの転写制御下にあるアデノ
ウイルスの複製に必要なアデノウイルス遺伝子を少なくとも１つ、好ましくは少
なくとも１個の初期遺伝子を含む。複製に必要な少なくとも１個のアデノウイル
ス遺伝子の細胞状態特異的転写を提供することで、本発明は選択的複製及び／又
は選択的転写により特異的細胞傷害作用に関し利用できるアデノウイルスを提供
する。これは的を絞った細胞殺滅が望まれる癌との関係に於いて特に有用である
。これはまた、対象となる細胞の選択的破壊及び／又は抑制が望ましい、その他
の非腫瘍性細胞の標的化した細胞傷害性作用に関しても有用である。このベクタ
ーは、その細胞状態が細胞状態特異的ＴＲＥの機能を可能にする細胞の存在、例
えば適当な生物学的（たとえば臨床の）サンプルの検出にも有用であろう。更に
アデノウイルスベクターは、細胞状態特異的ＴＲＥを利用することで標的細胞内
に１またはそれ以上の所望蛋白質を随意選択的に産生できる。
ーと接触せしめ、そしてアデノウイルスの複製が有る場合にはそれを検出するこ
とを含む、その細胞状態が生物サンプル中の細胞状態特異的ＴＲＥの機能を可能
にする細胞を検出するための方法を提供する。 （発明の詳細な説明） 我々は、その細胞状態が細胞状態特異的転写制御反応エレメント（ＴＲＥ）の
機能を可能にする状態にある細胞に於いて、優先的に転写されるように細胞状態
特異的ＴＲＥ転写制御下にあるアデノウイルス遺伝子を含んでいる複製可能アデ
ノウイルスベクターを発見し、また構築し、そしてこれらアデノウイルスベクタ
ーを用いる方法を開発した。幾つかの好ましい実施態様では、本発明のアデノウ
イルスは細胞状態特異的ＴＲＥにより制御される転写に必要な転写因子及び／又
は補助因子の結合によって特異的に制御されるＴＲＥの転写制御下にあるアデノ
ウイルスの複製に必要なアデノウイルス遺伝子を少なくとも１つ、好ましくは少
なくとも１個の初期遺伝子を含む。複製に必要な少なくとも１個のアデノウイル
ス遺伝子の細胞状態特異的転写を提供することで、本発明は選択的複製及び／又
は選択的転写により特異的細胞傷害作用に関し利用できるアデノウイルスを提供
する。これは的を絞った細胞殺滅が望まれる癌との関係に於いて特に有用である
。これはまた、対象となる細胞の選択的破壊及び／又は抑制が望ましい、その他
の非腫瘍性細胞の標的化した細胞傷害性作用に関しても有用である。このベクタ
ーは、その細胞状態が細胞状態特異的ＴＲＥの機能を可能にする細胞の存在、例
えば適当な生物学的（たとえば臨床の）サンプルの検出にも有用であろう。更に
アデノウイルスベクターは、細胞状態特異的ＴＲＥを利用することで標的細胞内
に１またはそれ以上の所望蛋白質を随意選択的に産生できる。
【００２６】 我々は本発明のアデノウイルスが、その細胞状態が細胞状態特異的ＴＲＥを機
能可能にする状態にある細胞内に於いて、細胞状態特異的ＴＲＥに選択的に作動
可能に連結したアデノウイルス遺伝子を複製及び／又は発現することを見いだし
た。特定の、分化した細胞にて優先的に複製することを目的とした従来報告され
たアデノウイルスベクターと異なり、本発明のアデノウイルスは細胞型に特異的
でない制御エレメントを含む。むしろ、それらは細胞状態特異的アデノウイルス
複製及び／又はアデノウイルス遺伝子及び／又はトランス遺伝子に作動可能に連
結した細胞状態特異的発現を付与する。
能可能にする状態にある細胞内に於いて、細胞状態特異的ＴＲＥに選択的に作動
可能に連結したアデノウイルス遺伝子を複製及び／又は発現することを見いだし
た。特定の、分化した細胞にて優先的に複製することを目的とした従来報告され
たアデノウイルスベクターと異なり、本発明のアデノウイルスは細胞型に特異的
でない制御エレメントを含む。むしろ、それらは細胞状態特異的アデノウイルス
複製及び／又はアデノウイルス遺伝子及び／又はトランス遺伝子に作動可能に連
結した細胞状態特異的発現を付与する。
【００２７】 本発明のアデノウイルスベクターは、可逆的及び／又は進行的である特異的生
理（即ち環境的又は代謝的）特性を有する細胞のなかで機能する細胞状態特異的
ＴＲＥを含む。標的細胞は、細胞状態ＴＲＥを機能させることを目的として低酸
素分圧の様な異常な生理状態を表すか、あるいは熱又は電離放射線の様な異常な
環境条件下に置かれるだろう。これらベクターが複製し易いことは、必要な生理
状態又は条件（例えば、異常な生理学的状態）にある細胞の複製レベルを、必要
な生理状態を示さない細胞（例えば正常な生理学的条件下にある）での複製レベ
ルと比較することで示される。即ち、本発明はアデノウイルスに関し望ましくな
いと考えられている観点、例えばその複製や想定される付随する免疫原性を利用
し、そして利点としている。制御不能な感染の確率は、ウイルス複製に関する細
胞状態特異的条件によって有意に低下している。特定の理論に結びつける意図無
しに、本発明者はアデノウイルス蛋白質の産生が免疫システムの活性化及び／又
は促進し、一般的及び／又は特異的に標的細胞にアデノウイルス蛋白質を産生さ
せ、これが患者がしばしば軽度から重度の免疫抑制状態にある癌では重要である
ことに注目した。
理（即ち環境的又は代謝的）特性を有する細胞のなかで機能する細胞状態特異的
ＴＲＥを含む。標的細胞は、細胞状態ＴＲＥを機能させることを目的として低酸
素分圧の様な異常な生理状態を表すか、あるいは熱又は電離放射線の様な異常な
環境条件下に置かれるだろう。これらベクターが複製し易いことは、必要な生理
状態又は条件（例えば、異常な生理学的状態）にある細胞の複製レベルを、必要
な生理状態を示さない細胞（例えば正常な生理学的条件下にある）での複製レベ
ルと比較することで示される。即ち、本発明はアデノウイルスに関し望ましくな
いと考えられている観点、例えばその複製や想定される付随する免疫原性を利用
し、そして利点としている。制御不能な感染の確率は、ウイルス複製に関する細
胞状態特異的条件によって有意に低下している。特定の理論に結びつける意図無
しに、本発明者はアデノウイルス蛋白質の産生が免疫システムの活性化及び／又
は促進し、一般的及び／又は特異的に標的細胞にアデノウイルス蛋白質を産生さ
せ、これが患者がしばしば軽度から重度の免疫抑制状態にある癌では重要である
ことに注目した。
【００２８】 本発明のアデノウイルスベクターは、その治療が例えば手術不能又は治療不可
能な特定の癌について狙いを絞った様な特異的治療法に於いて得に有用である。
本発明の重要な特徴の一つは、このベクターが癌の組織や細胞の型に関係なく治
療にとって有効であることであり、そして更にそれらの細胞傷害性が特定の部位
を標的化できることである。
能な特定の癌について狙いを絞った様な特異的治療法に於いて得に有用である。
本発明の重要な特徴の一つは、このベクターが癌の組織や細胞の型に関係なく治
療にとって有効であることであり、そして更にそれらの細胞傷害性が特定の部位
を標的化できることである。
【００２９】 一般的な技術 本発明の実施では、特記なき限り分子生物学（組換え体技術を含む）、微生物
学、細胞生物学、生化学及び免疫学の通常の技術を利用しており、これらは例え
ば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ」，第２版（Ｓａｎｂｒｏｏｋら、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，編集，１９８４）；
「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」 （Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅ
ｙ，編集、１９８７）；「 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」
（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）； 「 Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏ
ｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」 （Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉ
＆ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ， 編集）；「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ
Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」 （Ｊ．Ｍ．Ｍｉ
ｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｐ． Ｃａｌｏｓ， 編集、１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」 （Ｆ．
Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら、編集、１９８７）；「 ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」， （Ｍｕｌｌｉｓら、編集、
１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ」 （Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら、編集、１９９１）の様な文献に十分説明
されている。
学、細胞生物学、生化学及び免疫学の通常の技術を利用しており、これらは例え
ば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ」，第２版（Ｓａｎｂｒｏｏｋら、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，編集，１９８４）；
「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」 （Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅ
ｙ，編集、１９８７）；「 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」
（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）； 「 Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏ
ｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」 （Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉ
＆ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ， 編集）；「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ
Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」 （Ｊ．Ｍ．Ｍｉ
ｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｐ． Ｃａｌｏｓ， 編集、１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」 （Ｆ．
Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら、編集、１９８７）；「 ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」， （Ｍｕｌｌｉｓら、編集、
１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ」 （Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら、編集、１９９１）の様な文献に十分説明
されている。
【００３０】 アデノウイルスに関する技術に関しては、特に、ＦｅｌｇｎｅｒとＲｉｎｇｏ
ｌｄ（１９８９）「Ｎａｔｕｒｅ」３３７：３８７−３８８； Ｂｅｒｋｎｅｒ
とＳｈａｒｐ（１９８３）「Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」１１：６００３
−６０２０； Ｇｒａｈａｍ（１９８４）「ＥＭＢＯ Ｊ．」３：２９１７−２
９２２； Ｂｅｔｔら、（１９９３）「Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」６７：５９１１
０５９２１； Ｂｅｔｔら（１９９４）「Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．」Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：８８０２−８８０６参照。
ｌｄ（１９８９）「Ｎａｔｕｒｅ」３３７：３８７−３８８； Ｂｅｒｋｎｅｒ
とＳｈａｒｐ（１９８３）「Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」１１：６００３
−６０２０； Ｇｒａｈａｍ（１９８４）「ＥＭＢＯ Ｊ．」３：２９１７−２
９２２； Ｂｅｔｔら、（１９９３）「Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」６７：５９１１
０５９２１； Ｂｅｔｔら（１９９４）「Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．」Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：８８０２−８８０６参照。
【００３１】 定義 ここに用いる「転写反応エレメント」又は「転写制御エレメント」、あるいは
「ＴＲＥ」とは、ＴＲＥを機能可能にする、宿主内で作動可能に連結されたポリ
ヌクレオチド配列の転写を増加するポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配
列である。ＴＲＥはエンハンサー及び／又はプロモーターを含むことができる。
「ＴＲＥ」とは、ＴＲＥを機能可能にする、宿主内で作動可能に連結されたポリ
ヌクレオチド配列の転写を増加するポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配
列である。ＴＲＥはエンハンサー及び／又はプロモーターを含むことができる。
【００３２】 ここで用いる「細胞状態特異的ＴＲＥ」は、細胞状態特異的ＴＲＥを機能する
ことができる細胞、即ちこれに限定されることは無いが、異常な生理状態を含む
特定の生理学的条件を示す細胞内において作動可能に連結されたポリヌクレオチ
ドに転写活性を付与するものである。「細胞状態」とは、不可逆及び／又は進行
的である、細胞の所定の又は特定の生理学的状態（又は条件）を意味する。生理
学的状態は内部的又は外部的に作られるだろう；例えば、それは代謝状態（低酸
素の様な）であり、又はそれは熱又は電離放射線により生成されるだろう。「細
胞状態」は、正常状態下で不可逆的である細胞の分化状態に関係する「細胞型」
とは異なる。一般に（絶対ではない）、ここに論ずるように、細胞状態は、例え
ば以下に示すような異常生理状態に包含される。
ことができる細胞、即ちこれに限定されることは無いが、異常な生理状態を含む
特定の生理学的条件を示す細胞内において作動可能に連結されたポリヌクレオチ
ドに転写活性を付与するものである。「細胞状態」とは、不可逆及び／又は進行
的である、細胞の所定の又は特定の生理学的状態（又は条件）を意味する。生理
学的状態は内部的又は外部的に作られるだろう；例えば、それは代謝状態（低酸
素の様な）であり、又はそれは熱又は電離放射線により生成されるだろう。「細
胞状態」は、正常状態下で不可逆的である細胞の分化状態に関係する「細胞型」
とは異なる。一般に（絶対ではない）、ここに論ずるように、細胞状態は、例え
ば以下に示すような異常生理状態に包含される。
【００３３】 「正常細胞状態」又は「正常生理状態」は、正常な生理学的条件にあり、そし
て制御された様式にて非分裂または分裂する細胞、即ち正常な生理学的状態にあ
る細胞の状態である。 ここで交換可能に使用される「異常細胞状態」及び「異常生理状態」という用
語は、異常な生理学的条件に反応する、その結果である、又は影響を受ける細胞
の状態を意味する。異常細胞状態は、細胞特異的でも細胞非特異的でもない。異
常細胞状態は、非分裂／制御された分裂状態、かつ正常な生理学的条件下にある
同一タイプの細胞に関係して規定される。
て制御された様式にて非分裂または分裂する細胞、即ち正常な生理学的状態にあ
る細胞の状態である。 ここで交換可能に使用される「異常細胞状態」及び「異常生理状態」という用
語は、異常な生理学的条件に反応する、その結果である、又は影響を受ける細胞
の状態を意味する。異常細胞状態は、細胞特異的でも細胞非特異的でもない。異
常細胞状態は、非分裂／制御された分裂状態、かつ正常な生理学的条件下にある
同一タイプの細胞に関係して規定される。
【００３４】 「正常な生理的条件」は当業者に既知である。これら条件は、細胞の体内に於
ける局在によって変わるだろう。例えば低酸素分圧は組織間で変わる。ＴＲＥが
正常状態からの逸脱に反応するかどうか決定することを目的とするインビトロ分
析に関し、これら条件は一般には約20%Ｏ2の酸素濃度、及び約37℃の温度を含む
。「制御された細胞分裂」は、当業者に良く理解されている用語であり、細胞の
正常な有糸分裂活性を意味する。当業者は正常な有糸分裂活性は細胞の型によっ
て変わることを理解する。例えば、組織に於ける多くの最終分化した細胞は、殆
ど有糸分裂活性を持たないか、全く持たないが、造血細胞は一般に有糸分裂活性
的である。
ける局在によって変わるだろう。例えば低酸素分圧は組織間で変わる。ＴＲＥが
正常状態からの逸脱に反応するかどうか決定することを目的とするインビトロ分
析に関し、これら条件は一般には約20%Ｏ2の酸素濃度、及び約37℃の温度を含む
。「制御された細胞分裂」は、当業者に良く理解されている用語であり、細胞の
正常な有糸分裂活性を意味する。当業者は正常な有糸分裂活性は細胞の型によっ
て変わることを理解する。例えば、組織に於ける多くの最終分化した細胞は、殆
ど有糸分裂活性を持たないか、全く持たないが、造血細胞は一般に有糸分裂活性
的である。
【００３５】 ここに用いられる「異常生理条件」又は「異常生理状態」は正常生理状態から
逸脱した状態を意味し、低酸素状態の様な酸素濃度の変化、生理学的温度からは
ずれた温度；アポトーシスを惹起する条件；電離放射線やＵＶ照射を含む放射線
；例えば網膜芽腫蛋白質（Ｒｂ）の様な細胞分裂をコントロールする因子の欠損
、量的不足、または不活性化の結果起こる脱制御された細胞分裂の脱制御；細胞
周期のタイミングの変動；病原菌の感染；化学物質への曝露；又は上記条件の組
合せにより特徴付けられる生理学的条件を含むが、これに限定されるものではな
い。別の例は、いずれの型の細胞にも存在でき、又は存在する、即ちその存在が
細胞の分化状態に依存する、又は関係しない突然変異である。
逸脱した状態を意味し、低酸素状態の様な酸素濃度の変化、生理学的温度からは
ずれた温度；アポトーシスを惹起する条件；電離放射線やＵＶ照射を含む放射線
；例えば網膜芽腫蛋白質（Ｒｂ）の様な細胞分裂をコントロールする因子の欠損
、量的不足、または不活性化の結果起こる脱制御された細胞分裂の脱制御；細胞
周期のタイミングの変動；病原菌の感染；化学物質への曝露；又は上記条件の組
合せにより特徴付けられる生理学的条件を含むが、これに限定されるものではな
い。別の例は、いずれの型の細胞にも存在でき、又は存在する、即ちその存在が
細胞の分化状態に依存する、又は関係しない突然変異である。
【００３６】 ここで用いられる「標的細胞」とは、細胞が作動可能に連結されたポリペプチ
ドの転写活性化に影響する様な細胞状態特異的ＴＲＥの機能を可能または誘導す
る細胞である。標的細胞は異常な生理状態であってもよい、必要な生理（又は環
境）状態を表す細胞である。好ましくは標的細胞は哺乳動物細胞、好ましくはヒ
ト細胞である。標的細胞は新生物でも、又は新生物でなくともよい。転写活性化
により、標的細胞での転写のレベルは（例えば、必要生理学状態を表さないとき
、一般には正常生理状態）コントロール細胞での転写レベルの少なくとも約２倍
、好ましくは少なくとも約５倍、好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましく
は少なくとも約２０倍、より好ましくは少なくとも約５０倍、より好ましくは約
１００倍、より好ましくは少なくとも約２００倍、より更に好ましくは少なくと
も約４００倍〜約５００倍、更により好ましくは少なくとも約１０００倍増加す
ることを意味する。正常レベルは通常、細胞状態特異的ＴＲＥを活性化する条件
下に試験した細胞に於ける活性のレベル（もしあれば）、又は必要生理条件を表
す細胞内にて測定された時に細胞状態特異的ＴＲＥを欠くレポーター構築体の活
性のレベルである。
ドの転写活性化に影響する様な細胞状態特異的ＴＲＥの機能を可能または誘導す
る細胞である。標的細胞は異常な生理状態であってもよい、必要な生理（又は環
境）状態を表す細胞である。好ましくは標的細胞は哺乳動物細胞、好ましくはヒ
ト細胞である。標的細胞は新生物でも、又は新生物でなくともよい。転写活性化
により、標的細胞での転写のレベルは（例えば、必要生理学状態を表さないとき
、一般には正常生理状態）コントロール細胞での転写レベルの少なくとも約２倍
、好ましくは少なくとも約５倍、好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましく
は少なくとも約２０倍、より好ましくは少なくとも約５０倍、より好ましくは約
１００倍、より好ましくは少なくとも約２００倍、より更に好ましくは少なくと
も約４００倍〜約５００倍、更により好ましくは少なくとも約１０００倍増加す
ることを意味する。正常レベルは通常、細胞状態特異的ＴＲＥを活性化する条件
下に試験した細胞に於ける活性のレベル（もしあれば）、又は必要生理条件を表
す細胞内にて測定された時に細胞状態特異的ＴＲＥを欠くレポーター構築体の活
性のレベルである。
【００３７】 細胞状態特異的ＴＲＥの「機能的に保存された」変異体とは、別の細胞状態特
異的ＴＲＥとは異なるが、それでも細胞状態細胞特異的転写活性を保持している
細胞状態特異的ＴＲＥである。細胞状態特異的ＴＲＥ内の差は例えば単一塩基変
異、塩基の付加、欠失、及び／又は修飾により生ずる線状配列の差に基づくこと
がある。この差は、糖、及び／又は細胞状態特異的ＴＲＥの塩基間の結合の変化
より生じ得る。
異的ＴＲＥとは異なるが、それでも細胞状態細胞特異的転写活性を保持している
細胞状態特異的ＴＲＥである。細胞状態特異的ＴＲＥ内の差は例えば単一塩基変
異、塩基の付加、欠失、及び／又は修飾により生ずる線状配列の差に基づくこと
がある。この差は、糖、及び／又は細胞状態特異的ＴＲＥの塩基間の結合の変化
より生じ得る。
【００３８】 「アデノウイルスベクター（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）」又は「
アデノウイルスベクター（ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）」（交換し利
用できる）は本発明のポリペプチド構築体を含む。本発明のポリペプチド構築体
はＤＮＡ、アデノウイルスコート内に封入されたＤＮＡ、別のウイルス又はウイ
ルス様形状内にパッケージされたＤＮＡ（たとえば、単純ヘルペス及びＡＡＶ）
、リポソーム内に封入されたＤＮＡ、ポリリジンと複合したＤＮＡ、合成ポリカ
チオン分子と複合したＤＮＡ、トランスフェリンと接合したＤＮＡ及び分子を免
疫学的に「マスク」する、及び／又は半減期を増加する化合物、たとえば、ＰＥ
Ｇと複合したＤＮＡ、及び非ウイルス蛋白質と結合したＤＮＡを含む幾つかの形
状であるが、これに限定されるものではない。好ましくは、ポリヌクレオチドは
ＤＮＡである。ここで用いられる場合、「ＤＮＡ」は塩基Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧだけ
でなく、それらの類似体または修飾型塩基、たとえば、メチル化ヌクレオチド、
中間ヌクレオチド修飾体、たとえば、非荷電型結合及びチオ酸塩、糖類似体の利
用、及び修飾された、及び／又は変更された主鎖構造、たとえば、ポリアミドも
含む。
アデノウイルスベクター（ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）」（交換し利
用できる）は本発明のポリペプチド構築体を含む。本発明のポリペプチド構築体
はＤＮＡ、アデノウイルスコート内に封入されたＤＮＡ、別のウイルス又はウイ
ルス様形状内にパッケージされたＤＮＡ（たとえば、単純ヘルペス及びＡＡＶ）
、リポソーム内に封入されたＤＮＡ、ポリリジンと複合したＤＮＡ、合成ポリカ
チオン分子と複合したＤＮＡ、トランスフェリンと接合したＤＮＡ及び分子を免
疫学的に「マスク」する、及び／又は半減期を増加する化合物、たとえば、ＰＥ
Ｇと複合したＤＮＡ、及び非ウイルス蛋白質と結合したＤＮＡを含む幾つかの形
状であるが、これに限定されるものではない。好ましくは、ポリヌクレオチドは
ＤＮＡである。ここで用いられる場合、「ＤＮＡ」は塩基Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧだけ
でなく、それらの類似体または修飾型塩基、たとえば、メチル化ヌクレオチド、
中間ヌクレオチド修飾体、たとえば、非荷電型結合及びチオ酸塩、糖類似体の利
用、及び修飾された、及び／又は変更された主鎖構造、たとえば、ポリアミドも
含む。
【００３９】 「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、ここでは交換使用可能であ
るが、任意の長さを持つリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいず
れかである重合ヌクレオチドの形状を意味する。これら用語には、単鎖、２本鎖
、３本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッ
ド、又はプリン及びピリミジン塩基を含むポリマー、あるいはその他の天然、化
学的、生化学的に修飾された、非天然あるいは誘導化ヌクレオチド塩基を含む。
ポリヌクレオチドの主鎖は、糖及びリン酸基（典型的にはＲＮＡ及びＤＮＡに見
いだせる）、又は修飾もしくは置換された糖あるいはリン酸基を含むことができ
る。あるいは、ポリヌクレオチドの主鎖はフォスフォルアミデートの様な合成置
換基のポリマーを含むことができ、従ってオリゴデオキシヌクレオシドフォスフ
ォルアミデート（Ｐ−ＮＨ２）又は混合型フォスフォルアミデート−フォスフォ
ジエステルオリゴマーである。Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓら（１９９６）「Ｎｕｃｅｌ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」２４：１８４１−８； Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら
、（１９９６）「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」２４：２３１８−２
３； Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９９６）「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．」２４：２９６６−７３。フォスフォジエステル結合の代わりにフォスフォロ
チエート結合が利用できる。Ｂｒａｕｎら、（１９８８）「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．」１４１：２０８４−９； Ｌａｔｉｍｅｒら、（１９９５）「Ｍｏｌ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．」３２： １０５７−１０６４。更に、二本鎖ポリヌクレオチドは
、化学的合成した単鎖ポリヌクレオチド産物から、相補鎖を合成し、適当な条件
下にアニーリングすること、又は相補鎖を適当なプライマーとＤＮＡポリメラー
ゼを用いて新たに合成することで得られる。
るが、任意の長さを持つリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいず
れかである重合ヌクレオチドの形状を意味する。これら用語には、単鎖、２本鎖
、３本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッ
ド、又はプリン及びピリミジン塩基を含むポリマー、あるいはその他の天然、化
学的、生化学的に修飾された、非天然あるいは誘導化ヌクレオチド塩基を含む。
ポリヌクレオチドの主鎖は、糖及びリン酸基（典型的にはＲＮＡ及びＤＮＡに見
いだせる）、又は修飾もしくは置換された糖あるいはリン酸基を含むことができ
る。あるいは、ポリヌクレオチドの主鎖はフォスフォルアミデートの様な合成置
換基のポリマーを含むことができ、従ってオリゴデオキシヌクレオシドフォスフ
ォルアミデート（Ｐ−ＮＨ２）又は混合型フォスフォルアミデート−フォスフォ
ジエステルオリゴマーである。Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓら（１９９６）「Ｎｕｃｅｌ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」２４：１８４１−８； Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら
、（１９９６）「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」２４：２３１８−２
３； Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９９６）「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．」２４：２９６６−７３。フォスフォジエステル結合の代わりにフォスフォロ
チエート結合が利用できる。Ｂｒａｕｎら、（１９８８）「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．」１４１：２０８４−９； Ｌａｔｉｍｅｒら、（１９９５）「Ｍｏｌ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．」３２： １０５７−１０６４。更に、二本鎖ポリヌクレオチドは
、化学的合成した単鎖ポリヌクレオチド産物から、相補鎖を合成し、適当な条件
下にアニーリングすること、又は相補鎖を適当なプライマーとＤＮＡポリメラー
ゼを用いて新たに合成することで得られる。
【００４０】 以下は非限定的なポリヌクレオチド例である：遺伝子、又は遺伝子断片、エク
ソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組
換え体ポリヌクレオチド、分枝型ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、い
ずれかの配列の単離ＤＮＡ、何れかの配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプ
ライマー。ポリヌクレオチドは修飾ヌクレオチド、たとえば、メチル化ヌクレオ
チド及びヌクレオチド類似体、ウラシル、その他の糖類及び結合基、たとえば、
フルオロリボーソーム及びチオ酸塩並びにヌクレオチド分枝を含むだろう。ヌク
レオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されるだろう。ポリヌクレ
オチドは重合後、標識成分による複合体化等により更に修飾されるだろう。本定
義に含まれるその他のタイプの修飾は、キャップ、１又はそれ以上の天然に生ず
るヌクレオチドの類似体による置換、及びポリヌクレオチドを蛋白質、金属イオ
ン、標識成分、他のヌクレオチド、又は固相支持体に結合させるための手段の導
入である。好ましくは、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。ここで使用する場合
、「ＤＮＡ」には塩基Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧだけでなく、それらの類似体、又はそれ
らの修飾体、たとえば、メチル化ヌクレオチド、中間ヌクレオチド修飾体、たと
えば、非電荷結合及びチオ酸塩、糖類似体の利用並びに修飾された、及び／又は
変更された主鎖構造、たとえば、ポリアミドも含まれる。
ソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組
換え体ポリヌクレオチド、分枝型ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、い
ずれかの配列の単離ＤＮＡ、何れかの配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプ
ライマー。ポリヌクレオチドは修飾ヌクレオチド、たとえば、メチル化ヌクレオ
チド及びヌクレオチド類似体、ウラシル、その他の糖類及び結合基、たとえば、
フルオロリボーソーム及びチオ酸塩並びにヌクレオチド分枝を含むだろう。ヌク
レオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されるだろう。ポリヌクレ
オチドは重合後、標識成分による複合体化等により更に修飾されるだろう。本定
義に含まれるその他のタイプの修飾は、キャップ、１又はそれ以上の天然に生ず
るヌクレオチドの類似体による置換、及びポリヌクレオチドを蛋白質、金属イオ
ン、標識成分、他のヌクレオチド、又は固相支持体に結合させるための手段の導
入である。好ましくは、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。ここで使用する場合
、「ＤＮＡ」には塩基Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧだけでなく、それらの類似体、又はそれ
らの修飾体、たとえば、メチル化ヌクレオチド、中間ヌクレオチド修飾体、たと
えば、非電荷結合及びチオ酸塩、糖類似体の利用並びに修飾された、及び／又は
変更された主鎖構造、たとえば、ポリアミドも含まれる。
【００４１】 ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド域は他配列に対し特定割合の「配列同
一性」（例えば８０％、８５％、９０％又は９５％）を持つことは、配列をそろ
え整列した場合に、その割合の塩基が比較する２配列間で同一であることを意味
する。この整列及び相同性％、又は配列同一性は、例えば「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｂｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａ
ｕｓｕｂｅｌら、１９８７）追補３０、７．７．１８章、表７．７．１に記載の
様な、当業者公知のソフトウエアープログラムを利用し決定することができる。
好ましい整列プログラムはＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｔｉｆｉｃ ａｎｄ
Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）
であり、好ましくはデフォルトパラメータを利用する。
一性」（例えば８０％、８５％、９０％又は９５％）を持つことは、配列をそろ
え整列した場合に、その割合の塩基が比較する２配列間で同一であることを意味
する。この整列及び相同性％、又は配列同一性は、例えば「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｂｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａ
ｕｓｕｂｅｌら、１９８７）追補３０、７．７．１８章、表７．７．１に記載の
様な、当業者公知のソフトウエアープログラムを利用し決定することができる。
好ましい整列プログラムはＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｔｉｆｉｃ ａｎｄ
Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）
であり、好ましくはデフォルトパラメータを利用する。
【００４２】 「転写制御下」とは当業者公知の用語であり、ポリヌクレオチド配列、通常Ｄ
ＮＡ配列の転写が、転写の開始、又は促進に寄与するエレメントへの作動可能（
動作可能に）に結合されることに依存していることを意味している。「作動可能
に連結された」とは、エレメントがそれらが機能可能な配置にある並列状態を意
味する。
ＮＡ配列の転写が、転写の開始、又は促進に寄与するエレメントへの作動可能（
動作可能に）に結合されることに依存していることを意味している。「作動可能
に連結された」とは、エレメントがそれらが機能可能な配置にある並列状態を意
味する。
【００４３】 「複製」及び「増殖」は交換可能に利用され、発明のポリヌクレオチド構築体
の産生、または増幅の能力を意味する。この用語は当分野で公知である。本発明
の目的に関しては、複製はアデノウイルス蛋白質の産生を含み、一般にはアデノ
ウイルスの産生を意味する。複製はバーストアッセイ、プラークアッセイ、又は
１段階増殖曲線アッセイの様な当分野で標準の、ここに記載するアッセイにより
測定できる。
の産生、または増幅の能力を意味する。この用語は当分野で公知である。本発明
の目的に関しては、複製はアデノウイルス蛋白質の産生を含み、一般にはアデノ
ウイルスの産生を意味する。複製はバーストアッセイ、プラークアッセイ、又は
１段階増殖曲線アッセイの様な当分野で標準の、ここに記載するアッセイにより
測定できる。
【００４４】 ここで使用する場合「細胞傷害性」とは当分野で公知の用語であり、細胞の通
常の生化学的又は生物学的活性が傷害される状態（即ち阻害される）を意味する
。これらの活性には、代謝、細胞複製、ＤＮＡ複製、転写、分子取り込みが含ま
れるが、これに限定されない。「細胞傷害性」は、細胞死及び／又は細胞溶解を
含む。細胞傷害性を示す、色素除外法、3Ｈ−チミジン取り込み、及びプラーク
アッセイの様なアッセイは当分野で既知である。
常の生化学的又は生物学的活性が傷害される状態（即ち阻害される）を意味する
。これらの活性には、代謝、細胞複製、ＤＮＡ複製、転写、分子取り込みが含ま
れるが、これに限定されない。「細胞傷害性」は、細胞死及び／又は細胞溶解を
含む。細胞傷害性を示す、色素除外法、3Ｈ−チミジン取り込み、及びプラーク
アッセイの様なアッセイは当分野で既知である。
【００４５】 ここで使用される場合「選択的細胞傷害性」という用語は、細胞状態特異的Ｔ
ＲＥが機能できない細胞（非標的細胞）に対する本発明のアデノウイルスベクタ
ーにより付与される細胞傷害性に比べた時に、細胞状態特異的ＴＲＥの機能が作
動可能になるか、又は誘導される細胞（標的細胞）に対し本発明のアデノウイル
スベクターにより付与される細胞傷害性を意味する。この様な細胞傷害性は、例
えばプラークアッセイ、標的細胞を含む腫瘍の大きさの減少又は安定化により、
あるいは腫瘍細胞に特徴的なマーカー、あるいは組織特異的マーカー、例えば前
立腺特異抗原の様な癌マーカーの血清レベルの減少又は安定化により測定できる
だろう。
ＲＥが機能できない細胞（非標的細胞）に対する本発明のアデノウイルスベクタ
ーにより付与される細胞傷害性に比べた時に、細胞状態特異的ＴＲＥの機能が作
動可能になるか、又は誘導される細胞（標的細胞）に対し本発明のアデノウイル
スベクターにより付与される細胞傷害性を意味する。この様な細胞傷害性は、例
えばプラークアッセイ、標的細胞を含む腫瘍の大きさの減少又は安定化により、
あるいは腫瘍細胞に特徴的なマーカー、あるいは組織特異的マーカー、例えば前
立腺特異抗原の様な癌マーカーの血清レベルの減少又は安定化により測定できる
だろう。
【００４６】 アデノウイルスとの関係では、「異種ポリヌクレオチド」又は「異種遺伝子」
または「トランス遺伝子」は、野生型アデノウイルスに存在しないポリヌクレオ
チド又は遺伝子である。好ましくは、トランス遺伝子もアデノウイルスベクター
による誘導前には標的細胞内に発現又は存在していないだろう。好ましいトラン
ス遺伝子の例は以下に提供される。
または「トランス遺伝子」は、野生型アデノウイルスに存在しないポリヌクレオ
チド又は遺伝子である。好ましくは、トランス遺伝子もアデノウイルスベクター
による誘導前には標的細胞内に発現又は存在していないだろう。好ましいトラン
ス遺伝子の例は以下に提供される。
【００４７】 アデノウイルスの関係では、「異種」プロモーター又はエンハンサーは、アデ
ノウイルス遺伝子に関連しない、又は由来しないものである。 アデノウイルスの関係では、「内因性」プロモーター、エンハンサー又はＴＲ
Ｅは天然の、又はアデノウイルスに由来するものである。 細胞状態特異的ＴＲＥの関係では、「異種」プロモーター又はエンハンサーは
、細胞に於いて細胞状態特異的ＴＲＥに関係又は由来しないものである。異種プ
ロモーター又はエンハンサーの例は、アルブミンプロモーター又はエンハンサー
、及び他のウイルスプロモーター及びエンハンサー、たとえば、ＳＶ４０、又は
細胞タイプ特異的ＴＲＥ、たとえば、前立腺特異的ＴＲＥである。
ノウイルス遺伝子に関連しない、又は由来しないものである。 アデノウイルスの関係では、「内因性」プロモーター、エンハンサー又はＴＲ
Ｅは天然の、又はアデノウイルスに由来するものである。 細胞状態特異的ＴＲＥの関係では、「異種」プロモーター又はエンハンサーは
、細胞に於いて細胞状態特異的ＴＲＥに関係又は由来しないものである。異種プ
ロモーター又はエンハンサーの例は、アルブミンプロモーター又はエンハンサー
、及び他のウイルスプロモーター及びエンハンサー、たとえば、ＳＶ４０、又は
細胞タイプ特異的ＴＲＥ、たとえば、前立腺特異的ＴＲＥである。
【００４８】 「細胞タイプ特異的ＴＲＥ」は他のタイプの細胞に比べ、特異的タイプの細胞
に於いて優先的に機能する。細胞状態に対し「細胞型」は不可逆的である細胞の
分化状態を反映している。例えば、前立腺特異抗原は前立腺細胞に発現されるが
、その他タイプの細胞、たとえば、肝細胞、星状細胞、心臓細胞、リンパ細胞等
では本質的に発現されない。一般に、細胞タイプ特異的ＴＲＥは１種類のタイプ
の細胞で活性である。細胞タイプ特異的ＴＲＥが１種類以上のタイプの細胞で活
性な場合、その活性は限られた数のタイプの細胞に限定され、即ち全てのタイプ
の細胞で活性であることはない。細胞タイプ特異的ＴＲＥは腫瘍細胞特異的でも
、また特異的でなくともよい。
に於いて優先的に機能する。細胞状態に対し「細胞型」は不可逆的である細胞の
分化状態を反映している。例えば、前立腺特異抗原は前立腺細胞に発現されるが
、その他タイプの細胞、たとえば、肝細胞、星状細胞、心臓細胞、リンパ細胞等
では本質的に発現されない。一般に、細胞タイプ特異的ＴＲＥは１種類のタイプ
の細胞で活性である。細胞タイプ特異的ＴＲＥが１種類以上のタイプの細胞で活
性な場合、その活性は限られた数のタイプの細胞に限定され、即ち全てのタイプ
の細胞で活性であることはない。細胞タイプ特異的ＴＲＥは腫瘍細胞特異的でも
、また特異的でなくともよい。
【００４９】 腫瘍増殖を「抑制する」とは、ここに記載のアデノウイルスベクターとの接触
無し、即ちトランスフェクション無しの場合の増殖に比し低下された増殖状態を
示す。腫瘍細胞の増殖は、腫瘍サイズ計測、 3Ｈ−チミジン取り込みアッセイを
利用した腫瘍細胞増殖の有無の決定、又は腫瘍細胞数の測定を含む、既知の方法
によりアッセイできるが、これらに限定されない。「抑制」腫瘍細胞増殖とは、
以下の状態のいずれか、又は全てを意味する；腫瘍増殖の緩慢化、遅延、又は停
止及び腫瘍の縮小。
無し、即ちトランスフェクション無しの場合の増殖に比し低下された増殖状態を
示す。腫瘍細胞の増殖は、腫瘍サイズ計測、 3Ｈ−チミジン取り込みアッセイを
利用した腫瘍細胞増殖の有無の決定、又は腫瘍細胞数の測定を含む、既知の方法
によりアッセイできるが、これらに限定されない。「抑制」腫瘍細胞増殖とは、
以下の状態のいずれか、又は全てを意味する；腫瘍増殖の緩慢化、遅延、又は停
止及び腫瘍の縮小。
【００５０】 ここで用いる場合、「新生物細胞」、「新生物」、「腫瘍」、「腫瘍細胞」、
「癌」及び「癌細胞」（置き換え使用可能）という用語は、比較的に自律的増殖
を示す細胞を意味しており、その結果それらの細胞は細胞増殖の制御の明瞭な消
失を特徴とする異常な増殖表現形を表す（即ち、脱制御細胞分裂）。新生物細胞
は悪性でも、または良性でもよい。
「癌」及び「癌細胞」（置き換え使用可能）という用語は、比較的に自律的増殖
を示す細胞を意味しており、その結果それらの細胞は細胞増殖の制御の明瞭な消
失を特徴とする異常な増殖表現形を表す（即ち、脱制御細胞分裂）。新生物細胞
は悪性でも、または良性でもよい。
【００５１】 「宿主細胞」は、本発明のアデノウイルスベクターのレシピエントになれる、
またはレシピエントである個々の細胞、又は細胞培養体を含む。宿主細胞は、単
一宿主細胞の後代を含むが、後代は自然、偶然又は意図的な突然変異、及び／又
は変更により、元の親細胞と完全に同一である必要は無い（形態又は全ＤＮＡ相
補性について）。宿主細胞は、インビボ又はインビトロにて本発明のアデノウイ
ルスベクターによりトランスフェクト又は感染させられた細胞を含む。
またはレシピエントである個々の細胞、又は細胞培養体を含む。宿主細胞は、単
一宿主細胞の後代を含むが、後代は自然、偶然又は意図的な突然変異、及び／又
は変更により、元の親細胞と完全に同一である必要は無い（形態又は全ＤＮＡ相
補性について）。宿主細胞は、インビボ又はインビトロにて本発明のアデノウイ
ルスベクターによりトランスフェクト又は感染させられた細胞を含む。
【００５２】 「複製」及び「増殖」は交換可能に利用され、発明のアデノウイルスベクター
の産生、または増幅の能力を意味する。この用語は当分野で公知である。本発明
の目的に関しては、複製はアデノウイルス蛋白質の産生を含み、一般にはアデノ
ウイルスの産生を意味する。複製はバーストアッセイ、プラークアッセイ、又は
１段階増殖曲線アッセイの様な当分野で標準のアッセイであり、またここに記載
されるアッセイにより測定できる。「複製」及び「増殖」は、ウイルス製造の工
程に直接又は間接に含まれる、ウイルス遺伝子発現；ウイルス蛋白質、核酸又は
その他成分の産生；ウイルス成分の完全ウイルスへのパッケージング；及び細胞
融解の様な活性を含むが、これに限定されない。
の産生、または増幅の能力を意味する。この用語は当分野で公知である。本発明
の目的に関しては、複製はアデノウイルス蛋白質の産生を含み、一般にはアデノ
ウイルスの産生を意味する。複製はバーストアッセイ、プラークアッセイ、又は
１段階増殖曲線アッセイの様な当分野で標準のアッセイであり、またここに記載
されるアッセイにより測定できる。「複製」及び「増殖」は、ウイルス製造の工
程に直接又は間接に含まれる、ウイルス遺伝子発現；ウイルス蛋白質、核酸又は
その他成分の産生；ウイルス成分の完全ウイルスへのパッケージング；及び細胞
融解の様な活性を含むが、これに限定されない。
【００５３】 「ＡＤＰコード配列」は、ＡＤＰ又はその機能断片をコードするポリヌクレオ
チドである。ＡＤＰとの関係に於いては、ＡＤＰの「機能的断片」はアデノウイ
ルス複製に関し細胞傷害活性、特に細胞溶解を表すものである。細胞障害活性を
測定する方法は当分野で公知であり、ここに記載される。 ＡＤＰポリペプチドを「コードする」ポリヌクレオチドは転写され、そして／
又は翻訳されＡＤＰポリペプチド又はその断片を産生することができる。これら
ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖も、この配列をコードすると言われる。
チドである。ＡＤＰとの関係に於いては、ＡＤＰの「機能的断片」はアデノウイ
ルス複製に関し細胞傷害活性、特に細胞溶解を表すものである。細胞障害活性を
測定する方法は当分野で公知であり、ここに記載される。 ＡＤＰポリペプチドを「コードする」ポリヌクレオチドは転写され、そして／
又は翻訳されＡＤＰポリペプチド又はその断片を産生することができる。これら
ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖も、この配列をコードすると言われる。
【００５４】 「ＡＤＰポリペプチド」は、ＡＤＰのアミノ酸配列（配列番号５参照）の少な
くとも１部分または１領域を含み、ＡＤＰに伴う機能、特に細胞障害性、より具
体的には細胞溶解を示すポリペプチドである。ここに論ずる様に、これらの機能
は当業者に既知の技術を利用して測定できる。例えばＡＤＰポリペプチドを提供
するであろう保存的アミノ酸置換による特定配列変位が利用できることが理解さ
れる。
くとも１部分または１領域を含み、ＡＤＰに伴う機能、特に細胞障害性、より具
体的には細胞溶解を示すポリペプチドである。ここに論ずる様に、これらの機能
は当業者に既知の技術を利用して測定できる。例えばＡＤＰポリペプチドを提供
するであろう保存的アミノ酸置換による特定配列変位が利用できることが理解さ
れる。
【００５５】 配列番号に「記載」されているポリペプチド配列とは、配列が配列番号内の連
続配列に同一のもとのとして存在することを意味する。本用語は配列番号の一部
分、又は領域、及び配列番号内に含まれる全配列を含む。 「生物学的サンプル」は、個体より得られる各種タイプのサンプルを包含して
おり、診断又はモニタリングアッセイに利用できる。本定義は生物学的起源の血
液及びその他液体サンプル、生検検体または組織培養体、あるいはそれらに由来
する細胞、及びその子孫の様な固形組織サンプルを包含する。本定義はさらに、
その獲得後に、薬剤による処理、可溶化、蛋白質又はポリヌクレオチドといった
特定成分の濃縮の様な操作が加えられたサンプルも含む。「生物学的サンプル」
という用語は臨床サンプルを包含し、更に培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物
、血清、血漿、生物学的液体及び組織サンプルも含む。
続配列に同一のもとのとして存在することを意味する。本用語は配列番号の一部
分、又は領域、及び配列番号内に含まれる全配列を含む。 「生物学的サンプル」は、個体より得られる各種タイプのサンプルを包含して
おり、診断又はモニタリングアッセイに利用できる。本定義は生物学的起源の血
液及びその他液体サンプル、生検検体または組織培養体、あるいはそれらに由来
する細胞、及びその子孫の様な固形組織サンプルを包含する。本定義はさらに、
その獲得後に、薬剤による処理、可溶化、蛋白質又はポリヌクレオチドといった
特定成分の濃縮の様な操作が加えられたサンプルも含む。「生物学的サンプル」
という用語は臨床サンプルを包含し、更に培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物
、血清、血漿、生物学的液体及び組織サンプルも含む。
【００５６】 「個体」とは脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺
乳動物は、家畜、競技動物、齧歯類、霊長類、及び愛玩動物を含む。 「有効量」とは、臨床結果を含む有益な、又は所望する結果を表すのに十分な
量である。有効量は１回またはそれ以上の投与により投与できる。本発明の目的
に関しては、アデノウイルスベクターの有効量は、疾患状態の進行を和らげ、軽
減し、安定化し、緩慢化し、あるいは遅延させるのに十分な量である。
乳動物は、家畜、競技動物、齧歯類、霊長類、及び愛玩動物を含む。 「有効量」とは、臨床結果を含む有益な、又は所望する結果を表すのに十分な
量である。有効量は１回またはそれ以上の投与により投与できる。本発明の目的
に関しては、アデノウイルスベクターの有効量は、疾患状態の進行を和らげ、軽
減し、安定化し、緩慢化し、あるいは遅延させるのに十分な量である。
【００５７】 細胞状態特異的ＴＲＥを含むアデノウイルスベクター 本発明は、細胞状態特異的ＴＲＥの転写制御下にあるアデノウイルスを含むア
デノウイルスベクター構築体を提供する。好ましくは、アデノウイルス遺伝子は
細胞傷害性（直接及び／又は間接）を付与し、より好ましくは細胞を死に至らし
める細胞傷害性を付与し、さらに好ましくはアデノウイルス複製に特異的な細胞
障害性を付与する。細胞傷害性を付与する遺伝子の例は、アデノウイルス殺滅蛋
白質（ＡＤＰ；以下考察）を含むが、これに限定されるものではない。アデノウ
イルスが標的細胞、即ち細胞状態ＴＲＥを機能できる、又は機能を誘導する細胞
内での増殖に関し選択的（即ち優先的な）複製成分である場合、これら細胞はア
デノウイルスの増殖により優先的に死滅する。標的細胞が選択的細胞傷害性、及
び／又は細胞溶解性複製により破壊されると、アデノウイルスベクターの複製は
大きく低下し、その結果無制御な感染や不所望の傍観者効果の確率が低下する。
デノウイルスベクター構築体を提供する。好ましくは、アデノウイルス遺伝子は
細胞傷害性（直接及び／又は間接）を付与し、より好ましくは細胞を死に至らし
める細胞傷害性を付与し、さらに好ましくはアデノウイルス複製に特異的な細胞
障害性を付与する。細胞傷害性を付与する遺伝子の例は、アデノウイルス殺滅蛋
白質（ＡＤＰ；以下考察）を含むが、これに限定されるものではない。アデノウ
イルスが標的細胞、即ち細胞状態ＴＲＥを機能できる、又は機能を誘導する細胞
内での増殖に関し選択的（即ち優先的な）複製成分である場合、これら細胞はア
デノウイルスの増殖により優先的に死滅する。標的細胞が選択的細胞傷害性、及
び／又は細胞溶解性複製により破壊されると、アデノウイルスベクターの複製は
大きく低下し、その結果無制御な感染や不所望の傍観者効果の確率が低下する。
【００５８】 インビトロ培養体は、標的細胞、例えば新生物細胞又はその他望ましくない細
胞の発生（即ち存在）及び／又は再発に関し、混合体（例えば、生検又はその他
適当な生物学的サンプル）をモニターするために維持されるだろう。細胞傷害性
を更に確実にするために、細胞障害作用を有する１またはそれ以上のトランス遺
伝子も存在し、選択的転写制御下にあるだろう。本実施態様では、高い確実性を
もって標的細胞は破壊されるだろう。更に、又はあるいは、アデノウイルスベク
ターには、選択的転写制御なしに、あるいは制御下に細胞傷害性及び／又は細胞
死を付与するアデノウイルス遺伝子（たとえば、ＡＤＰ）が含まれるだろう。
胞の発生（即ち存在）及び／又は再発に関し、混合体（例えば、生検又はその他
適当な生物学的サンプル）をモニターするために維持されるだろう。細胞傷害性
を更に確実にするために、細胞障害作用を有する１またはそれ以上のトランス遺
伝子も存在し、選択的転写制御下にあるだろう。本実施態様では、高い確実性を
もって標的細胞は破壊されるだろう。更に、又はあるいは、アデノウイルスベク
ターには、選択的転写制御なしに、あるいは制御下に細胞傷害性及び／又は細胞
死を付与するアデノウイルス遺伝子（たとえば、ＡＤＰ）が含まれるだろう。
【００５９】 本発明のアデノウイルスベクターでの利用に適した細胞状態特異的ＴＲＥは、
あらゆる種、好ましくは哺乳動物に由来する。細胞状態に反応し、又は関連して
発現する数多くの遺伝子が報告されている。これら細胞状態関連遺伝子の何れか
を利用することで、細胞状態特異的ＴＲＥを作製できるだろう。 細胞状態の例は細胞周期である。その発現が細胞周期に関連する遺伝子の例は
、広く発現している増殖制御遺伝子の一つＥ２Ｆ−１であり、Ｓ期に最高転写活
性を示す。Ｊｏｈｎｓｏｎら、（１９９４）「Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．」８：１５
１４−１５２５． ＲＢ蛋白質及びその他のＢＢファミリーのメンバーは、Ｅ２
Ｆ−１と特異的複合体を形成し、それによってその転写活性化能を阻害する。即
ちＥ２Ｆ−１反応性プロモーターはＲＢによりダウンレギュレーションされる。
多くの腫瘍細胞が破壊されたＲＢ機能を有し、これがＥ２Ｆ−１反応性プロモー
ターの脱抑制を誘導し、その結果細胞分裂が脱制御される。
あらゆる種、好ましくは哺乳動物に由来する。細胞状態に反応し、又は関連して
発現する数多くの遺伝子が報告されている。これら細胞状態関連遺伝子の何れか
を利用することで、細胞状態特異的ＴＲＥを作製できるだろう。 細胞状態の例は細胞周期である。その発現が細胞周期に関連する遺伝子の例は
、広く発現している増殖制御遺伝子の一つＥ２Ｆ−１であり、Ｓ期に最高転写活
性を示す。Ｊｏｈｎｓｏｎら、（１９９４）「Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．」８：１５
１４−１５２５． ＲＢ蛋白質及びその他のＢＢファミリーのメンバーは、Ｅ２
Ｆ−１と特異的複合体を形成し、それによってその転写活性化能を阻害する。即
ちＥ２Ｆ−１反応性プロモーターはＲＢによりダウンレギュレーションされる。
多くの腫瘍細胞が破壊されたＲＢ機能を有し、これがＥ２Ｆ−１反応性プロモー
ターの脱抑制を誘導し、その結果細胞分裂が脱制御される。
【００６０】 従って、実施態様の一つでは、本発明はアデノウイルス遺伝子（好ましくは複
製に必要な遺伝子）が細胞状態特異的ＴＲＥの転写制御下にあり、細胞状態特異
的ＴＲＥが細胞周期活性化、又は細胞周期特異的ＴＲＥを含むアデノウイルスベ
クターを提供する。実施態様の一つでは、細胞周期活性化ＴＲＥはＥ２Ｆ１ＴＲ
Ｅである。実施態様の一つでは、ＴＲＥは図３及び配列番号２記載の配列を含む
。
製に必要な遺伝子）が細胞状態特異的ＴＲＥの転写制御下にあり、細胞状態特異
的ＴＲＥが細胞周期活性化、又は細胞周期特異的ＴＲＥを含むアデノウイルスベ
クターを提供する。実施態様の一つでは、細胞周期活性化ＴＲＥはＥ２Ｆ１ＴＲ
Ｅである。実施態様の一つでは、ＴＲＥは図３及び配列番号２記載の配列を含む
。
【００６１】 細胞状態により制御される別のグループの遺伝子は、その発現が低酸素状態に
反応して増加するものである。ＢｕｎｎとＰｏｙｔｏｎ（１９９６）「Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ．Ｒｅｖ．」７６：８３９−８８５； ＤａｃｈｓとＳｔｒａｔｆｏｒｄ
（１９９６）「Ｂｒ．Ｊ．Ｃｎａｃｅｒ」７４：５１２６−５１３２； Ｇｕｉ
ｌｌｅｍｉｎとＫｒａｓｎｏｗ（１９９７）「Ｃｅｌｌ」８９：９−１２。腫瘍
細胞が多くの場合血管を形成する内皮細胞より早く増殖することが一因となり、
多くの腫瘍では血液供給が不十分となり、その結果腫瘍内に低酸素域が生ずる。
Ｆｏｌｋｍａｎ（１９８９）「Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．」
８２；４−６；及びＫａｌｌｉｎｏｗｓｋｉ（１９９６）「Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅ
ｒ」Ｊ．９：３７−４０。低酸素反応の重要なインジケーターは、転写複合体Ｈ
ＩＦ−１又は低酸素誘導因子−１であり、血管内皮細胞因子を含むこれらは複数
の遺伝子の制御域内で低酸素反応エレメント（ＨＲＥ）、及びエノラーゼ−１を
含む糖分解酵素をコードするいくつかの遺伝子と相互作用する。マウスＨＲＥ配
列は同定され、特性分析されている。Ｆｉｒｔｈら（１９９４）「Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」９１：６４９６−６５００。ラットエノラ
ーゼ−１プロモーター由来のＨＲＥはＪｉａｎｇら（１９９７）「Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．」５７：５３２８−５３３５に記載されている。ラットエノラーゼ−
１プロモーター由来のＨＲＥは図２に記載され、配列番号１として示されている
。
反応して増加するものである。ＢｕｎｎとＰｏｙｔｏｎ（１９９６）「Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ．Ｒｅｖ．」７６：８３９−８８５； ＤａｃｈｓとＳｔｒａｔｆｏｒｄ
（１９９６）「Ｂｒ．Ｊ．Ｃｎａｃｅｒ」７４：５１２６−５１３２； Ｇｕｉ
ｌｌｅｍｉｎとＫｒａｓｎｏｗ（１９９７）「Ｃｅｌｌ」８９：９−１２。腫瘍
細胞が多くの場合血管を形成する内皮細胞より早く増殖することが一因となり、
多くの腫瘍では血液供給が不十分となり、その結果腫瘍内に低酸素域が生ずる。
Ｆｏｌｋｍａｎ（１９８９）「Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．」
８２；４−６；及びＫａｌｌｉｎｏｗｓｋｉ（１９９６）「Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅ
ｒ」Ｊ．９：３７−４０。低酸素反応の重要なインジケーターは、転写複合体Ｈ
ＩＦ−１又は低酸素誘導因子−１であり、血管内皮細胞因子を含むこれらは複数
の遺伝子の制御域内で低酸素反応エレメント（ＨＲＥ）、及びエノラーゼ−１を
含む糖分解酵素をコードするいくつかの遺伝子と相互作用する。マウスＨＲＥ配
列は同定され、特性分析されている。Ｆｉｒｔｈら（１９９４）「Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」９１：６４９６−６５００。ラットエノラ
ーゼ−１プロモーター由来のＨＲＥはＪｉａｎｇら（１９９７）「Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．」５７：５３２８−５３３５に記載されている。ラットエノラーゼ−
１プロモーター由来のＨＲＥは図２に記載され、配列番号１として示されている
。
【００６２】 従って、実施態様の一つでは、アデノウイルスベクターはＨＲＥを含む細胞状
態特異的ＴＲＥの転写制御下にアデノウイルス遺伝子、好ましくは複製に必須な
アデノウイルス遺伝子を含む。実施態様の一つでは、細胞状態特異的ＴＲＥは図
２及び配列番号１に示すＨＲＥを含む。 別の細胞状態特異的ＴＲＥは、熱誘導（即ち熱ショク）プロモーター、及び電
離放射線及びＵＶ照射を含む放射線曝露に反応するプロモーターを含む。例えば
、初期増殖反応−１（Ｅｇｒ−１）遺伝子のプロモーター領域は、電離放射線照
射により誘導されるエレメントを含む。Ｈａｌｌａｈａｎら、（１９９５）「Ｎ
ａｔ． Ｍｅｄ．」１：７８６−７９１；及びＴｓａｉ−Ｍｏｒｒｉｓら、（１
９８８）「Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．」１６：８８３５−８８４６。熱誘
導エレメントを含む熱誘導プロモーターが報告されている。例えば「Ｓｔｒｅｓ
ｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」，
Ｍｏｒｉｍｏｔｏ， ＴｉｓｓｅｒｅｓとＧｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ，編集、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：
の中のＷｅｌｓｈ（１９９０）及びＰｅｒｉｓｉｃら（１９８９）「Ｃｅｌｌ」
５９：７９７−８０６を参照。従って、幾つかの実施態様では、細胞状態特異的
ＴＲＥは電離放射線照射に反応するエレメントを含む。実施態様の一つでは、こ
のＴＲＥはＥｇｒ−１遺伝子の５’フランキング配列を含む。別の実施態様では
、細胞状態特異的ＴＲＥは熱ショック反応性、又は熱誘導性エレメントを含む。
態特異的ＴＲＥの転写制御下にアデノウイルス遺伝子、好ましくは複製に必須な
アデノウイルス遺伝子を含む。実施態様の一つでは、細胞状態特異的ＴＲＥは図
２及び配列番号１に示すＨＲＥを含む。 別の細胞状態特異的ＴＲＥは、熱誘導（即ち熱ショク）プロモーター、及び電
離放射線及びＵＶ照射を含む放射線曝露に反応するプロモーターを含む。例えば
、初期増殖反応−１（Ｅｇｒ−１）遺伝子のプロモーター領域は、電離放射線照
射により誘導されるエレメントを含む。Ｈａｌｌａｈａｎら、（１９９５）「Ｎ
ａｔ． Ｍｅｄ．」１：７８６−７９１；及びＴｓａｉ−Ｍｏｒｒｉｓら、（１
９８８）「Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．」１６：８８３５−８８４６。熱誘
導エレメントを含む熱誘導プロモーターが報告されている。例えば「Ｓｔｒｅｓ
ｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」，
Ｍｏｒｉｍｏｔｏ， ＴｉｓｓｅｒｅｓとＧｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ，編集、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：
の中のＷｅｌｓｈ（１９９０）及びＰｅｒｉｓｉｃら（１９８９）「Ｃｅｌｌ」
５９：７９７−８０６を参照。従って、幾つかの実施態様では、細胞状態特異的
ＴＲＥは電離放射線照射に反応するエレメントを含む。実施態様の一つでは、こ
のＴＲＥはＥｇｒ−１遺伝子の５’フランキング配列を含む。別の実施態様では
、細胞状態特異的ＴＲＥは熱ショック反応性、又は熱誘導性エレメントを含む。
【００６３】 細胞状態特異的ＴＲＥも多量体を含むこともできる。例えば、ＨＲＥは少なく
とも２、少なくとも３、少なくとも４又は少なくとも５個の低酸素反応性エレメ
ントのタンデム列を含む。これらの多量体も異種プロモーター及び／またはエン
ハンサー配列を含むことができる。 細胞状態特異的ＴＲＥはサイレンサーを含んでいても、また含まなくてもよい
。サイレンサーの存在（即ち、負の制御エレメント）は非許容細胞（即ち正常細
胞状態）での転写（及びその結果としての複製）の遮断を支援するだろう。即ち
、サイレンサーの存在は、非標的細胞でのアデノウイルスベクターの複製を効果
的に阻害することで、細胞状態特異的複製を高めるだろう。あるいは、サイレン
サーの欠如は標的細胞での複製の実施を支援し、即ち標的細胞内の複製をより効
率的にすることで、細胞状態特異的複製を高めるだろう。
とも２、少なくとも３、少なくとも４又は少なくとも５個の低酸素反応性エレメ
ントのタンデム列を含む。これらの多量体も異種プロモーター及び／またはエン
ハンサー配列を含むことができる。 細胞状態特異的ＴＲＥはサイレンサーを含んでいても、また含まなくてもよい
。サイレンサーの存在（即ち、負の制御エレメント）は非許容細胞（即ち正常細
胞状態）での転写（及びその結果としての複製）の遮断を支援するだろう。即ち
、サイレンサーの存在は、非標的細胞でのアデノウイルスベクターの複製を効果
的に阻害することで、細胞状態特異的複製を高めるだろう。あるいは、サイレン
サーの欠如は標的細胞での複製の実施を支援し、即ち標的細胞内の複製をより効
率的にすることで、細胞状態特異的複製を高めるだろう。
【００６４】 別の実施態様では、アデノウイルスベクターは第１細胞特異状態ＴＲＥの制御
下にあるアデノウイルスの複製に必須なアデノウイルス遺伝子、及び第２細胞特
異状態ＴＲＥの制御下のアデノウイルス複製に必須な第２アデノウイルス遺伝子
を含む。第１及び第２細胞状態特異的ＴＲＥは同一でも、同一でなくともよく、
そして本質的に相互に同一であっても、また同一でなくともよい。「本質的に同
一」とは、２つのＴＲＥ間の配列同一性に必要な程度を意味する。これらのＴＲ
Ｅ間の配列同一性の程度は少なくとも約８０％であり、好ましくは少なくとも約
８５％であり、より好ましくは少なくとも約９０％であり、更により好ましくは
少なくとも約９５％であり、更により好ましくは少なくとも約９８％であり、最
も好ましくは１００％である。配列同一性は、即ち当業者に既知の「Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ
．＜．Ａｕｓｕｂｅｌら、編集、１９８７）追補３０、７．７．１８章、表７．
７．１の様な配列整列プログラムを用い、配列を比較することで決定できる。好
ましい整列プログラムはＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｔｉｆｉｃ ａｎｄ
Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）で
あり、好ましくはデフォルトパラメータを利用する。又は、ストリンジェント条
件下のハイブリダイゼーションも配列同一性を示すことができる。ストリンジェ
ント条件は当分野で既知である；例えばストリンジェント条件の例は、温度８０
℃（又はそれ以上の温度）及び６×ＳＳＣ（またはそれ以下の濃度のＳＳＣ）で
ある。その他のハイブリダイゼーション条件及びパラメーター（ストリンジェン
ト度が高くなる順番で）は：インキュベーション温度が２５℃、３７℃、５０℃
及び６８℃；緩衝液濃度１０×ＳＳＣ，６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳ
Ｃ（１×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ及び１５ｍＭのクエン酸緩衝液）及び等
価のその他緩衝液；フォルムアミド濃度０％、２５％、５０％及び７５％；イン
キュベーション時間約２４時間から約５分；１、２またはそれ以上の洗浄段階；
洗浄インキュベーション時間１、２又は１５分、洗浄液６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ
、０．１×ＳＳＣ又は脱イオン水である。
下にあるアデノウイルスの複製に必須なアデノウイルス遺伝子、及び第２細胞特
異状態ＴＲＥの制御下のアデノウイルス複製に必須な第２アデノウイルス遺伝子
を含む。第１及び第２細胞状態特異的ＴＲＥは同一でも、同一でなくともよく、
そして本質的に相互に同一であっても、また同一でなくともよい。「本質的に同
一」とは、２つのＴＲＥ間の配列同一性に必要な程度を意味する。これらのＴＲ
Ｅ間の配列同一性の程度は少なくとも約８０％であり、好ましくは少なくとも約
８５％であり、より好ましくは少なくとも約９０％であり、更により好ましくは
少なくとも約９５％であり、更により好ましくは少なくとも約９８％であり、最
も好ましくは１００％である。配列同一性は、即ち当業者に既知の「Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ
．＜．Ａｕｓｕｂｅｌら、編集、１９８７）追補３０、７．７．１８章、表７．
７．１の様な配列整列プログラムを用い、配列を比較することで決定できる。好
ましい整列プログラムはＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｔｉｆｉｃ ａｎｄ
Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）で
あり、好ましくはデフォルトパラメータを利用する。又は、ストリンジェント条
件下のハイブリダイゼーションも配列同一性を示すことができる。ストリンジェ
ント条件は当分野で既知である；例えばストリンジェント条件の例は、温度８０
℃（又はそれ以上の温度）及び６×ＳＳＣ（またはそれ以下の濃度のＳＳＣ）で
ある。その他のハイブリダイゼーション条件及びパラメーター（ストリンジェン
ト度が高くなる順番で）は：インキュベーション温度が２５℃、３７℃、５０℃
及び６８℃；緩衝液濃度１０×ＳＳＣ，６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳ
Ｃ（１×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ及び１５ｍＭのクエン酸緩衝液）及び等
価のその他緩衝液；フォルムアミド濃度０％、２５％、５０％及び７５％；イン
キュベーション時間約２４時間から約５分；１、２またはそれ以上の洗浄段階；
洗浄インキュベーション時間１、２又は１５分、洗浄液６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ
、０．１×ＳＳＣ又は脱イオン水である。
【００６５】 第１及び第２細胞条件特異的ＴＲＥが同一、又は本質的に同一であるアデノウ
イルス構築体は、特にこれらＴＲＥが初期遺伝子（たとえば、Ｅ１ＡやＥ１Ｂ）
を制御する場合、例えば自動的な「自己崩壊」特性がウイルスにより遮断され、
それにより増殖の程度を制御できる場合には、特定の観点に関し所望される、不
安定性を示す。従って幾つかの実施態様では、第１及び第２細胞条件特異的ＴＲ
Ｅ、又は第１及び第２ＴＲＥ（一方が細胞条件特異的ＴＲＥである）は、互いの
同一性が低い２つのＴＲＥ（即ち、より大きな配列変動及び非類似性を持つ）と
比較した場合、不安定性を付与するに十分同一である。好適実施態様は、２つの
ＴＲＥがＥ１Ａ及びＥ１Ｂをそれぞれ制御するものである。「不安定性」とは、
アデノウイルスが細胞内で複製する時アデノウイルスベクターの構造健全性が保
存されていないことを意味しており、サザン分析の様な標準的技術を利用して測
定することができる。別の実施態様では、第１及び第２ＴＲＥは十分多様であり
、及び／又はベクターは安定な状態に置かれる（即ち、アデノウイルスベクター
の構造健全性は保存されている）。
イルス構築体は、特にこれらＴＲＥが初期遺伝子（たとえば、Ｅ１ＡやＥ１Ｂ）
を制御する場合、例えば自動的な「自己崩壊」特性がウイルスにより遮断され、
それにより増殖の程度を制御できる場合には、特定の観点に関し所望される、不
安定性を示す。従って幾つかの実施態様では、第１及び第２細胞条件特異的ＴＲ
Ｅ、又は第１及び第２ＴＲＥ（一方が細胞条件特異的ＴＲＥである）は、互いの
同一性が低い２つのＴＲＥ（即ち、より大きな配列変動及び非類似性を持つ）と
比較した場合、不安定性を付与するに十分同一である。好適実施態様は、２つの
ＴＲＥがＥ１Ａ及びＥ１Ｂをそれぞれ制御するものである。「不安定性」とは、
アデノウイルスが細胞内で複製する時アデノウイルスベクターの構造健全性が保
存されていないことを意味しており、サザン分析の様な標準的技術を利用して測
定することができる。別の実施態様では、第１及び第２ＴＲＥは十分多様であり
、及び／又はベクターは安定な状態に置かれる（即ち、アデノウイルスベクター
の構造健全性は保存されている）。
【００６６】 別の実施態様では、アデノウイルスベクターは第１細胞条件特異的ＴＲＥの制
御下にあるアデノウイルス複製に必須なアデノウイルス遺伝子、及び第２細胞条
件特異的ＴＲＥの制御下にあるトランス遺伝子を含む。第１及び第２細胞条件特
異的ＴＲＥは本質的に同一であっても、また同一でなくても良い。 幾つかの実施態様では、細胞条件特異的ＴＲＥは、例えば別の細胞条件特異的
ＴＲＥ、あるいは細胞型特異的ＴＲＥの様な別のＴＲＥと並列することができる
。「並列する」とは、細胞条件特異的ＴＲＥと第２ＴＲＥが同一遺伝子を転写的
に制御すること、又は少なくとも同一遺伝子に関し隣接することを意味する。こ
れら実施態様に関し、細胞条件特異的ＴＲＥ及び第２ＴＲＥは以下を含む多くの
配置のいずれでも良い（ａ）互いに隣り合う（即ち隣接する）；（ｂ）両方の５
’が転写的に制御されている遺伝子に隣接している（即ち両者の間に中断配列を
持つ）；（ｃ）一方のＴＲＥ５’ともう一方のＴＲＥ３’が遺伝子に隣接してい
るものであるが、これに限定されない。例えば、実施例１に記載され、及び図１
に示されている様に、細胞型特異的ＴＲＥは細胞条件特異的ＴＲＥに並列するこ
とができ、作動可能に連結したアデノウイルス遺伝子の転写を制御することがで
きる。この様な「複合」ＴＲＥを使って作動可能に連結されたポリペプチドの細
胞状態及び細胞型特異的発現を可能にし、その結果有意により優れた特異性及び
／又は効率性を付与することができるだろう。細胞型特異的ＴＲＥの例は以下に
提供される。あるいは、「複合」ＴＲＥは、様々な、そしておそらく相乗的であ
る細胞状態特異性を付与するのに利用できる。例えば、複合ＴＲＥは低酸素状態
及び熱ショックに対する特異性を付与できるだろう。
御下にあるアデノウイルス複製に必須なアデノウイルス遺伝子、及び第２細胞条
件特異的ＴＲＥの制御下にあるトランス遺伝子を含む。第１及び第２細胞条件特
異的ＴＲＥは本質的に同一であっても、また同一でなくても良い。 幾つかの実施態様では、細胞条件特異的ＴＲＥは、例えば別の細胞条件特異的
ＴＲＥ、あるいは細胞型特異的ＴＲＥの様な別のＴＲＥと並列することができる
。「並列する」とは、細胞条件特異的ＴＲＥと第２ＴＲＥが同一遺伝子を転写的
に制御すること、又は少なくとも同一遺伝子に関し隣接することを意味する。こ
れら実施態様に関し、細胞条件特異的ＴＲＥ及び第２ＴＲＥは以下を含む多くの
配置のいずれでも良い（ａ）互いに隣り合う（即ち隣接する）；（ｂ）両方の５
’が転写的に制御されている遺伝子に隣接している（即ち両者の間に中断配列を
持つ）；（ｃ）一方のＴＲＥ５’ともう一方のＴＲＥ３’が遺伝子に隣接してい
るものであるが、これに限定されない。例えば、実施例１に記載され、及び図１
に示されている様に、細胞型特異的ＴＲＥは細胞条件特異的ＴＲＥに並列するこ
とができ、作動可能に連結したアデノウイルス遺伝子の転写を制御することがで
きる。この様な「複合」ＴＲＥを使って作動可能に連結されたポリペプチドの細
胞状態及び細胞型特異的発現を可能にし、その結果有意により優れた特異性及び
／又は効率性を付与することができるだろう。細胞型特異的ＴＲＥの例は以下に
提供される。あるいは、「複合」ＴＲＥは、様々な、そしておそらく相乗的であ
る細胞状態特異性を付与するのに利用できる。例えば、複合ＴＲＥは低酸素状態
及び熱ショックに対する特異性を付与できるだろう。
【００６７】 実施例１は、ＨＲＥを含むＥ１Ａの上流、及び前立腺特異的ＴＲＥであるＰＳ
Ａ−ＴＲＥ（エンハンサー配列−５３２２〜−３７３８がＰＳＡ配列−５４１〜
＋１２に融合したものより成る；米国特許第５，８７１，７２６号；第５，６４
８，４７８号参照）の複合ＴＲＥを持つアデノウイルス構築体を記載する。従っ
て、幾つかの実施態様では本発明はＨＲＥ（好ましくは配列番号１記載の６７塩
基断片を含む、又は構成される）及び前立腺細胞特異的ＴＲＥ、好ましくはＰＳ
Ａエンハンサーを含む（好ましくは配列番号３の−５３２２〜３７５８；あるい
は約５０３〜約２０８６（図４の約５０３〜約２０８６の塩基）及びプロモータ
ー、好ましくはＰＳＡエンハンサーとＰＳＡプロモーターを含む（配列番号３の
約５２８５〜約５８３６）を含むＴＲＥの転写制御下にある複製、好ましくは初
期遺伝子の複製、好ましくはＥ１Ａ及びＥ１Ｂの複製に必須なアデノウイルスを
含むアデノウイルスベクターを提供する。
Ａ−ＴＲＥ（エンハンサー配列−５３２２〜−３７３８がＰＳＡ配列−５４１〜
＋１２に融合したものより成る；米国特許第５，８７１，７２６号；第５，６４
８，４７８号参照）の複合ＴＲＥを持つアデノウイルス構築体を記載する。従っ
て、幾つかの実施態様では本発明はＨＲＥ（好ましくは配列番号１記載の６７塩
基断片を含む、又は構成される）及び前立腺細胞特異的ＴＲＥ、好ましくはＰＳ
Ａエンハンサーを含む（好ましくは配列番号３の−５３２２〜３７５８；あるい
は約５０３〜約２０８６（図４の約５０３〜約２０８６の塩基）及びプロモータ
ー、好ましくはＰＳＡエンハンサーとＰＳＡプロモーターを含む（配列番号３の
約５２８５〜約５８３６）を含むＴＲＥの転写制御下にある複製、好ましくは初
期遺伝子の複製、好ましくはＥ１Ａ及びＥ１Ｂの複製に必須なアデノウイルスを
含むアデノウイルスベクターを提供する。
【００６８】 当業者により容易に認識されるように、細胞特異的ＴＲＥはポリヌクレオチド
配列であり、各種配列順序を越える機能を示すことができるものである。ヌクレ
オチド置換、付加、欠失の方法は当分野で既知であり、容易に利用できる機能ア
ッセイ（ＣＡＴ又はルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの様な）によって
、熟練者は配列変異体が必要な細胞状態特異的転写機能を現しているかどうかを
決定することができる。従って、本発明は置換、付加及び／又は欠失を含む、こ
こに開示された核酸配列の機能的に保存された変異体も含む。単一の理論によっ
て拘束されることを望まないが、本発明者は特定の変化が発現レベルの増加を含
む発現レベルの変化をもたらす可能性に注目した。発現レベルの変化、好ましく
は発現レベルの上昇は、特定の例、進行性の強い癌や、あるいはより迅速且つ／
又は攻撃的な細胞の殺滅パターンが望まれる場合（例えば個体の免疫抑制状態に
より）に特に望まれるだろう。
配列であり、各種配列順序を越える機能を示すことができるものである。ヌクレ
オチド置換、付加、欠失の方法は当分野で既知であり、容易に利用できる機能ア
ッセイ（ＣＡＴ又はルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの様な）によって
、熟練者は配列変異体が必要な細胞状態特異的転写機能を現しているかどうかを
決定することができる。従って、本発明は置換、付加及び／又は欠失を含む、こ
こに開示された核酸配列の機能的に保存された変異体も含む。単一の理論によっ
て拘束されることを望まないが、本発明者は特定の変化が発現レベルの増加を含
む発現レベルの変化をもたらす可能性に注目した。発現レベルの変化、好ましく
は発現レベルの上昇は、特定の例、進行性の強い癌や、あるいはより迅速且つ／
又は攻撃的な細胞の殺滅パターンが望まれる場合（例えば個体の免疫抑制状態に
より）に特に望まれるだろう。
【００６９】 細胞状態特異的ＴＲＥ活性がどの様にして決定できるかの例としては、ポリヌ
クレオチド配列又はこれら配列のセットを当分野既知の方法、例えば化学的合成
、部位特異的突然変異、ＰＣＲ及び／又は組換え体法を利用し作製することがで
きる。試験すべき配列は適当なレポーター遺伝子、もとよりこれに限定されない
が、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−
ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子によりコードされる）、ルシフェラーゼ（ｌ
ｕｃ遺伝子によりコードされる）、グリーン蛍光蛋白質、アルカリ性フォスファ
ターゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼを含むベクター内に挿入される。これら
ベクター及びアッセイは、特に市販製品より容易に入手できる。この様に構築さ
れたプラスミドは好適な宿主細胞内にトランスフェクトされ、リン酸カルシウム
沈殿法、エレクトロポレーション法、リポソーム法（リポフェクション）及びＤ
ＥＡＥデキストランの様な当分野で既知のトランスフェクション法を用い、推定
される細胞状態特異的ＴＲＥによりコントロールされるレポーター遺伝子の発現
について試験される。好適宿主細胞はＨｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ７、Ｈｕ
Ｈ１／Ｃ１２、ＬＮＣａＰ、ＨＢＬ−１００、Ｃｈａｎｇ肝臓細胞、ＭＣＦ−７
、ＨＬＦ、ＨＬＥ、３Ｔ３、ＨＵＶＥＣ及びＨｅｌａを含むが、これに限定され
ない。試験されるＴＲＥレポーター遺伝子構築体をトランスフェクトされた宿主
細胞は細胞状態（例えば異常な生理状態を生ずる）変化を生ずる状態に供する。
これら条件に供されない同一細胞、即ち正常生理条件下、従って正常生理条件下
にある同一細胞をコントロールとする。結果は、標準的アッセイを利用してレポ
ーター遺伝子の発現レベルを測定することで得られる。特定状態及びコントロー
ルの細胞間の発現の比較は、転写活性の有無を示す。「転写活性化」は以下に定
義される。
クレオチド配列又はこれら配列のセットを当分野既知の方法、例えば化学的合成
、部位特異的突然変異、ＰＣＲ及び／又は組換え体法を利用し作製することがで
きる。試験すべき配列は適当なレポーター遺伝子、もとよりこれに限定されない
が、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−
ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子によりコードされる）、ルシフェラーゼ（ｌ
ｕｃ遺伝子によりコードされる）、グリーン蛍光蛋白質、アルカリ性フォスファ
ターゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼを含むベクター内に挿入される。これら
ベクター及びアッセイは、特に市販製品より容易に入手できる。この様に構築さ
れたプラスミドは好適な宿主細胞内にトランスフェクトされ、リン酸カルシウム
沈殿法、エレクトロポレーション法、リポソーム法（リポフェクション）及びＤ
ＥＡＥデキストランの様な当分野で既知のトランスフェクション法を用い、推定
される細胞状態特異的ＴＲＥによりコントロールされるレポーター遺伝子の発現
について試験される。好適宿主細胞はＨｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ７、Ｈｕ
Ｈ１／Ｃ１２、ＬＮＣａＰ、ＨＢＬ−１００、Ｃｈａｎｇ肝臓細胞、ＭＣＦ−７
、ＨＬＦ、ＨＬＥ、３Ｔ３、ＨＵＶＥＣ及びＨｅｌａを含むが、これに限定され
ない。試験されるＴＲＥレポーター遺伝子構築体をトランスフェクトされた宿主
細胞は細胞状態（例えば異常な生理状態を生ずる）変化を生ずる状態に供する。
これら条件に供されない同一細胞、即ち正常生理条件下、従って正常生理条件下
にある同一細胞をコントロールとする。結果は、標準的アッセイを利用してレポ
ーター遺伝子の発現レベルを測定することで得られる。特定状態及びコントロー
ルの細胞間の発現の比較は、転写活性の有無を示す。「転写活性化」は以下に定
義される。
【００７０】 各種細胞状態特異的ＴＲＥ間の比較は、例えば正常及び異常生理条件下にある
単一細胞株内の発現レベルを測定し、比較することで評価される。これらの比較
は、可逆的環境条件（たとえば、熱）に供された単一細胞株及びそれら条件に供
されない細胞内の発現レベルを測定し、比較することでもできる。細胞状態特異
的ＴＲＥの絶対転写活性は標的細胞の性質、細胞状態特異的ＴＲＥの提供形式や
形状、及び選択的に転写活性化されるコード配列の様な複数の要因に依存するだ
ろう。使用する各種プラスミドのサイズを補償するため、活性はトランスフェク
トされたプラスミドのモル数当たりの比活性として表現される。あるいは、転写
（即ちｍＲＮＡ）レベルは標準的なノーザン分析とハイブリダイゼーション技術
を利用し測定できる。トランスフェクションレベルは例えばサイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）極初期プロモーターのコントロール下にある、各種レポーター遺伝
子をコードするプラスミドを共トランスフェクションすることで測定される。こ
の分析は、負の制御域、即ちサイレンサーも示すことができる。
単一細胞株内の発現レベルを測定し、比較することで評価される。これらの比較
は、可逆的環境条件（たとえば、熱）に供された単一細胞株及びそれら条件に供
されない細胞内の発現レベルを測定し、比較することでもできる。細胞状態特異
的ＴＲＥの絶対転写活性は標的細胞の性質、細胞状態特異的ＴＲＥの提供形式や
形状、及び選択的に転写活性化されるコード配列の様な複数の要因に依存するだ
ろう。使用する各種プラスミドのサイズを補償するため、活性はトランスフェク
トされたプラスミドのモル数当たりの比活性として表現される。あるいは、転写
（即ちｍＲＮＡ）レベルは標準的なノーザン分析とハイブリダイゼーション技術
を利用し測定できる。トランスフェクションレベルは例えばサイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）極初期プロモーターのコントロール下にある、各種レポーター遺伝
子をコードするプラスミドを共トランスフェクションすることで測定される。こ
の分析は、負の制御域、即ちサイレンサーも示すことができる。
【００７１】 低酸素誘導の測定方法の例としては、Ｊｉａｎｇら（１９９７）「Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」５７：５３２８−５３３５又はＤａｃｈｓら、（１９９
７）「Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．」３：５１５−５２０に記載の様なアッセイを利
用することができる。例えば推定ＨＲＥ又はその複数のタンデムコピーを、最少
プロモーターエレメントと共に作動可能な状態で含み、検出可能又は検出可能な
シグナルを提供するのに利用できる蛋白質をコードするポリヌクレオチドの転写
を制御する構築体を宿主細胞内にトランスフェクトする。次に宿主細胞は正常酸
素条件（例えば２０％Ｏ2）及び各種低酸素、例えば５％、２％、１％、０．１
％、又はより低いＯ2に供する。次に作動可能に連結された発現産物（レポータ
ー遺伝子）を測定する。
ｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」５７：５３２８−５３３５又はＤａｃｈｓら、（１９９
７）「Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．」３：５１５−５２０に記載の様なアッセイを利
用することができる。例えば推定ＨＲＥ又はその複数のタンデムコピーを、最少
プロモーターエレメントと共に作動可能な状態で含み、検出可能又は検出可能な
シグナルを提供するのに利用できる蛋白質をコードするポリヌクレオチドの転写
を制御する構築体を宿主細胞内にトランスフェクトする。次に宿主細胞は正常酸
素条件（例えば２０％Ｏ2）及び各種低酸素、例えば５％、２％、１％、０．１
％、又はより低いＯ2に供する。次に作動可能に連結された発現産物（レポータ
ー遺伝子）を測定する。
【００７２】 あるいは、細胞状態特異ＴＲＥ候補は、熱や電離放射線の様な必要な生理学的
状態を提示する細胞に関しアデノウイルスを複製付与する能力について評価する
ことができる。このアッセイに関しては、推定細胞状態特異的ＴＲＥに作動可能
に連結された複製に必須なアデノウイルス遺伝子を含む構築体は、必要な生理状
態を示す細胞内にトランスフェクトされる。これらの細胞内でのウイルス複製は
、例えば正常生理条件下にある細胞内（即ち、必要生理条件を提示しない細胞）
でのウイルス複製と比較される。
状態を提示する細胞に関しアデノウイルスを複製付与する能力について評価する
ことができる。このアッセイに関しては、推定細胞状態特異的ＴＲＥに作動可能
に連結された複製に必須なアデノウイルス遺伝子を含む構築体は、必要な生理状
態を示す細胞内にトランスフェクトされる。これらの細胞内でのウイルス複製は
、例えば正常生理条件下にある細胞内（即ち、必要生理条件を提示しない細胞）
でのウイルス複製と比較される。
【００７３】 Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ１２及びＡｄ４０の様な各種アデノウイルス血清型が利
用できる。例示を目的として、ここでは血清型Ａｄ５が示されている。 細胞状態特異的ＴＲＥが増殖に必須なアデノウイルスと共に用いられる場合、
複製能は細胞状態を発現する標的細胞内に於いて優先的に達成できる。好ましく
は、遺伝子はＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２又はＥ４の様な初期遺伝子である（Ｅ３はウ
イルス複製に必須ではない）。より好ましくは、細胞状態特異的ＴＲＥ下の初期
遺伝子はＥ１Ａ及び／又はＥ１Ｂである。１つ以上の初期遺伝子を細胞状態特異
的ＴＲＥの制御下に置くことができる。実施例１は、この様な構築体のより詳細
な説明を提供する。
用できる。例示を目的として、ここでは血清型Ａｄ５が示されている。 細胞状態特異的ＴＲＥが増殖に必須なアデノウイルスと共に用いられる場合、
複製能は細胞状態を発現する標的細胞内に於いて優先的に達成できる。好ましく
は、遺伝子はＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２又はＥ４の様な初期遺伝子である（Ｅ３はウ
イルス複製に必須ではない）。より好ましくは、細胞状態特異的ＴＲＥ下の初期
遺伝子はＥ１Ａ及び／又はＥ１Ｂである。１つ以上の初期遺伝子を細胞状態特異
的ＴＲＥの制御下に置くことができる。実施例１は、この様な構築体のより詳細
な説明を提供する。
【００７４】 Ｅ１Ａ遺伝子は、ウイルス感染直後（０〜２時間）且つ他のウイルス遺伝子よ
り前に発現される。Ｅ１蛋白質はトランス作用型の正に作用する転写制御因子で
あり、他の初期ウイルス遺伝子Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４及びプロモーター近接
主要後期遺伝子の発現に関し必要とされる。その名称とは異なり、主要後期プロ
モーターにより駆動するプロモーター近接遺伝子はＡｄ５感染後短時間で発現さ
れる。Ｆｌｉｎｔ（１９８２）「Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔ
ａ」６５１：１７５−２０８； Ｆｌｉｎｔ （１９８６）「Ａｄｖａｎｃｅｓ
Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅｒｃｈ」３１：１６９−２２８； Ｇｒａｎｄ （１９
８７）「Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．」２４１：２５−３８。機能的Ｅ１Ａ遺伝子が
無い場合、ウイルスＤＮＡ複製に必要な遺伝子産物が産生されないためウイルス
感染は進まない。Ｎｅｖｉｎｓ （１９８９）「Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．
」３１：３５−８１。Ａｄ５Ｅ１Ａの転写開始部位はウイルスゲノム中４９８で
あり、またＥ１Ａ蛋白質のＡＴＧ開始部位は５６０である。
り前に発現される。Ｅ１蛋白質はトランス作用型の正に作用する転写制御因子で
あり、他の初期ウイルス遺伝子Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４及びプロモーター近接
主要後期遺伝子の発現に関し必要とされる。その名称とは異なり、主要後期プロ
モーターにより駆動するプロモーター近接遺伝子はＡｄ５感染後短時間で発現さ
れる。Ｆｌｉｎｔ（１９８２）「Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔ
ａ」６５１：１７５−２０８； Ｆｌｉｎｔ （１９８６）「Ａｄｖａｎｃｅｓ
Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅｒｃｈ」３１：１６９−２２８； Ｇｒａｎｄ （１９
８７）「Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．」２４１：２５−３８。機能的Ｅ１Ａ遺伝子が
無い場合、ウイルスＤＮＡ複製に必要な遺伝子産物が産生されないためウイルス
感染は進まない。Ｎｅｖｉｎｓ （１９８９）「Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．
」３１：３５−８１。Ａｄ５Ｅ１Ａの転写開始部位はウイルスゲノム中４９８で
あり、またＥ１Ａ蛋白質のＡＴＧ開始部位は５６０である。
【００７５】 Ｅ１Ｂ蛋白質はトランス状態で機能し、核から細胞質への後期ｍＲＮＡの移動
に必要である。Ｅ１Ｂ発現の欠失は、後期ウイルス蛋白質の発現の不良と、宿主
細胞蛋白質合成の中止に至る不安定化をもたらす。Ｅ１ＢのプロモーターはＡｄ
４０及びＡｄ５の宿主域内のエレメントの差を規定するもとのとして関係してい
る；臨床的にはＡｄ４０はエンテロウイルスであり、一方Ａｄ５は急性の結膜炎
の原因である。Ｂａｉｌｅｙ， Ｍａｃｋａｙら、（１９９３）「Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ」１９３：６３１； Ｂａｉｌｅｙら（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２０２
：６９５−７０６）。Ａｄ５のＥ１Ｂプロモーターは単一のＳｐ１に関する高親
和性認識部位とＴＡＴＡボックスから成る。
に必要である。Ｅ１Ｂ発現の欠失は、後期ウイルス蛋白質の発現の不良と、宿主
細胞蛋白質合成の中止に至る不安定化をもたらす。Ｅ１ＢのプロモーターはＡｄ
４０及びＡｄ５の宿主域内のエレメントの差を規定するもとのとして関係してい
る；臨床的にはＡｄ４０はエンテロウイルスであり、一方Ａｄ５は急性の結膜炎
の原因である。Ｂａｉｌｅｙ， Ｍａｃｋａｙら、（１９９３）「Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ」１９３：６３１； Ｂａｉｌｅｙら（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２０２
：６９５−７０６）。Ａｄ５のＥ１Ｂプロモーターは単一のＳｐ１に関する高親
和性認識部位とＴＡＴＡボックスから成る。
【００７６】 アデノウイルスのＥ２域は７２ｋＤａのＤＮＡ結合蛋白質、８０ｋＤａ前駆体
末端蛋白質、及びウイルスＤＮＡポリメラーゼを含む、アデノウイルスの複製に
関連する蛋白質をコードしている。Ａｄ５のＥ２域は、それぞれ７６．０と７２
．０にマッピングされるＥ２初期とＥ２後期と呼ばれる２カ所のプロモーターよ
り、右側方向に転写される。Ｅ２後期プロモーターは感染後期に一過性に活性化
し、Ｅ１Ａ転写活性化蛋白質とは無関係であり、Ｅ２初期プロモーターはウイル
ス複製初期に於いて極めて重要である。
末端蛋白質、及びウイルスＤＮＡポリメラーゼを含む、アデノウイルスの複製に
関連する蛋白質をコードしている。Ａｄ５のＥ２域は、それぞれ７６．０と７２
．０にマッピングされるＥ２初期とＥ２後期と呼ばれる２カ所のプロモーターよ
り、右側方向に転写される。Ｅ２後期プロモーターは感染後期に一過性に活性化
し、Ｅ１Ａ転写活性化蛋白質とは無関係であり、Ｅ２初期プロモーターはウイル
ス複製初期に於いて極めて重要である。
【００７７】 Ｅ２後期プロモーターは反対側の鎖によりコードされている遺伝子のコード配
列と重複しており、従って遺伝子操作に利用することはできない。しかし、Ｅ２
初期プロモーターは反対鎖状にある３３ｋＤ蛋白質をコードする配列と数塩基し
か重複していない。更にＳｐｅＩ制限酵素部位（Ａｄ５位置２７０８２）は上記
３３ｋＤ蛋白質に関する停止コドンの一部であり、主要Ｅ２初期転写開始位置及
びＴＡＴＡ結合蛋白質部位を、上流の転写因子結合部位Ｅ２Ｆ及びＡＴＦから隔
てている。従って、ＳｐｅＩ末端を有する細胞状態ＴＲＥを＋鎖のＳｐｅＩ部位
に挿入すると、内因性のＡｄ５のＥ２初期プロモーターを破壊し、その結果Ｅ２
転写体の細胞状態特異的発現が可能になるだろう。
列と重複しており、従って遺伝子操作に利用することはできない。しかし、Ｅ２
初期プロモーターは反対鎖状にある３３ｋＤ蛋白質をコードする配列と数塩基し
か重複していない。更にＳｐｅＩ制限酵素部位（Ａｄ５位置２７０８２）は上記
３３ｋＤ蛋白質に関する停止コドンの一部であり、主要Ｅ２初期転写開始位置及
びＴＡＴＡ結合蛋白質部位を、上流の転写因子結合部位Ｅ２Ｆ及びＡＴＦから隔
てている。従って、ＳｐｅＩ末端を有する細胞状態ＴＲＥを＋鎖のＳｐｅＩ部位
に挿入すると、内因性のＡｄ５のＥ２初期プロモーターを破壊し、その結果Ｅ２
転写体の細胞状態特異的発現が可能になるだろう。
【００７８】 Ｅ４遺伝子は複数の転写産物を有する。Ｅ４域はウイルスゲノムＤＮＡの複製
の刺激と、後期遺伝子発現の刺激に関する２つのポリペプチドをコードしている
。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦＳ）３及び６の蛋白質産物は共にＥ１
Ｂ及びＥ２Ｆ−１とＤＰ−１のヘテロダイマー由来の５５ｋＤ蛋白質の結合によ
りこれら機能を実施する。ＯＲＦ６蛋白質はその活性に関しＥ１Ｂ５５ｋＤ蛋白
質との相互作用を必要とするが、ＯＲＦ３蛋白質は必要としない。ＯＲＦ３及び
ＯＲＦ６由来の機能蛋白質がない場合、プラークは野生型ウイルスの効率の１０ -6 低い効率で産生される。必要生理条件又は状態を示す細胞にウイルス複製を更
に制限するためには、Ｅ４ＯＲＦ１〜３を削除してウイルスＤＮＡ複製及び後期
遺伝子合成をＥ４ＯＲＦ６蛋白質に依存させることができる。この様な変異体を
Ｅ１Ｂ域が細胞状態特異的ＴＲＥによって制御されている配列と組み合わせるこ
とにより、Ｅ１Ｂ機能とＥ４機能の両方が細胞状態特異的ＴＲＥにより駆動して
いるＥ１Ｂに依存するウイルスを得ることができる。
の刺激と、後期遺伝子発現の刺激に関する２つのポリペプチドをコードしている
。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦＳ）３及び６の蛋白質産物は共にＥ１
Ｂ及びＥ２Ｆ−１とＤＰ−１のヘテロダイマー由来の５５ｋＤ蛋白質の結合によ
りこれら機能を実施する。ＯＲＦ６蛋白質はその活性に関しＥ１Ｂ５５ｋＤ蛋白
質との相互作用を必要とするが、ＯＲＦ３蛋白質は必要としない。ＯＲＦ３及び
ＯＲＦ６由来の機能蛋白質がない場合、プラークは野生型ウイルスの効率の１０ -6 低い効率で産生される。必要生理条件又は状態を示す細胞にウイルス複製を更
に制限するためには、Ｅ４ＯＲＦ１〜３を削除してウイルスＤＮＡ複製及び後期
遺伝子合成をＥ４ＯＲＦ６蛋白質に依存させることができる。この様な変異体を
Ｅ１Ｂ域が細胞状態特異的ＴＲＥによって制御されている配列と組み合わせるこ
とにより、Ｅ１Ｂ機能とＥ４機能の両方が細胞状態特異的ＴＲＥにより駆動して
いるＥ１Ｂに依存するウイルスを得ることができる。
【００７９】 本発明に関する主要遺伝子は、遺伝子Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５であり
、これらはアデノウイルスの蛋白質をコードしている。これら遺伝子は全て（典
型的には構造蛋白質をコードする）はアデノウイルス複製に必要であろう。後期
遺伝子は全てが、＋５９８６から＋６０４８に局在するＡｄ５主要後期プロモー
ター（ＭＬＰ）の制御下にある。
、これらはアデノウイルスの蛋白質をコードしている。これら遺伝子は全て（典
型的には構造蛋白質をコードする）はアデノウイルス複製に必要であろう。後期
遺伝子は全てが、＋５９８６から＋６０４８に局在するＡｄ５主要後期プロモー
ター（ＭＬＰ）の制御下にある。
【００８０】 必要とされる生理状態（例えば低酸素条件の様な異常生理状態）を示す細胞内
の優先複製能の特性により選択的細胞傷害性及び／又は細胞溶解活性が付与され
ることに加え、本発明のアデノウイルスベクターは更に細胞状態特異的ＴＲＥの
制御下にある異種遺伝子（トランス遺伝子）を含むことができる。この様にして
各種遺伝的能力が細胞、特に癌細胞内に導入されるだろう。例えば、ある例では
、例えば癌性の標的細胞の相対的な反応特性又は特定の攻撃性に基づき、細胞障
害活性の強さ及び／又は割合を高めることが望ましいだろう。これは、細胞状態
特異的複製細胞障害活性と例えばＨＳＫ−ｔｋ及び／又は５−フルオロシトシン
（５−ＦＣ）を化学療法剤である５−フルオロウラシル（５−ＦＣ）に代謝する
能力を細胞に付与するシトシンデアミナーゼ（ｃｄ）の細胞特異的発現とを組み
合わせることで達成できる。これらのトランス遺伝子の使用も傍観者効果を付与
し得る。
の優先複製能の特性により選択的細胞傷害性及び／又は細胞溶解活性が付与され
ることに加え、本発明のアデノウイルスベクターは更に細胞状態特異的ＴＲＥの
制御下にある異種遺伝子（トランス遺伝子）を含むことができる。この様にして
各種遺伝的能力が細胞、特に癌細胞内に導入されるだろう。例えば、ある例では
、例えば癌性の標的細胞の相対的な反応特性又は特定の攻撃性に基づき、細胞障
害活性の強さ及び／又は割合を高めることが望ましいだろう。これは、細胞状態
特異的複製細胞障害活性と例えばＨＳＫ−ｔｋ及び／又は５−フルオロシトシン
（５−ＦＣ）を化学療法剤である５−フルオロウラシル（５−ＦＣ）に代謝する
能力を細胞に付与するシトシンデアミナーゼ（ｃｄ）の細胞特異的発現とを組み
合わせることで達成できる。これらのトランス遺伝子の使用も傍観者効果を付与
し得る。
【００８１】 アデノウイルスベクターを介し導入される他の望ましいトランス遺伝子には、
ジフテリア毒素のＡ鎖、リシン、又はアブリンの様な細胞傷害性蛋白質をコード
する遺伝子（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、（１９８７）「Ｃｅｌｌ」５０：４３５；
Ｍａｘｗｅｌｌら（１９８７）「Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．」Ｂｉｏｌ．７： １５７
６； Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒら（１９８８）「Ｇｅｎｅｓ」Ｄｅｖ．２：４５３；
Ｍｅｓｓｉｎｇら（１９９２）「Ｎｅｕｒｏｎ」８：５０７； Ｐｉａｔａｋ
ら（１９８８）「Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｈｍ．」２６３：４９３７； Ｌａｍ
ｂら（１９８５）「ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．」１４８： ２６５；
Ｆｒａｎｋｅｌら、（１９８９）「Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．」Ｂｉｏｌ． ９：
４１５）、アポトーシスを開始できるファクターをコードする遺伝子、その他の
能力の中で構造蛋白質の様な増殖に必須な蛋白質又は転写因子；その病原菌が細
胞内で増殖する場合のウイルス又はその他病原性蛋白質をコードしているｍＲＮ
Ａに対するアンチセンス転写体又はリボザイム；ヌクレアーゼの加工された細胞
質変異体（例えばＲＮａｓｅＡ）又はプロテアーゼ（例えばアスウイン、パパイ
ン、プロテアーゼＫ、カルボキシペプチダーゼ等）又はＦａｓ遺伝子等をコード
する遺伝子が含まれる。対象となるその他遺伝子には、ＩＬ−１、−２，−６、
−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、−β、−γ、Ｔ
ＮＦ−α、−β、ＴＧＦ−α、−β、ＮＧＦ等の様なサイトカイン、抗原、膜貫
通蛋白質等が含まれる。正のエフェクター遺伝子はより初期に利用することがで
き、複製により細胞障害活性を示す。
ジフテリア毒素のＡ鎖、リシン、又はアブリンの様な細胞傷害性蛋白質をコード
する遺伝子（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、（１９８７）「Ｃｅｌｌ」５０：４３５；
Ｍａｘｗｅｌｌら（１９８７）「Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．」Ｂｉｏｌ．７： １５７
６； Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒら（１９８８）「Ｇｅｎｅｓ」Ｄｅｖ．２：４５３；
Ｍｅｓｓｉｎｇら（１９９２）「Ｎｅｕｒｏｎ」８：５０７； Ｐｉａｔａｋ
ら（１９８８）「Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｈｍ．」２６３：４９３７； Ｌａｍ
ｂら（１９８５）「ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．」１４８： ２６５；
Ｆｒａｎｋｅｌら、（１９８９）「Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．」Ｂｉｏｌ． ９：
４１５）、アポトーシスを開始できるファクターをコードする遺伝子、その他の
能力の中で構造蛋白質の様な増殖に必須な蛋白質又は転写因子；その病原菌が細
胞内で増殖する場合のウイルス又はその他病原性蛋白質をコードしているｍＲＮ
Ａに対するアンチセンス転写体又はリボザイム；ヌクレアーゼの加工された細胞
質変異体（例えばＲＮａｓｅＡ）又はプロテアーゼ（例えばアスウイン、パパイ
ン、プロテアーゼＫ、カルボキシペプチダーゼ等）又はＦａｓ遺伝子等をコード
する遺伝子が含まれる。対象となるその他遺伝子には、ＩＬ−１、−２，−６、
−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、−β、−γ、Ｔ
ＮＦ−α、−β、ＴＧＦ−α、−β、ＮＧＦ等の様なサイトカイン、抗原、膜貫
通蛋白質等が含まれる。正のエフェクター遺伝子はより初期に利用することがで
き、複製により細胞障害活性を示す。
【００８２】 ある実施態様では、Ｅ３域内にコードされるアデノウイルス殺滅蛋白質（ＡＤ
Ｐ）がアデノウイルスベクター内に維持される。主要後期プロモーター（ＭＬＰ
）の制御下にあるＡＤＰ遺伝子は、宿主細胞溶解を実行する上で重要な蛋白質（
ＡＤＰ）をコードすると考えられている。Ｆｏｌｌｅｆｓｏｎら（１９９６）「
Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．」７０（４）：２２９６； Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら（１９９
２）「Ｊ． Ｖｉｒｏｌ」６６（６）：３６３３。即ちＡＤＰ遺伝子を含むアデ
ノウイルスベクターは、アデノウイルスをより強力にし、より治療効果的にし、
そして／又は投与条件をより低くする。
Ｐ）がアデノウイルスベクター内に維持される。主要後期プロモーター（ＭＬＰ
）の制御下にあるＡＤＰ遺伝子は、宿主細胞溶解を実行する上で重要な蛋白質（
ＡＤＰ）をコードすると考えられている。Ｆｏｌｌｅｆｓｏｎら（１９９６）「
Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．」７０（４）：２２９６； Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら（１９９
２）「Ｊ． Ｖｉｒｏｌ」６６（６）：３６３３。即ちＡＤＰ遺伝子を含むアデ
ノウイルスベクターは、アデノウイルスをより強力にし、より治療効果的にし、
そして／又は投与条件をより低くする。
【００８３】 従って、本発明はここに記した様な、更にＡＤＰをコードするポリヌクレオチ
ド配列を含むアデノウイルスを提供する。ＡＤＰをコードするＤＮＡ配列及びＡ
ＤＰのアミノ酸配列は図９に記される。要約すると、ＡＤＰをコードする配列は
、好ましくはＰＣＲの様な当分野で既知の技術を利用してＡｄ２（この株のＡＤ
Ｐがより完全に特性分析されていることから）より得られる。好ましくはＹリー
ダー（後期遺伝子の正確な発現に重要な配列）も得て、ＡＤＰコード配列と連結
される。続いてＡＤＰコード配列（Ｙリーダー有り又は無しで）をアデノウイル
スゲノム、例えばＥ３域（ＡＤＰコード配列がＭＬＰにより作動される）内に導
入することができる。ＡＤＰコード配列はＥ４域の様なアデノウイルスゲノムの
別の場所に挿入することもできる。あるいは、ＡＤＰコード配列は、もとよりこ
れに限定されないが別のウイルスプロモーター、低酸素反応エレメントの様な細
胞状態特異的ＴＲＥ、又は癌胚性抗原（ＣＥＡ）、ムチン、及びラットプロバシ
ン遺伝子より得られる様な細胞型特異的ＴＲＥを含む異種プロモーター（エンハ
ンサー有り、又は無し）と作動可能に連結することもできるだろう。
ド配列を含むアデノウイルスを提供する。ＡＤＰをコードするＤＮＡ配列及びＡ
ＤＰのアミノ酸配列は図９に記される。要約すると、ＡＤＰをコードする配列は
、好ましくはＰＣＲの様な当分野で既知の技術を利用してＡｄ２（この株のＡＤ
Ｐがより完全に特性分析されていることから）より得られる。好ましくはＹリー
ダー（後期遺伝子の正確な発現に重要な配列）も得て、ＡＤＰコード配列と連結
される。続いてＡＤＰコード配列（Ｙリーダー有り又は無しで）をアデノウイル
スゲノム、例えばＥ３域（ＡＤＰコード配列がＭＬＰにより作動される）内に導
入することができる。ＡＤＰコード配列はＥ４域の様なアデノウイルスゲノムの
別の場所に挿入することもできる。あるいは、ＡＤＰコード配列は、もとよりこ
れに限定されないが別のウイルスプロモーター、低酸素反応エレメントの様な細
胞状態特異的ＴＲＥ、又は癌胚性抗原（ＣＥＡ）、ムチン、及びラットプロバシ
ン遺伝子より得られる様な細胞型特異的ＴＲＥを含む異種プロモーター（エンハ
ンサー有り、又は無し）と作動可能に連結することもできるだろう。
【００８４】 細胞型特異的エレメントを更に含む本発明のアデノウイルスベクター 必要な生理状態を提示する細胞内での、選択的複製能及び／又は細胞障害性因
子をコードする遺伝子の選択的転写の特性による選択的細胞傷害性及び／又は細
胞溶解活性の付与に加え、本発明のアデノウイルスベクターは細胞型特異的ＴＲ
Ｅの制御下にあるアデノウイルス遺伝子及び／又は異種遺伝子（トランス遺伝子
）を含むことができる。この様にして細胞傷害性はさらに特定の型の細胞に限定
される。
子をコードする遺伝子の選択的転写の特性による選択的細胞傷害性及び／又は細
胞溶解活性の付与に加え、本発明のアデノウイルスベクターは細胞型特異的ＴＲ
Ｅの制御下にあるアデノウイルス遺伝子及び／又は異種遺伝子（トランス遺伝子
）を含むことができる。この様にして細胞傷害性はさらに特定の型の細胞に限定
される。
【００８５】 例えば、前立腺細胞内にて選択的に機能するＴＲＥには前立腺特異的抗原遺伝
子（ＰＳＡ−ＴＲＥ）（米国特許第５，６４８，４７８号）、腺性カリクレイン
−１遺伝子（ヒト遺伝子、ｋＨＬＫＪ２−ＴＲＥ由来）及びプロバシン遺伝子（
ＰＢ−ＴＲＥ）（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４１３２）由来のＴＲ
Ｅが含まれるが、これに限定されない。これら遺伝子は全て前立腺細胞内で優先
して発現され、その発現はアンドロゲン誘導性である。一般に、アンドロゲン誘
導に反応する遺伝子の発現はアンドロゲン受容体（ＡＲ）の存在を必要とする。
子（ＰＳＡ−ＴＲＥ）（米国特許第５，６４８，４７８号）、腺性カリクレイン
−１遺伝子（ヒト遺伝子、ｋＨＬＫＪ２−ＴＲＥ由来）及びプロバシン遺伝子（
ＰＢ−ＴＲＥ）（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４１３２）由来のＴＲ
Ｅが含まれるが、これに限定されない。これら遺伝子は全て前立腺細胞内で優先
して発現され、その発現はアンドロゲン誘導性である。一般に、アンドロゲン誘
導に反応する遺伝子の発現はアンドロゲン受容体（ＡＲ）の存在を必要とする。
【００８６】 ＰＳＡは正常、過形成の及び悪性化前立腺上皮細胞により占有的に合成される
；従ってその組織特異的発現は、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）及び前立腺癌（Ｃａ
Ｐ）の優れた生体マーカーである。ＰＳＡの正常血清値は通常は５ｎｇ／ｍｌ以
下であり、ＢＰＨ又はＣａＰの出現に伴い増加する。Ｌｕｎｄｗａｌｌら（１９
８７）「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．」２１４：３１７； Ｌｕｎｄｗａｌｌ （１９
８９）「Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．」１６１
：１１５１；及びＲｉｅｇｍａｎｎら（１９９１）「Ｍｏｌｅｃ． Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎ」５： １９２１。
；従ってその組織特異的発現は、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）及び前立腺癌（Ｃａ
Ｐ）の優れた生体マーカーである。ＰＳＡの正常血清値は通常は５ｎｇ／ｍｌ以
下であり、ＢＰＨ又はＣａＰの出現に伴い増加する。Ｌｕｎｄｗａｌｌら（１９
８７）「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．」２１４：３１７； Ｌｕｎｄｗａｌｌ （１９
８９）「Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．」１６１
：１１５１；及びＲｉｅｇｍａｎｎら（１９９１）「Ｍｏｌｅｃ． Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎ」５： １９２１。
【００８７】 特に前立腺細胞にて、アンドロゲンに依存した細胞特異性を提供するために用
いられるＰＳＡ遺伝子の領域は、約6.0キロベースを含む。Schuurら、(1996)「J
. Biol. Chem.」271:7043-7051。ヒトでの約1.5kbのエンハンサー域は、ＰＳＡ
遺伝子の転写開始部位に対しｎｔ−５３２２〜ｎｔ−３７３８の範囲に局在する
。これら２つの遺伝的要素が並列すると、完全に機能的な、最低限の前立腺特異
的エンハンサー／プロモーター（ＰＳＥ）ＴＲＥができる。ＰＳＡの約６．０ｋ
ｂの領域である別の部分は、必要な機能性が維持できる範囲に於いて本発明に利
用できる。実施例１では、ＨＲＥ及びＰＳＡ−ＴＲＥを含む複合ＴＲＥ、−５４
１〜＋１２のＰＳＡプロモーターと融合した−５３２２〜３７７８のＰＳＡエン
ハンサーを含むＰＳＡ−ＴＲＥを具備するアデノウイルスベクターＣＮ７９６が
記述されている。このＰＳＡ−ＴＲＥは、アデノウイルスベクターＣＮ７０６に
由来する。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら（１９９７）「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ」５７：２５５９−２５６３。従って、実施態様の一つでは、アデノウイルス
ベクターは細胞状態特異的ＴＲＥ、ＨＲＥ及び細胞型特異的ＴＲＥであるＰＳＡ
−ＴＲＥを含む複合ＴＲＥの転写制御下にあるアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子を含
む。
いられるＰＳＡ遺伝子の領域は、約6.0キロベースを含む。Schuurら、(1996)「J
. Biol. Chem.」271:7043-7051。ヒトでの約1.5kbのエンハンサー域は、ＰＳＡ
遺伝子の転写開始部位に対しｎｔ−５３２２〜ｎｔ−３７３８の範囲に局在する
。これら２つの遺伝的要素が並列すると、完全に機能的な、最低限の前立腺特異
的エンハンサー／プロモーター（ＰＳＥ）ＴＲＥができる。ＰＳＡの約６．０ｋ
ｂの領域である別の部分は、必要な機能性が維持できる範囲に於いて本発明に利
用できる。実施例１では、ＨＲＥ及びＰＳＡ−ＴＲＥを含む複合ＴＲＥ、−５４
１〜＋１２のＰＳＡプロモーターと融合した−５３２２〜３７７８のＰＳＡエン
ハンサーを含むＰＳＡ−ＴＲＥを具備するアデノウイルスベクターＣＮ７９６が
記述されている。このＰＳＡ−ＴＲＥは、アデノウイルスベクターＣＮ７０６に
由来する。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら（１９９７）「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ」５７：２５５９−２５６３。従って、実施態様の一つでは、アデノウイルス
ベクターは細胞状態特異的ＴＲＥ、ＨＲＥ及び細胞型特異的ＴＲＥであるＰＳＡ
−ＴＲＥを含む複合ＴＲＥの転写制御下にあるアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子を含
む。
【００８８】 本発明に用いられるＰＳＥ及びＰＳＡ ＴＲＥは図４（配列番号３）に記載の
配列に由来する。エンハンサーエレメントは図４（配列番号３）の約５０３〜約
２０８６のヌクレオチドである。プロモーターは図４（配列番号３）の約５２８
５〜約５８３６のヌクレオチドである。従って、幾つかの実施態様では、複合Ｔ
ＲＥは配列番号１を含むＨＲＥを含み、ＰＳＡ−ＴＲＥは配列番号３の約５０３
〜約２０８６のヌクレオチドを含む。別の実施態様では、複合ＴＲＥは配列番号
１を含むＨＲＥを具備し、ＰＳＡ−ＴＲＥは配列番号３の約５０３〜約２０８６
のヌクレオチド及び配列番号３の約５２８５〜約５８３６のヌクレオチドを含む
。上記の如く、これら複合（ＨＲＥ／ＰＳＡ）ＴＲＥは作動可能に複製に必須な
アデノウイルス遺伝子、特にＥ１Ａ又はＥ１Ｂの様な初期遺伝子と連結している
。実施例１はこの様な構築体を記述している。
配列に由来する。エンハンサーエレメントは図４（配列番号３）の約５０３〜約
２０８６のヌクレオチドである。プロモーターは図４（配列番号３）の約５２８
５〜約５８３６のヌクレオチドである。従って、幾つかの実施態様では、複合Ｔ
ＲＥは配列番号１を含むＨＲＥを含み、ＰＳＡ−ＴＲＥは配列番号３の約５０３
〜約２０８６のヌクレオチドを含む。別の実施態様では、複合ＴＲＥは配列番号
１を含むＨＲＥを具備し、ＰＳＡ−ＴＲＥは配列番号３の約５０３〜約２０８６
のヌクレオチド及び配列番号３の約５２８５〜約５８３６のヌクレオチドを含む
。上記の如く、これら複合（ＨＲＥ／ＰＳＡ）ＴＲＥは作動可能に複製に必須な
アデノウイルス遺伝子、特にＥ１Ａ又はＥ１Ｂの様な初期遺伝子と連結している
。実施例１はこの様な構築体を記述している。
【００８９】 本発明では、細胞状態特異的ＴＲＥ及び細胞型特異的ＴＲＥを含む複製可能ア
デノウイルスベクターが、優先的に特定の主要細胞内にて機能する細胞型特異的
ＴＲＥを利用し得る。主要細胞特異的ＴＲＥの非限定的例及び潜在的標的細胞の
非限定例には、以下の遺伝子のＴＲＥが含まれる；αフェト蛋白質（ＡＦＰ）（
肝臓癌）、ムチン様糖蛋白質ＤＦ３（ＭＵＣＩ）（乳癌）、癌胚性抗原（ＣＥＡ
）（直腸結腸癌、胃癌、膵臓癌、乳癌及び肺癌）、プラスミノーゲン活性化ウロ
キナーゼ（ｕＰＡ）及びその受容体（乳癌、結腸癌、及び肝臓癌）、ＨＥＲ−２
／ｎｅｕ（ｃ−ｅｒｂ２／ｎｅｕ）（乳癌、卵巣癌、胃癌、及び肺癌）。
デノウイルスベクターが、優先的に特定の主要細胞内にて機能する細胞型特異的
ＴＲＥを利用し得る。主要細胞特異的ＴＲＥの非限定的例及び潜在的標的細胞の
非限定例には、以下の遺伝子のＴＲＥが含まれる；αフェト蛋白質（ＡＦＰ）（
肝臓癌）、ムチン様糖蛋白質ＤＦ３（ＭＵＣＩ）（乳癌）、癌胚性抗原（ＣＥＡ
）（直腸結腸癌、胃癌、膵臓癌、乳癌及び肺癌）、プラスミノーゲン活性化ウロ
キナーゼ（ｕＰＡ）及びその受容体（乳癌、結腸癌、及び肝臓癌）、ＨＥＲ−２
／ｎｅｕ（ｃ−ｅｒｂ２／ｎｅｕ）（乳癌、卵巣癌、胃癌、及び肺癌）。
【００９０】 その他の細胞タイプ特異的ＴＲＥは以下に例示する遺伝子に由来する（ＴＲＥ
が特異的に機能している細胞の型をカッコ内に示す）：血管内皮増殖因子受容体
（内皮細胞）、アルブミン（肝臓）、第ＶＩＩ因子（肝臓）、脂肪酸合成酵素（
肝臓）、フォンウイルブランド因子（脳上皮細胞）、アルファアクチン及びミオ
シン重鎖（共に平滑筋）、合成酵素Ｉ（小腸）、Ｎａ−Ｋ−Ｃｌトランスポータ
ー（腎臓）。その他細胞タイプ特異的ＴＲＥは当分野で既知である。
が特異的に機能している細胞の型をカッコ内に示す）：血管内皮増殖因子受容体
（内皮細胞）、アルブミン（肝臓）、第ＶＩＩ因子（肝臓）、脂肪酸合成酵素（
肝臓）、フォンウイルブランド因子（脳上皮細胞）、アルファアクチン及びミオ
シン重鎖（共に平滑筋）、合成酵素Ｉ（小腸）、Ｎａ−Ｋ−Ｃｌトランスポータ
ー（腎臓）。その他細胞タイプ特異的ＴＲＥは当分野で既知である。
【００９１】 ＡＦＰは癌胎性蛋白質で、その発現は一次的には内肺葉性起源の組織の発生に
限定される（卵黄嚢、胎児肝臓、及び食道）が、その発現レベルは組織及び発生
段階によって大きく変動する。ＡＦＰは、その血清濃度が多くの肝臓癌患者で上
昇し、進行した病気を持つ患者ほどＡＦＰのレベルが高いことから臨床の関心を
得ている。患者の血清ＡＦＰ値は肝臓細胞癌でのＡＦＰの発現により制御されて
おり、その周辺組織では発現していないと考えられている。即ちＡＦＰ遺伝子は
肝臓癌細胞特異的に発現するよう制御されていると思われる。
限定される（卵黄嚢、胎児肝臓、及び食道）が、その発現レベルは組織及び発生
段階によって大きく変動する。ＡＦＰは、その血清濃度が多くの肝臓癌患者で上
昇し、進行した病気を持つ患者ほどＡＦＰのレベルが高いことから臨床の関心を
得ている。患者の血清ＡＦＰ値は肝臓細胞癌でのＡＦＰの発現により制御されて
おり、その周辺組織では発現していないと考えられている。即ちＡＦＰ遺伝子は
肝臓癌細胞特異的に発現するよう制御されていると思われる。
【００９２】 ＡＦＰ遺伝子由来の細胞型特異的ＴＲＥが特定されている。例えば、ヒトＡＦ
Ｐ特異的エンハンサー活性のクローニングと特性分析はＷａｔａｎａｂｅら（１
９８７）「Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．」２６２：４８１２−４８１８に記述
されている。全５’ＡＦＰフランキング域（プロモーター、推定サイレンサー、
及びエンハンサーエレメントを含む）は、転写開始部位上流約５ｋｂ内に含まれ
る。
Ｐ特異的エンハンサー活性のクローニングと特性分析はＷａｔａｎａｂｅら（１
９８７）「Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．」２６２：４８１２−４８１８に記述
されている。全５’ＡＦＰフランキング域（プロモーター、推定サイレンサー、
及びエンハンサーエレメントを含む）は、転写開始部位上流約５ｋｂ内に含まれ
る。
【００９３】 ヒトのＡＦＰエンハンサー域は、ＡＦＰ遺伝子の転写開始部位に対し約ｎｔ−
３９５４〜約ｎｔ−３３３５の範囲に局在している。ヒトＡＦＰプロモーターは
約ｎｔ−１７４〜約ｎ＋２９の領域を包含する。これら２種類の遺伝的エレメン
トを並列させると、完全に機能的なＡＦＰ−ＴＲＥができる。Idoら(1995)はＨ
ＣＣに特異的である２５９ｂｐ（ｎｔ−２３０からｎｔ＋２９）のプロモーター
断片を報告している。「Ｃｎａｃｅｒ Ｒｅｓ．」５５： ３１０５−３１０９
。ＡＦＰエンハンサーは、転写開始部位に対しｎｔ−３９５４〜ｎｔ−３３３５
の範囲に位置する、Ａ及びＢと称される２つの領域を含む。プロモーター領域は
典型的なＴＡＴＡ及びＣＡＡＴボックスを含む。好ましくは、ＡＦＰ−ＴＲＥは
少なくとも１つのエンハンサー領域を含む。より好ましくは、ＡＦＰ−ＴＲＥは
両方のエンハンサー領域を含む。
３９５４〜約ｎｔ−３３３５の範囲に局在している。ヒトＡＦＰプロモーターは
約ｎｔ−１７４〜約ｎ＋２９の領域を包含する。これら２種類の遺伝的エレメン
トを並列させると、完全に機能的なＡＦＰ−ＴＲＥができる。Idoら(1995)はＨ
ＣＣに特異的である２５９ｂｐ（ｎｔ−２３０からｎｔ＋２９）のプロモーター
断片を報告している。「Ｃｎａｃｅｒ Ｒｅｓ．」５５： ３１０５−３１０９
。ＡＦＰエンハンサーは、転写開始部位に対しｎｔ−３９５４〜ｎｔ−３３３５
の範囲に位置する、Ａ及びＢと称される２つの領域を含む。プロモーター領域は
典型的なＴＡＴＡ及びＣＡＡＴボックスを含む。好ましくは、ＡＦＰ−ＴＲＥは
少なくとも１つのエンハンサー領域を含む。より好ましくは、ＡＦＰ−ＴＲＥは
両方のエンハンサー領域を含む。
【００９４】 ＡＦＰ−ＴＲＥｓを含むアデノウイルスベクターに好適な標的細胞は、ＡＦＰ
−ＴＲＥを機能させるいずれかの細胞である。好ましくは、これに限定されるも
のえはないが、ＡＦＰを発現している腫瘍細胞を含む、ＡＦＰを発現又は産生す
る細胞である。この様な細胞の例は肝細胞癌細胞、生殖腺及びその他生殖細胞癌
（特に内肺葉洞腫瘍）、脳腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膵臓の腺房細胞癌（Ｋａｗ
ａｍｏｔｏら、１９９２）「Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｌｏｇｙ」３
９：２８２−２８６）、原発性胆嚢癌（Ｋａｔｓｕｒａｇｉら（１９８９）「ｒ
ｉｎｓｋｏ Ｈａｓｈａｓｅｎ」３４：３７１−３７４）、子宮内皮腺癌細胞（
Ｋｏｙａｍａら、（１９９６）「Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」８
７： ６１２−６１７）及び前記の転移である（胚、副腎、骨髄、及び／又は脾
臓に起こる）。幾つかの例では、特定の膵臓癌及び胃癌から肝臓への転移性疾患
がＡＦＰを産生する。特に良く起こるのは肝細胞癌細胞及びその転移である。Ａ
ＦＰ産生はＡＦＰ蛋白質産生のレベルを決定するＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ又はウエス
タンブロット、又はＡＦＰｍＲＮＡ産生のレベルを決定するノーザンブロットの
様な当分野で標準のアッセイを用いて測定することができる。あるいはこれら細
胞は、転写的にＡＦＰ−ＴＲＥを活性化できる（即ち、ＡＦＰ−ＴＲＥを機能化
できる）それらの能力によって特定し、又は特徴付けることができる。
−ＴＲＥを機能させるいずれかの細胞である。好ましくは、これに限定されるも
のえはないが、ＡＦＰを発現している腫瘍細胞を含む、ＡＦＰを発現又は産生す
る細胞である。この様な細胞の例は肝細胞癌細胞、生殖腺及びその他生殖細胞癌
（特に内肺葉洞腫瘍）、脳腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膵臓の腺房細胞癌（Ｋａｗ
ａｍｏｔｏら、１９９２）「Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｌｏｇｙ」３
９：２８２−２８６）、原発性胆嚢癌（Ｋａｔｓｕｒａｇｉら（１９８９）「ｒ
ｉｎｓｋｏ Ｈａｓｈａｓｅｎ」３４：３７１−３７４）、子宮内皮腺癌細胞（
Ｋｏｙａｍａら、（１９９６）「Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」８
７： ６１２−６１７）及び前記の転移である（胚、副腎、骨髄、及び／又は脾
臓に起こる）。幾つかの例では、特定の膵臓癌及び胃癌から肝臓への転移性疾患
がＡＦＰを産生する。特に良く起こるのは肝細胞癌細胞及びその転移である。Ａ
ＦＰ産生はＡＦＰ蛋白質産生のレベルを決定するＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ又はウエス
タンブロット、又はＡＦＰｍＲＮＡ産生のレベルを決定するノーザンブロットの
様な当分野で標準のアッセイを用いて測定することができる。あるいはこれら細
胞は、転写的にＡＦＰ−ＴＲＥを活性化できる（即ち、ＡＦＰ−ＴＲＥを機能化
できる）それらの能力によって特定し、又は特徴付けることができる。
【００９５】 蛋白質ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）及びその細胞表面
受容体であるウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）は最
も頻繁に新生物が発生する多くに於いて発現し、癌転移に於ける代表的な重要蛋
白質と考えられている。いずれの蛋白質も乳癌、結腸癌、前立腺癌、肝臓癌、腎
臓癌、肺癌及び卵巣癌に関係している。ｕＰＡ及びｕＰＡＲ転写を制御する転写
制御エレメントはよく研究されている。Ｒｉｃｃｉｏら、（１９８５）「Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」１３： ２７５９−２７７１； Ａｃｎｎｉ
ｏら、（１９９１）「Ｎｕｃｅｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」１９： ２３０
３−２３０８。
受容体であるウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）は最
も頻繁に新生物が発生する多くに於いて発現し、癌転移に於ける代表的な重要蛋
白質と考えられている。いずれの蛋白質も乳癌、結腸癌、前立腺癌、肝臓癌、腎
臓癌、肺癌及び卵巣癌に関係している。ｕＰＡ及びｕＰＡＲ転写を制御する転写
制御エレメントはよく研究されている。Ｒｉｃｃｉｏら、（１９８５）「Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」１３： ２７５９−２７７１； Ａｃｎｎｉ
ｏら、（１９９１）「Ｎｕｃｅｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」１９： ２３０
３−２３０８。
【００９６】 ＣＥＡは、直腸結腸、胃及び膵臓癌の様な胃腸管及び乳癌や肺癌の様な腺腫と
いった内肺葉性新生物に存在する１８０，０００ダルトンの糖蛋白腫瘍関連抗原
である。ＣＥＡは、血中ＣＥＡが多くのＣＥＡ陽性腫瘍患者で検出されることか
ら、臨床的に注目されている。肺癌では、全例の約５０％が血中にＣＥＡを持っ
ており、腺癌でしばしば高濃度のＣＥＡ（２０ｎｇ／ｍｌ以上）が検出される。
胃癌患者の約５０％が血清学的にＣＥＡ陽性である。
いった内肺葉性新生物に存在する１８０，０００ダルトンの糖蛋白腫瘍関連抗原
である。ＣＥＡは、血中ＣＥＡが多くのＣＥＡ陽性腫瘍患者で検出されることか
ら、臨床的に注目されている。肺癌では、全例の約５０％が血中にＣＥＡを持っ
ており、腺癌でしばしば高濃度のＣＥＡ（２０ｎｇ／ｍｌ以上）が検出される。
胃癌患者の約５０％が血清学的にＣＥＡ陽性である。
【００９７】 ＣＥＡ遺伝子の５’上流側のフランキング配列が細胞特異活性を付与すること
が示されている。遺伝子の５’フランキング域内の翻訳開始位置の約最初の２４
ヌクレオチド上流にあるＣＥＡプロモーター域が、この領域が非増殖性のＨｅＬ
ａ細胞に比べＣＥＡ産生細胞により強いプロモーター活性を提供する場合に、細
胞特異性を付与することが示されている。Schreweら(1990）「Mol.Cell.Biol.」
10:2738-2748。更に、細胞特異的エンハンサー域も見つかっている。ＷＯ／９５
／１４１００号。全５’ＣＥＡフランキング域（プロモーター、推定サイレンサ
ー及びエンハンサーエレメントを含む）は転写開始部位から約１．４５ｋｂ上流
までに含まれていることが示されている。Ｒｉｃｈａｒｄｓら、（１９９５）；
ＷＯ９５／１４１００号。Ｒｉｃｈａｒｄｓら（１９９５）によるＣＥＡ遺伝子
のフランキング域に関する詳しい特性分析からは、−１３．６から−１０．７ｋ
ｂまたは−６．１から−４．０ｋｂまでの２種類の上流域を多量体化したプロモ
ーターに連結すると、ＣＥＡ産生ＬｏＶｏ及びＳＷ１４６３細胞にレポーター構
築体の高レベル且つ高選択的な発現をもたらすことが示された。Ｒｉｃｈａｒｄ
ｓらは（1995）更にプロモーター域が転写開始部位に対しｎｔ−９０〜ｎｔ＋６
９に局在し、ｎｔ−４１〜ｎｔ−１８の領域が発現に必須であることした。ＷＯ
９５／１４１００号は、細胞特異的活性を付与する一連の５’フランキングＣＥ
Ａ断片、例えば約ｎｔ−２９９〜約ｎｔ＋６９；約ｎｔ−９０〜約ｎｔ＋６９；
ｎｔ−１４，５００〜ｎｔ−１０，６００；ｎｔ−１３，６００〜ｎｔ−１０、
６００、ｎｔ−６１００〜ｎｔ−３８００を記載している。更に、細胞特異的転
写活性は配列番号６に記載のｎｔ−４０２〜ｎｔ＋６９のＣＥＡ断片により作動
可能に連結された遺伝子に付与される。本発明に用いられているＣＥＡ−ＴＲＥ
はこれに限定されるものではないが、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞に由来する。
即ち、いずれのＣＥＡ−ＴＲＥも必要とされる所望機能性がアデノウイルスベク
ター内に提示される限りに於いて本発明に利用できるだろう。ＣＥＡ配列のクロ
ーニング及び特性解析は文献に記載されており、従って本発明の実施に利用可能
であり、ここに詳細に記載する必要はない。
が示されている。遺伝子の５’フランキング域内の翻訳開始位置の約最初の２４
ヌクレオチド上流にあるＣＥＡプロモーター域が、この領域が非増殖性のＨｅＬ
ａ細胞に比べＣＥＡ産生細胞により強いプロモーター活性を提供する場合に、細
胞特異性を付与することが示されている。Schreweら(1990）「Mol.Cell.Biol.」
10:2738-2748。更に、細胞特異的エンハンサー域も見つかっている。ＷＯ／９５
／１４１００号。全５’ＣＥＡフランキング域（プロモーター、推定サイレンサ
ー及びエンハンサーエレメントを含む）は転写開始部位から約１．４５ｋｂ上流
までに含まれていることが示されている。Ｒｉｃｈａｒｄｓら、（１９９５）；
ＷＯ９５／１４１００号。Ｒｉｃｈａｒｄｓら（１９９５）によるＣＥＡ遺伝子
のフランキング域に関する詳しい特性分析からは、−１３．６から−１０．７ｋ
ｂまたは−６．１から−４．０ｋｂまでの２種類の上流域を多量体化したプロモ
ーターに連結すると、ＣＥＡ産生ＬｏＶｏ及びＳＷ１４６３細胞にレポーター構
築体の高レベル且つ高選択的な発現をもたらすことが示された。Ｒｉｃｈａｒｄ
ｓらは（1995）更にプロモーター域が転写開始部位に対しｎｔ−９０〜ｎｔ＋６
９に局在し、ｎｔ−４１〜ｎｔ−１８の領域が発現に必須であることした。ＷＯ
９５／１４１００号は、細胞特異的活性を付与する一連の５’フランキングＣＥ
Ａ断片、例えば約ｎｔ−２９９〜約ｎｔ＋６９；約ｎｔ−９０〜約ｎｔ＋６９；
ｎｔ−１４，５００〜ｎｔ−１０，６００；ｎｔ−１３，６００〜ｎｔ−１０、
６００、ｎｔ−６１００〜ｎｔ−３８００を記載している。更に、細胞特異的転
写活性は配列番号６に記載のｎｔ−４０２〜ｎｔ＋６９のＣＥＡ断片により作動
可能に連結された遺伝子に付与される。本発明に用いられているＣＥＡ−ＴＲＥ
はこれに限定されるものではないが、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞に由来する。
即ち、いずれのＣＥＡ−ＴＲＥも必要とされる所望機能性がアデノウイルスベク
ター内に提示される限りに於いて本発明に利用できるだろう。ＣＥＡ配列のクロ
ーニング及び特性解析は文献に記載されており、従って本発明の実施に利用可能
であり、ここに詳細に記載する必要はない。
【００９８】 ＭＵＣ１遺伝子の蛋白質産物（ムチン又はＭＵＣ１蛋白質；エピシアリン；多
形性上皮性ムチン又はＰＥＭ；ＥＭＡ；ＤＦ３抗原；ＮＰＧＰ；ＰＡＳ−Ｏ；又
はＣＡ１５．３抗原として知られる）は通常主に胃、膵臓、肺、気管、腎臓、子
宮、唾液腺、及び乳腺の腺又は管を裏打ちする上皮細胞の頂端表面に発現してい
る。Zotterら、(1988）「Cancer Rev.」11-12:55-101;及びGirlingら、（1989）
「Int. J. Cancer」43:1072-1076。しかし、ムチンはヒト乳癌の７５〜９０％で
過剰発現されている。Kufeら、(1984）「Hybridoma」3: 223-232。レビューに関
してはHilkens(1988）「Cacner Rev.」11-12: 25-54;及びTaylor-Papadimitriou
ら（1990)「J. Nucl. Med. Allied Sci.」34:144-150を参照。ムチン蛋白質の発
現は乳癌の分化度に相関する。Lundyら、(1985）「Breast Cancer Re/ Treat.」
5:269-276。この過剰発現は転写レベルで制御されていると考えられている。
形性上皮性ムチン又はＰＥＭ；ＥＭＡ；ＤＦ３抗原；ＮＰＧＰ；ＰＡＳ−Ｏ；又
はＣＡ１５．３抗原として知られる）は通常主に胃、膵臓、肺、気管、腎臓、子
宮、唾液腺、及び乳腺の腺又は管を裏打ちする上皮細胞の頂端表面に発現してい
る。Zotterら、(1988）「Cancer Rev.」11-12:55-101;及びGirlingら、（1989）
「Int. J. Cancer」43:1072-1076。しかし、ムチンはヒト乳癌の７５〜９０％で
過剰発現されている。Kufeら、(1984）「Hybridoma」3: 223-232。レビューに関
してはHilkens(1988）「Cacner Rev.」11-12: 25-54;及びTaylor-Papadimitriou
ら（1990)「J. Nucl. Med. Allied Sci.」34:144-150を参照。ムチン蛋白質の発
現は乳癌の分化度に相関する。Lundyら、(1985）「Breast Cancer Re/ Treat.」
5:269-276。この過剰発現は転写レベルで制御されていると考えられている。
【００９９】 ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７及びＡＲ−７５−１でのＭＵＣ１遺伝子の過剰発現は
、転写レベルで制御されていると考えられている。Kufeら(1984）；Kovarik（19
93）「J.Biol.Chem.」268:9917-9926；及びAbeら(1990）「J.Cell.Physiol.」14
3.226-231。細胞特異的転写に関係すると思われるＴＲＥを含む転写開始部位上
流約０．９ｋｂを含むＭＵＣ１遺伝子の制御配列がクローン化された。Abeら(19
93）「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」90:282-286;Kovarik（1993）;及びKovarikら（
1996）「J.Biol.Chem.」271:18140-18147。
、転写レベルで制御されていると考えられている。Kufeら(1984）；Kovarik（19
93）「J.Biol.Chem.」268:9917-9926；及びAbeら(1990）「J.Cell.Physiol.」14
3.226-231。細胞特異的転写に関係すると思われるＴＲＥを含む転写開始部位上
流約０．９ｋｂを含むＭＵＣ１遺伝子の制御配列がクローン化された。Abeら(19
93）「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」90:282-286;Kovarik（1993）;及びKovarikら（
1996）「J.Biol.Chem.」271:18140-18147。
【０１００】 本発明に用いられるＭＵＣ１−ＴＲＥは、ヒトに限定されないが、ヒト細胞を
含む哺乳動物細胞に由来する。好ましくはＭＵＣ１−ＴＲＥはヒトのものである
。実施態様の一つではＭＵＣ１−ＴＲＥはＭＵＣ１遺伝子の全０．９ｋｂ５’フ
ランキング配列を含むことができる。他の態様ではＭＵＣ１−ＴＲＥは以下の配
列を含む（ＭＵＣ１遺伝子の転写開始部位に対し）：約ｎｔ−７２５〜約ｎｔ＋
３１、ｎｔ−７４３〜約ｎｔ＋３３、ｎｔ−７５０〜約ｎｔ＋３３及びｎｔ−５
９８〜約ｎｔ＋４８５（プロモーターに作動可能に連結された）。
含む哺乳動物細胞に由来する。好ましくはＭＵＣ１−ＴＲＥはヒトのものである
。実施態様の一つではＭＵＣ１−ＴＲＥはＭＵＣ１遺伝子の全０．９ｋｂ５’フ
ランキング配列を含むことができる。他の態様ではＭＵＣ１−ＴＲＥは以下の配
列を含む（ＭＵＣ１遺伝子の転写開始部位に対し）：約ｎｔ−７２５〜約ｎｔ＋
３１、ｎｔ−７４３〜約ｎｔ＋３３、ｎｔ−７５０〜約ｎｔ＋３３及びｎｔ−５
９８〜約ｎｔ＋４８５（プロモーターに作動可能に連結された）。
【０１０１】 ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ遺伝子（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ又はＨＥＲ）は１８５ｋ
Ｄの上皮増殖因子受容体関連膜貫通糖蛋白質をコードする形質転換遺伝子である
。ヒトでは、ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ蛋白質は胎児発生中に発現されるが、成体
では多くの正常組織の上皮に弱く検出できる（免疫組織的に）のみである。ｃ−
ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ遺伝子の増幅、及び／又は過剰発現が乳癌、卵巣癌、子宮癌
、前立腺癌、胃癌及び肺癌を含む多くの癌に関連している。ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎ
ｅｕ蛋白質の過剰発現の臨床予後については乳癌及び卵巣癌で研究されている。
ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ蛋白質の過剰発現は乳癌の管内癌の２０〜４０％及び卵
巣癌の３０％に起こっており、両疾患の亜分類に於ける予後不良と関係している
。ヒト、ラット、及びマウスのｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕＴＲＥは同定されており
、ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕを発現細胞に特異活性を付与することが示されている
。Talら、(1987)「Mol. Cell. Biol.」7:2597-2601; Hudsonら、(1990)「J.Biol
.Chem.」265: 4389-4393; Grootheclaesら(1994)「Cancer Res.」54; 4193-4199
; Ishiiら(1987)「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」84:4373-4378; Scottら(1994)
「J. Biol.Chem.」269:19848-19858。
Ｄの上皮増殖因子受容体関連膜貫通糖蛋白質をコードする形質転換遺伝子である
。ヒトでは、ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ蛋白質は胎児発生中に発現されるが、成体
では多くの正常組織の上皮に弱く検出できる（免疫組織的に）のみである。ｃ−
ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ遺伝子の増幅、及び／又は過剰発現が乳癌、卵巣癌、子宮癌
、前立腺癌、胃癌及び肺癌を含む多くの癌に関連している。ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎ
ｅｕ蛋白質の過剰発現の臨床予後については乳癌及び卵巣癌で研究されている。
ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ蛋白質の過剰発現は乳癌の管内癌の２０〜４０％及び卵
巣癌の３０％に起こっており、両疾患の亜分類に於ける予後不良と関係している
。ヒト、ラット、及びマウスのｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕＴＲＥは同定されており
、ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕを発現細胞に特異活性を付与することが示されている
。Talら、(1987)「Mol. Cell. Biol.」7:2597-2601; Hudsonら、(1990)「J.Biol
.Chem.」265: 4389-4393; Grootheclaesら(1994)「Cancer Res.」54; 4193-4199
; Ishiiら(1987)「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」84:4373-4378; Scottら(1994)
「J. Biol.Chem.」269:19848-19858。
【０１０２】 上記の細胞タイプ特異的ＴＲＥは本発明に於いて機能するＴＲＥの非限定的な
例として提供されている。その他の細胞特異的ＴＲＥは当分野で既知であり、問
題のＴＲＥの細胞特異性を同定し、試験する方法も同様に当分野で既知である。 本発明のアデノウイルスの使用 アデノウイルスは裸のポリヌクレオチド（通常ＤＮＡ）構築体；カチオン性リ
ポソーム又はポリリジンの様なその他のカチオン性化合の様な物細胞内への侵入
を促進する作用物質と複合化したポリヌクレオチド；感染性アデノウイルス粒子
にパッケージされた形（アデノウイルスベクターをより免疫原性にする）；ＨＳ
Ｖ又はＡＶＶの様なその他の粒子状ウイルス形状にパッセージした形；免疫反応
を高める、又は弱化する作用物質（ＰＥＧの様な）との複合化；インビトロのト
ランスフェクションを促進するＤＯＴＭＡ（商標）、ＤＯＴＡＰ（商標）及びポ
リアミンの様な作用物質と複合化したものを含む様々な形で使用できるが、これ
に限定されない。この様に、本発明は細胞状態産生細胞にて好ましく増幅できる
アデノウイルスも提供する。「優先的に複製する」とは、アデノウイルスが必要
とされる生理状態を提示しない細胞に比べ、その状態を提示する細胞にてより複
製することを意味する。好ましくは、アデノウイルスは少なくとも約２倍以上複
製し、好ましくは少なくとも約５倍以上、より好ましくは少なくとも約１０倍以
上、さらにより好ましくは少なくとも約５０倍以上、さらにより好ましくは少な
くとも約１００倍以上、さらに好ましくは少なくとも約４００倍以上〜約５００
倍以上、さらにより好ましくは少なくとも約１０００倍以上、最も好ましくは少
なくとも１×１０6以上複製する。最も好ましくは、アデノウイルスは必要とさ
れる生理状態を提示する細胞のみにて複製する（即ち、必要とされる生理状態を
提示しない細胞では複製しないか、極めてゆっくり複製する）。
例として提供されている。その他の細胞特異的ＴＲＥは当分野で既知であり、問
題のＴＲＥの細胞特異性を同定し、試験する方法も同様に当分野で既知である。 本発明のアデノウイルスの使用 アデノウイルスは裸のポリヌクレオチド（通常ＤＮＡ）構築体；カチオン性リ
ポソーム又はポリリジンの様なその他のカチオン性化合の様な物細胞内への侵入
を促進する作用物質と複合化したポリヌクレオチド；感染性アデノウイルス粒子
にパッケージされた形（アデノウイルスベクターをより免疫原性にする）；ＨＳ
Ｖ又はＡＶＶの様なその他の粒子状ウイルス形状にパッセージした形；免疫反応
を高める、又は弱化する作用物質（ＰＥＧの様な）との複合化；インビトロのト
ランスフェクションを促進するＤＯＴＭＡ（商標）、ＤＯＴＡＰ（商標）及びポ
リアミンの様な作用物質と複合化したものを含む様々な形で使用できるが、これ
に限定されない。この様に、本発明は細胞状態産生細胞にて好ましく増幅できる
アデノウイルスも提供する。「優先的に複製する」とは、アデノウイルスが必要
とされる生理状態を提示しない細胞に比べ、その状態を提示する細胞にてより複
製することを意味する。好ましくは、アデノウイルスは少なくとも約２倍以上複
製し、好ましくは少なくとも約５倍以上、より好ましくは少なくとも約１０倍以
上、さらにより好ましくは少なくとも約５０倍以上、さらにより好ましくは少な
くとも約１００倍以上、さらに好ましくは少なくとも約４００倍以上〜約５００
倍以上、さらにより好ましくは少なくとも約１０００倍以上、最も好ましくは少
なくとも１×１０6以上複製する。最も好ましくは、アデノウイルスは必要とさ
れる生理状態を提示する細胞のみにて複製する（即ち、必要とされる生理状態を
提示しない細胞では複製しないか、極めてゆっくり複製する）。
【０１０３】 アデノウイルスベクターがアデノウイルス内にパッケージされる場合、標的化
を高めるためにアデノウイルス自体も選別されるだろう。例えば、アデノウイル
スファイバーは親和性を補助する細胞受容体との一次接触を伝達する。Ambergら
、(1997)「Virol.」227:239-244参照。アデノウイルスの特定の亜属が標的型細
胞に対する親和性を提示し、及び／または非標的型細胞に対する親和性を下げる
場合、この様な亜属（又は亜属群）は細胞傷害性及び／又は細胞溶解の細胞特異
性を更に高めるのに使用できるだろう。
を高めるためにアデノウイルス自体も選別されるだろう。例えば、アデノウイル
スファイバーは親和性を補助する細胞受容体との一次接触を伝達する。Ambergら
、(1997)「Virol.」227:239-244参照。アデノウイルスの特定の亜属が標的型細
胞に対する親和性を提示し、及び／または非標的型細胞に対する親和性を下げる
場合、この様な亜属（又は亜属群）は細胞傷害性及び／又は細胞溶解の細胞特異
性を更に高めるのに使用できるだろう。
【０１０４】 アデノウイルスベクターはリポソーム、当分野で公知の一般的なトランスフェ
クション法（たとえば、リン酸カルシウム沈殿法又はエレクトロポレーション法
）、直接注入、及び静脈注入を含む各種方法により標的細胞に供給できるが、こ
れらに限定されない。供給方法は具体的なアデノウイルスベクター（その形状を
含む）及び標的細胞の型と局在（即ち、細胞がインビトロかインビボか）に大き
く依存している。
クション法（たとえば、リン酸カルシウム沈殿法又はエレクトロポレーション法
）、直接注入、及び静脈注入を含む各種方法により標的細胞に供給できるが、こ
れらに限定されない。供給方法は具体的なアデノウイルスベクター（その形状を
含む）及び標的細胞の型と局在（即ち、細胞がインビトロかインビボか）に大き
く依存している。
【０１０５】 パッケージされたアデノウイルスとして用いる場合、アデノウイルスベクター
は約１０4〜約１０14の範囲の適当な生理学的に受け入れ可能な担体の中に投与
されるだろう。感染の多重度は一般に約０．００１〜１００の範囲であろう。ポ
リヌクレオチド構築体として（即ち、ウイルスとしてパッケージされていない）
投与される場合には約０．０１μｇ〜１０００μｇのアデノウイルスベクターが
投与できる。アデノウイルスベクターは、その目的とする応用及び宿主の免疫反
応能により１回又はそれ以上投与され、複数回の同時投与として投与されること
もあるだろう。免疫反応が望ましくない場合には、免疫反応は各種免疫抑制剤を
利用することで除かれるため、強い免疫反応なしに繰り返し投与することができ
るだろう。ＨＳＶの様な別のウイルス形状にパッケージされる場合、投与量は具
体的なウイルスに関する標準的知識に基づき（例えば出版された文献より容易に
得られる）、そして経験的に決定することができる。
は約１０4〜約１０14の範囲の適当な生理学的に受け入れ可能な担体の中に投与
されるだろう。感染の多重度は一般に約０．００１〜１００の範囲であろう。ポ
リヌクレオチド構築体として（即ち、ウイルスとしてパッケージされていない）
投与される場合には約０．０１μｇ〜１０００μｇのアデノウイルスベクターが
投与できる。アデノウイルスベクターは、その目的とする応用及び宿主の免疫反
応能により１回又はそれ以上投与され、複数回の同時投与として投与されること
もあるだろう。免疫反応が望ましくない場合には、免疫反応は各種免疫抑制剤を
利用することで除かれるため、強い免疫反応なしに繰り返し投与することができ
るだろう。ＨＳＶの様な別のウイルス形状にパッケージされる場合、投与量は具
体的なウイルスに関する標準的知識に基づき（例えば出版された文献より容易に
得られる）、そして経験的に決定することができる。
【０１０６】 本発明のアデノウイルスベクターを含む宿主細胞 本発明は、ここに記したアデノウイルスベクターを含む（すなわち、トランス
フォームされた）宿主細胞も提供する。宿主細胞内での維持に必要とされる配列
、例えば適当な複製起源が存在する限り、原核細胞及び真核細胞宿主細胞の両方
を使用することができる。便利のために、選択可能マーカーも提供される。原核
細胞宿主細胞には細菌細胞、例えば大腸菌、マイコバクテリアが含まれる。真核
宿主細胞は酵母、昆虫、鳥類、植物及び哺乳動物である。宿主システムは当分野
で既知であり、従ってここに記載する必要はない。
フォームされた）宿主細胞も提供する。宿主細胞内での維持に必要とされる配列
、例えば適当な複製起源が存在する限り、原核細胞及び真核細胞宿主細胞の両方
を使用することができる。便利のために、選択可能マーカーも提供される。原核
細胞宿主細胞には細菌細胞、例えば大腸菌、マイコバクテリアが含まれる。真核
宿主細胞は酵母、昆虫、鳥類、植物及び哺乳動物である。宿主システムは当分野
で既知であり、従ってここに記載する必要はない。
【０１０７】 本発明の組成物 本発明は更に、ここに記載のアデノウイルスベクターを含む医薬品組成物を含
む組成物も提供する。この様な組成物（特に医薬品組成物）は例えば個体中での
細胞殺滅の誘導及び効果の大きさを測定する場合の様な、インビトロでの投与に
有用である。医薬品として受け入れ可能な成分（一般にはアデノウイルスベクタ
ーの有効量）は、個体への全身投与に好適な単位投与形状、滅菌された非経口投
与液または懸濁液、滅菌された経口投与液、又は経口溶液又は懸濁液、水中油型
、又は油中水型乳剤等である。非経口及び経口薬物供給に関する調剤は当分野で
既知であり、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ」１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
（１９９５）に記載されている。医薬品組成物は更に本発明のアデノウイルスベ
クターの凍結乾燥された及び／又は再構築された形状（アデノウイルスの様なウ
イルスとしてパッケージされたものを含む）も含む。
む組成物も提供する。この様な組成物（特に医薬品組成物）は例えば個体中での
細胞殺滅の誘導及び効果の大きさを測定する場合の様な、インビトロでの投与に
有用である。医薬品として受け入れ可能な成分（一般にはアデノウイルスベクタ
ーの有効量）は、個体への全身投与に好適な単位投与形状、滅菌された非経口投
与液または懸濁液、滅菌された経口投与液、又は経口溶液又は懸濁液、水中油型
、又は油中水型乳剤等である。非経口及び経口薬物供給に関する調剤は当分野で
既知であり、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ」１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
（１９９５）に記載されている。医薬品組成物は更に本発明のアデノウイルスベ
クターの凍結乾燥された及び／又は再構築された形状（アデノウイルスの様なウ
イルスとしてパッケージされたものを含む）も含む。
【０１０８】 ここに記載の検出方法には、その他の組成物が利用され、また有用である。こ
れら組成物に関して、アデノウイルスベクターは通常、緩衝液システムの様な適
当な溶媒、又は溶液に懸濁されている。この様な溶媒は当分野で公知である。 本発明のキット 本発明は本発明のアデノウイルスベクターを含むキットも包含する。これらキ
ットは診断及び／又はモニタリングの目的、好ましくはモニタリングに使用でき
る。これらキットの使用方法は、臨床検査施設、実験研究室、医療現場、又は私
的個人によって実施できる。本発明に包含されるキットは、例えば生検標本の様
な好適な生物学的サンプル内にある細胞状態産生細胞の存在の検出を可能にする
。
れら組成物に関して、アデノウイルスベクターは通常、緩衝液システムの様な適
当な溶媒、又は溶液に懸濁されている。この様な溶媒は当分野で公知である。 本発明のキット 本発明は本発明のアデノウイルスベクターを含むキットも包含する。これらキ
ットは診断及び／又はモニタリングの目的、好ましくはモニタリングに使用でき
る。これらキットの使用方法は、臨床検査施設、実験研究室、医療現場、又は私
的個人によって実施できる。本発明に包含されるキットは、例えば生検標本の様
な好適な生物学的サンプル内にある細胞状態産生細胞の存在の検出を可能にする
。
【０１０９】 本発明のキットは、好適パッケージ内にここに記載したアデノウイルスベクタ
ーを含んでいる。キットは随意緩衝液、現像液、標識体、反応表面、検出手段、
コントロールサンプル、装置及び解釈に関する情報を含む操作に於いて有用な追
加の成分も提供できるが、もとよりこれに限定されない。 本発明のアデノウイルスベクターの調製 本発明のアデノウイルスベクターは、当分野で標準の組換え体技術により調製
できる。一般に細胞状態特異的ＴＲＥは所望のアデノウイルス遺伝子、１又はそ
れ以上の初期遺伝子の５’側に挿入される（後期遺伝子も利用できるが）。細胞
状態特異的ＴＲＥはオリゴヌクレオチド合成（配列が既知の場合）又は組換え体
法（ＰＣＲ及び／又は制限酵素法）を用い調製できる。天然のアデノＤＮＡ配列
内にある、又はオリゴヌクレオチド標的突然変異誘導法やＰＣＲの様な方法によ
り誘導された好都合な制限酵素部位は、細胞状態特異ＴＲＥに適した挿入部位を
提供する。従って、細胞状態特異的ＴＲＥのアニーリング（即ち挿入）に適した
好都合な制限酵素部位は、ＰＣＲの様な標準的組換え体法を用い、細胞状態特異
的ＴＲＥの５’及び３’端に作ることができる。
ーを含んでいる。キットは随意緩衝液、現像液、標識体、反応表面、検出手段、
コントロールサンプル、装置及び解釈に関する情報を含む操作に於いて有用な追
加の成分も提供できるが、もとよりこれに限定されない。 本発明のアデノウイルスベクターの調製 本発明のアデノウイルスベクターは、当分野で標準の組換え体技術により調製
できる。一般に細胞状態特異的ＴＲＥは所望のアデノウイルス遺伝子、１又はそ
れ以上の初期遺伝子の５’側に挿入される（後期遺伝子も利用できるが）。細胞
状態特異的ＴＲＥはオリゴヌクレオチド合成（配列が既知の場合）又は組換え体
法（ＰＣＲ及び／又は制限酵素法）を用い調製できる。天然のアデノＤＮＡ配列
内にある、又はオリゴヌクレオチド標的突然変異誘導法やＰＣＲの様な方法によ
り誘導された好都合な制限酵素部位は、細胞状態特異ＴＲＥに適した挿入部位を
提供する。従って、細胞状態特異的ＴＲＥのアニーリング（即ち挿入）に適した
好都合な制限酵素部位は、ＰＣＲの様な標準的組換え体法を用い、細胞状態特異
的ＴＲＥの５’及び３’端に作ることができる。
【０１１０】 本発明のアデノウイルスベクターの作製に利用されるポリヌクレオチドは、化
学的合成の様な標準的方法を利用し、組換え体法により、及び／又は生物学的資
源より所望の配列を得ることにより得ることができるだろう。 アデノウイルスベクターは１方のプラスミドがアデノウイルスの左方の領域を
提供し、もう一方のプラスミドが右手の領域を提供し、それらが相同的組み換え
に適した中央部の少なくとも５００ｎｔの領域を共有している２個のプラスミド
を利用することで好都合に調製される。この方法では、希望する場合には各プラ
スミドは独立に加工された後、コンピテント宿主細胞に共トランフクションされ
、適当であれば相補遺伝子が提供され、あるいはアデノウイルスの増殖に関係し
た細胞状態特異的ＴＲＥ由来の転写開始に関する適当な転写因子的が提供される
。プラスミドは一般にはカチオン性リポソームの様な適当なトランスダクション
法を用い、２９３細胞の様な好適宿主細胞内に導入される。又はアデノウイルス
ゲノムの左方及び右方部分のインビトロ連結を利用し、複製に必須な全てのアデ
ノウイルスゲノム部分を含む組換え体アデノウイルス誘導体を構築する。Ｂｅｒ
ｋｎｅｒら、（１９８３）「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」１
１： ６００３−６０２０； Ｂｒｉｄｇｅら、（１９８９）「Ｈ．Ｖｉｒｏｌ
．」６３：６３１−６３８。
学的合成の様な標準的方法を利用し、組換え体法により、及び／又は生物学的資
源より所望の配列を得ることにより得ることができるだろう。 アデノウイルスベクターは１方のプラスミドがアデノウイルスの左方の領域を
提供し、もう一方のプラスミドが右手の領域を提供し、それらが相同的組み換え
に適した中央部の少なくとも５００ｎｔの領域を共有している２個のプラスミド
を利用することで好都合に調製される。この方法では、希望する場合には各プラ
スミドは独立に加工された後、コンピテント宿主細胞に共トランフクションされ
、適当であれば相補遺伝子が提供され、あるいはアデノウイルスの増殖に関係し
た細胞状態特異的ＴＲＥ由来の転写開始に関する適当な転写因子的が提供される
。プラスミドは一般にはカチオン性リポソームの様な適当なトランスダクション
法を用い、２９３細胞の様な好適宿主細胞内に導入される。又はアデノウイルス
ゲノムの左方及び右方部分のインビトロ連結を利用し、複製に必須な全てのアデ
ノウイルスゲノム部分を含む組換え体アデノウイルス誘導体を構築する。Ｂｅｒ
ｋｎｅｒら、（１９８３）「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」１
１： ６００３−６０２０； Ｂｒｉｄｇｅら、（１９８９）「Ｈ．Ｖｉｒｏｌ
．」６３：６３１−６３８。
【０１１１】 都合の良いことに、アデノウイルスの必要部分を提供するプラスミドが利用で
きる。プラスミドｐＸＣ．１（ＭｃＫｉｎｎｏｎ（１９８２）「Ｇｅｎｅ」１９
： ３３−４２）はＡｄ５の野生型左端を含む。ｐＢＨＧ１０（Ｂｅｔｔら（１
９９４）「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ」９１：８８０
２−８８０６； Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， Ｔｏ
ｒｏｎｔｏ）はＥ３を欠くＡｄ５右端を提供する。Ｅ３の欠失により内因性エン
ハンサー／プロモーターを欠失すること無しに３ｋｂの細胞状態ＴＲＥをウイル
ス内に挿入するための空間が提供される。Bettら、(1994）。Ｅ３の遺伝子はＥ
４の反対鎖上に位置している（ｒ−鎖）。ｐＢＨＧ１１はより大きなＥ３欠失を
提供する（更に０．３ｋｂが欠失している）。Bettら(1994)。
きる。プラスミドｐＸＣ．１（ＭｃＫｉｎｎｏｎ（１９８２）「Ｇｅｎｅ」１９
： ３３−４２）はＡｄ５の野生型左端を含む。ｐＢＨＧ１０（Ｂｅｔｔら（１
９９４）「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ」９１：８８０
２−８８０６； Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， Ｔｏ
ｒｏｎｔｏ）はＥ３を欠くＡｄ５右端を提供する。Ｅ３の欠失により内因性エン
ハンサー／プロモーターを欠失すること無しに３ｋｂの細胞状態ＴＲＥをウイル
ス内に挿入するための空間が提供される。Bettら、(1994）。Ｅ３の遺伝子はＥ
４の反対鎖上に位置している（ｒ−鎖）。ｐＢＨＧ１１はより大きなＥ３欠失を
提供する（更に０．３ｋｂが欠失している）。Bettら(1994)。
【０１１２】 初期遺伝子の操作に関し、Ａｄ５Ｅ１Ａの転写開始部位はウイルスゲノムの４
９８に位置し、Ｅ１Ａ蛋白質のＡＴＧ開始部位はウイルスゲノムの５６０に位置
している。この領域は細胞状態特異的ＴＲＥの挿入に利用できる。制限酵素部位
はＡｄ５ゲノムに限定されて利用されるプライマー、又はＡｄ５ゲノムＤＮＡを
持つプラスミドの一部を含むプライマーを利用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）を実施することで導入される。例えば、ｐＢＲ３２２を利用する場合、プラ
イマーはｐＢＲ３２２主鎖内のＥｃｏＲＩ部位及びＡｄ５の１３３９位置にある
ＸｈａＩ部位を利用するだろう。領域中央部に重複するプライマーによって特異
的な制限酵素部位が生まれる様な３０配列変化を導入する２段階のＰＣＲを実施
することで、その部位に相同的ＴＲＥの挿入ができる。
９８に位置し、Ｅ１Ａ蛋白質のＡＴＧ開始部位はウイルスゲノムの５６０に位置
している。この領域は細胞状態特異的ＴＲＥの挿入に利用できる。制限酵素部位
はＡｄ５ゲノムに限定されて利用されるプライマー、又はＡｄ５ゲノムＤＮＡを
持つプラスミドの一部を含むプライマーを利用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）を実施することで導入される。例えば、ｐＢＲ３２２を利用する場合、プラ
イマーはｐＢＲ３２２主鎖内のＥｃｏＲＩ部位及びＡｄ５の１３３９位置にある
ＸｈａＩ部位を利用するだろう。領域中央部に重複するプライマーによって特異
的な制限酵素部位が生まれる様な３０配列変化を導入する２段階のＰＣＲを実施
することで、その部位に相同的ＴＲＥの挿入ができる。
【０１１３】 同様の方針はＥ１Ｂを制御する異種ＴＲＥの挿入にも利用できるだろう。Ａｄ
５のＥ１Ｂプロモーターは、ＳｐＩ及びＴＡＴＡボックスに対する単一の高親和
性認識部位である。この領域は１６３６から１７０１に伸びている。この領域に
異種ＴＲＥが挿入されることで、Ｅ１Ｂ遺伝子の標的細胞特異的転写を提供でき
る。異種ＴＲＥにより左領域を修飾し、Ｅ１Ｂを制御する異種ＴＲＥを導入する
ための鋳型となるＥ１Ａを得ることで、得られたアデノウイルスベクターはＥ１
Ａ及びＥ１Ｂの両方の発現に関し細胞状態特異的転写因子に依存する様になる。
５のＥ１Ｂプロモーターは、ＳｐＩ及びＴＡＴＡボックスに対する単一の高親和
性認識部位である。この領域は１６３６から１７０１に伸びている。この領域に
異種ＴＲＥが挿入されることで、Ｅ１Ｂ遺伝子の標的細胞特異的転写を提供でき
る。異種ＴＲＥにより左領域を修飾し、Ｅ１Ｂを制御する異種ＴＲＥを導入する
ための鋳型となるＥ１Ａを得ることで、得られたアデノウイルスベクターはＥ１
Ａ及びＥ１Ｂの両方の発現に関し細胞状態特異的転写因子に依存する様になる。
【０１１４】 同様に、細胞状態特異的ＴＲＥはＥ２遺伝子の上流に挿入でき、それによりそ
の発現を細胞状態特異的にできる。２７０５０〜２７１５０のＡｄ５内にマッピ
ングされるＥ２初期プロモーターは、主要転写開始部位及びＥ２転写体の約５％
に相当する副次的転写開始部位、２個の非典型的ＴＡＴＡボックス。２カ所のＥ
２Ｆ転写因子結合部位及びＡＴＦ転写因子結合部位より構成される。Ｅ２プロモ
ーター構造の詳細についてはＳｗａｍｉｎａｔｈａｎら，「Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ
ｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ， ａｎｄ Ｉｍｍ」（１９９５） １９９（ｐａｒ
ｔ ３）；１７７−１９４を参照。
の発現を細胞状態特異的にできる。２７０５０〜２７１５０のＡｄ５内にマッピ
ングされるＥ２初期プロモーターは、主要転写開始部位及びＥ２転写体の約５％
に相当する副次的転写開始部位、２個の非典型的ＴＡＴＡボックス。２カ所のＥ
２Ｆ転写因子結合部位及びＡＴＦ転写因子結合部位より構成される。Ｅ２プロモ
ーター構造の詳細についてはＳｗａｍｉｎａｔｈａｎら，「Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ
ｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ， ａｎｄ Ｉｍｍ」（１９９５） １９９（ｐａｒ
ｔ ３）；１７７−１９４を参照。
【０１１５】 Ｅ４に関しては、アデノウイルスゲノムの右手部分を使用しなければならない
。Ｅ４転写開始部位は３５６０９近傍であり、ＴＡＴＡボックスは３５６３８に
、そしてＯＲＦ１の最初のＡＴＧ／ＣＴＧは３５５３２にある。Ｖｉｒｔａｎｅ
ｎら（１９８４）「Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．」５１：８２２−８３１。他の遺伝子に関
する上記方針の何れかを利用し、細胞状態特異的ＴＲＥは転写開始部位上流に挿
入される。Ｅ４領域の変異体の構築に関しては、Ｗ１６２細胞内にて共トランス
フェクション及び相同組み換えを実施し、トランスのＥ４蛋白質をこれら蛋白質
の合成を欠失している相補欠損体に提供する（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、（１９８３
）「Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ．」８０：５３８３−５３８６
）。あるいは、これら構築体はインビトロ連結によって作製できる。
。Ｅ４転写開始部位は３５６０９近傍であり、ＴＡＴＡボックスは３５６３８に
、そしてＯＲＦ１の最初のＡＴＧ／ＣＴＧは３５５３２にある。Ｖｉｒｔａｎｅ
ｎら（１９８４）「Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．」５１：８２２−８３１。他の遺伝子に関
する上記方針の何れかを利用し、細胞状態特異的ＴＲＥは転写開始部位上流に挿
入される。Ｅ４領域の変異体の構築に関しては、Ｗ１６２細胞内にて共トランス
フェクション及び相同組み換えを実施し、トランスのＥ４蛋白質をこれら蛋白質
の合成を欠失している相補欠損体に提供する（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、（１９８３
）「Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ．」８０：５３８３−５３８６
）。あるいは、これら構築体はインビトロ連結によって作製できる。
【０１１６】 本発明のアデノウイルスベクターを利用する方法 本発明のアデノウイルスベクターは所望する、又は意図する結果が様々である
広範囲の目的に使用できる。従って本発明は上記のアデノウイルスベクターの使
用に関する方法を含む。 実施態様の一つでは、方法は細胞をここに記載したアデノウイルスベクターに
、このアデノウイルスベクターが細胞内に侵入する様に接触させることを含む、
一般には個体（好ましくはヒト）内にあるものの必ずしもその必要はない標的細
胞（即ち細胞状態特異的ＴＲＥを機能させるのに必要な生理状態を提示する細胞
）に選択的細胞傷害性を付与するために提供される。細胞傷害性は、色素排除法
、3Ｈ−チミジン取り込み及び／又は溶解法の様な当分野標準的なアッセイ法を
用い測定することができる。
広範囲の目的に使用できる。従って本発明は上記のアデノウイルスベクターの使
用に関する方法を含む。 実施態様の一つでは、方法は細胞をここに記載したアデノウイルスベクターに
、このアデノウイルスベクターが細胞内に侵入する様に接触させることを含む、
一般には個体（好ましくはヒト）内にあるものの必ずしもその必要はない標的細
胞（即ち細胞状態特異的ＴＲＥを機能させるのに必要な生理状態を提示する細胞
）に選択的細胞傷害性を付与するために提供される。細胞傷害性は、色素排除法
、3Ｈ−チミジン取り込み及び／又は溶解法の様な当分野標準的なアッセイ法を
用い測定することができる。
【０１１７】 別の実施態様では、方法は細胞状態特異的ＴＲＥを機能可能にする哺乳動物細
胞に関し特異的なアデノウイルスを増殖するために提供される。これら方法はア
デノウイルスベクターを哺乳動物細胞に組合せ、それによって該アデノウイルス
が増殖することを必要とする。 本発明は更に腫瘍細胞をここに記載したアデノウイルスベクターに、このアデ
ノウイルスベクターが腫瘍細胞内に侵入し、腫瘍細胞に選択的細胞傷害性を提示
する様に接触させることを含む、一般には個体（好ましくはヒト）内にあるもの
の必ずしもその必要はない腫瘍細胞の増殖を抑制する方法を提供する。腫瘍細胞
の増殖は、腫瘍サイズの測定、3Ｈ−チミジン取り込みアッセイ又は腫瘍細胞数
を測定することによる腫瘍細胞の増殖有無の決定を含む、当分野で既知の何れか
の方法により評価することができるが、もとより上記方法に限定されるわけでは
ない。
胞に関し特異的なアデノウイルスを増殖するために提供される。これら方法はア
デノウイルスベクターを哺乳動物細胞に組合せ、それによって該アデノウイルス
が増殖することを必要とする。 本発明は更に腫瘍細胞をここに記載したアデノウイルスベクターに、このアデ
ノウイルスベクターが腫瘍細胞内に侵入し、腫瘍細胞に選択的細胞傷害性を提示
する様に接触させることを含む、一般には個体（好ましくはヒト）内にあるもの
の必ずしもその必要はない腫瘍細胞の増殖を抑制する方法を提供する。腫瘍細胞
の増殖は、腫瘍サイズの測定、3Ｈ−チミジン取り込みアッセイ又は腫瘍細胞数
を測定することによる腫瘍細胞の増殖有無の決定を含む、当分野で既知の何れか
の方法により評価することができるが、もとより上記方法に限定されるわけでは
ない。
【０１１８】 本発明は更に生物学的サンプル中にある標的細胞（即ち細胞状態特異的ＴＲＥ
を機能させるのに必要な生理状態を提示する細胞）を検出するための方法を含む
。これらの方法は特に、実験的又は臨床状況に於いて、個体（即ち哺乳動物）の
臨床及び／又は生理学的状態をモニターするのに有用である。これらの方法では
、生物学的サンプルの細胞はアデノウイルスに接触させられ、アデノウイルスベ
クターの複製が検出される。好適な生物学的サンプルは、その中で必要とされる
生理学的（及び／又は環境）状態、例えば異常な生理状態（低酸素状態にある、
及びＨＩＦ−１の抑制の様な低酸素状態にある細胞に特徴的な表現形を示す細胞
）が存在するか、その存在が疑われるサンプルである。
を機能させるのに必要な生理状態を提示する細胞）を検出するための方法を含む
。これらの方法は特に、実験的又は臨床状況に於いて、個体（即ち哺乳動物）の
臨床及び／又は生理学的状態をモニターするのに有用である。これらの方法では
、生物学的サンプルの細胞はアデノウイルスに接触させられ、アデノウイルスベ
クターの複製が検出される。好適な生物学的サンプルは、その中で必要とされる
生理学的（及び／又は環境）状態、例えば異常な生理状態（低酸素状態にある、
及びＨＩＦ−１の抑制の様な低酸素状態にある細胞に特徴的な表現形を示す細胞
）が存在するか、その存在が疑われるサンプルである。
【０１１９】 一般に、哺乳動物では好適な臨床サンプルは、その中で低酸素状態にある固形
癌の中にある細胞の様な、必要とされる生理状態を提示している癌細胞の存在が
疑われるサンプルである。この様な細胞は、例えば針生検、又はその他の外科的
手法により得ることができる。接触を受ける細胞は、アッセイ条件を促進するた
めに、例えば選択的濃縮及び／又は可溶化の様な処理を受けるだろう。これらの
方法では、標的細胞はアデノウイルスの増殖を検出する、当分野で標準的である
インビトロアッセイを使用し検出できる。この様な標準的アッセイの例には、バ
ーストアッセイ（ウイルス産出量を測定する）及びプラークアッセイ（細胞当た
りの感染細胞を測定する）が含まれるが、これに限定されない。増殖は、特異的
アデノウイルスＤＮＡ複製を測定することによっても検出でき、これも標準的ア
ッセイである。
癌の中にある細胞の様な、必要とされる生理状態を提示している癌細胞の存在が
疑われるサンプルである。この様な細胞は、例えば針生検、又はその他の外科的
手法により得ることができる。接触を受ける細胞は、アッセイ条件を促進するた
めに、例えば選択的濃縮及び／又は可溶化の様な処理を受けるだろう。これらの
方法では、標的細胞はアデノウイルスの増殖を検出する、当分野で標準的である
インビトロアッセイを使用し検出できる。この様な標準的アッセイの例には、バ
ーストアッセイ（ウイルス産出量を測定する）及びプラークアッセイ（細胞当た
りの感染細胞を測定する）が含まれるが、これに限定されない。増殖は、特異的
アデノウイルスＤＮＡ複製を測定することによっても検出でき、これも標準的ア
ッセイである。
【０１２０】 本発明を例示するために以下実施例を提供するが、これにより本発明は制限さ
れない。 実施例 実施例１ 低酸素反応性エレメント及びＰＳＡ−ＴＲＥの転写制御下にあるＥ１Ａを含む
アデノウイルスベクター 一般技術 ヒト胚性腎臓細胞株、２９３は効率的にＡｄ５のＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子を発
現し、アデノウイルスＤＮＡによる高トランスフェクション率を示す。組換え体
アデノウイルスを作製するために、２９３細胞を１種類の左端Ａｄ５プラスミド
と１種類の右端Ａｄ５プラスミドで共トランスフェクションした。相同組み換え
により、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ蛋白質をトランスに提供し、それら蛋白質の合成の欠
損を補う、２９３細胞内での増殖に必須な遺伝子エレメントを持つアデノウイル
スが作製された。
れない。 実施例 実施例１ 低酸素反応性エレメント及びＰＳＡ−ＴＲＥの転写制御下にあるＥ１Ａを含む
アデノウイルスベクター 一般技術 ヒト胚性腎臓細胞株、２９３は効率的にＡｄ５のＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子を発
現し、アデノウイルスＤＮＡによる高トランスフェクション率を示す。組換え体
アデノウイルスを作製するために、２９３細胞を１種類の左端Ａｄ５プラスミド
と１種類の右端Ａｄ５プラスミドで共トランスフェクションした。相同組み換え
により、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ蛋白質をトランスに提供し、それら蛋白質の合成の欠
損を補う、２９３細胞内での増殖に必須な遺伝子エレメントを持つアデノウイル
スが作製された。
【０１２１】 組み合わせられるプラスミドはリポフェクチン（ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ（商標
）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の様なカチオン性リポソームを使用
し、２種類のプラスミドを組合せ、次にプラスミドＤＮＡ液（血清及びその他の
添加物を含まない最少必須培地（ＭＥＭ）５００μｌ中に各プラスミドを１０μ
ｌ含む）を４倍モル過剰濃度のリポソームを含む２００μｌの同一緩衝液と混合
することで２９３細胞内に共トランスフェクトされた。次にＤＮＡ−液体複合体
を細胞上に置き、３７℃、５％ＣＯ2で１６時間インキュベーションした。イン
キュベーション後、培地を１０％胎児ウシ血清を含むＭＥＭと交換し、細胞を更
に３７℃、５％ＣＯ2で１０日間、培地を２回交換しながらインキュベーション
した。終了時に、細胞及び培地をチューブに移し、３回凍結溶解し、溶解物をプ
ラークとして個々のウイルスを検出するのに適当な希釈率で使い２９３細胞に感
染させた。
）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の様なカチオン性リポソームを使用
し、２種類のプラスミドを組合せ、次にプラスミドＤＮＡ液（血清及びその他の
添加物を含まない最少必須培地（ＭＥＭ）５００μｌ中に各プラスミドを１０μ
ｌ含む）を４倍モル過剰濃度のリポソームを含む２００μｌの同一緩衝液と混合
することで２９３細胞内に共トランスフェクトされた。次にＤＮＡ−液体複合体
を細胞上に置き、３７℃、５％ＣＯ2で１６時間インキュベーションした。イン
キュベーション後、培地を１０％胎児ウシ血清を含むＭＥＭと交換し、細胞を更
に３７℃、５％ＣＯ2で１０日間、培地を２回交換しながらインキュベーション
した。終了時に、細胞及び培地をチューブに移し、３回凍結溶解し、溶解物をプ
ラークとして個々のウイルスを検出するのに適当な希釈率で使い２９３細胞に感
染させた。
【０１２２】 得られたプラークについて２回プラーク精製し、ＰＣＲ及び必要に応じＤＮＡ
配列決定を行い、所望する配列の存在についてウイルスを特徴付けた。その後の
実験の為に、ウイルスは塩化セシウム勾配遠心分離法により大規模で精製された
。 Ｅ１Ａが細胞状態特異的ＴＲＥの転写制御下にあるアデノウイルスベクター 低酸素反応エレメント（ＨＲＥ）を含むアデノウイルスベクターが作製された
。Ｅ１ＡがＨＲＥ及びＰＳＡ−ＴＲＥより成る複合ＴＲＥの制御下にあるアデノ
ウイルスベクターであるＣＮ７９６は、ＣＮ５１５をｐＢＨＧ１０と共トランス
フェクションすることで作製された。ＣＮ５１５はＨＥＲｅｎｏ１（Ｊｉａｎｇ
ら、（１９９７）「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｃｈ」５７：５３２８−５３３５
）（配列番号１：図２）由来の６７塩基対断片を、ＣＮ６５のＢｇＩＩＩ部位に
挿入することで構築された。ＣＮ６５は、−５４１から＋１２間でのＰＳＡプロ
モーターに融合した−５３２２から−３７３８までのエンハンサーから成るヒト
ＰＳＡ由来のエンハンサー及びプロモーターを含むプラスミドである。これは、
プラスミド７０６内に含有されたＰＳＡ−ＴＲＥである。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら
「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」５７：２５５９−２５６３。
配列決定を行い、所望する配列の存在についてウイルスを特徴付けた。その後の
実験の為に、ウイルスは塩化セシウム勾配遠心分離法により大規模で精製された
。 Ｅ１Ａが細胞状態特異的ＴＲＥの転写制御下にあるアデノウイルスベクター 低酸素反応エレメント（ＨＲＥ）を含むアデノウイルスベクターが作製された
。Ｅ１ＡがＨＲＥ及びＰＳＡ−ＴＲＥより成る複合ＴＲＥの制御下にあるアデノ
ウイルスベクターであるＣＮ７９６は、ＣＮ５１５をｐＢＨＧ１０と共トランス
フェクションすることで作製された。ＣＮ５１５はＨＥＲｅｎｏ１（Ｊｉａｎｇ
ら、（１９９７）「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｃｈ」５７：５３２８−５３３５
）（配列番号１：図２）由来の６７塩基対断片を、ＣＮ６５のＢｇＩＩＩ部位に
挿入することで構築された。ＣＮ６５は、−５４１から＋１２間でのＰＳＡプロ
モーターに融合した−５３２２から−３７３８までのエンハンサーから成るヒト
ＰＳＡ由来のエンハンサー及びプロモーターを含むプラスミドである。これは、
プラスミド７０６内に含有されたＰＳＡ−ＴＲＥである。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら
「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」５７：２５５９−２５６３。
【０１２３】 インビトロでのウイルス増殖 組換え体アデノウイルスの増殖選択性はプラークアッセイにて分析し、その中
で感染と複製を繰り返し、単一感染粒子は視認できるプラークを生じた。保存ウ
イルスを等しいｐｆｕ／ｍｌに希釈し、続いて細胞の単層に１時間感染した。接
種物を取り出し、培地を含む半固形寒天を細胞に重層し、３７℃で１０日間イン
キュベーションした。次に単層内のプラークを数え、各種細胞に於ける感染ウイ
ルスの力価を計算した。データは２９３細胞に対するＣＮ７０２（野生型）の力
価で標準化した。
で感染と複製を繰り返し、単一感染粒子は視認できるプラークを生じた。保存ウ
イルスを等しいｐｆｕ／ｍｌに希釈し、続いて細胞の単層に１時間感染した。接
種物を取り出し、培地を含む半固形寒天を細胞に重層し、３７℃で１０日間イン
キュベーションした。次に単層内のプラークを数え、各種細胞に於ける感染ウイ
ルスの力価を計算した。データは２９３細胞に対するＣＮ７０２（野生型）の力
価で標準化した。
【図１】 図１は実施例１記載の如くＥ１Ａ遺伝子がＨＲＥ及びＰＳＡ−ＴＲＥの転写制
御下にあるアデノウイルスベクターＣＮ７９６の概略図である。
御下にあるアデノウイルスベクターＣＮ７９６の概略図である。
【図２】 図２は、ラットエノラーゼ−１遺伝子の５’フランキング領域にあるＨＲＥの
ヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
ヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図３】 図３は、ヒトＥ２Ｆ１遺伝子の５’フランキング領域のヌクレオチド配列（配
列番号２）を示す。星印は転写開始部位を示す。
列番号２）を示す。星印は転写開始部位を示す。
【図４】 図４は前立腺特異的抗原ＴＲＥのヌクレオチド配列を示す。
【図５】 図５は癌胚抗原ＴＲＥのヌクレオチド配列を示す。
【図６】 図６はヒト腺型カリクレインＴＲＥのヌクレオチド配列を示す。
【図７】 図７はムチンＴＲＥのヌクレオチド配列を示す。
【図８】 図８はラットプロバシンＴＲＥのヌクレオチド配列を示す。
【図９】 図９はアデノウイルス死滅蛋白質のヌクレオチド配列及び翻訳されたアミノ酸
配列を示す。
配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 7/02 5/10 Ａ６１Ｋ 35/76 7/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 35/76 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA03 DA02 EA02 GA11 HA01 HA17 4B065 AA90X AA93X AA95X AA95Y AB01 AC20 BA02 CA24 CA45 4C084 AA13 NA13 NA14 ZB262 4C087 AA01 AA02 BC83 NA13 NA14 ZB26
Claims (28)
- 【請求項１】 細胞状態特異的ＴＲＥを含む転写制御エレメント（ＴＲＥ）
の転写制御下にあるアデノウイルス遺伝子を含むアデノウイルスベクター。 - 【請求項２】 アデノウイルス遺伝子がウイルス複製に必須である請求項１
のアデノウイルスベクター。 - 【請求項３】 アデノウイルス遺伝子が初期遺伝子である請求項２のアデノ
ウイルスベクター。 - 【請求項４】 アデノウイルス遺伝子が後期遺伝子である請求項２のアデノ
ウイルスベクター。 - 【請求項５】 アデノウイルス初期遺伝子がＥ１Ａである請求項３のアデノ
ウイルスベクター。 - 【請求項６】 アデノウイルス初期遺伝子がＥ１Ｂである請求項３のアデノ
ウイルスベクター。 - 【請求項７】 アデノウイルス初期遺伝子がＥ４である請求項３のアデノウ
イルスベクター。 - 【請求項８】 細胞状態特異的ＴＲＥがヒトのものである請求項１のアデノ
ウイルスベクター。 - 【請求項９】 細胞状態特異的ＴＲＥが低酸素反応性エレメント（ＨＲＥ）
を含む請求項１のアデノウイルスベクター。 - 【請求項１０】 ＨＲＥが配列番号１を含む、請求項９のアデノウイルスベ
クター。 - 【請求項１１】 細胞状態特異的ＴＲＥが細胞周期特異的エレメントを含む
請求項１のアデノウイルスベクター。 - 【請求項１２】 細胞周期特異的エレメントがＥ２Ｆ−１遺伝子に由来する
請求項１１のアデノウイルスベクター。 - 【請求項１３】 細胞状態特異的ＴＲＥが熱誘導エレメントを含む請求項１
のアデノウイルスベクター。 - 【請求項１４】 更に細胞型特異的ＴＲＥを含む請求項１のアデノウイルス
ベクター。 - 【請求項１５】 細胞型特異的ＴＲＥが前立腺細胞特異的である請求項１４
のアデノウイルスベクター。 - 【請求項１６】 前立腺細胞特異的ＴＲＥがＰＳＡ−ＴＲＥである請求項１
５のアデノウイルスベクター。 - 【請求項１７】 更に第２細胞状態特異的ＴＲＥの転写制御下にあるトラン
ス遺伝子を含む請求項１のアデノウイルスベクター。 - 【請求項１８】 細胞状態特異的ＴＲＥ及び細胞型特異的ＴＲＥを含むＴＲ
Ｅの転写制御下にあるアデノウイルス遺伝子を含むアデノウイルスベクター。 - 【請求項１９】 アデノウイルス遺伝子が初期遺伝子である請求項１８のア
デノウイルスベクター。 - 【請求項２０】 初期遺伝子がＥ１Ａである請求項１９のアデノウイルスベ
クター。 - 【請求項２１】 細胞状態特異的ＴＲＥがＨＲＥを含み、細胞タイプ特異的
ＴＲＥがＰＳＡ−ＴＲＥである請求項２０のアデノウイルスベクター。 - 【請求項２２】 ＨＲＥが配列番号１を含み、そしてＰＳＡ−ＴＲＥが配列
番号３の約５０３から約２０８６のヌクレオチド及び配列番号３の約５２８５か
ら約５８３６までのヌクレオチドを含む、請求項２１のアデノウイルスベクター
。 - 【請求項２３】 請求項１のアデノウイルスベクターを含む組成物。
- 【請求項２４】 更に医薬品として受け入れ可能な成分を含む請求項２３の
組成物。 - 【請求項２５】 請求項１のアデノウイルスベクターを含む宿主細胞。
- 【請求項２６】 請求項１によるアデノウイルスと細胞を組合せ、それによ
り該アデノウイルスが増殖することを含む、細胞状態特異的ＴＲＥを機能できる
細胞に特異的なアデノウイルスを増殖させる方法。 - 【請求項２７】 細胞状態特異的ＴＲＥを機能できる細胞を請求項１のアデ
ノウイルスベクターと接触させ、それにより該ベクターを細胞内に侵入させるこ
とを含む、標的細胞に特異的な細胞傷害性を付与する方法。 - 【請求項２８】 請求項１のアデノウイルスベクターを細胞状態特異的ＴＲ
Ｅを機能できる腫瘍細胞内に導入し、そのなかでアデノウイルスベクターの導入
が腫瘍増殖の抑制をもたらすことを含む腫瘍増殖を抑制する方法。
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