JP2004511203A - 内部リボソーム接近部位を含む細胞特異的なアデノウイルスベクター - Google Patents
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Abstract
Description
技術分野
本発明は、標的細胞において優先的に複製する、内部リボソーム接近部位を含む、新奇の、複製受容能のあるアデノウイルスベクターに関連する。本発明はまた、内部リボソーム接近部位を含むアデノウイルスベクターを用いた細胞の形質導入に関連する。
【0002】
背景
変化した細胞増殖、特に超増殖を伴う疾患は、重大な健康問題である。例えば、医学研究における数多くの進歩に関わらず、癌は依然として、米国における第二の主要な死因である。産業化した国家においては、およそ5人に1人が癌のために死亡する。外科的切除術、放射線治療および化学療法のような、臨床的医療の従来法は、特に固形腫瘍について著しい失敗率を有する。良性腫瘍に帰結するような新形成は、腫瘍塊の外科的除去により通常完全に治癒する。腫瘍が周囲組織への侵襲によって明らかになるような、悪性になった場合には、根絶するのははるかに困難になる。一旦悪性腫瘍が転移すると、根絶される可能性ははるかに低い。
【0003】
基底細胞癌を除外しても、米国のみにおいてでさえ、年間百万例を超える癌の新症例が存在し、当国において癌は年間50万例を超える死亡の原因である。全世界においては、最も一般的な5つの癌は、肺癌、胃癌、乳癌、大腸/直腸癌、および子宮頸癌であり、年間当たりの新たな症例の総数は、600万例を超える。
【0004】
米国においては、移行上皮癌(TCC)が、膀胱のあらゆる腫瘍の90%−95%の原因である。扁平上皮癌(SCC)が5%−10%であり、腺癌がおよそ1%−2%である。扁平上皮細胞および腺腫因子はしばしば、移行細胞腫瘍、特に重度の腫瘍に関連して認められる。膀胱癌は、概して、表在性および侵襲性の疾患に分けられる。決定的な要因は、粘膜に限定される腫瘍と、基底膜を貫通し、固有層にまで拡張した腫瘍との間の識別である。「表在性膀胱腫瘍」という用語は、筋層を侵襲していない腫瘍を表すために一般に使用される。侵襲性腫瘍は、固有筋層、膀胱周囲の線維脂肪組織、または近接する構造を侵襲したものと記載される。上皮内癌(CIS)は、非常に変化しやすい経過をたどる膀胱のTCCの重度および攻撃的な症状発現である。
【0005】
多くの尿路上皮細胞特異的なタンパク質について説明がなされており、ウロプラキンもその1つである。UPIaおよびUPIb(各々27 kDaおよび28 kDa)、UPII(15 kDa)、およびUPIII(47 kDa)を含むウロプラキン(UP)は、尿路上皮斑の主要タンパク質である内在性膜タンパク質群の一員である。これらの斑は哺乳動物の尿路上皮の先端表面の大部分を占め、尿路上皮先端表面の透過性関門および/または物理的安定器としての役割を担い得る。ウー(Wu)ら(1994)J.Biol.Chem.269:13716−13724を参照されたい。UPは膀胱特異的なタンパク質であり、移行上皮癌の約88%を含む、著しい比率の尿路上皮由来の腫瘍において発現される。モル(Moll)ら(1995)Am.J.Pathol. 147:1383−1397;およびウー(Wu)ら(1998)Cancer Res. 58:1291−1297を参照されたい。ヒトUPIIの発現の調節については研究がなされ、異種遺伝子上において尿路上皮特異的な転写を与えることのできる、マウスUPII遺伝子の上流の3.6 kb領域が同定された(Linら(1995)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 92:679−683)。米国特許第5,824,543号および第6,001,646号も参照されたい。
【0006】
皮膚およびその他の部位のメラノサイトに由来する悪性新生物である黒色腫は、世界中で発生数が増加しつつある。米国癌共同委員会(American Joint Committee on Cancer)では、ヒトにおいて生じる眼球外黒色腫の以下の5つの異なる形態を認識している:悪性黒子由来黒色腫;表在拡大型黒色腫;結節型黒色腫;末端部黒子様黒色腫;および分類されないもの。既知の黒色腫関連抗原は、3つの主要な群に分類できる:腫瘍関連の精巣特異的抗原であるMAGE、BAGE、GAGE、およびPRAME;メラノサイト分化抗原であるチロシナーゼ、Melan−A/MART−1(T細胞により認識される黒色種抗原に対する)、gp100、チロシナーゼ関連タンパク質−1(TRP−1)、チロシナーゼ関連タンパク質−2(TRP−2);ならびに突然変異したまたは異常に発現された抗原であるMUM−1、サイクリン依存性キナーゼ4(CDK4)、β−カテニン、gp100−in4、p15、およびN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV。例えば、カーキン(Kirkin)ら(1998)Exp.Clin.Immunogenet. 15:19−32を参照されたい。チロシナーゼ、TRP−1、およびTRP−2は、メラニン生合成に関する酵素であり、メラノサイトにおいて特異的に発現される。MART−1の抗原性エピトープは、黒色腫ワクチンを開発する目的で広く研究されてきた。免疫優性エピトープ、MART−1(27−35)は、MART−1に対して生じる大多数のCD8+細胞毒性T細胞クローンにより認識されることが報告されている。これらのMART−1(27−35)に特異的なCTLは、エピトープを発現する自己腫瘍細胞系を特異的に溶解する。フォーレ(Faure)およびコーリルスキー(Kourilsky)(1998)Crit.Rev.Immunol. 18:77−86を参照されたい。しかし、その他の研究者は、そのようなCTLの存在は重要な臨床反応を伴わないことを報告した。リボルティーニ(Rivoltini)ら(1998)Crit.Rev.Immunol. 18:55−63を参照されたい。
【0007】
癌治療に対する、主要な、実に圧倒的な障害は、選択性の問題である。即ち、正常な細胞の機能に影響を与えずに、腫瘍細胞の増殖を阻害する阻害能である。例えば、前立腺癌の従来的な化学療法においては、治癒比(即ち、正常な細胞致死に対する腫瘍細胞致死の比率)は1.5:1にすぎない。ゆえに、新形成の治療および予防のための、より効果的な治療法および薬学的組成物が必要である。
【0008】
したがって、特に治療を成功させることが困難な癌に対する、より特異的かつ標的指向性の形態の癌治療の開発が特に重要である。比較的非特異的な、およびしばしば重大な毒性をもたらす従来的な癌治療とは対照的に、悪性細胞を選択的に阻害するまたは殺す一方、無傷の健常な細胞はそのまま残す、より特異的な治療法の適用様式が要求される。
【0009】
関心対象の遺伝子が悪性細胞に導入される遺伝子治療は、多くの癌の治療へのアプローチとして試みられてきた。例えば、前立腺癌の遺伝子治療の説明については、ブーリカス(Boulikas)(1997)Anticancer Res. 17:1471−1505を参照されたい。関心対象の遺伝子は、別の化合物を用いた治療によって毒性物質に転換されるタンパク質をコードできる、または、プロドラッグを薬物に転換する酵素をコードできる。例えば、チミジンキナーゼをコードする単純ヘルペスウイルス遺伝子(HSV−tk)の導入は、条件付きでガンシクロビルに感受性の細胞を変化させる。ジルストラ(Zjilstra)ら(1989)Nature 342:435;マンスール(Mansour)ら(1988)Nature 336:348;ジョンソン(Johnson)ら(1989)Science 245:1234;アデア(Adair)ら(1989)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86:4574;カペッチ(Capecchi)(1989)Science 244:1288を参照されたい。または、関心対象の遺伝子は、例えばジフテリア毒素のような、直接的に毒性である化合物をコードできる。これらの治療を癌細胞特異的に変えるため、関心対象の遺伝子を、癌細胞において特異的に(即ち優先的に)活性な転写調節因子(TRE)の調節下に置く。細胞特異的なエンハンサーおよび/またはプロモーターをもつTREを用いることにより、細胞特異的または組織特異的な発現が達成できる。概して、ヒューバー(Huber)ら(1995)Adv.Drug Delivery Reviews 17:279−292を参照されたい。
【0010】
遺伝子転移のために、多くのウイルスベクターおよび非ウイルス送達系(例えばリポソーム)が開発された。遺伝子転移のために提案されたウイルスのうち、アデノウイルスは最も容易に生産および精製されるものの1つである。アデノウイルスはまた、形質導入(即ち、関心対象の遺伝子の標的細胞への導入)の効率が高く、効率的な形質導入のために細胞増殖を必要としないという利点がある。さらに、アデノウイルスは、インビトロおよびインビボにおいて、広範な種類の細胞に感染させることができる。アデノウイルスおよびアデノウイルスベクター系の開発に関する一般的なバックグラウンドの参照については、グラハム(Graham)ら(1973)Virology 52:456−467;タキフ(Takiff)ら(1981)Lancet 11:832−834;バークナー(Berkner)ら(1983)Nucleic Acid Research 11:6003−6020;グラハム(Graham)(1984)EMBO J 3:2917−2922;ベット(Bett)ら(1993)J.Virology 67:5911−5921;およびベット(Bett)ら(1994)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91:8802−8806を参照されたい。
【0011】
アデノウイルスは一般に、宿主細胞の感染に続く、溶菌複製サイクルを経る。感染した細胞の溶解に加えて、アデノウイルスの複製過程は宿主細胞のmRNAの輸送および翻訳をブロックし、したがって細胞タンパク質の合成を阻害する。アデノウイルスおよびアデノウイルス複製の総説については、シェンク(Shenk),T.およびホルウィッツ(Horwitz),M.S.、Virology、第3版、フィールズ(Fields),B.N.ら編、ラベンプレス社、ニューヨーク(Raven Press Limited、New York)(1996)、第67章および第68章を各々参照されたい。
【0012】
遺伝子転移に使用される場合、アデノウイルスベクターはしばしば、複製欠損であるように設計される、したがって標的細胞において複製しないように意図的に設計される。これらのベクターにおいては、初期アデノウイルス遺伝子産物E1Aおよび/またはE1Bは、しばしば欠失し、形質導入される遺伝子は一般に、欠失したウイルスゲノムのE1Aおよび/またはE1B領域に挿入される。ベット(Bett)ら(1994)、上記を参照されたい。そのようなベクターは、E1AおよびE1Bの機能をトランスに与える293系のようなパッケージング細胞系において増殖される。グラハム(Graham)ら(1987)J.Gen.Virol. 36:59−72;グラハム(Graham)(1977)J.Gen.Virol. 68:937−940を参照されたい。複製欠損のアデノウイルスベクターの、遺伝子の効率のよい形質導入のための媒体としての使用は、特に、ストラトフォード・ペリコーデット(Stratford−Perricaudet)(1990);Human Gene Therapy 1:241−256;ローゼンフェルド(Rosenfeld)(1991)Science 252:431−434;ワン(Wang)ら(1991)Adv.Exp.Med.Biol. 309:61−66;ジャッフェ(Jaffe)ら(1992)Nature Gen. 1:372−378;クアンティン(Quantin)ら(1992)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:2581−2584;ローゼンフェルド(Rosenfeld)(1992)Cell 68:143−155;ストラトフォード・ペリコーデット(Stratford−Perricaudet)ら(1992)J. Clin.Invest. 90:626−630;レガルレサル(Le Gal Le Salle)ら(1993)Science 259:988−990;マストランゲリ(Mastrangeli)ら(1993)J. Clin. Invest. 91:225−234;ラゴット(Ragot)ら(1993)Nature 361:647−650;ハヤスキ(Hayaski)ら(1994)J.Biol.Chem. 269:23872−23875;およびベット(Bett)ら(1994)、上記、によって記載されている。
【0013】
複製欠損のアデノウイルスによる癌の治療においては、宿主免疫応答が二段階で反復投与量の持続期間を制限する。第一に、アデノウイルス送達媒体のキャプシドタンパク質自体は免疫原性である。第二に、ウイルス後期遺伝子は形質導入された細胞において頻繁に発現され、細胞性免疫を誘導する。ゆえに、遺伝子発現の一過性の性質と連結された、サイトカイン、腫瘍抑制遺伝子、リボザイム、自殺遺伝子、またはプロドラッグを活性薬物に転換する遺伝子を反復して投与する能力は、遺伝子転移媒体、および、転移媒体のウイルス遺伝子産物の双方の免疫原性により制限される。これらの制限にも関わらず、遺伝子治療のためのアデノウイルスベクターの開発は、ウイルスを、それ自体をエフェクターとするのではなく、関心対象の遺伝子を導入するための媒体として使用することにほぼ完全に焦点を当ててきた。実際、アデノウイルスベクターの複製は、多くは宿主の免疫応答により、望ましくない結果であるとみなされてきた。
【0014】
しかし、さらに近年、アデノウイルスベクターのエフェクターとしての使用について説明がなされた。国際出願番号PCT/US98/04080、PCT/US98/04084、PCT/US98/04133、PCT/US98/04132、PCT/US98/16312、PCT/US95/00845、PCT/US96/10838、PCT/EP98/07380および米国特許第5,998,205号を参照されたい。アデノウイルスE1AおよびE1B遺伝子は、ラオ(Rao)ら(1992、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、第89巻:7742−7746)に開示されている。
【0015】
近年、アデノウイルス複製に関連した細胞毒性効果を利用する、複製受容能のあるアデノウイルスベクターが、選択的な細胞増殖阻害をもたらすための作用物質として記載された。そのような系においては、ウイルス複製に必須な遺伝子の発現を調節するために、細胞特異的な転写調節因子(TRE)が使用され、ゆえにウイルス複製はTREが機能的であるような細胞に制限される。例えば、国際出願番号PCT/EP99/07380、ヘンダーソン(Henderson)ら、米国特許第5,698,443号;ハーレンベック(Hallenbeck)ら、PCT/US95/15455および米国特許第5,998,205号;ロドリゲス(Rodriguez)ら(1997)Cancer Res. 57:2559−2563を参照されたい。
【0016】
国際出願番号PCT/US98/04080は、前立腺特異的抗原(PSA)、プロバシン(PB)、α−フェトタンパク質(AFP)、カリクレイン(hKLK2)、ムチン(MUC1)および癌胎児性抗原(CEA)の発現を制御するものなどの、異種TREを含む、複製受容能のある標的細胞特異的なアデノウイルスベクターを開示する。PCT/US98/04084は、肝臓癌細胞などの、AFPを発現する細胞において特異的に複製する、α−フェトタンパク質(AFP)TREを含む、複製受容能のあるアデノウイルスベクターを開示している。
【0017】
内部リボソーム接近部位(IRES)は、複数のタンパク質コード領域が連なるバイシストロニック(bicystronic)またはマルチシストロニック(multicystronic)なRNA転写産物内の内部開始コドン(通常AUG)からの翻訳を開始する配列である。IRESは、脳心筋炎ウイルスおよび関連ピコルナウイルスにおいて特徴付けられた。例えば、ジャクソン(Jackson)ら(1995)RNA 1:985−1000およびヘルマン(Herman)(1989)Trends in Biochemical Sciences 14(6):219−222を参照されたい。カルジオウイルス、ライノウイルス、アフタウイルス、C型肝炎ウイルス(HCV)フレンドマウス白血病ウイルス(FrMLV)およびモロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)のようなその他のウイルス由来のmRNAにおいても、IRES配列は検出される。IRESの細胞RNAにおける存在についてもまた記載されている。IRESを含む細胞mRNAの例には、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(BiP)、血管内皮増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子2、インシュリン様増殖因子、翻訳開始因子eIF4G、および酵母転写因子TFIIDおよびHAP4をコードするものが含まれる。例えば、マセジャック(Macejak)ら(1991)Nature 353:90−94;オー(Oh)ら(1992)Genes Dev. 6:1643−1653;ヴァグナー(Vagner)ら(1995)Mol.Cell.Biol. 15:35−44;ヒー(He)ら(1996)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 93:7274−7278;ヒー(He)ら(1996)Gene 175:121−125;トマニン(Tomanin)ら(1997)Gene 193:129−140;ガンボット(Gambotto)ら(1999)Cancer Gene Therapy 6:45−53;キャオ(Qiao)ら(1999)Cancer Gene Therapy 6:373−379を参照されたい。IRES因子を含む発現ベクターについては記載されている。例えば、国際出願番号PCT/US98/03699および国際出願番号PCT/EP98/07380を参照されたい。
【0018】
したがって、細胞特異的な複製がさらに増強され得る一方で、非標的細胞(即ち非癌性細胞)における複製の程度が最小化されるような、より改善された、複製受容能のあるアデノウイルスベクターが引き続き求められている。
【0019】
本明細書において言及される全ての特許および刊行物の開示は、その全ての内容が参照として組み入れられる。
【0020】
発明の概要
本発明は、標的細胞特異的異種転写調節因子(TRE)の転写制御下において共転写される第一遺伝子および第二遺伝子を含む、改善された、複製受容能のあるアデノウイルスベクターであり、第二遺伝子が内部リボソーム接近部位(IRES)の翻訳制御下にあるアデノウイルスベクターを提供する。ある態様において、第一遺伝子および第二遺伝子は単一のmRNAとして共転写され、第二遺伝子はその内在性プロモーターにおける突然変異またはその欠失を有する。本発明はさらに、アデノウイルスベクターを用いた宿主細胞および方法を提供する。
【0021】
ある局面において、第一遺伝子および/または第二遺伝子は、アデノウイルス遺伝子であり、別の局面において、第一アデノウイルス遺伝子および/または第二アデノウイルス遺伝子は、ウイルスの複製に必須である。必須遺伝子は、例えばE1A;E1B;E2;および/もしくはE4を含むウイルス初期遺伝子、またはウイルス後期遺伝子であってよい。別の局面において、初期遺伝子はE3である。
【0022】
ある態様において、第一遺伝子はアデノウイルス遺伝子であり、第二遺伝子は治療的遺伝子である。別の態様において、双方の遺伝子はアデノウイルス遺伝子である。さらなる態様において、第一アデノウイルス遺伝子はE1Aであり、第二アデノウイルス遺伝子はE1Bである。任意に、例えばE1Aのような、ウイルス複製に必須な共転写アデノウイルス遺伝子の1つについての内在性プロモーターは、その遺伝子がただ標的細胞特異的なTREの転写制御下だけにあるように、欠失している、および/または突然変異している。
【0023】
別の局面において、本発明は、標的細胞特異的なTREの調節下におけるウイルス複製に必須なアデノウイルス遺伝子を含むアデノウイルスベクターであり、該アデノウイルス遺伝子がその内在性プロモーターの突然変異またはそれにおける欠失を有するようなアデノウイルスベクターを提供する。ある態様において、アデノウイルス遺伝子はウイルス複製に必須である。別の態様において、アデノウイルス遺伝子は、E1Aプロモーターが欠失しており、かつ、E1A遺伝子が、細胞特異的な異種TREの転写制御下にあるようなE1Aである。別の態様において、アデノウイルス遺伝子は、E1Bプロモーターが欠失しており、かつ、E1B遺伝子が、細胞特異的な異種TREの転写制御下にあるようなE1Bである。
【0024】
別の局面において、本発明は、E1Bが、アポトーシスを阻害することが示された産物をコードする、E1Bの19kDa領域における欠失またはその突然変異を有するような、標的細胞特異的なTREの調節下にあるE1Bを含むアデノウイルスベクターを提供する。
【0025】
その他の態様において、第一アデノウイルス遺伝子および/または第二アデノウイルス遺伝子のエンハンサー因子が不活性化される。本発明は、E1Aエンハンサーが不活性化された、E1Aを含むアデノウイルスベクターを提供する。さらに別の態様において、本発明は、E1Aプロモーターが不活性化され、E1AエンハンサーIが不活性化された、E1Aを含むアデノウイルスベクターを提供する。さらなる態様において、本発明は、その内在性サイレンサー因子を不活性化されたTREを含むアデノウイルスベクターを提供する。
【0026】
細胞特異的な発現を行う任意のTREが、開示されるベクターにおいて使用できる。ある態様において、TREは例えば、前立腺癌細胞、乳癌細胞、肝臓癌細胞、黒色腫細胞、膀胱bladder細胞および/または結腸癌細胞に特異的なTREを含む。別の態様において、TREは、プロバシン(PB)TRE;前立腺特異的抗原(PSA)TRE;ムチン(MUC1)TRE;α−フェトタンパク質(AFP)TRE;hKLK2 TRE;チロシナーゼTRE;ヒトウロプラキンII TRE(hUPII)および癌胎児性抗原(CEA)TREを含む。別の態様において、標的細胞特異的なTREとは、細胞状態特異的TREである。さらにその他の態様において、標的細胞特異的なTREとは、組織特異的なTREである。
【0027】
さらなる態様において、アデノウイルスベクターは、細胞特異的なTREの調節下において共転写される、少なくとも1つの付加的な遺伝子を含む。別の態様において、付加的な共転写遺伝子は、IRESの翻訳制御下にある。
【0028】
本発明の別の局面において、アデノウイルスベクターは、例えば細胞毒性遺伝子のような導入遺伝子をさらに含む。ある態様において、導入遺伝子は、第一遺伝子および第二遺伝子と同じTREの転写制御下にあり、任意に、内部リボソーム接近部位の翻訳制御下にある。別の態様において、導入遺伝子は、第一遺伝子および第二遺伝子の転写を制御するTREと同じ細胞において機能的な異なるTREの転写制御下にあり、任意に、IRESの翻訳制御下にある。
【0029】
本発明はまた、本明細書に記載される、複製受容能のあるアデノウイルスベクターを含む組成物を提供する。ある態様において、組成物は薬学的に許容されうる賦形剤をさらに含む。本発明はまた、本明細書に記載される、複製受容能のあるアデノウイルスベクターを含むキットを提供する。
【0030】
開示されるアデノウイルスベクターを含む宿主細胞もまた提供される。宿主細胞は、ベクターの増殖に使用されるもの、および治療目的のためにベクターが導入されるものを含む。
【0031】
別の局面において、標的細胞特異的なTREを機能させる哺乳動物細胞に特異的な、本発明の複製受容能のあるアデノウイルスベクターを増殖するための方法であり、アデノウイルスベクターが細胞に入り、それによって、該アデノウイルスが増殖されるように、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターを標的細胞特異的なTREを機能させるような哺乳動物細胞と組み合わせる段階を含む方法が提供される。
【0032】
別の局面において、それによってベクターが細胞に入る、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターと細胞を接触させる段階を含む、標的細胞における選択的な細胞毒性を与えるための方法が提供される。
【0033】
本発明は、アデノウイルスベクターが腫瘍細胞に入って、腫瘍細胞に対して選択的な細胞毒性を表すように、本発明のアデノウイルスベクターと腫瘍細胞を接触させる段階を含む、腫瘍細胞、特に標的腫瘍細胞の増殖を抑制する方法をさらに提供する。
【0034】
別の局面において、生物試料における細胞を本発明のアデノウイルスベクターと接触させる段階、およびアデノウイルスベクターの複製があればそれを検出する段階を含む、標的細胞特異的なTREを機能させる細胞を検出するための方法が提供される。
【0035】
別の局面において、アデノウイルスベクターが細胞に入る、本明細書に記載されるように、細胞をアデノウイルスベクターと接触させる段階を含む、標的細胞の遺伝子型を改変するための方法が提供される。
【0036】
本発明は、アデノウイルス遺伝子がメラノサイト特異的なTREの転写制御下にある、アデノウイルス遺伝子を含むアデノウイルスベクターを提供する。別の態様において、メラノサイト特異的なTREはヒトのものである。別の態様において、メラノサイト特異的なTREは、メラノサイト特異的なプロモーターおよび異種エンハンサーを含む。その他の態様において、メラノサイト特異的なTREは、メラノサイト特異的なプロモーターを含む。その他の態様において、メラノサイト特異的なTREは、メラノサイト特異的なエンハンサーおよび異種プロモーターを含む。その他の態様において、メラノサイト特異的なTREは、メラノサイト特異的なプロモーターおよびメラノサイト特異的なエンハンサーを含む。
【0037】
いくつかの態様において、メラノサイト特異的なTREの転写制御下にあるアデノウイルス遺伝子は、複製に必須なアデノウイルス遺伝子である。いくつかの態様において、複製に必須なアデノウイルス遺伝子は初期遺伝子である。別の態様において、初期遺伝子はE1Aである。別の態様において、初期遺伝子はE1Bである。さらに別の態様において、E1AおよびE1Bの双方は、メラノサイト特異的なTREの転写制御下にある。さらなる態様において、複製に必須であるアデノウイルス遺伝子はE1Bであり、E1Bは19kDa領域において欠失を有する。
【0038】
いくつかの態様において、メラノサイト特異的なTREは、チロシナーゼ遺伝子の5’隣接領域に由来する。その他の態様において、メラノサイト特異的なTREは、チロシナーゼ関連タンパク質−1遺伝子の5’隣接領域に由来する。その他の態様において、メラノサイト特異的なTREは、チロシナーゼ関連タンパク質−2遺伝子の5’隣接領域に由来する。その他の態様において、メラノサイト特異的なTREは、MART−1遺伝子の5’隣接領域に由来する。その他の態様において、メラノサイト特異的なTREは、黒色腫において異常に発現された遺伝子の5’隣接領域に由来する。
【0039】
その他の態様において、本発明は、(a)メラノサイト特異的なTREの転写制御下にあるアデノウイルス遺伝子;および(b)E3領域を含むアデノウイルスベクターを提供する。これらの態様のうち幾つかにおいては、E3領域はメラノサイト特異的なTREの転写制御下にある。
【0040】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載されるメラノサイト特異的なアデノウイルスベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0041】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載されるメラノサイト特異的なアデノウイルスベクターを含む薬学的組成物を提供する。
【0042】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載されるメラノサイトアデノウイルスベクターを含むキットを提供する。
【0043】
別の局面において、ベクターが細胞に入るように、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターと細胞を接触させる段階を含む、標的細胞(即ち、メラノサイト特異的なTREを機能させるまたは誘導する細胞)における選択的な細胞毒性を与えるための方法が提供される。
【0044】
別の局面において、メラノサイトに特異的なアデノウイルスを増殖するための方法であり、本明細書に記載されるメラノサイト特異的なアデノウイルスベクターをメラノサイトと組み合わせ、それにより該アデノウイルスが増殖される段階を含む方法が提供される。
【0045】
本発明は、アデノウイルスベクターが黒色腫細胞に入り、黒色腫細胞に対して選択的な細胞毒性を表すように、本発明のメラノサイト特異的なアデノウイルスベクターと黒色腫細胞を接触させる段階を含む、黒色腫細胞の増殖を抑制する方法をさらに提供する。
【0046】
別の局面において、生物試料における細胞を、本明細書に記載されるメラノサイトアデノウイルスベクターと接触させる段階、および、アデノウイルスベクターの複製があればそれを検出する段階を含む、生物試料における、黒色腫細胞を含むメラノサイトを検出するための方法が提供される。
【0047】
発明を実施するための形態
本発明者らは、標的細胞特異的異種転写調節因子(TRE)の転写制御下において共転写される第一遺伝子および第二遺伝子を含み、第二遺伝子が内部リボソーム接近部位(IRES)の翻訳制御下にある、改善したアデノウイルスベクターを見出し構築した。ある態様において、第一遺伝子および第二遺伝子は、単一のmRNAとして共転写され、第二遺伝子はその内在性プロモーターにおける突然変異またはその欠失を有する。別の態様において、少なくとも遺伝子の1つはアデノウイルス遺伝子であり、さらに別の態様において、双方の遺伝子が、ウイルスの複製に必須なアデノウイルス遺伝子を含むアデノウイルス遺伝子である。アデノウイルスベクターは(直接的および/または間接的な)細胞毒性に寄与する、および/または、細胞死を引き起こす遺伝子を含み得る。細胞毒性に寄与するアデノウイルス遺伝子の例は、これらに限定されないが、アデノウイルス死タンパク質遺伝子を含む。
【0048】
本発明のいくつかの局面において、標的細胞特異的なTREの転写制御下において共転写される第一遺伝子および第二遺伝子を含み、第二遺伝子がIRESの翻訳制御下にあるアデノウイルスベクターは、遺伝子に機能的に連結された、標的細胞特異的なTREを含みIRESを欠くアデノウイルスベクターよりも、標的細胞に対するより高い特異性を表す。いくつかの態様において、標的細胞特異的なTREの存在による、第一遺伝子および第二遺伝子の優先的な転写および/または翻訳により特異性が与えられる。その他の態様において、特異性は、複製に必須な遺伝子の転写を行う標的細胞特異的なTREによる、標的細胞におけるアデノウイルスベクターの優先的な複製により与えられる。
【0049】
本明細書においては、その内在性プロモーターにおける突然変異またはその欠失を有する、ウイルスの複製に必須なアデノウイルス遺伝子を含有する、IRESを含むアデノウイルスベクターもまた開示される。本明細書において開示されるある態様において、アデノウイルスベクターは、その内在性プロモーターの欠失を有するアデノウイルス初期遺伝子E1Aを含む。本明細書において開示される別の態様において、アデノウイルスベクターは、その内在性プロモーターの欠失を有するアデノウイルス初期遺伝子E1Bを含む。本明細書において開示されるその他の態様において、E1Bの19kDa領域は欠失している。
【0050】
別の局面において、本明細書において開示されるアデノウイルスベクターは、その内在性エンハンサーにおける突然変異またはその欠失を有するような、ウイルスの複製に必須なアデノウイルス遺伝子を含む。ある態様において、アデノウイルスベクターは、その内在性プロモーターの突然変異またはそれにおける欠失を有する、アデノウイルス初期遺伝子E1Aを含む。ある態様において、アデノウイルスベクターは、E1AエンハンサーIの突然変異またはそれにおける欠失を有する、アデノウイルス初期遺伝子E1Aを含む。さらなる態様において、アデノウイルスベクターは、その内在性プロモーターの突然変異またはそれにおける欠失を有する、およびE1Aエンハンサーの突然変異またはそれにおける欠失を有する、アデノウイルス初期遺伝子E1Aを含む。さらなる態様において、アデノウイルスベクターは、その内在性プロモーターの突然変異またはそれにおける欠失を有する、アデノウイルス初期遺伝子E1A、および、その内在性プロモーターの突然変異またはそれにおける欠失を有する、アデノウイルス初期遺伝子E1Bを含む。さらなる態様において、アデノウイルスベクターは、その内在性プロモーターの突然変異またはそれにおける欠失を有する、および、E1AエンハンサーIの突然変異またはそれにおける欠失を有する、アデノウイルス初期遺伝子E1A、および、その内在性プロモーターの突然変異またはそれにおける欠失を有する、アデノウイルス初期遺伝子E1Bを含む。本明細書において開示されるその他の態様において、E1Bの19kDa領域が欠失している。
【0051】
本発明の複製受容能のあるアデノウイルスベクターは、これまではアデノウイルスベクターの望ましくない局面と考えられていたもの、即ち、それらの複製および可能性のある共同性の免疫原性を利用する。ウイルス複製についての細胞特異的な要求物によって、流出感染は予防される。特定の理論に縛られるわけではないが、アデノウイルスタンパク質の産生が、広くまたは特異的に、アデノウイルスタンパク質を産生する標的細胞に対する免疫系を活性化および/または刺激する役割を担い得ることが注目される。この種の免疫刺激は、患者がしばしば中等度から重篤な免疫無防備状態になる癌の状況においては、重要な考察事項となり得る。
【0052】
2つまたはそれ以上の遺伝子の翻訳を連結する遺伝子間IRES因子を含む、本発明のアデノウイルスベクターは、ベクターにおける相同的な調節領域の存在に基づく相同的組換えについてのあらゆる潜在性が除かれた場合、2つまたはそれ以上の望ましい遺伝子の発現を促進するために同一の調節領域を用いるベクター構築物に係る改善を反映する。本明細書に記載されているように、IRESを含むアデノウイルスベクターは安定であり、ある態様において、IRESを含まないベクターよりも高い特異性を提供する。遺伝子間IRESを含むアデノウイルスベクターの別の利点は、第二のTREよりもむしろIRESを使用することにより、治療的遺伝子のような付加的な遺伝子のために、ベクターにおける付加的な空間を提供できるということである。
【0053】
したがって、IRESの調節下にある第二遺伝子を含むアデノウイルスベクターは、高レベルの標的細胞特異性を維持し、標的細胞において安定を保つ。よって、本発明のある局面において、本明細書において開示されるウイルスベクターは、マルチシストロニック転写産物の生成が、標的細胞特異的異種TREにより制御される、マルチシストロニック転写産物内に少なくとも1つのIRESを含む。IRESの調節下にある第二遺伝子を含むアデノウイルスベクターについては、IRESの翻訳制御下にある遺伝子の内在性プロモーターが、第二遺伝子の転写を妨げないように欠失されることが好ましい。IRESが開始コドンを含む場合、第二遺伝子がIRESとインフレームであることが好ましい。ATGのような開始コドンがIRESにおいて存在する場合、第二遺伝子の開始コドンが除去され、IRESおよび第二遺伝子がインフレームであることが好ましい。または、IRESが開始コドンを含まない場合、または開始コドンがIRESから除去されている場合、第二遺伝子の開始コドンが使用される。ある態様において、アデノウイルスベクターは、細胞特異的異種TREの転写制御下にある、アデノウイルス必須遺伝子、E1A遺伝子およびE1B遺伝子、および、E1AおよびE1Bの間に導入されたIRESを含む。ゆえに、E1AおよびE1Bの双方は、共通の転写制御下にあり、E1Bコード領域の翻訳は、IRESの存在によって得られる。ある態様において、E1Aはその内在性プロモーターを欠失している。別の態様において、E1Aはある内在性エンハンサーを欠失しており、さらにさらなる態様において、E1Aはその内在性プロモーターを欠失し、E1AエンハンサーIを欠失している。別の態様において、E1Bはその内在性プロモーターを欠失している。本明細書において開示されるその他の態様において、E1Bの19kDa領域が欠失している。
【0054】
標的細胞に対する細胞毒性を提供するため、細胞毒性効果をもつ1つまたはそれ以上の導入遺伝子をベクターにおいて存在させることができる。さらに、または代わりに、アデノウイルス死タンパク質(ADP)遺伝子のような、細胞毒性および/または細胞死に寄与するアデノウイルス遺伝子を、任意に異種TREの選択的な転写制御下、および任意にIRESの翻訳制御下にあるように、ベクターに含み得る。
【0055】
細胞毒性活性を持続することが望ましい、および/または耐性がある任意の細胞が標的細胞となり得るが、標的細胞の例には、新生物形成細胞が含まれる。標的細胞特異的なTREを含むアデノウイルスベクターを、インビトロまたはインビボにおいて、標的細胞および非標的細胞の混合物と組み合わせることにより、標的細胞においてベクターが優先的に複製し、細胞毒性効果および/または細胞溶解効果を生じる。選択的な細胞毒性活性および/または細胞溶解活性によって一旦標的細胞が破壊されれば、ベクターの複製は著しく減少し、流出感染の可能性および望ましくないバイスタンダー効果を減少させる。標的細胞特異的なTREが機能的であるような望ましくない標的細胞、例えば癌細胞の存在について、混合物(例えば、生検またはその他の適切な生物試料のようなもの)を引き続いてモニタリングするために、インビトロの培養を維持できる。本発明のアデノウイルスベクターはまた、標的細胞を含む望ましい生物試料が動物個体から除去され、標的細胞特異的なTREを含む本発明のアデノウイルスベクターへの曝露を受け、その後、動物個体内において置き換えられる、エクスビボにおける手順においても使用できる。
【0056】
一般的技術
本発明の実施は、他に指示されない限り、当技術分野の範囲内である、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来的技術を使用する。そのような技術は、「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Mannual)」第2版(Sambrookら、1989);「オリゴヌクレオチド合成(Oligonucleotide Synthesis)」(M.J. Gait編、1984);「動物細胞培養(Animal Cell Culture)」(R.I. Freshney編、1987);「酵素学における方法論(Methods in Enzymology)」(アカデミックプレス社(Academic Press, Inc.));「実験免疫学ハンドブック(Handbook of Experimental Immunology)」(D.M. Wei & C.C. Blackwell編);「哺乳動物細胞のための遺伝子転移ベクター(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)」(J.M. Miller & M.P. Calos編、1987);「分子生物学における最新プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」(F.M. Ausubelら編、1987および年刊最新版);「PCR:ポリメラーゼ連鎖反応(PCR:The Polymerase Chain Reaction)」(Mullisら編、1994);「免疫学における最新プロトコール(Current Protocols in Immunology)」(J.E. Coliganら編,1991および年刊最新版)のような文献において、完全に記載される。
【0057】
アデノウイルスに関連する技術については、特に、フェルグナー(Felgner)およびリンゴールド(Ringold)(1989)Nature 337:387−388;バークナー(Berkner)およびシャープ(Sharp)(1983)Nucl.Acids Res. 11:6003−6020;グラハム(Graham)(1984)EMBO J. 3:2917−2922;ベット(Bett)ら(1993)J.Virology 67:5911−5921;ベット(Bett)ら(1994)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91:8802−8806を参照されたい。
【0058】
定義
本明細書において使用されるように、「内部リボソーム接近部位」または「IRES」とは、シストロン(タンパク質コード領域)のATGのような開始コドンへの内部リボソームの直接接近を促進し、それにより遺伝子のキャップ非依存的な翻訳を導く因子を指す(Jackson RJ、Howell MT、Kaminski A(1990)Trends Biochem Sci 15(12):477−83;ならびにJackson,RJおよびKaminski,A(1995)RNA 1(10):985−1000を参照されたい)。本発明は、シストロンの開始コドンへの内部リボソームの直接接近を促進できる任意のIRES因子の使用を包含する。本明細書において用いられる「IRESの翻訳制御下にある」とは、翻訳がIRESと関連し、キャップ非依存的な仕方で進むことを意味する。当技術分野において既知の「IRES」の例は、これらに限定されないが、ピコルナウイルスから得られるIRES(Jacksonら、1990、Trends Biochem Sci 15(12):477−483);および、例えば免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(BiP)、血管内皮増殖因子(VEGF)(Huezら(1998)Mol.Cell.Biol. 18(11):6178−6190)、線維芽細胞増殖因子2、およびインシュリン様増殖因子、翻訳開始因子eIF4G、酵母転写因子TFIIDおよびHAP4のような、ウイルスmRNAまたは細胞mRNA源から得られるIRESを含む。IRESはまた、カルジオウイルス、ライノウイルス、アフタウイルス、HCV、フレンドマウス白血病ウイルス(FrMLV)およびモロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)のような異なるウイルスにおいて報告されている。本明細書において用いられるように、「IRES」とは、その変異がシストロンの開始コドンへの内部リボソームの直接接近を促進できる限り、IRES配列の機能的な変異を包含する。好ましい態様において、IRESは哺乳動物性である。その他の態様において、IRESはウイルス性または原生生物性である。本明細書において開示される、ある実施的な態様において、IRESは脳心筋炎ウイルス(ECMV)(Novogenより市販されている、Dukeら(1992)J.Virol 66(3):1602−1609)から得られる。本明細書において開示される、別の実施的な態様において、IRESはVEGF由来のものである。表1および表2は、本発明において有用な、様々なIRES配列を開示する。
【0059】
「マルチシストロニック転写産物」とは、1つより多くのタンパク質コード領域、またはシストロンを含むmRNA分子を指す。2つのコード領域を含むmRNAは、「バイシストロニック転写産物」と称される。「5’近接の」コード領域またはシストロンとは、その翻訳開始コドン(通常AUG)がマルチシストロニックmRNA分子の5’末端に最も近いコード領域である。「5’遠位の」コード領域またはシストロンとは、その翻訳開始コドン(通常AUG)がmRNAの5’末端に最も近い開始コドンではないものである。「5’遠位の」および「下流」という用語は、mRNA分子の5’末端に近接でないコード領域を指すために、同意語として使用される。
【0060】
本明細書において使用されるように、「共転写される」とは、ポリヌクレオチドの2つ(またはそれ以上)のコード領域が単一の転写調節因子の転写制御下にあることを意味する。
【0061】
「遺伝子」とは、ポリヌクレオチドのコード領域を指す。「遺伝子」は、非コード配列および/または制御因子を含んでもよく、含まなくてもよい。
【0062】
本明細書において使用されるように、「転写応答因子」または「転写調節因子」、または「TRE」とは、TREを機能させる宿主細胞において、機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を増加するポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。TREは、エンハンサーおよび/またはプロモーターを含み得る。「転写制御配列」とはTREである。「標的細胞特異的な転写応答因子」または「標的細胞特異的なTRE」とは、特異的な細胞型、即ち、標的細胞において優先的に機能するポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。したがって、標的細胞特異的なTREは、標的細胞特異的なTREを機能させる標的細胞において機能的に連結されたポリヌクレオチド配列を転写する。本明細書において使用されるように、「標的細胞特異的な」という用語は、細胞型特異性、組織特異性、発生段階特異性、および腫瘍特異性、ならびに与えられる標的細胞の癌性状態特異性を含むことが意図される。「標的細胞特異的なTRE」とは、細胞型特異的TREおよび細胞状態特異的なTRE、ならびに「複合(comprosite)」TREを含む。「複合TRE」という用語は、細胞型特異的TREおよび細胞状態特異的TREの両方を含むTREを含む。標的細胞特異的なTREはまた、例えばSV40またはサイトメガロウイルス(CMV)のプロモーターを含む、異種成分を含み得る。組織特異的かつ標的細胞特異的なTREの例は、プロモーターおよびエンハンサーの両方を含むCMV TREである。
【0063】
本明細書においてさらに詳細が記載されるように、標的細胞特異的なTREは、これらに限定されないが、標的細胞特異的なプロモーター;および標的細胞特異的なエンハンサー;異種プロモーターおよび標的細胞特異的なエンハンサー;標的細胞特異的なプロモーターおよび異種エンハンサー;異種プロモーターおよび異種エンハンサー;ならびにそれらの多量体を含む、任意の数の構成を含み得る。標的細胞特異的なTREのプロモーターおよびエンハンサー成分は、望ましい標的細胞特異的な転写活性が得られる限り、関心対象のコード配列からの任意の向きおよび/または距離にあることができる。転写の活性化は、当技術分野において既知の(および下記においてさらに詳細が記載される)多くの方法において測定できるが、一般には、標的細胞特異的なTREの調節下にある(即ち、機能的に連結された)コード配列のmRNAまたはタンパク質産物の検出および/または定量により測定される。本明細書において議論されるように、標的細胞特異的なTREは、様々な長さ、および様々な配列組成のものであってよい。本明細書において使用されるように、「細胞状態特異的なTRE」という用語は、これらに限定されないが、細胞状態特異的なTREを機能させる細胞、即ち、異常な生理学的状態を含む、特定の生理学的条件を表す細胞において機能的に連結されたポリヌクレオチドにおいて優先的に機能する、即ち、転写活性化を与える。「細胞の状態」とはゆえに、可逆性であるおよび/または進行性である、所与の、または特定の、細胞の生理学的状態(または条件)を指す。生理学的状態は、内部または外部から生み出し得る;例えば、(低酸素条件に対する反応のような)ある代謝状態であってよい、または、熱または電離放射線によって生み出し得る。「細胞状態」とは、正常な条件下においては不可逆性である細胞の分化状態に関連する「細胞型」とは別のものである。一般に(必須ではないが)、本明細書において議論されるように、細胞状態は、その例が下記に与えられる異常な生理学的状態において具体化される。
【0064】
標的細胞特異的なTREの「機能的部分」とは、機能的に連結された遺伝子またはコード領域が標的細胞において優先的に発現されるように、機能的に連結された遺伝子またはコード領域上における標的細胞特異的な転写を与えるものである。
【0065】
「転写活性化」または「転写における増加」によって、標的細胞(即ち、標的細胞)における転写が、基底レベル以上に、少なくとも約2倍、好ましくは少なくとも約5倍、好ましくは少なくとも約10倍、より好ましくは少なくとも約20倍、より好ましくは少なくとも約50倍、より好ましくは少なくとも約100倍、より好ましくは少なくとも約200倍、さらにより好ましくは少なくとも約400−約500倍、さらにより好ましくは少なくとも約1,000倍、増加されることが意図される。基底レベルは一般に、非標的細胞(即ち、異なる細胞型)における(存在する場合の)活性レベル、または、標的細胞系において調べられる、標的細胞特異的なTREを欠くレポーター構築物の(存在する場合の)活性レベルである。
【0066】
標的細胞特異的なTREの「機能的に保存された変異体」とは、別の標的細胞特異的なTREとは異なるが、(下記に議論されるように)活性化の程度は変化し得るとしても、標的細胞特異的な転写活性をさらに維持する標的細胞特異的なTREである。標的細胞特異的なTREにおける差異は、例えば単一塩基突然変異、塩基の付加、欠失、および/または修飾から生じる、直鎖配列における差異による可能性がある。差異はまた、糖、および/または標的細胞特異的なTREの塩基間の連結における変化によって生じ得る。例えば、TREの配列内におけるある点突然変異は、転写因子の結合および転写刺激を減少することが示された。ブラックウッド(Blackwood)ら(1998)Science 281:60−63およびスミス(Smith)ら(1997)J.Biol.Chem. 272:27493−27496を参照されたい。当業者には、転写因子結合部位およびその周囲における、塩基のある変化は、転写の刺激および細胞特異性に負の影響を及ぼす可能性がより高い一方、転写因子の結合に関わらない塩基における変化はそのような影響を持つ可能性が低いことが認識される。ある突然変異はまた、TRE活性を増加できる。塩基の変化による影響を調べる試験は、ゲル移動度シフトアッセイ法、または、TRE機能的細胞およびTRE非機能的細胞における、これらの変化を含むベクターのトランスフェクションのような、当技術分野において既知の任意の方法により、インビトロまたはインビボにおいて実施できる。さらに、当業者には、配列の転写制御能を変化させずに、TRE配列に対して点突然変異および欠失を生じさせ得ることが認識される。
【0067】
本明細書において使用されるように、特定の遺伝子由来のTREは、それが由来する遺伝子により言及され、該遺伝子を発現する宿主細胞において機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を制御するポリヌクレオチド配列である。例えば、本明細書において使用されるように、「ヒト腺性カリクレイン転写調節因子」または「hKLK2−TRE」とは、前立腺細胞のような、アンドロゲン受容体を発現する細胞(好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞)のような、hKLK2−TREを機能させる宿主細胞において機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を増加する、ポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。ゆえにhKLK2−TREは、アンドロゲン受容体の結合に対して反応性であり、少なくともhKLK2プロモーターおよび/またはhKLK2エンハンサーの一部(即ち、AREまたはアンドロゲン受容体結合部位)を含む。
【0068】
本明細書において使用されるように、「プロバシン(PB)転写調節因子」または「PB−TRE」とは、アンドロゲン受容体を発現する細胞(好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞、さらにより好ましくは前立腺細胞)のような、PB−TREを機能させる宿主細胞において機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増加する、ポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。ゆえにPB−TREは、アンドロゲン受容体の結合に対して反応性であり、少なくともPBプロモーターおよび/またはPBエンハンサーの一部(即ち、AREまたはアンドロゲン受容体結合部位)を含む。
【0069】
本明細書において使用されるように、「前立腺特異的抗原(PSA)転写調節因子」または「PSA−TRE」、または「PSE−TRE」とは、アンドロゲン受容体を発現する細胞(好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞、さらにより好ましくは前立腺細胞)のような、PSA−TREを機能させる宿主細胞において機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増加する、ポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。ゆえにPSA−TREは、アンドロゲン受容体の結合に対して反応性であり、少なくともPSAプロモーターおよび/またはPSAエンハンサーの一部(即ち、AREまたはアンドロゲン受容体結合部位)を含む。
【0070】
本明細書において使用されるように、「癌胎児性抗原(CEA)転写調節因子」または「CEA−TRE」とは、CEAを発現する細胞(好ましくは哺乳動物細胞、さらにより好ましくはヒト細胞)のような、CEA−TREを機能させる宿主細胞において機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増加する、ポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。CEA−TREは、CEA産生細胞に関連する転写因子および/または補因子に対して反応性であり、少なくともCEAプロモーターおよび/またはエンハンサーの一部を含む。
【0071】
本明細書において使用されるように、「α−フェトタンパク質(AFP)転写調節因子」または「AFP−TRE」とは、AFPを発現する細胞(好ましくは哺乳動物細胞、さらにより好ましくはヒト細胞)のような、AFP−TREを機能させる宿主細胞において(機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の)転写を選択的に増加する、ポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。AFP−TREは、AFP産生細胞に関連する転写因子および/または補因子に対して反応性であり、少なくともAFPプロモーターおよび/またはエンハンサーの一部を含む。
【0072】
本明細書において使用されるように、「ムチン遺伝子(MUC)転写調節因子」または「MUC1−TRE」とは、MUC1を発現する細胞(好ましくは哺乳動物細胞、さらにより好ましくはヒト細胞)のような、MUC1−TREを機能させる宿主細胞において(機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の)転写を選択的に増加する、ポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。MUC1−TREは、MUC1産生細胞に関連する転写因子および/または補因子に対して反応性であり、少なくともMUC1プロモーターおよび/またはエンハンサーの一部を含む。
【0073】
本明細書において使用されるように、「尿路上皮細胞特異的転写応答因子」または「尿路上皮細胞特異的TRE」とは、尿路上皮特異的TREを機能させる宿主細胞、即ち標的細胞において機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を増加する、ポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。様々な尿路上皮細胞特異的TREが既知であり、尿路上皮細胞に関連する細胞タンパク質(転写因子および/または補因子)に反応性であり、少なくとも尿路上皮特異的プロモーターおよび/または尿路上皮特異的エンハンサーの一部を含む。本明細書においては、尿路上皮細胞特異的TREの活性を測定し、したがって与えられる細胞が尿路上皮細胞特異的TREを機能させるかどうかを決定する方法が記載される。
【0074】
本明細書において使用されるように、「メラノサイト細胞特異的転写応答因子」または「メラノサイト細胞特異的TRE」とは、メラノサイト特異的TREを機能させる宿主細胞、即ち標的細胞において、機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を増加する、ポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列である。様々なメラノサイト細胞特異的TREが既知であり、メラノサイト細胞に関連する細胞タンパク質(転写因子および/または補因子)に反応性であり、少なくともメラノサイト特異的プロモーターおよび/またはメラノサイト特異的エンハンサーの一部を含む。本明細書においては、、メラノサイト細胞特異的TREの活性を測定し、したがって与えられる細胞がメラノサイト細胞特異的TREを機能させるかどうかを決定する方法が記載される。
【0075】
「E1B 19kDa領域」(「E1B 19kDaゲノム領域」と互換的に使用される)とは、E1B 19kDa産物をコードするアデノウイルスE1B遺伝子のゲノム領域を指す。野生型Ad5においては、E1B 19kDa領域は1714位のヌクレオチドと2244位のヌクレオチドの間に位置する261 bpの領域である。E1B 19kDa領域は、例えばラオ(Rao)らProc.Natl.Acad.Sci. USA、89:7742−7746において記載されている。本発明は、欠失または突然変異がE1B 19kDaに関連するアポトーシスの阻害を低減または除去する限り、E1B 19kDa領域の一部または全部の欠失、およびE1B 19kDa領域が突然変異した態様を包含する。
【0076】
本明細書において使用されるように、標的細胞特異的TREは、これらに限定されないが、標的細胞特異的プロモーター;標的細胞特異的エンハンサー;標的細胞特異的プロモーターおよび標的細胞特異的エンハンサー;標的細胞特異的プロモーターおよび異種エンハンサー;異種プロモーターおよび標的細胞特異的エンハンサー;ならびにそれらの多量体を含む、任意の数の構成を含み得る。標的細胞特異的TREのプロモーターおよびエンハンサー成分は、望ましい標的細胞特異的転写活性が得られる限り、関心対象のコード配列から任意の向きおよび/または距離にあることができる。転写活性化は、当技術分野において既知の(および下記においてさらに詳細が記載される)多くの方法で測定できるが、一般には、標的細胞特異的TREの調節下にある(即ち、機能的に連結された)コード配列のmRNAまたはタンパク質産物の検出および/または定量によって測定される。
【0077】
本明細書において使用されるように、「優先的に複製する」とは、アデノウイルスが非標的細胞よりも標的細胞においてより多く複製することを意味する。好ましくは、標的細胞において非標的細胞におけるよりも著しく高い効率でアデノウイルスが複製する;好ましくは、少なくとも約2倍高く、好ましくは、少なくとも約5倍高く、より好ましくは、少なくとも約10倍高く、さらにより好ましくは、少なくとも約50倍高く、さらにより好ましくは、少なくとも約100倍高く、さらにより好ましくは、少なくとも約400−500倍高く、さらにより好ましくは、少なくとも約1,000倍高く、最も好ましくは、少なくとも約1×106倍高い。最も好ましくは、アデノウイルスは標的細胞においてのみ複製する(つまり、非標的細胞においては複製しない、または非常に低レベルで複製する)。
【0078】
本明細書において使用されるように、「ベクター」という用語は、1つまたはそれ以上の細胞型の形質導入/トランスフェクションのために設計されたポリヌクレオチド構築物を指す。ベクターは、例えば、挿入されたヌクレオチドの単離、増殖および複製のために設計される「クローニングベクター」、宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現のために設計される「発現ベクター」、または、組換えウイルスまたはウイルス様粒子の産生をもたらすために設計される「ウイルスベクター」、または、1つ以上の種類のベクターの特質を含む「シャトルベクター」であってよい。
【0079】
「アデノウイルスベクター」または「アデノウイルス性ベクター」(互換的に使用される)とは、本発明のポリヌクレオチド構築物を含む。本発明のポリヌクレオチド構築物は、これらに限定されないが、DNA、アデノウイルスの被膜に被包されたDNA、別のウイルスまたはウイルス様形態(単純ヘルペス、およびAAVのようなもの)にパッケージングされたDNA、リポソームに被包されたDNA、ポリリジンと複合体化されたDNA、合成ポリカチオン分子と複合体化されたDNA、トランスフェリンと結合されたDNA、免疫学的に分子を「覆う」ために、および/または半減期を増加するためにPEGのような化合物と複合体化されたDNA、および非ウイルスタンパク質に結合されたDNAを含む、幾つかのうち任意の形態にあるものであってよい。好ましくは、ポリヌクレオチドはDNAである。本明細書において使用されるように、「DNA」とは、塩基A、T、CおよびGを含むのみならず、メチル化ヌクレオチド、非電荷結合およびチオアート(thioate)のようなヌクレオチド間修飾、糖類似体の使用、およびポリアミドのような修飾されたおよび/または代替的なバックボーン構造などの、これらの塩基の任意の類似体または修飾型も含む。本発明の目的のためには、アデノウイルスベクターは標的細胞において複製受容能がある。
【0080】
本明細書において互換的に使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドの重合体化した形態を指す。これらの用語は、単鎖、二重鎖または三重鎖のDNA、ゲノムDNA、cDNA、RNA、DNA−RNAハイブリッド、またはプリン塩基およびピリミジン塩基、またはその他の天然の、化学的、生化学的に修飾された、非天然または誘導ヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。ポリヌクレオチドのバックボーンは、糖およびリン酸基(RNAまたはDNAにおいて典型的に認められるように)を、または、修飾または置換された糖またはリン酸基を含み得る。または、ポリヌクレオチドのバックボーンは、ホスホルアミド酸のような合成サブユニットのポリマーを含み得、したがってオリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミド酸(P−NH2)または混合ホスホルアミド酸−リン酸ジエステルオリゴマーであってよい。ペイロッツ(Peyrottes)ら(1996)Nucleic Acids Res. 24:1841−8;チャターヴェディ(Chaturvedi)ら(1996)Nucleic Acids Res. 24:2318−23;シュルツ(Schultz)ら(1996)Nucleic Acids Res. 24:2966−73を参照されたい。ホスホロチオアート結合を、リン酸ジエステル結合の代わりに使用できる。ブラウン(Braun)ら(1988)J.Immunol. 141:2084−9;ラティマー(Latimer)ら(1995)Molec.Immunol. 32:1057−1064を参照されたい。さらに、二重鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成し、適切な条件下において鎖をアニールすること、またはDNAポリメラーゼを適切なプライマーと共に用いて相補鎖を新たに合成することのいずれかにより、化学合成単鎖ポリヌクレオチド産物から得ることができる。(配列番号の引用のような)ポリヌクレオチド配列の参照はまた、相補的な配列をも含む。
【0081】
以下は、限定ではないポリヌクレオチドの例である:遺伝子または遺伝子断片、エキソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体のような修飾ヌクレオチド、ウラシル、フルオロリボースおよびチオアートのようなその他の糖類および結合基、およびヌクレオチド分枝を含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断できる。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分との結合によって、合成後、さらに修飾できる。この定義に含まれる修飾のその他の種類は、キャップ、天然に生じるヌクレオチドの類似体との1つまたはそれ以上の置換、およびポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、その他のポリヌクレオチド、または固形支持体に付着させる方法の導入である。好ましくは、ポリヌクレオチドはDNAである。本明細書において使用されるように、「DNA」とは、塩基A、T、CおよびGを含むのみならず、それらの任意の類似体または、メチル化ヌクレオチド、非電荷結合およびチオアートのようなヌクレオチド間修飾、糖類似体の使用、およびポリアミドのような修飾されたおよび/または代替的なバックボーン構造などの、それらの塩基の修飾型も含む。
【0082】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域が、他方の配列に対して、ある割合(例えば、80%、85%、90%、または95%)の「配列同一性」をもつということは、整列化された場合、2つの配列の比較において塩基のその割合は同じであることを意味する。このアラインメントおよび相同性または配列同一性の割合は、例えば「分子生物学における最新プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」(F.M.Ausubelら編、1987)補遺30、第7.7.18節において記載されるもののような、当技術分野において既知のソフトウェアプログラムを用いて決定できる。好ましい整列化プログラムは、ALIGN Plus(Scientific and Educational Software、Pennsylvania)であり、好ましくは以下のデフォルトパラメータを用いる:ミスマッチ(mismatch)= 2;オープンギャップ(open gap)= 0;エクステンドギャップ(extend gap)= 2。
【0083】
「転写制御下にある」とは、当技術分野においてはよく理解される用語であり、ポリヌクレオチド配列、通常DNA配列の転写が、転写の開始に寄与する、または転写を促進する因子に、それが使用可能なように(操作的に)連結されることに依存することを示す。「機能的に連結された」とは、因子がそれらを機能させるように並んでいる、並列を指す。
【0084】
「E3領域」(「E3」と互換的に使用される)は、当技術分野においてはよく理解される用語であり、E3産物(本明細書において議論される)をコードするアデノウイルスゲノムの領域を意味する。一般に、E3領域は、アデノウイルスゲノムの約28583位と30470位の間に位置する。E3領域は、例えばウォルド(Wold)ら(1995)Curr.Topics Microbiol.Immunol. 199:237−274を含む、様々な刊行物において記載されている。
【0085】
E3領域の「一部」とは、全E3領域より小さいことを意味し、それ自体が、ポリヌクレオチドの欠失、および、1つまたはそれ以上のE3領域のポリペプチド産物をコードするポリヌクレオチドを含む。
【0086】
本明細書において使用されるように、「細胞毒性」とは、当技術分野においてはよく理解される用語であり、細胞の通常の生化学的または生物学的活性が弱められている(即ち、阻害されている)状態を指す。これらの活性は、これらに限定されないが、代謝;細胞の複製;DNA複製;転写;翻訳;分子の取り込みを含む。「細胞毒性」とは、細胞死および/または細胞溶解を含む。当技術分野においては、色素排除テスト、3H−チミジンの取り込み、およびプラーク試験のような、細胞毒性を示すアッセイ法が知られている。
【0087】
本明細書において使用されるように、「選択的細胞毒性」という用語は、標的細胞特異的TREを機能させない細胞(非標的細胞)において、本発明のアデノウイルスベクターにより与えられる細胞毒性と比較した場合、標的細胞特異的TREを機能させるまたは誘導する細胞(標的細胞)において、本発明のアデノウイルスベクターにより与えられる細胞毒性を指す。そのような細胞毒性は、例えば、プラーク試験により、標的細胞を含む腫瘍のサイズにおける減少または安定化、または、腫瘍細胞に特徴的なマーカーまたは組織特異的マーカー、例えば癌マーカーの、血清レベルの減少または安定化により測定できる。
【0088】
アデノウイルスの文脈において、「異種ポリヌクレオチド」または「異種遺伝子」または「導入遺伝子」とは、野生型アデノウイルスには存在しない、任意のポリヌクレオチドまたは遺伝子である。好ましくは、導入遺伝子は、アデノウイルスべクターによる導入以前には標的細胞においても発現されない、または存在しない。好ましい導入遺伝子の例は下記に提供される。
【0089】
アデノウイルスの文脈において、「異種」のプロモーターまたはエンハンサーとは、アデノウイルス遺伝子に関連しない、または由来しないものである。
【0090】
アデノウイルスの文脈において、「内在性」プロモーター、エンハンサー、またはTREは、アデノウイルスに特有である、または由来する。プロモーターの文脈において、「不活性化」とは、内在性プロモーターの一部または全部において突然変異または欠失があること、即ち、例えば点突然変異または挿入のように、内在性プロモーターに、プロモーターを機能できなくする修飾または変化があることを意味する。
【0091】
標的細胞特異的TREの文脈において、「異種」のプロモーターまたはエンハンサーとは、参照標的細胞特異的TREが由来する遺伝子以外の遺伝子に由来するものである。
【0092】
腫瘍の成長を「抑制すること」とは、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターとの接触がない、即ちアデノウイルスベクターによるトランスフェクションがない場合の成長と比較した場合に抑制される成長状態を示す。腫瘍細胞の増殖は、これらに限定されないが、腫瘍サイズの測定、3H−チミジン取り込みアッセイ法を用いた、腫瘍細胞が繁殖しているかどうかの決定、または腫瘍細胞の計測を含む、当技術分野において既知の任意の方法によって評価できる。腫瘍細胞の増殖を「抑制すること」とは、任意のまたは全ての以下の状態を意味する:腫瘍の成長の減速、遅延、および停止、および腫瘍の縮小。
【0093】
本明細書において使用されるように、「新生物形成細胞」、「新形成」、「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「癌」および「癌細胞」(互換的に使用される)という用語は、細胞繁殖の調節の著しい欠損(即ち、非制御細胞分裂)によって特徴付けられる、異常な成長の表現型を示すように、相対的に自律増殖を表す細胞を指す。新生物形成細胞は悪性または良性のものであってよい。
【0094】
「宿主細胞」とは、本発明のアデノウイルスベクターのレシピエントであり得る、またはレシピエントであった、個々の細胞または細胞培養を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫細胞を含み、子孫細胞は、天然の、偶発的な、または意図的な突然変異および/または変化により、(形態学的に、または全DNA相補性において)元の親細胞に必ずしも完全に同一である必要はない。宿主細胞は、本発明のアデノウイルスベクターを用いて、インビボまたはインビトロにおいてトランスフェクションされたまたは感染した細胞を含む。
【0095】
「複製」および「増殖」とは、互換的に使用され、本発明のアデノウイルスベクターの再生能または繁殖能を指す。これらの用語は、当技術分野においてはよく理解される。本発明の目的のためには、複製はアデノウイルスタンパク質の産生に関わり、一般にアデノウイルスの再生が行われる。複製は、バースト試験またはプラーク試験のような、当技術分野において標準的な、本明細書に記載されるアッセイ法を用いて測定できる。「複製」および「増殖」とは、これらに限定されないが、ウイルス遺伝子発現;ウイルスタンパク質、核酸またはその他の成分の産生;ウイルス成分の完全なウイルスへのパッケージング;および細胞溶解を含む、ウイルス生産の過程に、直接または間接に関わる任意の活性を含む。
【0096】
「ADPコード配列」とは、ADPまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドである。ADPの文脈において、ADPの「機能的断片」とは、アデノウイルスの複製に関して、細胞毒性活性、特に細胞溶解を表すものである。細胞毒性活性の測定法は、当技術分野において既知であり、本明細書に記載される。
【0097】
ADPポリペプチドを「コードする」ポリヌクレオチドとは、ADPポリペプチドまたはその断片を産生するために転写および/または翻訳できるものである。そのようなポリヌクレオチドのアンチセンス鎖もまた、配列をコードすると言われる。
【0098】
「ADPポリペプチド」とは、少なくともADPのアミノ酸配列の一部または領域を含み、ADPに関連する機能、特に細胞毒性、とりわけ細胞溶解を示すポリペプチドである。本明細書において議論されるように、これらの機能は、当技術分野において既知の技術を用いて測定できる。例えば、ADPポリペプチドを提供できる、保存的なアミノ酸置換による、ある配列変異が使用できることが理解される。
【0099】
本明細書において使用されるように、「アンドロゲン受容体」またはARとは、機能がアンドロゲンに特異的に結合することであり、特異的結合の結果として、アンドロゲン反応因子(ARE)を認識および結合し、それに続いてARが転写活性を制御できるようなタンパク質を指す。ARは、活性化された場合に細胞アンドロゲン反応性因子に結合する核受容体である。正常な細胞においては、ARはアンドロゲンによって活性化されるが、正常ではない細胞(悪性細胞を含む)においては、ARは、アンドロゲン以外のホルモンを含む非アンドロゲン性物質によって活性化され得る。「アンドロゲン受容体」という用語には、機能が十分保存される限り、アミノ酸の付加、挿入、切断および欠失に特徴付けられるもののような、アンドロゲン受容体の突然変異形態が包含される。突然変異体は、機能が十分保存される限り、アミノ酸の付加、挿入、切断および欠失を有するアンドロゲン受容体を含む。この文脈において、機能的なアンドロゲン受容体は、アンドロゲン、および、アンドロゲンの結合後は、AREの両方に結合するものである。
【0100】
配列番号「に記載された」ポリヌクレオチド配列とは、その配列がその配列番号における同一の連続配列として存在することを意味する。本用語は、配列番号の一部または領域、および配列番号内に含まれる全長配列を包含する。
【0101】
「生物試料」とは、個体から得られ、診断アッセイ法またはモニタリングアッセイ法において使用できる、様々な試料型を包含する。本定義は、血液試料および生物学的起源をもつその他の液体試料、生検検体または組織培養またはそれに由来する細胞のような固形組織試料、およびその子孫細胞を包含する。本定義はまた、試薬を用いた処理、可溶化、またはタンパク質またはポリヌクレオチドのようなある成分についての増加によるように、その獲得後に任意の方法において処理された試料をも含む。「生物試料」という用語は、臨床的試料を包含し、また培養における細胞、細胞上清、細胞溶解産物、血清、血漿、生物学的液体、および組織試料をも含む。
【0102】
「個体」とは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は、これらに限定されないが、家畜、狩猟動物、げっ歯類、霊長類、およびペットを含む。
【0103】
「有効量」とは、臨床的な結果を含む、有益なまたは望ましい結果をもたらすのに十分な量である。一回の有効量を、1回またはそれ以上の投与において投与できる。本発明の目的のためのアデノウイルスベクターの有効量は、疾患状態の進行を緩和、改善、安定化、逆転、減速または遅延させるのに十分な量である。
【0104】
所与のTREは、自然界においてその遺伝子に関連する場合、所与の遺伝子「に由来する」。
【0105】
「発現」とは、転写および/または翻訳を含む。
【0106】
本明細書において使用されるように、「含む(comprising)」という用語およびその同系語は、それらの包括的な意味において使用される;つまり、「含む(including)」という用語およびその対応する同系語と同等である。
【0107】
「ある(a)(an)」および「その(the)」とは、文脈により他に明らかに指示されない限り、複数の言及を含む。
【0108】
内部リボソーム接近部位(IRES)
IRES因子は、ピコルナウイルスmRNAにおいて最初に発見された(Jackson RJ、Howell MT、Kaminski A(1990)Trends Biochem Sci 15(12):477−83、および、Jackson RJおよびKaminski A(1995)RNA 1(10):985−1000)を参照されたい。本発明は、標的細胞特異的異種TREの転写制御下において共転写される第一遺伝子および第二遺伝子を含み、第二遺伝子(即ち、コード領域)が内部リボソーム接近部位(IRES)の翻訳制御下にある、改善されたアデノウイルスベクターを提供する。任意のIRESは、それらがベクターにおいて必要な機能を示す限り、本発明のアデノウイルスベクターにおいて使用できる。本発明において使用できるIRESの例には、表1において提供され、表2において参照されるものが含まれる。IRES因子の例には、配列が表1(配列番号:1)に記載されている、ノバゲン社(Novagen)から市販されている脳心筋炎ウイルス(EMCV)(Dukeら(1992)J.Virol 66(3):1602−9)が含まれる。本明細書において開示されるIRES因子の別の例は、VEGF IRES(Huezら(1998)Mol Cell Biol 18(11):6178−90)である。このIRESは短いセグメントをもち、その配列は表1に記載されている(配列番号:2)。
【0109】
IRESは、下流シストロンの開始コドンへの内部リボソームの直接接近を促進し、キャップ非依存的な翻訳を導く。ゆえに、下流シストロンの産物は、ポリタンパク質の断裂またはモノシストロニックmRNAの生成のいずれかを必要とせずに、バイシストロニック(またはマルチシストロニック)mRNAから発現できる。ゆえに、本発明のある実施的な態様において、IRESの翻訳制御下にあるE1Bを含むアデノウイルスベクターは、標的細胞特異的TREの調節下にあるバイシストロニックE1A−E1B mRNAからE1Bを翻訳させる。図7は、本発明のアデノウイルス構築物の概略図を提供する。
【0110】
内部リボソーム接近部位はおよそ450ヌクレオチド長であり、主要な配列の適度な保存および二次構造の強固な保存により特徴付けられる。IRESの最も重要な主要な配列の特徴は、その開始がIRESの3’末端のおよそ25ヌクレオチド上流に位置する、ピリミジンに富む部位である。ジャクソン(Jackson)ら(1990)を参照されたい。
【0111】
ピコルナウイルスIRESの3つの主要なクラスが、同定および特徴付けされた:(1)カルジオウイルス(cardiovirus)およびアフタウイルス(aphthovirus)クラス(例えば、脳心筋炎ウイルス、Jangら(1990)Gene Dev 4:1560−1572);(2)エンテロウイルスおよびライノウイルスクラス(例えば、ポリオウイルス、Bormanら(1994)EMBO J. 13:3149−3157);および(3)A型肝炎ウイルス(HAV)クラス(Glassら(1993)Virol 193:842−852)。最初の2つのクラスについては、2つの一般原則が適用される。第一に、IRESの450ヌクレオチド配列のほとんどは、リボソームの結合および翻訳の開始に寄与する特定の二次構造および三次構造を維持するように機能する。第二に、リボソーム接近部位は、保存されたピリミジンの連続した配列のおよそ25ヌクレオチド下流である、IRESの3’末端に位置するAUG 3塩基連鎖(triplet)である。翻訳開始は、リボソーム接近部位(カルジオウイルス)または次の下流AUG(エンテロウイルス/ライノウイルスクラス)のいずれかにおいて起こり得る。アフタウイルスにおいては、開始は双方の部位において起こる。
【0112】
HCVおよびウシウイルス性下痢性ウイルス(BVDV)または古典的豚コレラウイルス(CSFV)のようなペスチウイルスは、341ヌクレオチド長および370ヌクレオチド長の5’UTRを各々もつ。これらの5’UTR断片は、同様のRNA二次構造を形成し、適度に有効なIRES機能を有し得る(Tsukiyama−Koharaら(1992)、J.Virol. 66;1476−1483;Frolov Iら(1998)RNA 4:1418−1435)。表1は、HCVゲノム配列からの5’UTR領域を表す(GenBankアクセッション番号D14853)。
【0113】
リーシュマニアRNAウイルス1(LRV1)は、二重鎖RNAウイルスである。その128ヌクレオチド長の5’UTRは、キャップ非依存的な翻訳を促進するためのIRES活性をもつ(Megaら(1995)Mol Cell Biol 15:4884−4889)。この断片はまた、保存されたステムループ二次構造を形成し、少なくともその前部は必須である。
【0114】
近年の研究により、フレンドマウス白血病ウイルス(MLV)5’UTRおよびラットレトロトランスポゾンウイルス様30S(VL30)の配列の双方が、レトロウイルス起源のIRES構造を含むことが示された(Torrentら(1996)Hum Gene Ther 7:603−612)。これらの断片はまた、レトロウイルス由来のベクターにおいて使用された場合、パッキングシグナルとして機能的である。トリ細網内皮症ウイルスA型(REV−A)の研究により、そのIRESはパッケージング/二量体化(E/DLS)配列の下流に位置し、最小のIRES配列は、5’先導領域の129ヌクレオチド断片(452−580)内、gag AUGコドンのすぐ上流にあると考えられることが示される(Lopez−Lastraら(1997)Hum Gene Ther 8:1855−1865)。
【0115】
真核細胞においては、翻訳は通常、開始因子の調節下において、キャップを付加されたmRNA 5’末端からのリボソーム読み取りによって開始される。しかし、幾つかの細胞mRNAは、キャップ非依存的な翻訳を仲介するためのIRES構造をもつことが認められている(van der Veldeら(1999)Int J Biochem Cell Biol. 31:87−106)。例は、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(BiP)(Macejakら(1991)Nature 353:90−94)、ショウジョウバエのアンテナペディアmRNA(Ohら(1992)Gene and Dev 6:1643−1653)、線維芽細胞増殖因子−2(FGF−2)(Vagnerら(1995)Mol Cell Biol 15:35−44)、血小板由来増殖因子B(PDGF−B)(Bernsteinら(1997)J Biol Chem 272:9356−9362)、インシュリン様増殖因子II(Teerinkら(1995)Biochim Biophys Acta 1264:403−408)、および翻訳開始因子eIF4G(Ganら(1996)J Biol Chem 271:623−626)である。表1は、BiPおよびPDGFの5’非コード領域を示す。近年、血管内皮増殖因子(VEGF)もまた、IRES因子をもつことが認められた(Steinら(1998)Mol Cell Biol 18:3112−3119;Huezら(1998) Mol Cell Biol 18:6178−6190)。
【0116】
ピリミジンの連続した配列を除いて、ヌクレオチド配列自体はIRES機能に重要であるとは考えられない。特定の理論に縛られるわけではないが、IRESの機能について可能な説明は、それが、哺乳動物のリボソーム(リボソームタンパク質および/またはリボソームRNA成分のいずれか)、および/または開始因子、および/またはリボソームおよび/または開始因子と相互作用するRNA結合タンパク質との相互作用に寄与する三次元構造におけるその配列の特定の単鎖領域を配向する、二次構造および/または三次構造を形成するというものである。IRESの三次元構造が、1つまたはそれ以上のRNA結合タンパク質により決定される、または安定化されることもまた可能である。ゆえに、同様の三次元構造において同様の単鎖領域をもつ合成IRES配列を考案することができる。
【0117】
ある場合においては、1つまたはそれ以上のトランス作用細胞タンパク質がIRES機能のために必要でありうる。例えば、HAVおよびエンテロウイルス/ライノウイルスIRESは、網赤血球溶解産物においてはインビトロにおいて不十分に機能する。HeLa、Krebs II腹水、またはL細胞からの細胞質抽出物によって網赤血球溶解産物を補足することにより、エンテロウイルス/ライノウイルスIRESの活性は回復される。例えば、ブラウン(Brown)ら(1979)Virology 97:396−405;およびドーナー(Dorner)ら(1984)J.Virol. 50:507−514を参照されたい。HAV IRESのインビトロの活性は、肝臓細胞質の抽出物によって刺激される。グラス(Glass)ら(1993)Virology 193:1047−1050を参照されたい。これらの観察により、細胞特異的な翻訳制御は細胞特異的IRESの使用によって達成できることが示される。さらに、ウイルス複製の細胞特異性をさらに増加するため、協働する細胞特異的転写調節因子および細胞特異的翻訳制御因子をベクターに含み得る。例えば、AFP−TREおよびHAV−IRESの組み合わせは、肝細胞におけるベクターの優先的な複製を行うために使用することができる。ゆえに、ある実施的な態様において、ベクターは、バイシストロニックE1A−E1B mRNAの転写を制御するAFP−TREを含み、E1Bの翻訳は、ECMV IRESによって制御される。別の実施的な態様において、ベクターは、バイシストロニックE1A−E1B mRNAの転写を制御するプロバシンTREを含み、E1Bの翻訳は、ECMV IRESによって制御される。さらに別の実施的な態様において、ベクターは、バイシストロニックE1A−E1B mRNAの転写を制御するCMV−TREを含み、E1Bの翻訳は、ECMV IRESによって制御される。
【0118】
本発明において使用できるIRESの例は、表1および表2において提供されるものを含む。本発明において使用できるIRES配列は、以下のように試験することができる。試験ベクターは、例えば試験されるIRESの翻訳制御下に置かれた、ルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子をもつように作製される。望ましい細胞型を、望ましいIRESレポーター遺伝子を含むベクターを用いてトランスフェクションし、レポーター遺伝子の存在を検出するためのアッセイ法を実施する。ある実施的な例においては、試験ベクターは、CMVプロモーターによって転写促進される、共転写されるクロラムフェニコールトランスフェラーゼ(CAT)およびルシフェラーゼをコードする遺伝子を含み、ルシフェラーゼコード遺伝子は、試験されるIRESによって翻訳促進される。宿主細胞は、当業者に既知の方法により、試験ベクターを用いて一過的にトランスフェクションされ、ルシフェラーゼの存在についてアッセイされる。
【0119】
IRESは、当技術分野において既知の標準的な組換え法および合成法を用いて、および実施例において記載されるように、調製されうる。クローニングの便宜のため、使用されるIRES断片末端に制限酵素認識部位を組み込むことができる。
【0120】
転写応答因子(TRE)
本発明のアデノウイルスベクターは、特定の標的細胞における操作的に連結された遺伝子の優先的な発現を行う標的細胞特異的TREを含む。TREは、組織または腫瘍に存在する細胞型によって、組織特異的、腫瘍特異的、発生段階特異的、細胞状態特異的等であってよい。
【0121】
細胞特異的および組織特異的な転写調節因子、およびその同定、単離、特徴付け、遺伝子操作の方法、および操作的に連結されたコード配列の制御のための使用は、当技術分野においてよく知られている。TREは、単一の遺伝子の転写制御配列に由来できる、または、異なる遺伝子に由来する配列を、機能的TREを作製するために組み合わせることができる。細胞特異的TREは、例えば前立腺細胞または肝細胞のような、限られた集団(または種類)の細胞において優先的に機能する。したがって、ある態様において、使用されるTREは、以下の細胞型の任意のものにおいて優先的に機能する:前立腺;肝臓;乳房;尿路上皮細胞(膀胱);結腸;肺;卵巣;膵臓;胃;および子宮の細胞。その他の態様において、以下においてまたは以下の期間、細胞状態に従って、TREは機能的である:低酸素条件(低酸素症);S期のような細胞周期のある段階;温度上昇;電離放射線。
【0122】
当技術分野において既知のように、TREの活性は誘導可能である。誘導可能なTREは一般に、誘発因子の不在下においては低い活性を示し、誘発因子の存在下においては上方制御される。誘発因子には、例えば、核酸、ポリペプチド、小分子、有機化合物および/または温度、圧力または低酸素のような環境条件が含まれる。誘導可能なTREは、ある時点またはある位置においてのみ発現が望まれる場合に、または誘導物質を用いて発現レベルを定量するのが望ましい場合に、好ましい可能性がある。本明細書およびPCT/US98/04080において記載されるように、例えば、PSE−TRE、PB−TREおよびhKLK2−TREからの転写活性は、アンドロゲンによって誘導できる。したがって、本発明のある態様において、アデノウイルスベクターは誘導可能な異種TREを含む。
【0123】
TRE多量体はまた、開示されるベクターにおいて有用である。例えば、TREは、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、または少なくとも5つのプロモーター断片の縦列のコピーを含み得る。または、TREは、1つまたはそれ以上のエンハンサー領域と共に、1つまたはそれ以上のプロモーター領域を含み得る。TRE多量体はまた、異なる遺伝子からのプロモーターおよび/またはエンハンサー配列を含み得る。TREのプロモーターおよびエンハンサー成分は、望ましい細胞特異的転写活性が得られる限り、互いに関して任意の向きにあることが可能であり、関心対象のコード配列から任意の向きおよび/または任意の距離にあることができる。
【0124】
開示されるベクターは、TREが機能的である標的細胞において複製が優先的に増強されるように設計される。同じ標的細胞においてTREが機能的である限り、1つのベクターにおいて1つ以上のTREが存在できる。しかし、与えられるTREは、1つ以上の種類の標的細胞において機能的であり得ることに注意することが重要である。例えば、CEA−TREは、細胞型のうちとりわけ、胃癌細胞、結腸直腸癌細胞、膵臓癌細胞および肺癌細胞において機能する。
【0125】
本ベクターにおける使用のためのTREは、サイレンサーを含んでもよく、含まなくてもよい。サイレンサーの存在(即ち、当技術分野において既知の負の制御因子)は、非標的細胞における転写(およびそれにしたがった複製)の停止を補助する可能性がある。ゆえに、サイレンサーの存在は、非標的細胞においてより効果的に複製を妨げることにより、細胞特異的ベクターの複製を増強し得る。または、サイレンサーの欠如は、標的細胞における複製を刺激し、ゆえに標的細胞特異性を増強し得る。
【0126】
当業者には容易に理解されるように、TREはポリヌクレオチド配列であり、それ自体が、様々な配列置換に渡って機能を示し得る。ヌクレオチドの置換、付加、および欠失の方法は当技術分野においては既知であり、容易に利用可能な機能的アッセイ法(CATまたはルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ法等)は、標準技術の1つによって、配列変異体が必要な細胞特異的転写制御機能を示すかどうかを決定させる。ゆえに、核酸の置換、付加および/または欠失を含む、TREの機能的に保存された変異体は、本明細書において開示されるベクターにおいて使用できる。したがって、変異TREは、標的細胞における機能を維持するが、最大の機能を示す必要はない。実際、望ましい結果を達成するために、TREの最大転写活性化活性は、常に必要ではなく、TREの断片によって与えられる誘導レベルは、ある適用については十分であり得る。例えば、疾患状態の治療または緩和に使用される場合、例として、標的細胞が特に毒性でない場合、および/または疾患の拡張が比較的限定される場合は、最大よりも少ない反応性で十分であり得る。
【0127】
ある塩基修飾は、発現レベルおよび/または細胞特異性の増強をもたらす可能性がある。例えば、当技術分野において既知のように、TRE内における核酸配列の欠失または付加は、転写制御タンパク質結合部位を、正常な構造において存在するよりも互いにより近く、もしくは遠くに移動させ得る、またはそれらがDNAらせんの反対側になり、それによりTREと結合した転写因子の間の空間的関係が変化し、転写の減少もしくは増加をもたらすように、それらを回転させ得る。ゆえに、特定の理論に縛られるわけではないが、本開示により、TREのある修飾が、細胞特異性の増強を含む、TREによって行われる発現レベルの調節をもたらす可能性が予測される。発現レベルの増強の達成は、新生物形成成長のより攻撃的な形態の場合において、ならびに/または細胞死のより急速および/もしくは攻撃的なパターンが必ず起きる場合(例えば、免疫無防備状態の個体における)において、特に望ましい。
【0128】
TREにより行われる転写活性(阻害および増強の両方を含む)は、当技術分野において既知の(および下記においてより詳細が記載される)多くの方法において測定できるが、一般には、mRNAおよび/またはTREの調節下にある(即ち、機能的に連結された)配列によってコードされるタンパク質産物の検出および/または定量によって測定される。
【0129】
本明細書において議論されるように、TREは多様な長さ、および多様な配列組成のものであってよい。異種TREのサイズは、ウイルスベクターの容量によって部分的に決定され、その容量は、ベクターの予想される形態に依存する(以下を参照されたい)。導入遺伝子(以下に議論される)および/または付加的な制御配列のような、望まれ得る、その他の配列の挿入のための潜在的余地を提供するため、一般にTREについては、最小サイズが好ましい。好ましい態様において、そのような付加的な制御配列はIRESである。しかし、付加的な配列が予想されない場合、または、例えば、アデノウイルスベクターが維持され、ウイルスパッケージングの制限なく送達される場合、結果的に生じるアデノウイルスベクターが複製受容能を保つ限り、より大きなTRE配列が使用できる。
【0130】
アデノウイルスベクターを、ウイルス配列の欠失を必要とせずに、ゲノムサイズの総計約5%、またはおよそ1.8 kbまでの外部の配列と共にパッケージングできる。非必須配列がアデノウイルスゲノムから除去される場合、付加的な4.6 kbの挿入物を(即ち、約6.4 kbの全挿入能について)許容できる。欠失できる非必須アデノウイルス配列の例は、E3配列および、E4 ORF6をコードするもの以外のE4配列である。
【0131】
非特異的な複製を最小化するため、内在性(例えば、アデノウイルス)TREは、好ましくはベクターから除去される。標的細胞特異的複製の促進に加えて、内在性TREの除去はまた、アデノウイルスベクターがウイルス粒子内にパッケージングされる場合に特に重要となり得る、ベクターにおけるより大きな挿入能を提供する。さらにより重要なことには、内在性TREの欠失は、それによって異種TREが欠失され内在性TREがその各々のアデノウイルスコード配列の転写制御を行う(ゆえに非特異的な複製をさせる)ような、組換え事象の可能性を妨げる。ある態様において、アデノウイルスベクターは、アデノウイルス遺伝子の内在性転写制御配列が欠失し、1つまたはそれ以上の異種TREに置き換えられるように構築される。しかし、内在性TREは、十分な細胞特異的複製の優先性が保存される場合は、アデノウイルスベクターにおいて維持できる。これらの態様は、内在性TREと複製遺伝子コード部分間に異種TREを挿入することによって構築される。必要な細胞特異的複製の優先性は、異種TREを機能させる細胞におけるアデノウイルスベクターの複製を、機能させない細胞における複製と比較するアッセイ法を行うことによって決定される。
【0132】
一般にTREは、標的細胞におけるベクターの複製を、TREの不在下における複製の基底レベルと比較して、少なくとも約2倍、好ましくは少なくとも約5倍、好ましくは少なくとも約10倍、より好ましくは少なくとも約20倍、より好ましくは少なくとも約50倍、より好ましくは少なくとも約100倍、より好ましくは少なくとも約200倍、さらにより好ましくは少なくとも約400倍−500倍、さらにより好ましくは少なくとも約1,000倍増加する。認められる差異は、経験的に(例えば、RNAブロットアッセイ法、リボヌクレアーゼプロテクション法または当技術分野において既知のその他のアッセイ法を用いたmRNAレベルの測定によって)決定でき、ベクターの予想される使用および/または望ましい結果に依存する。
【0133】
特異的な標的細胞に導入させる、複製受容能のあるアデノウイルスベクターは、標的細胞において優先的に機能するTREを用いて生じさせ得る。本発明のある態様において、標的細胞は腫瘍細胞である。腫瘍細胞特異的な異種TRE、およびそれら各々の標的細胞の限定しない例は以下を含む:プロバシン(PB)、標的細胞、前立腺癌(PCT/US98/04132);α−フェトタンパク質(AFP);標的細胞肝臓癌(PCT/US98/04084);ムチン様糖タンパク質DF3(MUC1)、標的細胞、乳癌(PCT/US98/04080);癌胎児性抗原(CEA)、標的細胞、結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、および肺癌(PCT/US98/04133);ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子(urokinase plasminogen activator;uPA)およびそのレポーター遺伝子、標的細胞、乳癌、結腸癌、および肝臓癌(PCT/US98/04080);E2F1(細胞周期S期特異的プロモーター);標的細胞、途絶された網膜芽腫遺伝子機能をもつ腫瘍、およびHER−2/neu(c−erbB2/neu)、標的細胞、乳癌、卵巣癌、胃癌、および肺癌(PCT/US98/04080);チロシナーゼ、標的細胞、本明細書に記載されるような黒色腫細胞およびウロプラキン、標的細胞、本明細書に記載されるような膀胱細胞。付加的な標的細胞特異的TREの同定、単離、特徴付けおよび利用のための方法は、当業者には容易に利用可能である。
【0134】
さらに、腫瘍特異的TREは、以下の典型的な遺伝子からの組織特異的なTREと関連させて使用できる(TREが特異的に機能的であるような組織は括弧内):低酸素反応性因子、血管内皮増殖因子受容体(内皮)、アルブミン(肝臓)、第VII因子(肝臓)、脂肪酸シンセターゼ(肝臓)、フォン・ビルブラント因子(脳内皮)、α−アクチンおよびミオシン重鎖(双方とも平滑筋)、シンセターゼI(小腸)、Na+−K+−Cl−輸送体(腎臓)。付加的な組織特異的TREは当技術分野において知られている。
【0135】
本発明のある態様において、標的細胞特異的な、異種TREは腫瘍細胞特異的である。ベクターは、単一の腫瘍細胞特異的TRE、または、同じ細胞において腫瘍細胞特異的および機能的な複数の異種TREを含み得る。別の態様において、ベクターは、腫瘍細胞特異的な1つまたはそれ以上の異種TREを含み、付加的に、組織特異的な1つまたはそれ以上の異種TREを含むことにより、全てのTREが同じ細胞において機能的となる。
【0136】
前立腺特異的 TRE
一つの態様において、アデノウイルスベクターは、前立腺細胞に特異的な異種TREを含む。前立腺細胞において優先的に機能し、アデノウイルスの複製を前立腺腫瘍の標的にするのに利用可能なTREとして、例えば、前立腺特異的抗原遺伝子(PSA−TRE、Henderson、米国特許第5,698,443号)、腺性カリクレイン−1遺伝子(ヒト遺伝子由来hKLK2−TRE、PCT/US 98/16312)、およびプロバシン遺伝子(PB−TRE、PCT/US 98/04132)由来のTREが含まれるが、これらに限定されない。これら三つの遺伝子は全て、前立腺細胞で優先的に発現しており、その発現はアンドロゲンにより誘導される。一般に、アンドロゲン誘導に応答性のある遺伝子の発現は、アンドロゲン受容体(AR)に仲介される。
【0137】
前立腺特異的抗原(PSA)
PSAは前立腺上皮細胞のみにおいて合成され、これらの細胞が正常であるか、過形成性であるか、または悪性であるかに関わらず合成される。組織特異的発現をするため、PSAは良性の前立腺過形成(BPH)や前立腺癌(CaP)に対する優れたバイオマーカーである。PSAの通常の血清中濃度は、典型的には5 ng/ml未満であり、その上昇はBPHやCaPを示す。ランドウォール(Lundwall)ら(1987)FEBS Lett. 214:317;ランドウォール(Lundwall)(1989)Biochem. Biophys. Res. Comm. 161:1151;およびリーグマン(Riegmann)ら(1991)Molec. Endocrin. 5:1921を参照されたい。
【0138】
特に前立腺細胞において、アンドロゲン依存性の細胞特異性を提供するPSA遺伝子領域は、約6.0kbを含んでいる。シューア(Schuur)ら(1996)J. Biol. Chem. 271:7043−7051を参照されたい。ヒトにおいて約1.5kbにわたるエンハンサー領域は、PSA遺伝子の転写開始点に対して−5322位から−3739位の間に位置している。これらのエンハンサー配列内には、アンドロゲン受容体と結合する配列であるアンドロゲン応答性因子(ARE)が存在する。また、PSAプロモーター配列の座標は、転写開始点に対しておよそ−540位から+8位である。エンハンサーとプロモーターの近接により、完全に機能する最小の前立腺特異的TRE(PSA−TRE)が得られる。このPSA遺伝子の約6.0kbの領域以外の部分も、必要な機能が維持される限り、本明細書記載のベクター内で利用可能である。
【0139】
ヒト腺性カリクレイン(hKLK2)
ヒト腺性カリクレイン(hKLK2、hK2タンパク質をコードする)は前立腺のみにおいて発現し、その発現はアンドロゲンにより主に転写の活性化を通じて上方制御される。ウォルフ(Wolf)ら(1992)Molec. Endocrinol. 6:753−752;モーリス(Morris)(1989)Clin. Exp. Pharm. Physiol. 16:345−351;クイ(Qui)ら(1990)J. Urol. 144:1550−1556;およびヤング(Young)ら(1992)Biochem. 31:818−824を参照されたい。様々な腫瘍や前立腺癌の患者の血清内で見いだされるhK2のレベルは、hK2抗原が前立腺癌の有意なマーカーである可能性を示している。チャールズワース(Charlesworth)ら(1997)Urology 49:487−493を参照されたい。hK2の発現が、解析した257の根治前立腺切除標本のそれぞれから検出された。ダルソン(Darson)ら(1997)Urology 49:857−862を参照されたい。特異的抗体を用いて検出したhK2発現の強度および程度の上昇が、良性の上皮から高程度の前立腺上皮内腫瘍(PIN)および腺癌まで観察された。
【0140】
hKLK2プロモーターの活性が説明され、転写開始点に対して−2256位までの領域がこれまでに明らかになっている。シェドリッチ(Schedlich)ら(1987)DNA 6:429−437を参照されたい。hKLK2プロモーターはアンドロゲン応答性であり、かつプロモーターのみがレポーター遺伝子の発現を制御するようなプラスミド構築物においては、レポーター遺伝子の発現は、アンドロゲン存在下で約10倍に上昇する。ムター(Murtha)ら(1993)Biochem. 32:6459−6464を参照されたい。hKLK2のエンハンサー活性は転写開始点に対して約−12,014位から−2257位のポリヌクレオチド配列内にみられ、この配列をhKLK2プロモーターおよびレポーター遺伝子に機能的に連結させた場合、前立腺細胞における機能的に連結された配列の転写は、アンドロゲン非存在下の転写レベルと比べて、アンドロゲン存在下では約30倍から約100倍のレベルにまで上昇する。この誘導は一般にエンハンサー配列の向きや位置には依存しない。またエンハンサー活性は、以下の領域においても示されている:(全て、転写開始点に対して)約−3993位から約−3643位、約−4814位から約−3643位、約−5155位から約−3387位、約−6038位から約−2394位。
【0141】
したがってhKLK2エンハンサーをhKLK2プロモーターまたは異種プロモーターと機能的に連結させてhKLK2転写調節因子(hKLK2−TRE)を形成することが可能である。その後hKLK2−TREを異種ポリヌクレオチドに機能的に連結させて、連結した遺伝子をhKLK2−TRE特異的に転写調節し、したがってその発現を増加させることが可能である。
【0142】
プロバシン
ラットのプロバシン(PB)遺伝子は最初にラットの背外側前立腺で特徴付けられた、アンドロゲンおよび亜鉛制御タンパク質をコードする。ドッド(Dodd)ら(1983)J. Biol. Chem. 258:10731−10737;マツシク(Matusik)ら(1986)Biochem. Cell. Biol. 64:601−607;およびスイートランド(Sweetland)ら(1988)Mol. Cell. Biochem. 84:3−15を参照されたい。げっ歯類前立腺の背外側葉は、ヒトの前立腺の末梢帯域に最も相同であると考えられており、ヒトの前立腺癌の約68%はこの領域から生じると考えられている。
【0143】
PB−TREは、プロバシンコード配列の上流の約0.5kb断片であり、転写開始点に対して約−426位から約+28位に存在することが示されている。PB遺伝子由来のこの最小プロモーター配列は、トランスジェニックマウスにおいて機能的に連結された異種遺伝子の前立腺特異的で発生およびホルモンにより調節される発現を行うための、十分な情報を提供することが示されている。グリーンバーグ(Greenberg)ら(1994)Mol. Endocrinol. 8:230−239を参照されたい。
【0144】
α − フェトタンパク質
α−フェトタンパク質(AFP)は癌胎児性のタンパク質で、その発現レベルは組織や発生段階により大きく変化するものの、主に内胚葉起源の発生中の組織に限られている(卵黄嚢、胎児肝臓、および腸)。AFPの血清濃度は大多数の肝臓癌の患者で上昇しており、とくに病気が進行した患者で高レベルのAFPが見られることから、AFPは臨床上の関心対象である。患者における高レベルの血清AFPは、周囲の正常な肝臓においてではなく、肝細胞癌(HCC)におけるAFPの発現に起因することが示されている。したがってAFP遺伝子の発現は肝臓癌の特徴となり得る。AFP−TREは例えばPCT/US 98/04084に記載されている。
【0145】
公開された報告によると、AFP−TREは、AFP産生細胞に関連する細胞タンパク質(転写因子および/または補因子)、例えばAFP結合タンパク質(例えば米国特許第5,302,698号参照)に応答し、少なくともAFPプロモーターおよび/またはAFPエンハンサーの一部を含む。AFP遺伝子からは細胞特異的TREが同定されている。例えば、ヒトAFP特異的エンハンサー活性のクローニングおよび特徴付けが、ワタナベ(Watanabe)ら(1987)J. Biol. Chem. 262:4812−4818において説明されている。5’AFP調節領域(プロモーター、推定サイレンサー、およびエンハンサーを含む)は、転写開始点から約5kb上流に含まれている。
【0146】
AFP調節領域内において、ヒトAFPエンハンサー領域は、AFP遺伝子の転写開始点に対して約−3954位から約−3335位の間に位置している。ヒトAFPプロモーターは、約−174位から約+29位の領域を含んでいる。この二つの遺伝的要素の近接により、完全に機能的なAFP−TREがもたらされる。イド(Ido)ら(1995)Cancer Res. 55:3105−3109は、HCC細胞内での発現に特異的な259bpのプロモーター断片(−230位から+29位)を記載している。AFPエンハンサーは、転写開始点に対して−3954位から−3335位の間に位置しており、AおよびBと示される二つの領域を含んでいる。プロモーター領域は典型的なTATAボックスおよびCAATボックスを含む。AFP−TREが少なくとも一つのエンハンサー領域を含むことが好ましい。AFP−TREが両方のエンハンサー領域を含むことがさらに好ましい。
【0147】
AFP−TREを含むベクターに対する好適な標的細胞は、AFP−TREを機能させる任意の細胞型である。好ましくは、AFPを発現または産生する細胞であり、AFPを発現している腫瘍細胞も含まれるが、これに限定されない。このような細胞の例としては、肝細胞癌(HCC)細胞、性腺およびその他の生殖細胞の腫瘍(特に内胚葉洞腫瘍)、脳腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膵臓の腺房細胞癌(Kawamotoら(1992)Hepatogastroenterology 39:282−286)、一次胆嚢腫瘍(Katsuragiら(1989)Rinsho Hoshasen 34:371−374)、子宮体腺癌(uterine endometrial adenocarcinoma)細胞(Koyamaら(1996)Jpn. J. Cancer Res. 87:612−617)、ならびに任意の前述の転移(肺、副腎、骨髄および/または脾臓において起こり得る)が挙げられる。いくつかの例では、ある種の膵臓癌および胃癌から肝臓への転移性疾患によりAFPが産生される。AFP−TREの標的細胞として特に好ましいのは、肝細胞癌細胞および任意のその転移である。
【0148】
当技術分野における標準的なイムノアッセイ法、例えば、AFPタンパク質産生レベルを測定するための、RIA、ELISAもしくはタンパク質免疫ブロット(ウェスタンブロット)を利用し、および/または、AFP mRNAレベルを測定するためのRNAブロッティング(ノーザンブロット)を用いて、AFP産生を測定できる(およびしたがってAFP産生細胞を同定できる)。または、そのような細胞を、AFP−TREを転写的に活性化する(すなわちAFP−TREの機能を可能にする)能力により同定することができ、かつ/または特徴付けることができる。
【0149】
またAFP−TREに関しては共有されている(co−owned)PCT W098/39465も参照されたい。より詳細がそこで述べられているように、AFP−TREは任意の数の構造を含むことができ、AFPプロモーター;AFPエンハンサー;AFPプロモーターおよびAFPエンハンサー;AFPプロモーターおよび異種エンハンサー;異種プロモーターおよびAFPエンハンサー;ならびにそれらの多量体、などを含むがこれに限定されない。AFP−TREの構成要素のプロモーターおよびエンハンサーは、所望のAFP細胞特異的転写活性が得られる限り、任意の方向および/または関心対象のコード配列からの任意の距離でよい。本発明のアデノウイルスベクターはAFP−TRE内在性サイレンサー因子を含むことが可能であり、または、AFP−TRE内在性サイレンサー因子は除去されることも可能である。
【0150】
ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子
ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子(uPA)タンパク質およびその細胞表面受容体であるウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体(uPAR)は、最も頻繁に発生する腫瘍の多くで発現しており、癌転移において重要なタンパク質を代表するものだと思われる。両タンパク質とも、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、腎臓癌、肺癌、および卵巣癌と関連がある。uPAおよびuPARの転写を調節する配列因子は精力的に研究されている。リシオ(Riccio)ら(1985)Nucleic Acids Res. 13:2759−2771;カニオ(Cannio)ら(1991)Nucleic Acids Res. 19:2303−2308を参照されたい。
【0151】
癌胎児性抗原( CEA )
CEAは180,000ダルトンの腫瘍関連性糖タンパク質抗原で、結腸直腸癌、胃癌、および膵臓癌などの消化管の内胚葉由来の腫瘍、ならびに乳癌および肺癌などのその他の腺癌にみられる。CEA陽性の腫瘍をもつ患者の大多数において循環CEAが検出できることから、CEAは臨床的関心対象となっている。肺癌においては、全例の約50%で循環CEAがみられ、腺癌ではしばしば高濃度(20ng/mlを上回る)のCEAが検出される。胃癌患者の約50%は血清学的にCEA陽性である。
【0152】
CEA遺伝子の5’隣接配列は、細胞特異的活性をもつことが示されている。CEAプロモーター領域は、遺伝子の5’隣接領域における転写開始点に対して−の最初の約424塩基であり、CEA産生細胞では非産生HeLa細胞に比べて高プロモーター活性を提供するという長所から、細胞特異的活性をもつことが示された。シュレーウェ(Schrewe)ら(1990)Mol. Cell. Biol. 10:2738−2748を参照されたい。さらに細胞特異的エンハンサー領域も見いだされている。PCT/GB/02546を参照されたい。CEAプロモーター、推定サイレンサー、およびエンハンサー因子は、転写開始点から約14.5kb上流までの領域内に含まれていると考えられる。Richardsら(1995)PCT/GB/02546を参照されたい。リチャード(Richards)ら(1995)前記、によるCEA遺伝子の5’隣接領域のさらなる同定により、二つの上流領域(一つは約−13.6kbから約−10.7kbの間、もう一つは約−6.1kbから約−4.0kbの間)が多量体化(multimerized)プロモーターと結合したときに、CEA産生LoVo細胞およびSW1463細胞において、レポーター構築物の高レベルかつ選択的な発現をもたらすことが示された。リチャード(Richards)ら(1995)前記、はまた、プロモーター領域を、転写開始点に対して約−90位から約+69位の間に局在化させ、約−41位から約−18位の間の領域が発現に必須であった。PCT/GB/02546は、以下の配列を含む断片を含む、細胞特異的活性をもつ一連の5’隣接CEA断片を記載している:全て転写開始点に対して、約−299位から約+69位;約−90位から約+69位;−14,500位から−10,600位;−13,600位から−10.600位;および−6,100位から−3,800位。さらに、細胞特異的転写活性を、−402位から+69位のCEA断片に機能的に連結された遺伝子も有する。
【0153】
本明細書で開示したベクターにおいて使われるCEA−TREは、ヒトの細胞を含む哺乳動物細胞に由来するが、これに限定されない。したがってベクターが必要とする望ましい機能が示される限り、いかなるCEA−TREでも利用可能である。
【0154】
ムチン
MUC1遺伝子のタンパク質産物(ムチン、MUC1タンパク質、エピシアリン(episialin)、多形上皮ムチンまたはPEM、EMA、DF3抗原、NPGP、PAS−O、もしくはCA15.3抗原として知られる)は通常、主に、胃、膵臓、肺、気管、腎臓、子宮、唾液腺、乳腺の腺または管を裏打ちする上皮細胞の頂端表面で発現している。ゾッター(Zotter)ら(1988)Cancer Rev. 11−12:55−101;およびガーリング(Girling)ら(1989)Int. J. Cancer 43:1072−1076を参照されたい。しかし、ムチンはヒトの乳癌の75%〜90%で過剰発現している。クーフェ(Kufe)ら(1984)Hybridoma 3:223−232を参照されたい。総説としてはヒルケンス(Hilkens)(1988)Cancer Rev. 11−12:25−54;およびテイラー−パパジミトリオー(Taylor−Papadimitriou)ら(1990)J. Nucl. Med. Allied Sci. 34:144−150を参照されたい。ムチンタンパク質の発現は、乳癌の分化の程度と関連している。ランディ(Lundy)ら(1985)Breast Cancer Res. Treat. 5:269−276を参照されたい。
【0155】
ヒト乳癌細胞MCF−7およびZR−75−1におけるMUC1遺伝子の過剰発現は、転写レベルで起こることが示されている。クーフェ(Kufe)ら(1984)、前述;コバリック(Kovarik)ら(1993)J. Biol. Chem. 268:9917−9926;およびアベ(Abe)ら(1990)J. Cell. Physiol. 143:226−231を参照されたい。細胞特異的転写に関与していると思われるTREを含む、転写開始点に対して約−0.9kbを含む、MUC1遺伝子の制御配列が単離されている。アベ(Abe)ら(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:282−286、コバリック(Kovarik)ら(1993)、前述;およびコバリック(Kovarik)(1996)J. Biol. Chem. 271:18140−18147を参照されたい。
【0156】
MUC1−TREはヒト細胞を含む哺乳動物細胞に由来するが、これに限定されない。好ましくは、MUC1−TREはヒトである。ある態様において、MUC1−TREはMUC1遺伝子の全5’隣接配列の0.9kbを含む。他の態様において、MUC1−TREはプロモーターに機能的に連結された以下の配列を含む:(MUC1遺伝子の転写開始点に対して)約−725位から約+31位、約−743位から約+33位、約−750位から約+33位、および約−598位から約+485位。
【0157】
c−erbB2/HER−2/neu
c−erbB2/neu遺伝子(HER−2/neuまたはHER)は、185kDの上皮細胞増殖因子受容体に関連した膜糖タンパク質をコードする形質転換遺伝子である。ヒトにおいてc−erbB2/neuタンパク質は、胎児の発生の時期に発現し、成人では、多くの正常な組織の上皮においてそのタンパク質は(免疫組織化学により)わずかに検出可能である。c−erbB2/neu遺伝子の増幅および/または過剰発現は、乳癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、胃癌、および肺癌を含む多くのヒトの癌と関連している。c−erbB2/neuタンパク質の過剰発現による臨床上の結果は、乳癌および卵巣癌において最も研究されている。乳房の管内の腫瘍の20%から40%、および卵巣癌の30%で、c−erbB2/neuタンパク質の過剰発現が起こっており、かつこれは両疾患のサブカテゴリーにおける不十分な予後と関連している。
【0158】
ヒト、ラット、およびマウスのc−erbB2/neu TREが同定されており、c−erbB2/neuを発現する細胞に特異的な転写活性をもつことが示されている。タル(Tal)ら(1987)Mol. Cell. Biol. 7:2597−2601;ハドソン(Hudson)ら(1990)J. Biol. Chem. 265:4389−4393;グーテクラス(Grooteclaes)ら(1994)Cancer Res. 54:4193−4199;イシイ(Ishii)ら(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4374−4378;およびスコット(Scott)ら(1994)J. Biol. Chem. 269:19848−19858を参照されたい。
【0159】
メラノサイト特異的 TRE
黒色腫タンパク質をコードするいくつかの遺伝子は、正常な組織の大部分ではサイレント(silent)であるが、黒色腫/メラノサイトで頻繁に発現されることが示されている。様々なメラノサイト特異的TREが知られており、それらはメラノサイトに関連した細胞タンパク質(転写因子および/または補因子)に応答し、かつメラノサイト特異的プロモーターおよび/またはメラノサイト特異的エンハンサーの少なくとも一部を含む。一つまたは複数のメラノサイト特異的遺伝子の発現を制御する既知の転写因子には、小眼球症と関連のある転写因子MITFが含まれる。ヤスモト(Yasumoto)ら(1997)J. Biol. Chem. 272:503−509を参照されたい。一つまたは複数のメラノサイト特異的遺伝子の発現を制御するその他の転写因子には、MART−1/Melan−A、gp100、TRP−1、およびTRP−2が含まれる。
【0160】
メラノサイト特異的TREの活性の測定方法、および、所与の細胞がメラノサイト特異的なTREを機能させるかどうかの判定方法は、本明細書に記載されている。
【0161】
いくつかの態様において、本発明で用いられるメラノサイト特異的TREはヒト、ラットおよびマウスを含むがこれに限定されない、哺乳動物細胞由来である。任意のメラノサイト特異的TREが、本発明のアデノウイルスベクターに使われ得る。黒色腫細胞内で特異的または優先的に発現するげっ歯類およびヒトの5’隣接配列が文献に記載されており、したがって本研究の実施のために利用可能であり、本明細書においては詳細を記述する必要はない。以下は利用可能なメラノサイト特異的TREのいくつかの例である。ヒトチロシナーゼ遺伝子の5’隣接領域のプロモーターおよびその他の制御因子が記載されており、配列はGenBankアクセッション番号X16073およびD10751として登録されている。キクチ(Kikuchi)ら(1989)Biochim. Biophys. Acta 1009:283−286;およびシバタ(Shibata)ら(1992)J. Biol. Chem. 267:20584−20588を参照されたい。また、ヒトチロシナーゼ遺伝子のメラノサイト特異的発現を増強するシス作用性因子が定義されている。この因子はチロシナーゼ遠位因子(TDE)として知られる20bpの配列を含み、CATGTGモチーフを含み、かつヒトチロシナーゼ遺伝子の転写開始点に対して約−1874位から約−1835位に位置している。ヤスモト(Yasumoto)ら(1994)Mol. Cell. Biol. 14:8058−8070を参照されたい。ヒトチロシナーゼ遺伝子の約−209位から+61位の配列を含むプロモーター領域が、メラノサイト特異的発現を指示することが見出された。シバタ(Shibata)(1992)を参照されたい。同様に、マウスチロシナーゼの5’隣接領域が解析され、配列がGenBankアクセッション番号D00439およびX51743として登録されている。クルッペル(Kluppel)ら(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3777−3788を参照されたい。マウスのTRP−1遺伝子に対する最小のプロモーターが同定され、かつ転写開始点に対して−44位から+107位のヌクレオチドを含むことが報告された。ローウィング(Lowings)ら(1992)Mol. Cell. Biol. 12:3653−3662を参照されたい。ヒトTRP−2遺伝子のメラノサイト特異的発現に必要な二つの調節領域が同定された。ヨコヤマ(Yokoyama)ら(1994)J. Biol. Chem. 269:27080−27087を参照されたい。ヒトのMART−1プロモーター領域が説明され、GenBankアクセッション番号U55231として登録されている。メラノサイト特異的プロモーター活性が、ヒトMART−1遺伝子の5’隣接領域の233bpの断片において見いだされた。バターフィールド(Butterfield)ら(1997)Gene 191:129−134を参照されたい。基本的なヘリックス−ループ−ヘリックス/ロイシンジッパーを含む転写因子である小眼球症関連転写因子(microphthalmia associated transcription factor;MITF)が、チロシナーゼおよびTRP−1遺伝子の転写活性化に関与していることが説明された。ヤスモト(Yasumoto)ら(1997)J. Biol. Chem. 272:503−509を参照されたい。
【0162】
いくつかの態様において、メラノサイト特異的TREは、表3に記載されたヒトチロシナーゼ遺伝子の5’隣接領域に由来する配列を含む。これらの態様のいくつかでは、メラノサイト特異的TREは、転写開始点に対して約−231位から約+65位(配列番号:10の約244位から約546位)のヌクレオチドであるチロシナーゼを含み、かつさらにヒトチロシナーゼの転写開始点に対して約−1956位から約−1716位(配列番号:10の約6位から約243位)のヌクレオチドを含みうる。またメラノサイト特異的TREは、約−1956位から約−1716位のヌクレオチドと近接した約−231位から約+65位のヌクレオチドも含みうる。ヒトチロシナーゼの転写開始部位に対して約−1956位から約−1716位のヌクレオチドは、相同的または異種性のどちらかのプロモーターをもつ機能的に連結されたレポーター遺伝子に、メラノサイト特異的発現を付与し得ることが説明されている。従って、いくつかの態様においてメラノサイト特異的TREは、異種プロモーターに機能的に連結された約−1956位から約−1716位のヌクレオチドを含む。
【0163】
メラノサイト特異的TREはまた多量体を含んでもよい。例えば、メラノサイト特異的TREは、少なくとも二つ、少なくとも三つ、少なくとも四つ、または少なくとも五つの、連続した直列のチロシナーゼプロモーター断片を含んでもよい。または、メラノサイト特異的TREは、一つまたは複数のチロシナーゼエンハンサー領域をともなった一つまたは複数のチロシナーゼプロモーター領域を有することができる。これらの多量体はまた、異種プロモーターおよび/または異種エンハンサーの配列を含んでもよい。
【0164】
細胞状態特異的 TRE
本発明のアデノウイルスベクターにおいて利用する細胞状態特異的TREは、任意の生物種に由来することができるが、好ましくは哺乳動物に由来する。細胞状態に対して応答する発現、または細胞状態と関連した発現をする多くの遺伝子が説明されている。細胞状態に関連したこれらのTREのいずれも、細胞状態特異的TREを作製するのに利用され得る。
【0165】
細胞状態の例の一つに細胞周期がある。細胞周期に関連した発現をする遺伝子の例えばE2F−1が挙げられる。E2F−1は広範に発現する成長調節遺伝子であり、S期に転写活性のピークを示す。ジョンソン(Johnson)ら(1994)Genes Dev. 8:1514−1525を参照されたい。RBタンパク質は、RBファミリーのその他のメンバー同様、E2F−1と特異的な複合体を形成し、それにより転写活性化能を阻害する。したがって、E2F−1に応答するプロモーターはRBによる下方制御を受ける。多くの腫瘍細胞においてRBの機能が乱されており、これがE2F−1応答プロモーターの抑制解除をもたらし、次に細胞分裂の調節解除をもたらす。
【0166】
したがってある態様において本発明は、アデノウイルス遺伝子、好ましくは複製に必須の遺伝子が、細胞状態特異的TREの転写制御下におかれ、細胞状態特異的TREが細胞周期により活性化されるTREを含む、E3を含むアデノウイルスベクターを提供する。一つの態様として、細胞周期により活性化されるTREはE2F1 TREである。
【0167】
細胞状態により制御される遺伝子のその他の群に、低酸素条件(hypoxic conditions)に応答して発現が増加するものがあげられる。ブーン(Bunn)およびポイトン(Poyton)(1996)Physiol. Rev. 76:839−885;ダックス(Dachs)およびストラットフォード(Stratford)(1996)Br. J. Cancer 74:5126−5132;ギレミン(Guillemin)およびクラスノー(Krasnow)(1997)Cell 89:9−12を参照されたい。一般的に腫瘍細胞は血管を構成する内皮細胞よりも成長が早いという事実にいくらか起因して、多くの腫瘍では血液の供給が不足しており、腫瘍内に低酸素の部位を生じる。フォルクマン(Folkman)(1989)J. Natl. Cancer Inst. 82:4−6;およびカリノースキ(Kallinowski)(1996)The Cancer J. 9:37−40を参照されたい。低酸素応答の重要な介在物質には転写複合体HIF−1または低酸素誘導性因子(hypoxia inducible factor)−1が挙げられ、これは血管内皮増殖因子、およびエノラーゼ1を含む解糖系の酵素をコードするいくつかの遺伝子を含む、いくつかの遺伝子の制御領域内の低酸素応答性因子(HRE)と相互作用する。マウスのHRE配列は同定され特徴づけされている。ファース(Firth)ら(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6496−6500を参照されたい。ラットのエノラーゼ1プロモーターに由来するHREが、ジャン(Jiang)ら(1997)Cancer Res. 57:5328−5335に記載されている。ラットのエノラーゼ1プロモーター由来のHREを表3に示す。
【0168】
したがってある態様においてアデノウイルスベクターは、HREを含む細胞状態特異的TREの転写制御下にある、アデノウイルス遺伝子、好ましくは複製に必須のアデノウイルス遺伝子を含む。ある態様において、細胞状態特異的TREは表3に示されたHREを構成する。
【0169】
その他の細胞状態特異的TREとして、熱誘導性(すなわち熱ショック)プロモーター、ならびに電離放射線および紫外線を含む照射暴露(radiation exposure)応答性のプロモーターが含まれる。例えば、初期増殖応答−1(early growth response−1;Egr−1)遺伝子のプロモーター領域は、電離放射線誘導性の因子を含む。ハラハン(Hallahan)ら(1995)Nat. Med. 1:786−791;およびサイ−モリス(Tsai−Morris)ら(1988)Nucl. Acids. Res. 16:8835−8846を参照されたい。熱誘導性因子を含む熱誘導性プロモーターが報告されている。例えばウェルシュ(Welsh)(1990)「生物学および薬学におけるストレスタンパク質(Stress Proteins in Biology and Medicine)」、モリモト(Morimoto)、ティセア(Tisseres)、およびジョーゴパウロス(Georgopoulos)編、Cold Spring Harbor Laboratory Press;ならびにペリシック(Perisic)ら(1989)Cell 59:797−806を参照されたい。すなわちいくつかの態様において、細胞状態特異的TREは電離放射線応答性因子を含む。ある態様において、このTREはEgr−1遺伝子の5’隣接配列を含む。その他の態様において、細胞状態特異的TREは熱ショック応答性因子を含む。
【0170】
上に挙げた細胞状態特異的TREは、本発明において機能すると考えられるTREの非制限的な例として提供される。当技術分野において、さらなる細胞状態特異的TREが知られており、また同様に、細胞状態特異的TREと思われるものの細胞状態特性を同定および検査するための方法も知られている。
【0171】
尿路上皮細胞特異的TRE
あらゆる尿路上皮細胞特異的TREが、本発明のアデノウイルスベクター内で利用され得る。多くの尿路上皮細胞特異的タンパク質が説明されているが、その中にウロプラキン(Uroplakin)がある。UPIaおよびUPIb(それぞれ27kDaおよび28kDa)、UPII(15kDa)、ならびにUPIII(47kDa)を含むウロプラキン(UP)は、尿路上皮プラークの主要なタンパク質である複合膜タンパク質群のメンバーである。これらのプラークは哺乳動物の尿路上皮の頂端表面の大部分を占め、かつ透過障壁および/または尿路上皮頂端表面の物理的安定化剤としての役割を果たしうる。ウー(Wu)ら(1994)J. Biol. Chem. 269:13716−13724を参照されたい。UPは膀胱特異的タンパク質で、移行上皮癌の88%を含む、有意な割合の尿路上皮由来の腫瘍において発現している。モール(Moll)ら(1995)Am. J. pathol. 147:1383−1397;およびウー(Wu)ら(1998)Cancer Res. 58:1291−1297を参照されたい。ヒトUPIIの発現制御が研究されており、マウスのUPII遺伝子の上流3.6kbの領域が、異種遺伝子における尿路上皮特異的転写をもたらし得るとして同定されている(Linら(1995)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:679−683を参照されたい)。
【0172】
尿路上皮細胞特異的TREとして好ましいものには、ウロプラキンUPIa、UPIb、UPII、およびUPIII、ならびにウロヒンジン(urohingin)由来のTREが含まれる。ウロプラキンTREは、意図されるアデノウイルスの用途次第で、かつ必要とする機能が標的細胞または宿主細胞で示されれば、任意の生物種に由来し得る。重要なことに、尿路上皮細胞特異的TREを含むアデノウイルス構築物は、膀胱内の尿路上皮細胞に隣接する平滑筋細胞とは対照的に、尿路上皮細胞において、選択的な複製が可能であることが認められている。
【0173】
ウロプラキン
hUPII遺伝子に由来する尿路上皮特異的TREが本明細書に記載されている。すなわちいくつかの態様において、本発明のアデノウイルスベクターは、表3に示すhUPII遺伝子の5’隣接領域に由来する2.2kbの配列を含む尿路上皮細胞特異的TREの転写制御下にある、アデノウイルス遺伝子、好ましくは複製に必須なアデノウイルス遺伝子を含む。他の態様において、本発明のアデノウイルスベクターは、表3に示す430位から2239位のヌクレオチドの、hUPII遺伝子の5’隣接領域に由来する1.8kbの配列を含む尿路上皮細胞特異的TREの転写制御下にある、アデノウイルス遺伝子、好ましくは複製に必須なアデノウイルス遺伝子を含む。別の態様において、尿路上皮細胞特異的TREは、表3に示した2.2kbの配列の機能的な部分、または表3に示した430位から2239位の1.8kbのヌクレオチド配列の機能的な部分、例えば、hUPIIの5’隣接領域の200bp断片を含む、2000bp以下の断片、1500bp以下、もしくは1000bp以下、600bp以下、または少なくとも200bpの断片を含む。
【0174】
マウスのUPII(mUPII)遺伝子に位置する3.6kbの5’隣接配列は、異種遺伝子に尿路上皮細胞特異的転写をもたらすが、これは本発明のベクターに有益な尿路上皮細胞特異的TREの一つである(表3)。より小さいTRE(すなわち、3500bp以下、より好ましくは約2000bp、1500bp、または1000bp未満)が好ましい。mUPIIの3.6kb断片に由来する、より小さなTREは、好ましい尿路上皮細胞特異的TRE群の一つである。特に発明者らは、異種遺伝子の尿路上皮細胞特異的発現をもたらす、mUPII遺伝子の5’非翻訳(UTR)領域の540bpを含む、mUPII遺伝子の5’隣接DNA由来の約600bpの断片を同定した。
【0175】
すなわちいくつかの態様において、本発明のアデノウイルスベクターは、表3に示すマウスUPII遺伝子の5’隣接領域に由来する3.6kbの配列を含む尿路上皮細胞特異的TREの転写制御下にある、アデノウイルス遺伝子、好ましくは複製に必須なアデノウイルス遺伝子を含む。別の態様において、尿路上皮細胞特異的TREは、表3に示した3.6kbの配列の機能的な部分、例えば、5’UTRの540bpの断片を含む3500bp以下、2000bp以下、1500bp以下、または1000bp以下の断片を含む。尿路上皮細胞特異的TREはまた、mUPIIの5’隣接領域3.6kbまたは本明細書記載の任意のそれらの断片と実質的に同一の配列でもあり得る。
【0176】
尿路上皮細胞特異的TRE活性の測定方法の例として、化学合成、部位特異的変異誘発、PCRおよび/または組み換え法などの、当技術分野において既知の方法を用いて、ポリヌクレオチド配列またはそのような配列のセットを作成できる。試験される配列は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、βガラクトシダーゼ(lacZ遺伝子によりコードされる)、ルシフェラーゼ(luc遺伝子によりコードされる)、緑色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼを含むがこれに限定されない、適切なレポーター遺伝子を含むベクターに挿入される。これらベクターおよびアッセイ法は、とりわけ市販の供給源から容易に利用可能である。このように構築したプラスミドを、推定標的細胞特異的TREにより制御されるレポーター遺伝子の発現を検査するために、リン酸カルシウム沈降法、エレクトロポレーション、リポソーム(リポフェクション)、およびDEAEデキストランなどの、当技術分野において既知のトランスフェクション法を用いて、適切な宿主細胞にトランスフェクトする。適切な宿主細胞としては、KU−1、MYP3(非腫瘍原性のラット尿路上皮細胞株)、804G(ラットの膀胱癌細胞株)、培養ヒト尿路上皮細胞(HUC)、HCV−29、UM−UC−3、SW780、RT4、HL60、KG−1、およびKG−1Aを含むがこれに限定されない、任意の尿路上皮細胞型が含まれる。LNCaP、HBL−100、HLF、HLE、3T3、Hep3B、HuH7、CADO−LC9およびHeLaなどの非尿路上皮細胞が対照として使われる。結果は、標準的な方法を用いてレポーター遺伝子の発現レベルを測定することで得られる。尿路上皮細胞および対照の間での発現の比較が、転写活性の有無を示す。
【0177】
様々な尿路上皮細胞特異的TRE間の比較は、単一の尿路上皮細胞株内の発現レベルを測定および比較することにより評価可能である。尿路上皮細胞特異的TREの絶対転写活性は、標的細胞の性質、送達様式および尿路上皮細胞特異的TREの型、ならびに選択的に転写が活性化されるコード配列などの、いくつかの要因に依存すると考えられることが理解される。使われた様々なプラスミドの大きさを補償する(compensate)ため、活性はトランスフェクトされたプラスミドのモルあたりの相対活性として表される。または、転写(すなわちmRNA)のレベルは、標準的なノーザン解析およびハイブリダイゼーション技法を用いて測定可能である。トランスフェクションのレベル(すなわちトランスフェクション効率)は、CMV即時型プロモーターのような異なるTREの制御下で、異なるレポーター遺伝子をコードするプラスミドを同時トランスフェクトすることで測定される。この解析はまた、負の調節領域、すなわちサイレンサーを示すことも出来る。
【0178】
または、推定尿路上皮細胞特異的TREを、尿路上皮細胞特異的TREを機能させる細胞に対してアデノウイルスの複製の優先性をもたらす能力について評価することができる。このアッセイ法のため、推定尿路上皮細胞特異的TREに機能的に連結された複製に必須なアデノウイルス遺伝子を含む構築物が、尿路上皮細胞へトランスフェクトされる。これらの細胞におけるウイルスの複製は、例えばこれらの細胞中の野生型のアデノウイルスによるウイルスの複製および/または非尿路上皮細胞における構築物によるウイルスの複製と比較される。
【0179】
TREの構成
本発明で使われるTREは、様々な構成で存在することが可能である。あるTREは多量体を含むことが可能である。例えば、あるTREは少なくとも二つ、少なくとも三つ、少なくとも四つ、または少なくとも五つの、連続した直列の標的細胞特異的TREを含むことが可能である。これらの多量体はまた、異種プロモーターおよび/またはエンハンサー配列を含んでもよい。
【0180】
選択的に、転写終結因子または転写「サイレンサー」を、標的細胞特異的TREの上流に配置することができ、したがって標的細胞特異的TREの転写制御下において、コードセグメントの望ましくない読み過ごし転写が予防される。さらに選択的には、標的細胞特異的TREの転写制御下に位置するべきコードセグメントの内在性プロモーターを欠失させることができる。
【0181】
標的細胞特異的TREはサイレンサーを欠失してもよいし、欠失しなくてもよい。サイレンサー(すなわち負の制御因子)の存在は、非許容(non−permissive)細胞(すなわち非標的細胞)において転写(およびしたがって複製)の停止を補助しうる。したがって、サイレンサーの存在は、非標的細胞におけるアデノウイルスベクターの複製をより効果的に妨げることにより、標的細胞特異的複製の増強をもたらしうる。または、サイレンサーの欠如は、標的細胞における効率的な複製を補助しうり、したがって標的細胞におけるより効率的な複製による標的細胞特異的複製の増強をもたらす。
【0182】
また本発明は、二次mRNAの翻訳がIRESと関連する、バイシストロニックmRNAの転写を調節する標的細胞特異的TREを含むことが理解される。アデノウイルスベクターはさらに、標的細胞特異的TREと同じ遺伝子に機能的に連結されてもよいし、連結されなくてもよい、追加の異種TREを含みうる。例えば、TRE(例えば細胞型特異的なまたは細胞状態特異的なTRE)は、標的細胞特異的TREの第二の型と並列し得る。「並列する」とは、標的細胞特異的TREおよび第二のTREが同じ遺伝子の転写を制御する、という意味である。これらの態様として、標的細胞特異的TREおよび第二TREは、以下を含む配置でよいが、これに限定されない:(a)互いに隣り合う(すなわち隣接している);(b)両方とも、転写を制御される遺伝子の5’側である(すなわち両者の間に介在配列が存在し得る);(c)一つのTREは遺伝子の5’側でありもう一方のTREは3’側である。
【0183】
当業者において容易に認識されるように、標的細胞特異的TREはポリヌクレオチド配列であり、様々な配列順列について機能を示すことが可能である。ヌクレオチドの置換、付加、および欠失の方法が当技術分野において知られており、容易に利用可能な機能測定法(CATまたはルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ法など)は、当業者が配列変種(valiant)が標的細胞特異的転写機能に必要であることが示されるか否かを決定することを可能にする。それゆえ本発明はまた、核酸の置換、付加および/または欠失を含む、本明細書で開示されたTRE核酸配列の機能を保持した変種も含んでいる。本明細書で開示される配列の変種は、本明細書で開示された任意の尿路上皮細胞特異的TRE配列に対して、例えば、好ましくはミスマッチ = 2、オープンギャップ = 0、エクステンドギャップ = 2のデフォルトパラメータを用いた、ALIGN Plus(Scientific and Educational Software、Pennsylvania)による測定により、80%、85%、90%、95%、98%、99%またはそれを上回る同一性を有しうる。標的細胞特異的TRE配列の変種はまた、本明細書で開示された任意の標的細胞特異的TRE配列に対して、68℃で0.1×SSCという高ストリンジェンシーにおいてハイブリダイズし得る。
【0184】
ハイブリダイゼーションの条件に関しては、本明細書で開示されたTRE配列にハイブリダイズする能力により配列が決定されるならば、必要な配列同一性が高いほど、ハイブリダイゼーションの条件はよりストリンジェントになる。すなわち本発明はまた、本明細書で開示されたTREの少なくとも連続した約15ヌクレオチド(またはそれ以上、例えば連続した23ヌクレオチド、35ヌクレオチド、50ヌクレオチド、75ヌクレオチド、または100ヌクレオチド)を含む配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを含む。ハイブリダイゼーションの条件はストリンジェントであると考えられる:すなわち、80℃(またはより高い温度)および6M SSC(またはより低濃度のSSC)など。別のストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件のセットとしては、68℃および0.1×SSCが挙げられる。ハイブリダイゼーション反応に関する考察については、下記を参照されたい。
【0185】
ハイブリダイゼーション反応を、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で実施することが可能である。当技術分野において公知かつ公表されている、ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増大させる条件としては、例えば、サムブルック(Sambrook)ら(1989)のp7.52を参照されたい。(ストリンジェンシーを増大させるための)関連のある条件の例には以下が含まれる:インキュベーション温度 25℃、37℃、50℃、および68℃;緩衝液の濃度 10×SSC、6×SSC、1×SSC、0.1×SSC(SSCが0.15M塩化ナトリウムおよび15mMのクエン酸緩衝液である場合)および他の緩衝液系を用いたそれらの等価物;ホルムアミド濃度 0%、25%、50%、および75%;インキュベーション時間 5分から24時間まで;洗浄段階 1回、2回またはそれ以上;洗浄インキュベーション時間 1分、2分または15分;ならびに洗浄液 6×SSC、1×SSC、0.1×SSCまたは脱イオン水。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例示的なセットは、68℃および0.1×SSCである。
【0186】
「Tm」とは、実験の条件下で、ワトソンクリック塩基対による逆平行方向に水素結合した相補鎖により作製されたポリヌクレオチドの二重鎖の50%が、単鎖へと解離する時の摂氏温度である。Tmは以下のような標準的な公式にしたがい推定され得る:
【数1】
Tm=81.5 + 16.6log[X+] + 0.41(%G/C)− 0.61(%F)− 600/L
式中、[X+]は陽イオン(通常はナトリウムイオン、Na+)の濃度mol/L、(%G/C)は二重鎖における全残基に対する割合としてのGおよびC残基の数、(%F)は溶液中のホルムアミドの割合(wt/vol)、Lは二重鎖の各鎖におけるヌクレオチド数である。
【0187】
特定の理論に縛られるわけではないが、本発明者らは、ある修飾により発現レベルの増加を含む発現レベルの結果を変調しうると述べている。発現レベルの結果の変調、好ましくは発現レベルの増加の達成は、癌がより攻撃的な型である場合、または(例えば個体の免疫無防備状態により)より速いおよび/もしくは攻撃的な細胞殺傷パターンが確認されている場合などにおいては、特に望ましい。
【0188】
TRE活性の測定
TRE活性は例えば下記のように測定が可能である。TREのポリヌクレオチド配列またはそのような配列のセットを、化学合成、部位特異的変異誘発、PCRおよび/または組み換え法などの、当技術分野において既知の方法を用いて作成することが出来る。試験される配列を、プロモーター(TREにプロモーター因子が存在しない場合)および、以下を含むがこれに限定されない、レポータータンパク質をコードする適切なレポーター遺伝子を含むベクターに挿入できる:クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、βガラクトシダーゼ(lacZ遺伝子によりコードされる)、ルシフェラーゼ(luc遺伝子によりコードされる)、アルカリホスファターゼ(AP)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、および西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)。これらのベクターおよびアッセイ法は、とりわけ市販の供給源から、容易に利用可能である。このように作製したプラスミドを、推定TREにより制御されるレポーター遺伝子の発現について試験するために、リン酸カルシウム沈降法、エレクトロポレーション、リポソーム、DEAEデキストラン媒介性移入、微粒子銃または直接注入などの当技術分野において既知のトランスフェクション法を用いて、適切な宿主細胞にトランスフェクトする。TRE活性は、レポーター遺伝子由来のmRNAおよび/またはタンパク質の検出および/または定量により測定される。レポータータンパク質産物は、直接(例えば免疫化学的に)、または、もしあれば適切な基質を用いてその酵素活性を通じて、検出可能である。一般的に、TREの細胞特異的活性を決定するには、TREレポーター遺伝子構築物を様々な細胞型へ導入する。おのおのの細胞型におけるTRE活性量を測定し、TREを欠くレポーター遺伝子構築物の活性量と比較する。もし、異なる細胞型と比較して、一つの細胞型が選択的に機能的であるならば、TREは細胞特異的であると決定される。
【0189】
アデノウイルス初期遺伝子
本発明のアデノウイルスベクターは、第二遺伝子がIRESの翻訳制御下にある、標的細胞特異的TREの制御下で共転写される二つ以上の遺伝子を含む。一つまたは複数の遺伝子はアデノウイルスの遺伝子であってよく、好ましくは複製に必須のアデノウイルス遺伝子である。E1A、E1B、E2、E4または任意の後期遺伝子など、アデノウイルス複製に必須の任意の遺伝子が有用である。アデノウイルスはまたE3も含んでもよい。さらに、一つまたは複数の遺伝子が導入遺伝子または異種遺伝子であることが可能である。任意の様々なアデノウイルス血清型が利用可能であり、例えばAd2、Ad5、Ad12およびAd40が利用可能である。説明の目的のため、本明細書においてはAd5血清型を例示する。
【0190】
E1A遺伝子はウイルス感染直後(0時間から2時間の間)、他のどのウイルス遺伝子よりも前に発現する。E1Aタンパク質は、トランス作用性の正の転写調節因子で、他の初期ウイルス遺伝子E1B、E2、E3、E4およびプロモーター近位の主要後期遺伝子の発現に必要とされる。その名称にも関わらず、主要な後期プロモーターにより発現するプロモーター近位遺伝子もまた、Ad5感染後の初期の間に発現する。フリント(Flint)(1982)Biochem. Biophys. Acta 651:175−208;フリント(Flint)(1986)Advances Virus Research 31:169−228およびグランド(Grand)(1987)Biochem. J. 241:25−38を参照されたい。機能的E1A遺伝子の非存在下では、ウイルスDNAの複製に必要な遺伝子産物が産生されないために、ウイルス感染は進行しない。ネビンス(Nevins)(1989)Adv. Virus Res. 31:35−81を参照されたい。ウイルスゲノム中で、Ad5 E1Aの転写開始点は498の位置で、E1Aタンパク質のATG開始点は560の位置である。
【0191】
E1Bタンパク質は、後期mRNAが核から細胞質へ輸送されるのにトランスで必要である。E1B発現の欠損は、後期ウイルスタンパク質の発現を弱め、宿主細胞のタンパク質合成を止めることが出来なくなる。E1Bのプロモーターは、Ad40とAd5の宿主の間における違いを決定する因子として関連づけられている:臨床的にAd40は腸内ウイルスである一方、Ad5は急性結膜炎の原因となる。バイリー(Bailey)ら(1993)Virology 193:631;バイリー(Bailey)ら(1994)Virology 202:695−706を参照されたい。Ad5のE1Bプロモーターは、一つのSp1およびTATAボックスに対する高親和性認識部位から成り、Ad5の1636位から1701位のヌクレオチドにおよぶ。
【0192】
アデノウイルスE1B 19kDa(19K)タンパク質は、アポトーシスの強力な阻害因子であり、E1Aと協同で一次細胞の発癌性の形質転換を起こす(Raoら、1992、Cell Biology、89:7742−7746)。増殖性アデノウイルスの感染の間、E1Aは宿主細胞のDNA合成を刺激し、それにより細胞に細胞周期の異常進行をもたらす。細胞周期の脱制御(deregulation)に応答して、宿主細胞はアポトーシスを起こす。防御機構として、E1B 19kDaタンパク質はこのE1A誘導性アポトーシスを阻害し、細胞が自殺を図る前にウイルス子孫の構築の完了を可能にする。E1B 19kDaは複数の機構により抗アポトーシス機能を実行する。E1B 19kDaは例えばE1a、p53、TNFを含む複数の刺激によるアポトーシスを阻害する。野生型Ad5では、E1B 19kDaの領域は1714位から2244位の間に位置する。E1B 19−Kda領域については例えばラオ(Rao)らProc. Natl. Acad. Sci. USA、89:7742−7746などに記載されている。
【0193】
好ましい態様において、E1Aの上流に細胞特異的TREを位置させ、E1AとE1Bの間に内部リボソーム接近部位を位置させることにより、細胞特異的な様式でAdゲノムのE1AおよびE1Bの領域の発現が細胞特異的に促進される。
【0194】
アデノウイルスのE2領域は、72kD DNA結合タンパク質、80kD 前駆終結タンパク質、およびウイルス性DNAポリメラーゼを含むアデノウイルスゲノムの複製に関係するタンパク質をコードする。Ad5のE2領域は、それぞれ初期E2(E2 early)および後期E2(E2 late)と名付けられ、76.0マップ単位および72.0マップ単位にマッピングされた二つのプロモーターから、右方向へ転写される。後期E2プロモーターが感染後期の間に一時的に活性であり、E1Aトランス活性化タンパク質に依存しないのに対して、初期E2プロモーターはウイルス複製の初期の間に重要である。
【0195】
Ad5の初期E2プロモーターは、27,050位から27,150位のヌクレオチドの間に位置し、主要なおよび重要でない転写開始点(後者はE2の転写の約5%を占める)、二つの非正準(non−canonical)TATAボックス、二つのE2F転写因子結合部位、およびATF転写因子結合部位から成る。E2プロモーターの構造の詳細についてはスワミナサン(Swaminathan)ら(1995)Curr. Topics in Micro. and Imm. 199、第三巻、177−194を参照されたい。
【0196】
後期E2プロモーターは反対鎖(counterstrand)にコードされる遺伝子のコード配列と重複しており、したがって遺伝子操作に適さない。しかし、初期E2プロモーターは反対鎖における33kDのタンパク質をコードする配列と数塩基のみ重複している。特に、SpeI制限酵素部位(Ad5の27,082位)は上述の33kDタンパク質の終止コドンの一部であり、便利なことに主要な初期E2転写開始点およびTATAボックスと、E2fおよびATF結合部位上流から分割している。したがってSpeI末端をもつ異種TREをSpeI部位に挿入することで、Ad5の内在性の初期E2プロモーターが破壊され、E2転写のTRE制御性発現が可能になる。
【0197】
E3領域とは、E3産物をコードするアデノウイルスゲノム中の領域を指す。E3領域については、例えばウォルズ(Wold)ら(1995)Curr. Topics Microbiol. Immunol. 199:237−274を含む、様々な出版物で説明されている。一般的にE3領域は、アデノウイルスゲノムの約28583位から約30470位のヌクレオチドの間に位置している。本発明で利用するためのE3領域は、任意の血清型のアデノウイルスに由来しうる。E3配列はE3領域由来の配列を含むポリヌクレオチド配列である。いくつかの態様において配列はADPをコードする。その他の態様において、配列はADP以外をコードし、ADPのみをコードする配列は除外される。当技術分野においてよく知られているように、ADPコード領域は、Yリーダーを含む、約29468bpから約29773bpのアデノウイルスゲノム内のE3領域に位置し、ADPの位置はAd5では約28375bpから約29773bpである。その他の血清型におけるその他のADP領域も当技術分野において既知である。E3配列は欠失、挿入、融合、および置換を含むが、これに限定されない。E3配列はまた、E3領域、またはE3領域の一部を含みうる。「E3配列」は「E3領域」に限定されないため、本明細書における「E3領域」または「E3配列」についてのどちらかの記載は、この単語が互換的であることを示さない。本発明を目的とした機能的E3配列の決定のためのアッセイ法に関しては、本明細書で記載されている。
【0198】
E4遺伝子は多くの転写産物をもち、2つのポリペプチド(オープンリーディングフレーム(ORF)3および6の産物をコードする。これらは細胞転写因子であるE2F−1およびDP−1のヘテロニ量体と相互作用することで、ウイルスゲノムDNA複製の刺激、および後期遺伝子発現の刺激を行う。ORF6タンパク質が活性のためにE1B 55kDタンパク質との相互作用を必要とするのに対し、ORF3タンパク質は必要としない。ORF3およびORF6がコードする機能的タンパク質の非存在下では、プラーク形成の効率は野生型ウイルスと比べて10−6未満である。
【0199】
細胞特異的な複製をさらに増加させるために、E4 ORF6遺伝子産物とE1B 55kDタンパク質間の相互作用の利点を利用することが可能である。例えば、E4 ORF1−3を欠失させた場合、ウイルスDNA複製および後期遺伝子の合成は、E4 ORF6タンパク質に依存するようになる。E1B領域が細胞特異的TREにより制御されるベクター内におけるそのような欠失を作製することにより、E1BおよびE4の両機能が、E1Bを制御する細胞特異的TREに依存するようなウイルスが得られる。
【0200】
開示されるベクターに関連する後期遺伝子は、ウイルス粒子のタンパク質をコードするL1、L2、およびL3である。これらの遺伝子(典型的には構造タンパク質をコードする)は全て、アデノウイルスの複製に必要であると考えられる。全ての後期遺伝子は、Ad5の5986位から6048位の間に位置する主要後期プロモーター(MLP)の制御下にある。
【0201】
一つの態様において、アデノウイルス初期遺伝子は細胞特異的異種TREの転写制御下にある。さらなる態様において、初期遺伝子は、E1A、E1B、E2、E3、およびE4を含む群より選択される。別の態様において、アデノウイルス後期遺伝子は、細胞特異的異種TREの転写制御下にある。さらなる態様において、二つ以上の初期遺伝子が、同じ標的細胞内で機能する異種TREの制御下にある。異種TREは同一でも異なっていてもよく、または一方が他方の変種でもよい。さらなる態様において、二つ以上の後期遺伝子が、同じ標的細胞内で機能する異種TREの制御下にある。異種TREは同一でも異なっていてもよく、または一方が他方の変種でもよい。さらに別の態様において、一つまたは複数の初期遺伝子および一つまたは複数の後期遺伝子が、同じまたは異なる異種TREの転写制御下にあり、ここでTREは同じ標的細胞内で機能する。
【0202】
本発明のいくつかの態様において、アデノウイルスベクターは必須E1A遺伝子を含み、E1Aプロモーターが除去されている。その他の態様において、アデノウイルスベクターは必須E1A遺伝子を含み、E1AエンハンサーIが除去されている。またさらにその他の態様において、E1Aプロモーターが除去され、かつE1AエンハンサーIが除去されている。その他の態様において、(E1Bは翻訳的に結合されるように)内部リボソーム接近部位(IRES)がE1Bの上流に挿入され、標的細胞特異的TREはE1Aに機能的に連結される。さらにその他の態様において、(E1Bが翻訳的に結合されるように)IRESはE1Bの上流に挿入され、標的細胞特異的TREはE1Aに機能的に連結され、これによりE1Aプロモーターおよび/またはエンハンサーIは維持されてもよく、されなくてもよい(すなわち、E1Aプロモーターおよび/またはエンハンサーIの除去は可能であるが、必須ではない)。さらにその他の態様においてE1Bの19kDa領域が除去される。
【0203】
IRESの制御下にある第二遺伝子を含むアデノウイルスベクターとしては、内在性プロモーターが第二遺伝子の転写を妨害しないように、IRESの転写制御下にある遺伝子の内在性プロモーターが除去されていることが好ましい。もしIRESが開始コドンを含むならば、第二遺伝子はIRESと同じフレーム内であることが好ましい。IRES内にATGのような開始コドンが含まれるなら、第二遺伝子の開始コドンが除去され、かつIRESと第二遺伝子がインフレームであることが好ましい。または、IRESが開始コドンを含まない場合、またはIRESから開始コドンが除去されている場合には、第二遺伝子の開始コドンが使われる。
【0204】
アデノウイルス死タンパク質(ADP)遺伝子および遺伝子産物
アデノウイルスベクターの構築において、一つまたは複数のTREおよび/もしくは導入遺伝子の挿入を促進するために、E3領域はしばしば除去される。しかしいくつかの態様において、E3領域内にコードされるアデノウイルス死タンパク質(ADP)は、アデノウイルスベクター内に保持される。ADP遺伝子は主要後期プロモーター(MLP)の制御下にあり、宿主細胞の溶解促進に重要なタンパク質(ADP)をコードすると考えられる。トレフソン(Tollesfson)ら(1992)J. Virol. 66:3633;およびトレフソン(Tollesfson)ら(1996)J. Virol. 70:2296を参照されたい。したがって、ウイルスベクターにADP遺伝子を含めることは、ベクターをより強力にし、より効率的な治療および/または必要な投与量の低下を可能にする。
【0205】
ADPをコードする配列は、PCRなどの当技術分野における既知の技術を利用して、好ましくは(Ad2が、ADPが最も完全に特徴づけられている株であるため)Ad2より得られる。好ましくはYリーダー(後期遺伝子の正確な発現に重要な配列である)を得て、ADPをコードする配列と機能的に連結させて配置する。さらに(Yリーダーを含む、または含まない)ADPコード配列は、ADPコード配列の発現がMLPにより行われるような、例えばE3領域などのアデノウイルスゲノム内へ導入される。ADPをコードする配列はもちろん、E4領域などアデノウイルスゲノムのその他の位置にも挿入されうる。またADPをコードする配列は、その他のウイルスTREまたは標的細胞特異的TRE(下記を参照されたい)を含むがこれに限定されない異種TREと、機能的に連結されうる。別の態様において、ADP遺伝子は、その翻訳がIRESと関連しているようなマルチシストロニックなmRNAの一部として転写されるような、ウイルスゲノム中に存在する。
【0206】
E3を含む標的細胞特異的アデノウイルスベクター
いくつかの態様において、アデノウイルスベクターはE3領域またはE3領域の一部を含む。アデノウイルスのE3領域を含めることにより、本発明の標的細胞特異的アデノウイルスベクターの細胞毒性を増強させることが可能である。E3領域を含むアデノウイルスベクターは、高レベルの特異性を維持し得、E3領域を欠くベクターと比べて、インビボにおいて(a)細胞毒性が有意に高く、(b)細胞外ウイルス収量を含むより高いウイルス収量を産生し、(c)より大きなプラークを形成し、(d)より迅速な細胞死をもたらし、(e)腫瘍をより効果的に殺し得る。本発明のアデノウイルスベクターはE3領域またはE3領域の一部を含んでもよい。E3が含まれると、例えば複製および合成の増加など、アデノウイルスベクターにおける機能性が観察可能かつ測定可能になるので、E3の機能的に等価な変腫(機能性が本質的に維持され、保存され、または増強されもしくは減少されたりさえする)を作製し得ることが理解される。例えばE3の一部などが使われ得る。一部は包含的でなく(non−inclusively)、以下のどちらかでありうる:(a)好ましくは3’末端における、欠失;(b)E3の一つまたは複数の様々なオープンリーディングフレームの包含。Ad−E3領域にコードされる以下の五つのタンパク質が同定され特徴づけされている。(1)19kDaの糖タンパク質(gp19k)はアデノウイルスの初期タンパク質の中で最も豊富なものの一つで、主要組織適合複合体I型分子の細胞表面への輸送を阻害し、したがってペプチド認識および細胞毒性Tリンパ球(CTL)によるAd感染細胞の排除の両方に障害を与えることが知られている。(2)E3 14.7kタンパク質およびE3 10.4k/14.5kのタンパク質複合体は、腫瘍壊死因子(TNF)が媒介する細胞毒性および炎症性の応答を阻害する。(3)E3 10.4k/14.5kタンパク質複合体は、炎症を阻害しうり、かつ効率的なウイルスの複製のための静止状態の感染細胞を活性化しうる、表皮増殖因子受容体を下方制御する。(4)アデノウイルス2および5由来のE3 11.6kタンパク質(アデノウイルス死タンパク質、ADP)は、細胞死および感染細胞からのウイルスの放出を促進すると考えられる。E3がコードする3つのタンパク質(3.6k、6.7k、および12.5k)の機能は知られていない。分子量7.5kDaの9番目のタンパク質が存在することが想定されているが、野生型アデノウイルスに感染した細胞内では検出されていない。ウォルズ(Wold)ら(1995)Curr. Topics Microbiol. Immunol. 199:237−274を参照されたい。E3領域は図6に模式的に示されている。これらの完全なE3、その一部、またはその変種は、当技術分野における標準的な知見または技術を用いることで、容易に構築され得る。完全なE3領域を用いることが好ましい。
【0207】
本発明のアデノウイルスベクターにおいて、E3は、天然のアデノウイルスの転写調節因子による転写制御下にあってもよいし、なくてもよい。E3プロモーターは、アデノウイルスの血清型間で高度に保存されている必須タンパク質であるウイルス粒子タンパク質VIIIのコード配列内に位置している。いくつかの態様においてE3は、標的細胞特異的TREを含むがこれに限定されない、異種TREの転写制御下にある。すなわちある態様において本発明は、標的細胞特異的なTREの転写制御下にあるE3領域(またはE3の一部)を含むアデノウイルスベクター、好ましくは複製受容能のあるアデノウイルスベクターを提供する。他の態様において、E3領域は天然のアデノウイルスTREの転写制御下にあり、さらにベクターは標的細胞特異的TREの転写制御下にあって複製に必須なアデノウイルス遺伝子から成る。他の態様において、E3領域は標的細胞特異的TREの転写制御下にあり、さらにベクターは標的細胞特異的TREの転写制御下にあって複製に必須なアデノウイルス遺伝子を含む。
【0208】
標的細胞特異的TREの転写制御下にある導入遺伝子
本発明によって、標的細胞特異的TREの制御下にある一つまたは複数のアデノウイルス遺伝子に加えて、導入遺伝子もまた標的細胞特異的TREの制御下、および選択的にIRESの翻訳制御下にある様々なその他の複製受容能のあるアデノウイルスベクターが作製可能である。導入遺伝子は、治療的導入遺伝子およびレポーター遺伝子を含むが、これに限定されない。
【0209】
レポーター遺伝子
例えば標的細胞特異的TREを、E1AまたはE1Bなどの初期遺伝子のすぐ上流に、かつこれに機能的に連結させて、アデノウイルスベクターへ導入することが可能である。さらにこの構築物は、IRESの翻訳制御下にある第二の共転写遺伝子を含んでもよい。第二遺伝子はレポーター遺伝子であり得る。レポーター遺伝子は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、βガラクトシダーゼ(lacZ遺伝子によりコードされる)、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、緑色蛍光タンパク質、西洋ワサビペルオキシダーゼを含むがこれに限定されない、適切なレポータータンパク質をコードすることが可能である。生物試料内の推定癌細胞の検出のため、生物試料は、レポーター遺伝子(例えばルシフェラーゼ)が標的細胞特異的TREの制御下にある、修飾アデノウイルスとともに処理され得る。標的細胞特異的TREの機能を可能にする細胞内において、標的細胞特異的TREは転写的に活発であると考えられ、ルシフェラーゼが産生されると考えられる。この産生が、例えばヒト宿主または生物試料内の癌細胞を含む標的細胞の検出を可能にすると考えられる。または、条件付きで生存に必須である産物(例えば抗生物質耐性マーカー)をコードする遺伝子が標的細胞特異的TREの転写制御下にあるような、アデノウイルスを構築することが可能である。このアデノウイルスが生物試料内へ導入されると、標的細胞は抗生物質耐性になると考えられる。その後、非癌性の細胞を殺すために抗生物質を培地へ導入することが可能である。
【0210】
治療用導入遺伝子
導入遺伝子はまた、望ましくない標的細胞を排除するように細胞毒性を増強するなど、治療上の効果をもたらし得る遺伝子を含む。このように様々な遺伝的能力が標的細胞、特に癌細胞へ導入され得る。例えばある場合においては、例えば癌性標的細胞の相対的な不応性または特別な病原力に起因して、細胞毒性活性の程度および/または速度を増強することが望ましい可能性がある。これは、標的細胞特異的な細胞毒性活性を、例えばHSV−tkおよび/またはシトシンデアミナーゼ(cd)の細胞特異的発現と共役させることで達成することが可能であり、5−フルオロシトシン(5−FC)を代謝することができる細胞を、化学療法剤5−フルオロウラシル(5−FU)に与える。このような種類の導入遺伝子の利用は傍観者効果をもたらし得る。
【0211】
アデノウイルスベクターにより導入され得るその他の望ましい導入遺伝子には、ジフテリア毒素A鎖、リシン、またはアブリンなどの細胞毒性タンパク質をコードする遺伝子(Palmiterら(1987)Cell 50:435;Maxwellら(1987)Mol. Cell. Biol. 7:1576;Behringerら(1988)Genes Dev. 2:453;Messingら(1992)Neuron 8:507;Piatakら(1988)J. Biol. Chem. 263:4937;Lambら(1985)Eur. J. Biochem. 148:265;Frankelら(1989)Mol. Cell. Biol. 9:415)、アポトーシスを開始することが出来る因子をコードする遺伝子、その他の能力のうち、増殖に必須なタンパク質をコードするmRNAに向けられ得る、アンチセンス転写産物もしくはリボザイムをコードする配列、たとえば構造タンパク質、または転写因子、病原体が細胞内で増殖する際のウイルス性またはその他の病原性タンパク質、ヌクレアーゼ(例えばRNaseA)もしくはプロテアーゼ(例えばオーシン(awsin)、パパイン、プロテイナーゼK、カルボキシペプチダーゼなど)の操作された細胞内腫をコードする、またはFas遺伝子をコードする遺伝子などが含まれる。その他の関心対象の遺伝子としては、IL−1、IL−2、IL−6、IL−12、GM−CSF、G−CSF、M−CSF、IFN−α、IFN−β、IFN−χ、TNF−α、TNF−β、TGF−α、TGF−β、NGFなどの、サイトカイン、抗原、膜貫通細胞タンパク質などが含まれる。正のエフェクター遺伝子は初期に利用可能であり、複製により細胞毒性活性がおこる。
【0212】
宿主細胞
本発明はまた、本明細書に記載されたアデノウイルスベクターを含む(すなわちアデノウイルスベクターで形質転換された)宿主細胞を提供する。適切な複製起点などその宿主内での維持に必要な配列が存在する限り、原核生物および真核生物のどちらの宿主細胞も利用可能である。便宜的に、選択的マーカーもまた提供される。宿主系は当技術分野において既知であり、本明細書で詳細を記載する必要はない。原核生物の宿主細胞には細菌細胞、例えば大腸菌(E. coli)、枯草菌(B. subtilis)、マイコバクテリウム(micobacteria)が含まれる。真核宿主細胞には酵母、昆虫、トリ、植物、線虫(C. elegansまたはnematode)、および哺乳動物の宿主細胞が含まれる。菌類(酵母を含む)の宿主細胞の例には、酵母菌(S. cerevisiae)、クライベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、C. アルビカンス(albicans)およびC. グラブラタ(glabrata)を含むカンジダ(Candida)種、アスペルギルス・ニズランス(Aspergillus nidulans)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、およびヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)がある。哺乳動物細胞の例としては、ヒト培養標的細胞(HUC)、KU−1、MYP3(ラット非腫瘍原性標的細胞株)、804G(ラット膀胱腫瘍細胞株)、HCV−29、UM−UC−3、SW780、RT4、HL60、KG−1、およびKG−1Aがある。COS細胞、マウスL細胞、LNCaP細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胚腎臓(embryonic kidney)(HEK)細胞、およびアフリカミドリザル細胞、ツメガエル(Xenopus laevis)卵母細胞、または両生類起源のその他の細胞なども利用され得る。
【0213】
組成物およびキット
本発明はまた、本明細書に記載のアデノウイルスベクターを含む、医薬品の組成物を含む、組成物を含む。このような組成物は、インビボでの投与、例えばある個体における形質導入の程度および/または細胞死滅の有効性を測定する場合に有用である。組成物は、本発明のアデノウイルスベクターおよび、生理的に許容されうる緩衝剤などの適切な溶剤を含んでもよい。これらは当技術分野においてよく知られている。その他の態様において、これらの組成物はさらに薬学的に許容されうる賦形剤を含む。薬学的に許容されうる賦形剤中に、有効量の本発明のアデノウイルスベクターを含んでもよい。これらの組成物は、単位剤形の、無菌非経口溶液または懸濁液、無菌経口溶液または懸濁液、水中油型または油中水型の乳濁剤などとしての、個体への全身的なまたは局所的な投与に適している。非経口および経口の薬物送達のための製剤は、当技術分野において既知であり、「レミントン薬学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)」、第19版、Mack Publishing(1995)に記載されている。組成物はまた、凍結乾燥および/または再構成された形状の本発明のアデノウイルスベクター(アデノウイルスなどのウイルスとして封入されたものを含む)を含む。
【0214】
本発明はまた、本発明のアデノウイルスベクターを含むキットを含む。これらのキットは、診断および/またはモニターのため、好ましくはモニターのために、利用可能である。これらのキットを利用する手順を、臨床研究室、実験研究室、開業医、または私的個人により、実施することが可能である。本発明をとりいれたキットは、生検標本などの適切な生物試料において、膀胱癌細胞の存在を検出することを可能にする。
【0215】
本研究のキットは、適切に封入された本明細書に記載のアデノウイルスベクターを含む。選択的に、キットは、手順において有用な追加的組成物を提供してもよく、緩衝液、展開剤、ラベル、反応面、検出手段、対照試料、説明書、および解釈上の情報などを含むが、これに限定されない。
【0216】
本発明のアデノウイルスベクターの調製
本発明のアデノウイルスベクターを、当技術分野において標準的な組み換え技術を用いて調製できる。一般的には標的細胞特異的TREが、関心対象のアデノウイルス遺伝子、好ましくはアデノウイルス複製遺伝子、より好ましくは一つまたは複数の初期複製遺伝子(後期遺伝子も利用可能であるが)の5’側へ挿入される。標的細胞特異的TREを、(もし配列が既知であれば)オリゴヌクレオチド合成または組み換え法(PCRおよび/または制限酵素など)を利用して調製できる。天然のアデノDNA配列中の、またはPCRもしくは部位特異的変異誘発などの方法により導入された、便利な制限酵素部位は、標的細胞特異的TREのための挿入部位を提供する。すなわち、標的細胞特異的TREをアニール(すなわち挿入)するための便利な制限酵素部位を、PCRのような標準的な組み換え方法を用いてUP−TREの5’側および3’側へと操作できる。
【0217】
本発明のアデノウイルスベクターの作製に利用するためのポリヌクレオチドは、化学合成および組み換え法など、当技術分野において標準的な方法を用いて得られうり、ならびに/または生物供給源から得られうる。
【0218】
標的細胞特異的TREの制御下にある望ましい因子(例えばE1A)とともに複製に必須な因子を全て含むアデノウイルスベクターは、一方がアデノウイルスの左部分を提供し、もう一方が右部分を提供するプラスミドであり、そのうち一つまたは複数が標的細胞特異的TREの制御下にある少なくとも一つのアデノウイルス遺伝子を含む二つのプラスミドの相同組み換えまたはインビトロライゲーションにより、都合よく調製される。相同組み換えが使われた場合には、二つのプラスミドは少なくとも約500bpの配列重複を共有していなければならない。望ましくは各プラスミドは独立に操作されうり、その後、適切な補完遺伝子またはアデノウイルス増殖のための標的細胞特異的TREからの転写開始に適切な転写因子を提供する、受容能のある宿主に同時トランスフェクトされる。プラスミドは一般に、陽イオン性リポソーム(cationic liposomes)などの適切な形質導入法を用いて、293細胞などの適切な宿主細胞へ導入される。または、アデノウイルスゲノムの右部分および左部分のインビトロライゲーションを、アデノウイルスゲノムの複製に必須な全部分を含む組み換えアデノウイルス誘導体を構築するのに利用できる。バークナー(Berkner)ら(1983)Nucleic Acid Research 11:6003−6020;ブリッジ(Bridge)ら(1989)J.Virol. 63:631−638を参照されたい。
【0219】
便宜上、アデノウイルスの必須部分を提供するプラスミドが利用可能である。プラスミドpXC.1(McKinnon(1982)Gene 19:33−42)は野生型Ad5の右末端を含む。pBHG10(Bettら(1994)Microbix Biosystems Inc.、Toronto)はE3が欠失したAd5の右末端を提供する。E3の欠失により、ウイルス内に、内在性エンハンサー/プロモーターを欠失することなしに3kbの標的細胞特異的TREを挿入するための余地が提供される。E3遺伝子はE4の反対鎖(r鎖)に位置している。ベット(Bett)ら(1994)を参照されたい。または、pBHGE3(Microbix Biosystems, Inc.)の利用により、完全長のE3を含むAd5の右末端が提供される。
【0220】
初期遺伝子の操作のため、ウイルスゲノム上において、Ad5 E1Aの転写開始点は498位であり、E1AコードセグメントのATG開始点は560位である。この領域は標的細胞特異的TREの挿入に利用可能である。制限酵素部位はポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)を利用することにより導入され得り、ここで利用されるプライマーはAd5ゲノムに限定されうるか、またはAd5ゲノムDNAを保有するプラスミドの一部を含みうる。例えば、pBR322が使われる際には、プライマーはpBR322骨格中のEcoRI部位、およびAd5の1339位のXbaI部位を利用できる。その領域の中央で重複するプライマーがヌクレオチド配列の変更を導入することにより固有の制限酵素部位がもたらされるような二段階PCRを行うことにより、その部位に標的細胞特異的TREを挿入することが可能である。
【0221】
E1Bを調節するために標的細胞特異的TRE因子を挿入するのに、同様の戦略が利用可能である。Ad5のE1Bプロモーターは、Sp1およびTATAボックスに対して高親和性の単一認識部位から成る。この領域はAd5の1636位から1701位のヌクレオチドに及ぶ。標的細胞特異的TREをこの領域へ挿入することにより、E1B遺伝子の細胞特異的転写を提供することが可能である。E1Bを制御する標的細胞特異的TREを導入するための鋳型として、E1Aを調節する細胞特異的応答因子で修飾された左側領域を利用することにより、得られるアデノウイルスベクターはE1AおよびE1B両方の発現のための細胞特異的転写因子に依存すると考えられる。さらなる態様において、E1Bの19kDa領域は除去される。
【0222】
同様に、標的細胞特異的TREをE2遺伝子の上流に挿入し、その発現を細胞特異的にすることが可能である。初期E2プロモーターは、Ad5の27050位から27150位にマッピングされ、主要なおよび重要でない転写開始点(後者はE2の転写の約5%を占める)、二つの非正準TATAボックス、二つのE2F転写因子結合部位、ならびにATF転写因子結合部位(E2プロモーター構造の詳細な総説はSwaminathanら(1995)Curr. Topics in Micro. And Immunol. 199、第三巻、177−194を参照されたい)から構成される。
【0223】
後期E2プロモーターは、反対鎖にコードされる遺伝子のコード配列と重複しており、したがって遺伝子操作の影響を受けにくい。しかし、初期E2プロモーターは反対鎖の33kDのタンパク質をコードする遺伝子とほんの数塩基しか重複していない。特に、SpeI制限酵素部位(Ad5の27082位)は上述の33kDタンパク質の終止コドンの一部であり、便利なことに主要な初期E2転写開始点およびTATA結合タンパク質部位と、E2FおよびATF結合部位を分割する。したがってSpeI末端をもつ標的細胞特異的TREを第一鎖のSpeI部位に挿入することで、Ad5の内在性初期E2プロモーターは破壊され、E2の転写物が標的細胞に限定した発現をもたらすはずである。
【0224】
E4に関しては、アデノウイルスゲノムの右部分を利用しなければならない。E4転写開始点は主に約35605位に、TATAボックスは約35631位に、ORF Iの最初のAUG/CUGは約35532位にある。ビルタネン(Virtanen)ら(1984)J. Virol. 51:822−831を参照されたい。他の遺伝子に対する上述の戦略のどれかを使うことにより、UP−TREが転写開始点に対して−に導入され得る。E4領域に標的細胞特異的TREが挿入された完全長のアデノウイルスの構築には、同時トランスフェクトおよび相同組み換えがW162細胞において実施され(Weinbergら(1983)Proc. Natl. Acad. Sci. 80:5383−5386)、これによりE4タンパク質がトランスに提供され、これらのタンパク質合成における欠損を補完する。
【0225】
E3領域を含むアデノウイルス構築物を作製できる、ここでE3含有アデノウイルスプラスミド、例えばBHGE3(Microbix Biosystems Inc.、Toronto)とE3非含有アデノウイルスプラスミドの間で相同組み換えが実施される。
【0226】
または、E3領域を含むアデノウイルスベクターを、アデノウイルス構築物、またはアデノウイルスプラスミド構築物と一緒に、例えば293細胞などの細胞に導入することが可能であり、ここでこれらは、E3領域を含むアデノウイルスを産生するために相同組み換えされうる。この場合、E3含有アデノウイルスベクターおよびアデノウイルス構築物またはプラスミド構築物は、アデノウイルスの相補的な領域を含む。例えば、一方が左側、他方が右側領域を含み、相同組み換えを可能にするために十分な配列重複をもつ。
【0227】
または本発明のE3含有アデノウイルスベクターを、(例えば制限ヌクレアーゼおよび/またはPCRを用いる)標準的な組み換え法、化学合成、またはこれらの任意の組み合わせを含む、その他の従来法を用いて構築することが可能である。さらにE3領域の部分欠損を、分子生物学の標準的な技術を利用して作製することが可能である。
【0228】
IRESのベクターへの挿入は、制限酵素消化、ライゲーション、およびPCRなどを含むが、これに限定されない、当技術分野において既知でありかつ本明細書において前述の方法および技術により達成される。IRESのDNAコピーを、化学合成により、または、例えばピコルナウイルスIRESの、cDNAのコピーの作製により得ることが可能である。例えばEMCV IRESの説明についてはデュケ(Duke)ら(1995)J. Virol. 66(3):1602−9、およびVEGF IRESの説明についてはウェルツ(Huez)ら(1998)Mol. Cell. Biol. 18(11):6178−90を参照されたい。内部翻訳開始配列は、マルチシストロニックmRNA中の5’末端コード領域の上流に存在するように、ベクターゲノム内の部位へ挿入される。例えば、バイシストロニックなE1A−E1BのmRNAの産生が、標的細胞特異的TREの制御下にある、アデノウイルスベクターの好ましい態様において、E1Bプロモーターが除去されまたは不活性化され、かつIRES配列がE1AとE1Bの間に位置する。カルジオウイルスおよびある種のアフタウイルスのIRES配列は、IRESの3’末端に、リボソーム接近部位としておよび翻訳開始部位としてはたらくAUGコドンを含んでいる。したがって、タンパク質の翻訳を制御する、タンパク質の翻訳開始コドンを置換するために、この種のIRESがベクターへ導入される。しかし、エンテロウイルス/ライノウイルス型のIRES内では、IRESの3’末端のAUGはリボソーム接近のみに使われ、翻訳は下流の次のAUGコドンにおいて開始される。したがって、もしエンテロウイルス/ライノウイルスのIRESを下流コード領域の翻訳調節のためにベクター内で利用するならば、下流遺伝子のAUG(またはその他の翻訳開始コドン)をベクター構築物に残しておく。
【0229】
ポリヌクレオチドをアデノウイルス粒子へ封入する方法は当技術分野において既知であり、かつ共有されている国際出願番号第PCT/US98/04080号中でも記載されている。
【0230】
アデノウイルスベクターの送達
アデノウイルスベクターを、裸のポリヌクレオチド(通常はDNA)構築物を含むが、これに限定されない、様々な形状で用いることが可能である。またはアデノウイルスは、陽イオンリポソームまたはポリリジンなどのその他の陽イオン化合物など細胞への侵入を容易にする薬剤と複合体化された;(アデノウイルスベクターをより免疫原性にしうる)感染性アデノウイルス粒子へ封入された;HSVまたはAAVなどその他の粒子状ウイルスの型へと封入された;免疫応答を増強または抑制する薬剤(PEGなど)と複合体化された;DOTMA(商標)、DOTAP(商標)、およびポリアミンなどのインビボトランスフェクションを容易にする薬剤と混合されたポリヌクレオチド構築物を含むことができる。
【0231】
アデノウイルスポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターが(キャプシドを含む)アデノウイルス全体に封入されているならば、アデノウイルス自身は標的化を増強するためにさらに選択され得る。例えば、アデノウイルス繊維は、細胞受容体との一次接触を媒介し、向性の助けとなる。例えばアンバーグ(Amberg)ら(1997)Virol. 227:239−244を参照されたい。もし、アデノウイルス血清型の特定の亜属が、標的細胞型に向性を示す、および/または非標的細胞型への親和性を減少させたならば、そのような亜属は細胞毒性および/または細胞溶解性の細胞特異性をさらに増すために利用することが可能である。
【0232】
アデノウイルスベクターは、リポソームならびに、リン酸カルシウム沈降法、エレクトロポレーション、直接注射、および静脈内注入などの当技術分野において既知の一段階トランスフェクション法を含むがこれに限定されない、様々な方法で標的細胞へ送達され得る。送達手段は、特定のアデノウイルスベクター(形状を含む)、ならびに、標的細胞の型および局在性(すなわち細胞がインビトロであるかインビボであるか)に大部分依存する。
【0233】
封入されたアデノウイルスを使う場合、アデノウイルスベクターを、生理学的に許容可能な適切な担体で、約104から約1014の投与量で投与できる。感染多重度(multiplicity of infection)は一般に約0.001から約100の範囲であると考えられる。ポリヌクレオチド構築物(すなわちウイルスとして封入されていない)として投与する場合には、約0.01μgから約1000μgのアデノウイルスベクターを投与することが可能である。アデノウイルスベクターは、使用意図および宿主の免疫応答可能性に依存してもしくは一回または複数回投与されうり、または、複数回同時注入として投与されうる。もし免疫応答が望ましくなければ、強い免疫応答無しに投与を繰り返すことが出来るよう、様々な免疫抑制剤を使用することで免疫応答を減少させ得る。HSVなどの別のウイルスとして封入されている場合は、投与量はその特定のウイルスについての標準的な知見(例えば公表論文などから容易に得ることができる)に基づいており、かつ経験的に決定されうる。
【0234】
本発明のアデノウイルスベクターの使用法
本ベクターを、広範囲の様々な目的で使用することが可能であり、これは、望ましい、または意図される結果により変わると考えられる。すなわち、本発明は上述のアデノウイルスベクターの使用法を含む。
【0235】
一つの態様において、標的細胞特異的TREを機能させる細胞に、好ましくは標的細胞に選択的細胞毒性を与える方法が提供され、この方法はそのような細胞と本明細書記載のアデノウイルスベクターを接触させる段階を含む。細胞毒性は、色素排除法、3H−チミジン取り込み、および/または溶解などの、当技術分野における標準的アッセイ法を利用することで測定されうる。
【0236】
別の態様において、標的細胞特異的TREを機能させる細胞、好ましくは標的細胞、好ましくは癌細胞に特異的なアデノウイルスを増殖させるための方法が提供される。これらの方法は、アデノウイルスベクターを細胞と混合させ、それによってアデノウイルスを増殖させる段階を伴う。
【0237】
別の態様は、細胞混合物と本発明のアデノウイルスベクターを混合させる段階を含む、標的細胞特異的TREを細胞混合物中で機能させる細胞を殺傷する方法を提供する。細胞混合物は一般に正常細胞および宿主細胞特異的TREを機能させる癌細胞の混合物であり、インビボの混合物でもよいし、インビトロの混合物でもよい。
【0238】
本発明はまた、生物試料において、癌細胞など、標的細胞特異的TREを機能させる細胞を検出する方法を含む。これらの方法は特に、実験的または臨床的な設定のどちらにおいても、個体(すなわち哺乳動物)の臨床的および/または生理学的な条件をモニターするのに有用である。ある態様において、生物試料の細胞をアデノウイルスベクターと接触させ、アデノウイルスベクターの複製を検出する。または、試料を、レポーター遺伝子が標的細胞特異的TREの制御下にあるアデノウイルスと接触させることが可能である。そのようなアデノウイルスを生物試料に導入した場合、レポーター遺伝子の発現が、標的細胞特異的TREを機能させる細胞の存在を示す。または、細胞の生存に条件付きで必要な遺伝子が標的細胞特異的TREの制御下に位置するようなアデノウイルスを構築することが可能である。この遺伝子は、例えば抗生物質耐性をコードし得る。その後で、生物試料は抗生物質で処理される。抗生物質耐性を表す生存細胞の存在により、標的細胞特異的TREを機能させる細胞の存在が示される。適切な生物試料とは、癌細胞などの標的細胞特異的TREを機能させる細胞が存在しうる、または存在することが疑われ得るものである。一般に、哺乳動物において、適切な臨床上の試料とは、癌細胞など標的細胞特異的TREを機能させる癌性細胞の存在が疑われるものである。そのような細胞は、例えば、針生検またはその他の外科的手段により得られうる。接触させる細胞は、選択的濃縮および/または可溶化など、アッセイ条件を促進させるために処理され得る。これらの方法においては、標的細胞特異的TREを機能させる細胞は、当技術分野において標準的な、アデノウイルス増殖を検出するインビトロアッセイ法を用いて検出されうる。そのような標準的アッセイ法の例は、バースト(burst)アッセイ法(ウイルス収量を測定する)およびプラークアッセイ法(細胞あたりの感染粒子を測定する)を含むが、これに限定されない。増殖はまた、標準的な検出方法である特異的なアデノウイルスDNA複製の測定によっても検出されうる。
【0239】
本発明はまた、標的細胞の遺伝子型を修飾する方法も提供し、この方法は標的細胞を本明細書記載のアデノウイルスベクターと接触させる段階を含み、アデノウイルスベクターは細胞へ侵入する。
【0240】
本発明はさらに、腫瘍細胞、好ましくは標的細胞特異的TREを機能させる腫瘍細胞の増殖を抑制する方法を提供し、この方法は、アデノウイルスベクターが腫瘍細胞に侵入して腫瘍細胞に対して選択的な細胞毒性を示すように、腫瘍細胞を本発明のアデノウイルスベクターに接触させる段階を含む。これらの方法に関しては、アデノウイルスベクターを、(下記へ挙げたような)化学療法剤、放射線および/または抗体など、腫瘍抑制のためのその他の治療様式と組み合わせて使ってもよいし、使わなくてもよい。
【0241】
本発明はまた、個体における腫瘍細胞マーカーのレベルを低下させる方法も提供し、この方法は個体へ本発明のアデノウイルスを投与する段階を含み、アデノウイルスベクターは標的細胞特異的TREを機能させる細胞に対して選択的細胞毒性である。腫瘍細胞マーカーにはCK−20が含まれるが、これに限定されない。腫瘍細胞マーカーのレベルの測定法は当業者に公知であり、かつ腫瘍細胞マーカーに特異的な抗体を用いる酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)などの免疫学的アッセイ法を含むが、これに限定されない。一般に、生物試料は検査されるべき個体より得られ、ELISAなどの適切な測定法が生物試料に対して実施される。これらの方法では、アデノウイルスベクターは、(下記へ挙げるような)化学療法剤、放射線および/または抗体などの腫瘍抑制のためのその他の治療様式と組み合わせて使ってもよいし、使わなくてもよい。
【0242】
本発明はまた、有効量の本明細書記載のアデノウイルスベクターが個体へ投与されるような、治療方法も提供する。アデノウイルスベクターを用いた治療は、上述の癌を有する個体において示されている。また、病気が切除された個体および癌の家族歴をもつ個体など、癌(単一の細胞を含む)の発症の危険にさらされていると考えられる個体においても示される。本発明のアデノウイルスベクター投与の適切性の決定はとりわけ、血清学的徴候および組織生検の組織学的な検査などの、査定可能な臨床学的パラメータに依存すると考えられる。一般的には、薬学的に許容されうる賦形剤中にアデノウイルスベクターを含む薬学的組成物が投与される。薬学的組成物は上述である。これらの方法では、アデノウイルスベクターは、(下記へ挙げるような)化学療法剤、放射線および/または抗体などの腫瘍抑制のためのその他の治療様式と組み合わせて使ってもよいし、使わなくてもよい。
【0243】
投与されるアデノウイルスベクターの量は、アデノウイルスベクターがその他の治療様式と組み合わせて使われたかどうかはもちろん、投与経路、個体の病状、病気の病原力(aggressiveness)の程度、利用された特定の標的細胞特異的TRE、特定のベクター構築物(すなわちどのアデノウイルス遺伝子が標的細胞特異的TREの制御下にあるか)、などのいくつかの因子に依存すると考えられる。
【0244】
封入されたアデノウイルスとして投与される場合、約104から約1014、好ましくは約104から約1012、より好ましくは約104から約1010投与される。ポリヌクレオチド構築物(すなわちウイルスとして封入されていない)として投与される場合、約0.01μgから約100μg好ましくは0.1μgから約500μg、より好ましくは約0.5μgから約200μgが投与されうる。二つ以上のアデノウイルスベクターを、同時にまたは連続的に投与することが可能である。典型的には投与を、あらゆる応答をモニターしながら、定期的に行う。投与を、例えば腫瘍内、静脈内または腹腔内で行うことが可能である。
【0245】
本発明のアデノウイルスベクターは、単独で、または所望の目的を促進する化学療法剤などの他の活性剤と組み合わせて、利用することが可能である。膀胱腫瘍の増殖を抑制するのに適切な化学療法剤の例としては、カルメット−ゲラン桿菌(bacillus Calmett−Guerin;BGC)、マイトマイシン−C、シスプラチン、チオテパ、ドキソルビシン、メトトレキセート、パクリタキセル(TAXOL(商標))、イホスファミド、硝酸ガリウム、ゲムシタビン(gemcitabine)、カルボプラチン、シクロホスファミド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、フルオロウラシル、エトポシド、ブレオマイシンが挙げられる。併用治療の例としては、CISCA(シクロホスファミド、ドキソルビシン、およびシスプラチン)、CMV(シスプラチン、メトトレキセート、ビンブラスチン)、MVMJ(メトトレキセート、ビンブラスチン、ミトキサントロン、カルボプラチン)、CAP(シクロホスファミド、ドキソルビシン、シスプラチン)、MVAC(メトトレキセート、ビンブラスチン、ドキソルビシン、シスプラチン)が挙げられる。放射線もまた化学療法剤と併用されうり、例えば放射線とシスプラチンが併用され得る。化学療法剤の投与は一般的に膀胱内(膀胱へ直接)または静脈内である。
【0246】
以下の実施例は説明のために提供されるものであり、本発明を限定するものではない。
【0247】
実施例
実施例1:AFP−TREおよびEMCV IRESを含む、複製受容能のあるアデノウイルスベクターの構築
表1に記載した脳心筋炎ウイルス(ECMV)IRESを、以下のように、AFP発現細胞に特異的な複製受容能のあるアデノウイルスベクターのE1A領域とE1B領域の間に導入した。表1は、表4に列挙したプライマーA/Bにより、ノバゲン(Novagen)社のpCITEベクターからPCR増幅された519塩基対のIRESセグメントを示している。E1Aプロモーター領域内の98塩基対を、Ad5の最左側の16muを含むプラスミドであるpXC.1において欠失させた。プラスミドpXC.1(McKinnon(1982)Gene、19:33−42)は、ベクターpBR322内に末端逆反復配列、パッケージング配列、ならびにE1a遺伝子およびE1b遺伝子を含む、アデノウイルス5の22位〜5790位のヌクレオチド由来の野生型Ad5の左側の端を含む。pBHG10(Bettら(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA、91:8802−8806;Microbix Biosystems社、Tronto)は、E3が欠失した、Ad5の右末端を提供する。得られるプラスミドCP306(PCT/US98/16312)は、CP624作製のための重複PCRにおける骨格として使用した。E1aおよびE1bの間にSalI部位を配置するために、プライマーC/D、E/F(表4)を用い、pXC.1由来でありかつE1aプロモーターを欠失しているプラスミドである、CP306を増幅した。鋳型としてCP306およびプライマーC/D、E/Fを使用した1回目のPCRの後、得られた2種のDNA断片を、プライマーC/Fによる別の回の重複PCRのために一緒に混合した。重複PCR産物を、平滑末端ライゲーションによりベクターへクローニングした。得られたプラスミドCP624(表5)は、E1a/E1b遺伝子間領域に100bpの欠失を含み、この接合部にSalI部位を導入している。このプラスミド上で、内在性E1aプロモーターが欠失し、E1aポリアデニル化シグナルおよびE1bプロモーターが、SalI部位で置換されている。次にCP625のSalI断片をCP624のSalI部位にクローニングし、CP627を作製した(表5)。CP627は、EMCV IRESと結合しているアデノウイルス必須遺伝子E1aおよびE1bを有する。CP627において、一連の様々な腫瘍特異的プロモーターは、E1aの前のPinAI部位に配置され、E1発現を転写制御することができる。
【0248】
【表4】
【0249】
肝臓癌特異的ウイルスの作製のため、表3に示した約0.8kb AFPプロモーター断片を、CP627のPinAI部位へ配置し、これによりプラスミドCP686を得た。完全長ウイルスゲノムを、CP686とアデノウイルスゲノムの右腕を含むプラスミドの間の組換えにより得た。ウイルス組換えにおいて使用された右腕は、無傷のE3領域を含むpBHGE3(Microbix Biosystems社)、およびE3領域に欠失を含むpBHG11またはpBHG10(Bettら、(1994))であった。
【0250】
無傷のE3領域を含む右腕を用いたCP686の組換えにより得られたウイルスを、CV890と称した。欠失E3領域を含む右腕(pBHG10)を用いたCP686の組換えにより得られたウイルスを、CV840と称した。全てのウイルスゲノムの構造を、対応する特異的領域の診断用であるPCR増幅を行って確認した。
【0251】
従って、CV89Oと称されたアデノウイルスベクターは、0.8kb AFPプロモーター、E1A、E1Aプロモーターの欠失、EMCV IRES、E1B、E1Bプロモーターの欠失および無傷のE3領域を含む。アデノウイルスベクターCV840は、AFPプロモーター、E1A、E1Aプロモーターの欠失、EMCV IRES、E1B、E1Bプロモーターの欠失および欠失したE3領域を含む。
【0252】
【表5】
【0253】
実施例2:プロバシンTREおよびEMCV IRESを有する、複製受容能のあるアデノウイルスベクターの構築
表3に示したようなプロバシンプロモーターを、プラスミドCP627のPinAI部位へ挿入し(実施例1参照)、E1Aの上流にプロバシンプロモーター、およびE1AとE1Bの間にEMCV IRESを含むCP628を作製した。完全長ウイルスゲノムは、CP628とアデノウイルスゲノムの右腕を含むプラスミドの間の組換えにより得た。ウイルス組換えに使用した右腕は、無傷のE3領域を含むpBHGE3、およびE3領域が欠失したpBHG11またはpBHG10であった。全てのウイルスゲノムの構造を、対応する特異的領域の診断用であるPCR増幅を行い確認した。
【0254】
従って、CV834と称されるアデノウイルスは、プロバシンプロモーター、E1A、E1Aプロモーターの欠失、EMCV IRES、E1B、E1B内在性プロモーターの欠失および欠失したE3領域を含む。
【0255】
実施例3:hCMV−TREおよびEMCV IRESを有する、複製受容能のあるアデノウイルスベクターの構築
本来pCMVβ(Clonetech社、PaloAlto)起源のプラスミドCP629由来のhCMV前初期遺伝子(immediate early gene;IE)プロモーターを、プラスミドCP627のPinAI部位へ挿入し(実施例1参照)、E1Aの上流にCMV IEプロモーターおよびE1AとE1Bの間にIRESを含む、CP629を作製した。完全長ウイルスゲノムは、CP629とアデノウイルスゲノムの右腕を含むプラスミドの間の組換えにより得た。ウイルス組換えに使用した右腕は、無傷のE3領域を含むpBHGE3、およびE3領域の欠失を含むpBHG11またはpBHG10であった。全てのウイルスゲノムの構造を、対応する特異的領域の判断用であるPCR増幅を行い確認した。
【0256】
従って、CV835と称されるアデノウイルスは、hCMV−IEプロモーター、E1A、E1Aプロモーターの欠失、EMCV IRES、E1B、E1B内在性プロモーターの欠失および欠失したE3領域を含む。CV835は、hCMVエンハンサーを欠失しており、したがって組織特異的ではない。hCMV IEエンハンサー配列をCV835に添加することにより、ベクターを組織特異的とする。
【0257】
実施例4:E1発現を制御する様々なTREを用いたIRES含有アデノウイルスベクターの複製
一般に弱いプロモーターとみなされているプロバシンプロモーター(CV836およびCV834)、ならびに一般に強力なプロモーターとみなされているヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子(HCMV−IE)プロモーター(CV837およびCV835)を含むアデノウイルスベクターのウイルス複製を、ウイルス収量アッセイ法で特徴付けた。
【0258】
プロバシンプロモーターを含むアデノウイルスベクター(PCT/US98/04132参照)であるCV836およびCV834、ならびにHCMV−IEプロモーターを含むアデノウイルスベクターであるCV837およびCV835を、ウイルス複製(致死率の指標)および特異性に関する細胞株のパネルに対して試験した。293細胞株(産生株)、LNCap細胞株およびHepG2細胞株を、6ウェル組織培養プレートに、ウェル1個あたり0.5×106個となるよう播種し、37℃で24時間インキュベーションし、その後CV836、CV834またはCV837およびCV835に、2プラーク形成単位/細胞(PFU/細胞)の感染多重度(MOI)で、37℃で4時間感染した。感染期間の最後に、培地を置換して、細胞を37℃で更に72時間インキュベーションして、ユー(Yu)ら(1999)Cancer Res.、59:1498−1504により記載されたウイルス収量アッセイ法のために収集した。結果を図3に示す。
【0259】
データにより、E3領域に欠失を有する野生型AD5のようなIRESが欠如した対照ウイルスと比較して、E1AとE1Bの間の遺伝子間領域中のIRES因子の存在はウイルス複製に有意に作用しないことが明らかにされた。CV834において、組織の細胞毒性の喪失は、ウイルス構造中のプロバシンプロモーターの弱さにより引き起されると考えられる。
【0260】
実施例5:二重TREベクターの単一TRE/IRES含有ベクターとの比較
2種の肝臓癌特異的アデノウイルスベクターであるCV790およびCV733(各々、CN790およびCN733とも称される)を作製して特徴決定した。PCT/US98/04084を参照されたい。これらのウイルスは二つのAFP TREを含み、一つはE1Aの上流にあり、および一つはE1Bの上流にある。CV790は無傷のE3領域を含む一方、CV733においてはE3領域が欠失している点で、これらは異なる。これらの2種のウイルスの複製を、新たに作製したIRES含有ウイルスであるCV890およびCV840(実施例1参照)と比較した。
【0261】
ウイルス複製を、様々な細胞型において、実施例4に説明したようなウイルス収量アッセイ法を用いて比較した。細胞を各型のウイルスに感染させ、感染から72時間後、ウイルス収量をプラークアッセイ法により決定した。図4Aおよび図4Bは、様々な細胞型における様々なウイルスについてのウイルス収量を示している。結果により、E1B翻訳がIRESにより調節されている、E1AとE1Bの間にIRESを含むベクター(CV890およびCV840)は、293細胞および肝細胞癌細胞のようなAFP産生細胞において、正常なアデノウイルスおよび二重AFP TREを有するウイルスと同程度複製することが示された。SK−Hep−1(肝細胞)、PA−1細胞(卵巣癌)およびLNCaP細胞(前立腺細胞)において、IRES含有ウイルスは、二重TREまたは野生型アデノウイルスと同様に複製せず、このことは、IRES含有ウイルスが肝臓癌細胞に対しより高い特異性を有することを示唆している。これらの結果に基づいて、IRES含有ベクターは、二重TREベクターと変わらない複製レベルを有するが、より安定しており、かつより良好な標的細胞特異性を有すると結論付けられる。
【0262】
実施例6:EMCV IRESを含むウロプラキンアデノウイルス構築物
ウロプラキンII配列(マウスおよび/またはヒト)に加えEMCV内部リボソーム接近部位(IRES)を含む、多くのE3含有ウイルス構築物を調製した。これらのウイルス構築物を、表6に概略する。これらのベクターは全て、E1Aプロモーターを欠如しており、E1Aエンハンサーを保持していた。
【0263】
519塩基対のEMCV IRESセグメントを、プライマーA/Bを用いて、ノバゲン(Novagen)社のpCITEベクターからPCR増幅した:
(GTCGACはSalI部位である)。
【0264】
EMCV IRES因子を、PCR平滑末端ベクター(Invitrogen社のpCR(登録商標)平滑末端ベクター)にライゲーションした。
【0265】
CP1066
CP620由来のマウスUPIIの1.9kb(−1885位から+1位)断片を、AflIII(平滑化)およびHindIIIで消化して、XhoI(平滑化)およびHindIIIで消化したCP620由来のpGL3−Basicへ挿入し、CP1066を作製した。
【0266】
CP1086
1.9kbのマウスUPII挿入物を、PinAIで消化して、同様にPinAIで切断したCP269(E1A/E1B内在性プロモーターを欠失している、CMV駆動(driving)E1AおよびIRES駆動E1B)へライゲーションした。
【0267】
CP1087
1kb(−1128位から+1位)ヒトUPIIを、CP665からPinAIで切り出して、PinAIで切断されたCP629へ挿入し、精製した(CMV溶離のため)。
【0268】
CP1088
2.2kb(−2225位から+1位)ヒトUPIIを、CP657から、プライマー
を用いて増幅し、PinAIを用いて消化して、PinAIを用いて切断したCP629とライゲーションした。
【0269】
CP627は、E1AおよびE1Bの接合部に脳心筋炎ウイルス(EMCV)由来の内部リボソーム接近部位(IRES)を有するAd5プラスミドである。まず、CP306(Yuら、1999)を、プライマー対96.74.3/96.74.6および96.74.4/96.74.5で増幅した。
【0270】
これら2種のPCR産物を混合し、プライマー対96.74.3および96.74.5を用いて増幅した。得られたPCR産物は、E1A−E1B遺伝子間領域に100bpの欠失および接合部に新たなSalI部位を含む。EMCV IRES断片を、pCITE−3a(+)(Novagen社)から、プライマー96.74.1および96.74.2を用いて増幅した。IRESを含むSalI断片をSalI部位に配置し、バイシストロニックE1A−IRES−E1Bカセットを持つCP627を作製した。CP629は、プライマー99.120.1および99.120.2を用いてpCMVβ(Clontech社)から増幅され、CP627のPinAI部位へクローニングされたCMVプロモーターを有するプラスミドである。
【0271】
CP657は、pGL3Basic(Promega社)においてヒトUPII遺伝子の2.2kbの5’隣接領域を有するプラスミドである。2.2kb hUPIIを、プライマー100.113.1および100.113.2を用いてGenomeWalker産物からPCRにより増幅して、pGEM−TへTAクローニングし、CP655を作製した。
【0272】
SacII(平滑末端)およびKpnIを用いて消化した2.2kb挿入物を、pGL3−Basicへ、HindIII(平滑末端)およびKpnIにおいてクローニングし、CP657を作製した。
【0273】
CP1089
1kb(−965から+1)マウスUPIIを、PinAIによりCP263から消化して、PinAIで切断したCN422(E1A/E1B内在性プロモーターの欠失を有するPSE起動E1AおよびGKE起動E1B)へ挿入して、精製し、更にEagIで消化して、EagIを用いてCP669から切断した1kb(−1128位から+1位)のヒトUPIIにライゲーションした。
【0274】
CP1129
PinAI部位を有する1.8kb hUPII断片を、プライマー127.50.1および127.2.2を用いてCP657から増幅して、CP629のPinAI部位へクローニングした。
【0275】
CP1131
CP686を、CP629中のCMVプロモーターの、CP219由来のAFP断片との置換により構築した。1.4kb DNA断片を、BssHIIによる消化によりCP686から切り離し、Klenowを充填し(filling)、その後BglIIで消化した。次にこのDNA断片を、同様に切断したCP686へクローニングし、CP1199を作製した。CP1199において、E1B 19KDa領域のほとんどが欠失していた。PinAI部位を有する1.8kb hUPII断片を、プライマー127.50.1および127.2.2を用いたPCRによりCP657から増幅して、同様に消化したCP1199へ挿入し、CP1131を作製した。
【0276】
前記プラスミドを全て、pBHGE3と同時トランスフェクションし、CV874(CP1086由来)、CV875(CP1087由来)、CV876(1088由来)およびCV877(CP1089由来)、CV882(CP1129由来)ならびにCV884(CP1131由来)を作製した。CP1088、CP1129およびCP1131を、各々、CV876、CV892およびCV884構築のために、lipofectAMINE(Gibco/BRL社)により11日〜14日間pBHGE3と同時トランスフェクションした。pBHGE3は、ミクロビクス(Microbix)社から購入し、前述した。細胞を、3回の凍結融解サイクルにより溶解させ、1週間かけて293細胞においてプラーク形成させた。単一のプラークを採取して、293細胞における3日〜5日間の感染により増幅した。ウイルスDNAを、溶解物から単離して、PCRにより、E1領域で、CV876についてはプライマー31.166.1/51.176を用いて、CV882およびCV884についてはプライマー127.50.1/51.176を用いて、ならびにE3領域で、3種全てのウイルスについてプライマー32.32.1/2を用いて、構築物を確認した。
【0277】
【表6】
ウイルスを、前述のように試験して特徴付けした。
【0278】
プライマー配列:
【0279】
実施例7:チロシナーゼTREおよびEMCV IRESを有する、複製受容能のあるアデノウイルスベクターの構築
CP621は、PinAI断片にヒトチロシナーゼエンハンサー因子およびプロモーター因子を含むプラスミドである。この断片を、CP627のPinAI部位にライゲーションし、CP1078を作製した。CP1078をpBHGE3と組合せ、新規黒色腫特異的ウイルスであるCV859を作製した。表3は、チロシナーゼプロモーターおよびエンハンサーを含むPinAI断片のポリヌクレオチド配列を示している。
【0280】
実施例8:プロバシンTREおよびVEGF IRESを有する、複製受容能のあるアデノウイルスベクターの構築
実施例1に記載したのと類似した戦略を用いて、マウス血管内皮増殖因子(VEGF)遺伝子由来のIRES断片を増幅して、CP628へSalI部位でクローニングした。表1は、血管内皮増殖因子(VEGF)mRNAから入手可能なIRES断片を示している。この断片を、E1a/E1b遺伝子間領域にクローニングするために、2種の長いオリゴヌクレオチド小片(piece)を合成した。センスオリゴヌクレオチドを表に示すが、一方第二の小片は、これに対応するアンチセンスなものである。これら2種を一緒にアニーリングし二本鎖を作製した後、二本鎖をSalI消化に供し、得られた断片を、CP628上のSalI部位にクローニングした。得られたプラスミドCP630は、E1aの前にプロバシンプロモーターを、およびE1bの前にVEGF IRES因子を有する。このプラスミドを用い、VEGF IRES因子を含む前立腺癌特異的ウイルスを構築した。
【0281】
実施例9:AFP−TREおよびVEGF IRESを有する、複製受容能のあるアデノウイルスベクターの構築
実施例1に記載したのと類似した戦略を用いて、AFP TREを含むPinAI断片を得ることができる。このAFP TREを、CP628上のE1Aの前のPinAI部位にクローニングし、プラスミドCP1077を得た。このプラスミドは、E1転写制御のためのAFP TRE、および、E1b前にVEGF IRES因子を有している。CP1077を、pBHGE3を用いて組換え、CV858と称する肝臓特異的アデノウイルスを作製することができる。
【0282】
実施例10:hKLK2−TREおよびEMCV IRESを有する、複製受容能のあるアデノウイルスベクターの構築
実施例1に類似した戦略を用い、表3に示したようなヒト腺性カリクレインII由来のTRE断片を、CP627のPinAI部位へクローニングした。得られたプラスミドCP1079を、pBHGE3と同時トランスフェクションし、CV860を作製した。
【0283】
実施例11:複製受容能のある肝細胞癌特異的CV790およびドキソルビシンならびに肝細胞癌特異的CV890およびドキソルビシンを用いた、Hep3B腫瘍異種移植片の治療
CV790は、AFP産生肝細胞癌特異的なアデノウイルスであり、E3領域と同一のAFPプロモーターおよびエンハンサー(表3に示した822塩基対のプロモーター)の制御下にあるE1AおよびE1Bを有する。CV890アデノウイルス構築物もまた、822bp AFPプロモーター(制限部位に対するヌクレオチドを含む827bp)の転写制御下にある、E1A遺伝子およびE1B遺伝子を有する肝細胞癌特異的または肝臓特異的なアデノウイルス変異体であり、ここでE1Bは、EMCV IRESの転写制御下にあり、無傷のE3領域を有する。従ってCV890構造は、AFP/E1A、IRES/E1B、E2、E3、E4と読まれる。CV790およびドキソルビシンならびにCV890およびドキソルビシンの併用の効力のインビボ試験を、以下に記載した小さい変更を伴う、実施例4に詳述したプロトコールによって実行した。
【0284】
化学療法剤と併用したCV790およびCV890の試験における異種移植片として、肝臓癌Hep3B細胞を使用した。ウイルスCV790またはCV890を、ヌードマウスの尾静脈を通じて1×1011粒子の単回静脈内注射により投与した。ウイルス送達の1日後、ドキソルビシン一回量を、各動物へ、腹腔内(i.p.)注射により投与した。ドキソルビシン単独およびドキソルビシンとウイルス療法の併用の両方に関して、ドキソルビシン用量は10mg/kgであった。腫瘍体積を、6週間にわたり週1回測定した。腫瘍を、外径により2次元で毎週測定して、体積を式[長さ(mm)×幅(mm)2]/2により概算した。
【0285】
図8は、二重TREを含むCV790と比較した、IRESを含むCV890の抗腫瘍活性を示す。図8で明らかであるように、相対腫瘍体積は、CV790を投与した場合よりもCV890を投与した場合の方が少なかった。更に、肝細胞癌のCV790/ドキソルビシンおよびCV890/ドキソルビシン療法は両方とも、相乗的結果を示した。CV790/ドキソルビシンまたはCV890/ドキソルビシンのいずれかによる治療の4日後、相対腫瘍体積は、10%未満であった。ウイルス単独またはドキソルビシン単独のいずれかで治療されたマウスと異なり、CV790/ドキソルビシンまたはCV890/ドキソルビシンのいずれかで治療したマウスについての、4日後の相対腫瘍体積は増加しなかった。対照マウスにおける6日目に、相対腫瘍体積はCV790試験においておよそ1000%であり、CV890試験においておよそ600%であった。ウイルス単独で治療されたマウスの相対腫瘍体積は、250%(CV790)および520%(CV890)であるのに対し、ドキソルビシン単独で治療されたマウスについての相対腫瘍体積は450%であり、CV790試験において280%であり、CV890試験において500%であった。
【0286】
実施例12:メラノサイト特異的TRE含有アデノウイルス構築物のインビトロ特徴決定
メラノサイト細胞特異的アデノウイルスベクターの開発に際し特に有用な目的とは、黒色腫の患者を治療することである。メラノサイト特異的TREの活性を測定する方法、およびそれにより所与の細胞がメラノサイト特異的TREを機能させるかどうかを決定する方法を以下に説明する。
【0287】
細胞および培養法
例えばHepG2細胞(肝臓);Lovo細胞(結腸);LNCap細胞(前立腺);PMEL細胞(黒色腫);SKMel細胞(黒色腫);G361細胞(黒色腫)およびMeWo細胞などの宿主細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection;ATCC)(Rockville、MD)から9継代で入手した。MeWo細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS;Intergen社)、100U/mlのペニシリン、および100U/mlのストレプトマイシンを補充したRPMI 1640培地(RPMI社)において維持した。ルシフェラーゼ発現についてアッセイするMeWo細胞を、10%ストリップ(strip)−血清(T3、T4、およびステロイドを除去するためにチャコール/デキストラン処理したウシ胎仔血清;Gemini Bioproduct社、Calabases、CA)RPMI中において維持した。
【0288】
MeWo 細胞のトランスフェクション
トランスフェクションのために、MeWo細胞を、細胞密度が6cm培養皿(Falcon社、NJ)1個当り5×105個細胞になるよう、完全RPMI中に播種した。N−[1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル−N,N,N−トリメチル塩化アンモニウム(DOTAP(登録商標);Avanti Polar Lipids社、AL)およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE(商標);Avanti Polar Lipids社、AL)の1:1モル比脂質混合物と複合させた後、DNAをMeWo細胞へ導入し、DNA/脂質複合体を、血清非含有RPMIにおいて、2:1のモル比で調製した。典型的には、DNA8μg(24.2nmol)を、不完全RPMI 200μLに希釈して、50nmolのトランスフェクション用脂質を含むRPMI 200μLへと、成分の均質な混合を確実にするためにゆっくり攪拌しながら滴下した。DNA/脂質複合体を、室温で15分間アニーリングさせ、その後それらをMeWo細胞へ添加した。培地をMeWo細胞から取除いて血清非含有RPMI 1mLで置換し、DNA/脂質複合体を滴下した。細胞を、複合体と共に、37℃、5%CO2下で、4時間〜5時間インキュベーションした。培地を除去して、細胞をPBSで1回洗浄した。その後これらの細胞をトリプシン処理し、10%ストリップ−血清RPMI(フェノールレッド非含有)中で再懸濁した。細胞を、不透明な96ウェル組織培養プレート(Falcon社、NJ)に、100 μL培地につき細胞密度40,000細胞/ウェルで再度播種し、アッセイした。
【0289】
プラークアッセイ法
前述のアデノウイルス構築物がメラノサイト中で優先的に複製するかどうかを決定するために、プラークアッセイ法を行った。プラーク形成効率を、下記の細胞型について評価した:黒色腫細胞(MeWo細胞)、前立腺癌細胞株(LNCap細胞)、乳房正常細胞株(HBL−100細胞)、卵巣腫瘍細胞株(OVCAR−3細胞、SK−OV−3細胞)、およびヒト胚性腎細胞(293細胞)。293細胞株はAd5 E1AおよびE1Bタンパク質を発現するため、プラーク形成効率のための陽性対照としてはたらく。メラノサイト特異的TREを含む構築物の分析のために、上述の細胞株などの、メラノサイト特異的TREを機能させることができる細胞、およびHuH7細胞、HeLa細胞、PA−1細胞またはG361細胞などのこのように機能させない細胞を使用した。プラークアッセイ法を下記のように行った。集密細胞の単層を、感染の前に、6ウェル皿に18時間播種した。単層を、各ウイルスの10倍連続希釈液で感染させた。単層を4時間血清非含有培地(MEM)中で感染させた後、培地を取除き、0.75%低融点アガロースおよび組織培養培地の溶液で置換した。感染の2週間後、プラークをスコア化した。
【0290】
実施例13:CEA−TREおよびEMCV IRESを有する、複製受容能のあるアデノウイルスベクターの構築
実施例1に類似した戦略を用い、癌胎児性抗原(CEA)(表3、配列番号:14)由来のTRE断片を用い、CV873と称されるウイルスを構築した。CEA−TREを含むPinAI断片を、転写制御のために、E1A CP627の前のPinAI部位にクローニングした。得られたプラスミドCP1080をpBHGE3と共に用い、CV873を作製した。
【0291】
実施例14:抗腫瘍活性のインビトロおよびインビボにおけるアッセイ法
尿路上皮細胞特異的アデノウイルスベクター開発における特に有用な目的は、膀胱癌患者の治療である。実行可能性の最初の指標は、細胞株およびBalb/c nu/nuマウスにおいて皮下増殖した腫瘍異種移植片に対する細胞毒性活性についてのベクター(または複数)の試験である。
【0292】
CV876のインビトロ特徴決定
CV876 のウイルス収量アッセイ法
5×105個の293細胞、RT−4細胞、SW780細胞、PA−1細胞、G361細胞、MKN1細胞、HBL−100細胞、繊維芽細胞(肺由来)および平滑筋細胞(膀胱由来)を、6ウェルプレートの各ウェルに播種した。24時間後、培地を吸引して、MOI 2pfu/細胞でCV802(E3を有する野生型Ad5)またはCV876を含有する1mLの血清非含有RPMI 1640で置換した。37℃で4時間インキュベーションした後、細胞を予め温めたPBSで洗浄し、2mLの完全RPMI 1640を各ウェルに添加した。37℃で更に72時間放置後、これらの細胞を培地にスクラップ(scrap)して、3回の凍結融解サイクルにより溶解させた。溶解物を、ウイルス産生について、8日間〜10日間、293細胞に対し半固形アガロース下での3つ組のプラークアッセイ法で試験した。
【0293】
全ての被験細胞において良好に増殖する、野生型Ad5であるCV802とは異なり、CV876は、許容細胞(293細胞、RT−4細胞およびSW780細胞)において、非許容細胞(PA−1細胞、G361細胞、MKN1細胞、HBL−100および初代細胞)においてよりも、約100倍〜10000倍良好に複製した。注目すべきは、 SW780細胞におけるCV876の複製は、CV802の約1/100であり、これはこのウイルスの有効性の限界を示唆している。
【0294】
CV876 の増殖曲線実験
5×105個のRT−4細胞、PA−1細胞、平滑筋細胞および繊維芽細胞を、6ウェルプレートの各ウェルに播種した。24時間後、培地を吸引して、MOI 2pfu/細胞でCV802(133を有する野生型Ad5)またはCV876を含有する1mLの血清非含有RPMI 1640で置換した。37℃で4時間インキュベーションした後、細胞を予め温めたPBSで洗浄し、2mLの完全RPMI 1640を各ウェルに添加した。0時間、12時間、24時間、36時間、48時間、72時間、96時間および120時間の様々な時点で、細胞を培地にスクラップして、3回の凍結融解サイクルにより溶解させた。溶解物を、ウイルス産生について、8日間〜10日間、293細胞に対し半固形アガロース下での3つ組のプラークアッセイ法で試験した。
【0295】
ウイルス収量アッセイ法の時と非常に類似して、CV876は、RT−4細胞においてのみ良好に複製したが、初代細胞およびPA−1細胞においては120時間を超えても良好に複製しなかった。しかし、CV876は、RT−4細胞において、CV802と比べて複製の遅延を示さなかった。
【0296】
CV876 についての細胞変性効果
5×105個の293細胞、RT−4細胞、SW780細胞、PA−1細胞、MKN1細胞およびLNCap細胞を、6ウェルプレートの各ウェルに播種した。24時間後、培地を吸引して、0.001から10まで漸増するMOIにおいてCV802(E3を有する野生型Ad5)またはCV876を含有する1mLの血清非含有RPMI 1640で置換した(MOI 1でのデータは示さず)。37℃で4時間インキュベーションした後、培地を完全RPMI 1640 3mLで置換し、細胞変性作用がCV802についてMOI 0.01において認められた場合には、37℃で6日間〜8日間インキュベーションした。
【0297】
CV802は、全ての被験細胞において効力を示したのに対し、CV876は、許容細胞(293細胞、RT−4細胞およびSW780細胞)のみを殺傷し、非許容細胞(PA−1細胞、MKN−1およびLNCap細胞)は殺傷しなかった。
【0298】
CV876 についての MTT アッセイ法
2×104個の293細胞、RT−4細胞、SW780細胞、MKN1細胞、PA−1細胞、HBL−100細胞、平滑筋細胞(膀胱由来)および繊維芽細胞(肺由来)を、96ウェルプレートの各ウェルに播種した。24時間後、これらの細胞を、CV802およびCV876を含む完全RPMI 1640中で、0.001から10まで漸増するMOIにおいて感染させた。細胞増殖および生存に関する迅速比色アッセイ法を、1日目、3日目、5日目、7日目および10日目の各時点で行った。培地をMTTの1mg/ml溶液50μlで置換したが、これは肝細胞の活性ミトコンドリア内に存在する脱水素酵素により不溶性の紫色のホルマザン(formazan)に転換される。37℃で3時間〜4時間インキュベーションした後、溶液をイソプロパノールで置換して、プレートを、30℃で1時間インキュベーションして、560nm試験波長および690nm参照波長で測定した。
【0299】
CPEアッセイ法の結果と同様に、CV876は、許容細胞においてのみ効力を示し、非許容細胞においては示さなかった。また、RT−4細胞およびSW780細胞において、CV876は、CV802よりもはるかにゆっくりと細胞を殺傷した。
【0300】
CV882のインビトロ特徴決定
CV882 についてのウイルス収量アッセイ法
5×105個の293細胞、RT−4細胞、SW780細胞、G361細胞、LNCap細胞、HBL−100細胞、MKN1細胞、PA−1細胞、繊維芽細胞および平滑筋細胞を、6ウェルプレートの各ウェルに播種した。24時間後、培地を吸引して、MOI 2pfu/細胞でCV802(E3を有する野生型Ad5)またはCV882を含有する1mLの血清非含有RPMI 1640で置換した。37℃で4時間インキュベーションした後、細胞を予め温めたPBSで洗浄し、2mLの完全RPMI 1640を各ウェルに添加した。37℃で更に72時間放置後、細胞を培地にスクラップして、3回の凍結融解サイクルにより溶解させた。溶解物を、ウイルス産生について、8日間〜10日間、293細胞に対し半固形アガロース下での3つ組のプラークアッセイ法で試験した。
【0301】
許容細胞(293細胞、RT4細胞およびSW780細胞)におけるCV882の複製は、CV802と同等であったが(差は100倍未満であった)、非許容細胞(G361細胞、LNCap細胞、HBL−100細胞、MKN1細胞、PA−1細胞および初代細胞)においては、1000〜1000000倍を上回る差を示した。
【0302】
CV882 の増殖曲線実験
5×105個のRT4細胞、PA−1細胞、および繊維芽細胞を、6ウェルプレートの各ウェルに播種した。24時間後、培地を吸引して、MOI 2pfu/細胞でCV802(E3を有する野生型Ad5)またはCV882を含有する1mLの血清非含有RPMI 1640で置換した。37℃で4時間インキュベーションした後、細胞を予め温めたPBSで洗浄し、2mLの完全RPMI 1640を各ウェルに添加した。0時間、12時間、24時間、36時間、48時間、72時間、96時間および120時間の様々な時点で、細胞を培地にスクラップして、3回の凍結融解サイクルにより溶解させた。溶解物を、ウイルス産生について、8日間〜10日間、293細胞に対し半固形アガロース下での3つ組のプラークアッセイ法で試験した。
【0303】
ウイルス収量アッセイ法の時と非常に類似して、CV882は、RT−4細胞においてのみ良好に複製したが、初代細胞およびPA−1細胞においては120時間を超えても良好に複製しなかった。加えて、CV882は、RT−4細胞において、CV876と比べてより良好な複製を示した。
【0304】
CV882 についての細胞変性効果
5×105個の293細胞、RT−4細胞、SW780細胞、HBL−100細胞、G361細胞、PA−1細胞および繊維芽細胞を、6ウェルプレートの各ウェルに播種した。24時間後、培地を吸引して、0.001から10まで漸増するMOIにおいてCV802(E3を有する野生型Ad5)またはCV882を含有する1mLの血清非含有RPMI 1640で置換した(MOI 1でのデータは示さず)。37℃で4時間インキュベーションした後、培地を、完全RPMI 1640 3mLで置換し、細胞変性作用がCV802についてMOI 0.01において認められた場合には、37℃で6日間〜8日間インキュベーションした。
【0305】
CV802が全ての被験細胞において効力を示したのに対し、CV882は、許容細胞(293細胞、RT−4細胞およびSW780細胞)のみを殺傷し、非許容細胞(HBL−100、G361細胞、PA−1細胞および繊維芽細胞)を殺傷しなかった。
【0306】
CV882 についての MTT アッセイ法
2×104個のRT−4細胞、SW780細胞、PA−1細胞、HBL−100細胞、U118細胞および繊維芽細胞を、96ウェルプレートの各ウェルに播種した。24時間後、細胞を、CV802およびCV882で、完全RPMI 1640中で、0.001から10まで漸増するMOIにおいて感染させた。細胞増殖および生存に関する迅速な比色アッセイ法を、1日目、3日目、5日目、7日目および10日目の各時点で行った。培地を、MTTの1mg/ml溶液50μlで置換したが、これは肝細胞の活性ミトコンドリア内に存在する脱水素酵素により不溶性の紫色のホルマザンに転換される。37℃で3時間〜4時間インキュベーションした後、溶液をイソプロパノールで置換して、プレートを、30℃で1時間インキュベーションして、560nm試験波長および690nm参照波長で測定した。
【0307】
CPEアッセイ法の結果と同様に、CV882は、許容細胞においてのみ効力を示し、非許容細胞においては示さなかった。
【0308】
CV884のインビトロ特徴決定
CV884 についてのウイルス収量アッセイ法
5×105個の293細胞、RT−4細胞、SW780細胞、G361細胞、LNCap細胞、HBL−100細胞、MKN1細胞、PA−1細胞、繊維芽細胞および平滑筋細胞を、6ウェルプレートの各ウェルに播種した。24時間後、培地を吸引して、MOI 2pfu/細胞でCV802(E3を有する野生型Ad5)またはCV984を含有する1mLの血清非含有RPMI 1640で置換した。37℃で4時間インキュベーションした後、細胞を予め温めたPBSで洗浄し、2mLの完全RPMI 1640を各ウェルに添加した。37℃で更に72時間放置後、これらの細胞を培地にスクラップして、3回の凍結融解サイクルにより溶解させた。溶解物を、ウイルス産生について、8日間〜10日間、293細胞に対し半固形アガロース下での3つ組のプラークアッセイ法で試験した。
【0309】
CV884の複製は、許容細胞(293細胞、RT−4細胞およびSW780細胞)においてはCV802と非常に類似しているが、非許容細胞(G361細胞、LNCap細胞、HBL−100細胞、MKN1細胞、PA−1細胞および初代細胞)においては、CV802との1000倍を上回る違いを示した。CV884は、多くの特異性を失うことなく、CV876およびCV882よりもより良好な効力を示している。
【0310】
CV884 の増殖曲線実験
5×105個のRT−4細胞、PA−1細胞、平滑筋細胞および繊維芽細胞を、6ウェルプレートの各ウェルに播種した。24時間後、培地を吸引して、MOI 2pfu/細胞でCV802(E3を有する野生型Ad5)またはCV884を含有する1mLの血清非含有RPMI 1640で置換した。37℃で4時間インキュベーションした後、細胞を予め温めたPBSで洗浄し、2mLの完全RPMI 1640を各ウェルに添加した。0時間、12時間、24時間、36時間、48時間、72時間、96時間および120時間の様々な時点で、細胞を培地にスクラップして、3回の凍結融解サイクルにより溶解させた。溶解物を、ウイルス産生について、8日間〜10日間、293細胞に対し半固形アガロース下での3つ組のプラークアッセイ法で試験した。
【0311】
ウイルス収量アッセイ法の時と非常に類似して、CV884は、RT−4細胞においてのみ良好に複製した(CV802と同様)が、初代細胞およびPA−1細胞においては良好に複製しなかった。また、CV884の複製は、CV882およびCV876よりも優れていた。
【0312】
CV884 についての細胞変性効果
5×105個の293細胞、RT−4細胞、SW780細胞、G361細胞、PA−1細胞および繊維芽細胞を、6ウェルプレートの各ウェルに播種した。24時間後、培地を吸引して、0.001から10まで漸増するMOIにおいてCV802(E3を有する野生型Ad5)またはCV884を含有する1mLの血清非含有RPMI 1640で置換した(MOI 1でのデータは示さず)。37℃で4時間インキュベーションした後、培地を、完全RPMI 1640 3mLで置換し、細胞変性作用がCV802についてMOI 0.01において認められた場合には、37℃で6日〜8日間インキュベーションした。
【0313】
CV802は、全ての被験細胞において効力を示したのに対し、CV884は、許容細胞(293細胞、RT−4細胞およびSW780細胞)のみを殺傷し、非許容細胞(G361細胞、PA−1細胞および繊維芽細胞)は殺傷しなかった。
【0314】
CV884 についての MTT アッセイ法
2×104個の293細胞、T−4細胞、SW780細胞、U118細胞、繊維芽細胞および平滑筋細胞を、96ウェルプレートの各ウェルに播種した。24時間後、これらの細胞を、CV802およびCV884で、完全RPMI 1640中で、0.001から10まで漸増するMOIにおいて感染させた。細胞増殖および生存に関する迅速な比色アッセイ法を、1日目、3日目、5日目、7日目および10日目の各時点で行った。培地を、MTTの1mg/ml溶液50μlで置換したが、これは肝細胞の活性ミトコンドリア内に存在する脱水素酵素により不溶性の紫色のホルマザンに転換される。37℃で3時間〜4時間インキュベーションした後、溶液をイソプロパノールで置換して、プレートを、30℃で1時間インキュベーションして、560nm試験波長および690nm参照波長で測定した。
【0315】
CPEアッセイ法の結果と同様に、CV884は、許容細胞においてのみ強力な効力を示し(野生型Ad5同様)、非許容細胞においては示さなかった。
【0316】
CV808 のインビトロ活性
マウスに、1×106個のSW78O細胞を皮下注射(SC)した。腫瘍が約500mm3に成長した時点で、CV808をマウスに腫瘍内導入した(PBSおよび10%グリセロール0.1ml中ウイルス5×107PFU)。対照マウスにはビヒクル単独を導入した。腫瘍サイズを毎週測定した。結果を図11に示す。このデータは、CV808は腫瘍増殖の抑制に効果があることを示している。
【0317】
本明細書に記載されたウイルスに基づく治療は、病巣内投与(すなわち、直接注射)される可能性が高いにもかかわらず、アデノウイルスベクターの静脈内(IV)投与が腫瘍の成長に影響を及ぼすかどうかを決定することも望ましい。そうであるならば、その後、ウイルスを、直接注射では接近不可能な転移性腫瘍沈着を治療するために使用することができると考えられる。この実験のために、膀胱上皮腫瘍を有するマウス群に、アデノウイルスベクター1O8〜1010 PFU、または陰性対照としてのウイルスを運搬するために使用した緩衝液を、尾静脈注射により接種した。腫瘍サイズに対するアデノウイルスベクターのIV注射の作用を、ビヒクル処置と比較した。
【0318】
実施例15:CV890と化学療法剤の相乗作用
材料および方法
細胞
肝細胞癌細胞株であるHepG2、Hep3B、PLC/PRF/5、SNU449およびSk−Hep−1、Chang肝細胞(ヒト正常肝細胞)に加え、他の腫瘍細胞株であるPA−1(卵巣癌)、UM−UC−3(膀胱癌)、SW780(膀胱癌)、HBL100(乳房上皮細胞)、Colo201(結腸腺癌)、U118MG(グリア芽細胞腫)およびLNCaP(前立腺癌)を、アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection;ATCC)から入手した。HuH−7(肝臓癌)は、パトリシア・マリオン博士(Dr. Patricia Marion)(スタンフォード大学)のご厚意により得た。293細胞(アデノウイルスE1領域を含むヒト胚性腎)を、ミクロビクス(Microbix)社(Tronto、Canada)から購入した。初代細胞nBdSMC(正常ヒト膀胱平滑筋細胞)、nHLFC(正常ヒト肺繊維芽細胞)、およびnHMEC正常ヒト乳房上皮細胞)を、クロンティクス(Clonetics)社(SanDiego、California)から購入した。全ての腫瘍細胞株を、10%ウシ胎仔血清(Irvine Scientific社)、100U/mlペニシリンおよび100ug/mlストレプトマイシンを補充したRPMI 1640(Bio Whittaker社)において維持した。初代細胞を、供給元(Clonetics社、SanDiego)の指示に従い維持した。細胞を、イムノアッセイ法(Genzyme Diagnostics社、SanCarlos、CA)により、AFP発現について試験した。
【0319】
ウイルス収量および一段階( one−step )増殖曲線
6ウェル皿(Falcon社)に、ウェル1個あたり5×105個の関心対象の細胞を感染の24時間前に播種した。細胞を、血清非含有培地において、感染多重度(MOI)2 PFU/細胞で3時間感染させた。3時間後、ウイルス含有培地を除去し、単層を、3回PBSで洗浄して、完全培地(RPMI164O+10%FBS)4mlを各ウェルに添加した。感染後72時間で、細胞を培養培地にスクラップして、3回の凍結融解サイクルにより溶解させた。
【0320】
一段階増殖曲線時点を、感染後様々な時点で収集した。各ウイルス細胞の組合せの2回の独立した感染を、293細胞に対し2つ組で力価決定した。(Yuら(1999)Cancer Research、59:1498−1504)。
【0321】
ノーザンブロット分析
Hep3B細胞またはHBL100細胞を、CV802またはCV890のいずれかを用いて、MOI 20PFU/細胞(細胞当りプラーク形成単位)で感染させて、感染後24時間で収集した。細胞全RNAを、RNeasyプロトコール(Qiagen社)を用いて精製した。ノーザンブロットは、NorthernMax Plus試薬(Ambion社、Austin、Texas)を用いて行った。RNA 5μgを、1%アガロースの、ホルムアルデヒドに基づく変性ゲル上で分画して、BrightStar−Plus(Ambion社)正帯電した膜にキャピラリートランスファー(capillary transfer)により転写した。E1A(アデノウイルスゲノム501bpから1141bp)またはE1B(1540bpから3910bp)のアンチセンスRNAプローブは、pGEM−T easy(Promega社)にクローニングされ、かつ[α32P]UTPで転写標識されたPCR産物であった。ブロットを、ZipHyb溶液により68℃で14時間ハイブリダイズさせ、標準法(Ambion社)を用いて洗浄した。膜を、BioMaxフィルム(Kodak社)に曝露した。
【0322】
ウェスタンブロット分析
Hep3B細胞またはHBL100細胞を、CV802またはCV890のいずれかを用いて、MOI 20PFU/細胞で感染させて、感染の24時間後に収集した。細胞を、冷PBSで洗浄して、氷上で、50mM Tris(pH8.0)、150mM NaCl、1%IGEPAL CA360 a NP4O同等物(Sigma社)、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche社、PaloAlto、CA)中で、30分間溶解させた。30分後、4℃で遠心し、上清を収集して、タンパク質アッセイESLキット(Roche社)によりタンパク質濃度を決定した。1レーンあたりタンパク質50μgを、816%SDS−PAGE上で分離して、Hybond ECL膜(Amersham Phannacia社、Piscataway、NewJersey)上に電気ブロットした。膜を、5%無脂肪乾燥ミルクを補充したPBST(0.1%Tween−20を含有するPBS)中で一晩ブロックした。一次抗体のインキュベーションを、PBST/1%ミルクで希釈した抗体により室温で2〜3時間行い、その後洗浄して、希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した二次抗体(Santa Cruz Biotechnology社、SantaCruz、CA)と共に1時間インキュベーションした。増強した化学発光体(ECL;Amersham Pharmacia社)を検出に用いた。E1A抗体(クローンM58)はNeoMarkers社(Fremont、California)から、E1B−21kD抗体はオンコジーン(Oncogene)社(Cambridge、Massachusetts)から入手した。全ての抗体を、製造業者の指示に従い使用した。
【0323】
細胞生存率アッセイ法および統計解析
ウイルスおよび化学療法剤の併用療法における細胞殺傷作用を判定するために、細胞生存率アッセイ法を、先に記載されたものに変更を加え行った(Denizot(1986)Journal Immunology. Methods、89:271−277)。96ウェルプレート上、関心対象の細胞を、感染の48時間前に、ウェル1個あたり細胞10,000個で播種した。その後細胞を、ウイルス単独、薬物単独、または併用で処理した。細胞生存率は、培地を除去する段階、MTT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウムブロミド)(Sigma社、St.Louis、MO)の1mg/ml溶液50μlを添加する段階、および37℃で3時間インキュベーションする段階ごとに、様々な時点で測定した。MTT溶液を除去した後、ウェル内に残存する結晶を、イソプロパノール50μlの添加により溶解化させ、30℃で0.5時間インキュベーションした。吸光度を、マイクロプレートリーダー(Molecular Dynamics社)において560nm(試験波長)および690nm(参照波長)で測定した。生存細胞の割合を、ウイルスまたは薬物で処理した細胞の0D550−0D650値を、対照細胞の0D550−0D650値で除算することにより概算した。6個の複製(replica)試料を各時点で採取して、各実験を少なくとも3回反復して行った。
【0324】
統計解析のために、CurveExpert(Daniel Hyamsのシェアウェア、バージョン1.34)を用い、ウイルスおよび薬物に関する用量反応曲線をプロットした。この用量反応曲線を基に、アイソボログラムを、スチール(Steel)およびペッカム(Peckham)の原理(1993、Int. J. Rad. Onc. Biol. Phys.、5:85)ならびにアオエ(Aoe)らが記載した方法(1999、Anticancer Res.、19:291−299)に従い作製した。
【0325】
動物実験
6週齢〜8週齢のBALB/C nu/nu無胸腺マウスを、シモンソンラボラトリーズ(Simonson Laboratories)(Gilroy、California)から入手して、腫瘍移植前の1週間実験室条件に馴化した。異種移植片を、100μlのRPMI 1640培地中に懸濁した1×106個のHep3B細胞、HepG2細胞またはLNCaP細胞の皮下注入により確立した。腫瘍が200mm3から300mm3の間に達したら、マウスを無作為化して、被験物質100μlを腫瘍内注射または尾静脈注射により投薬した。腫瘍を、外径より2次元寸法を測定して、体積を式[長さ(mm)×幅(mm)2]/2により概算した。動物は、腫瘍負荷が過剰になった時点で人道的に屠殺した。血清を眼窩後方の出血(retro−orbital bleed)から毎週採取した。血清中のAFPレベルを、AFPイムノアッセイキット(Geazyme Diagnostics社、SanCarlos、CA)により決定した。処置群間の平均腫瘍体積および平均血清AFP濃度の差異を、対のない両側t検定を用いて統計学的有意性について比較した。
【0326】
様々な細胞における CV890 の E1A/E1B バイシストロニックカセットの転写および翻訳
野生型アデノウイルス感染において、E1A遺伝子およびE1B遺伝子は、交互にスプライシングされた産物のファミリーを形成する。5個のE1A mRNA、中でもとりわけ12S(880ヌクレオチド、nt)および13S(1018nt)のmRNAが、感染後初期および後期の両方において発現される主なものであることが見いだされている。12Sおよび13SのmRNAは、それぞれ、243アミノ酸(243R)および289アミノ酸(289R)の遺伝子産物をコードしている(Shenk、1996に概説)。19kDおよび55kDのタンパク質をコードしている2種の主要なE1B転写産物は、12S(1031nt)および22S(2287nt)のmRNAである。E1B 12S mRNAは19kD産物のみをコードしているのに対し、22S mRNAは、翻訳時の異なる開始部位のために、19kDおよび55kDの両産物をコードしている。現在の研究において、E1A−IRES−E1Bバイシストロニックカセットの作製は、ウイルス感染におけるE1AおよびE1B転写産物のパターンを変化させると予想された。従って、ノーザンブロット分析を行い、E1AおよびE1B転写産物の定常状態レベルを評価した。最初に、CV802またはCV890を、Hep3B(AFP)細胞またはHBL100(AFP)細胞に24時間感染させた。総RNA試料を、アガロースゲル上で分離して、アンチセンスRNAプローブとハイブリダイズすることによりノーザンブロットのために処理した。E1Aプローブによるノーザンブロットにより、両方の野生型CV802感染細胞において12Sおよび13SのmRNAを可視化した。CV890について、E1A転写産物は、Hep3B細胞においてのみ認められ、これはE1Aの条件付き転写を示している。CV890にただひとつの巨大な転写産物(約3.51Kb)が存在し、12Sおよび13SのmRNAは最早存在しないことがわかったことは興味深い。この巨大な転写産物は、E1A−IRES−E1Bバイシストロニックカセットの連続転写を示し、このことはCV890におけるウイルスのE1Aスプライシングパターンの変更を示唆している。CV890からのE1Bの転写も、AFP依存型のように見える。E1Bの12Sおよび22Sの両mRNAが、野生型CV802試料中に存在するのに対し、12S mRNAおよび巨大化した22S mRNA(3.5Kb)は、CV890感染細胞に出現したことが示される。明らかに、この巨大化されたmRNAの正体は、E1Aブロットにおいて可視化されたのと同じ3.5Kb転写産物であり、これはE1A/E1Bバイシストロニックカセットの転写に由来している。従ってE1B mRNAは、この巨大な転写産物においてE1A mRNAの後にタグ付けされている。この巨大な転写産物は、E1A、E1B 19kDおよびE1B 55kDの全てのコード情報を含む。CV802に出現するmRNAスプライシングパターンは、CV890にはあてはまらず、E1Bプローブによる12S mRNAは消失している。一方、E1Bノーザンブロットにおいては、本発明者らのE1Bプローブ(1540bp−3910bp)の選択により、ヘキソン会合したタンパク質であるアデノウイルス遺伝子IX(3580bp−4070bp)のmRNAも検出された。CV890感染したHep3B細胞において、IX遺伝子の発現はCV802のものと同等であるのに対し、CV890感染HBL100においては、その発現は同様に完全に停止された。この結果は更に、AFP制御されたE1A/E1B発現が、後期遺伝子発現同様、ウイルス複製にとって重要であることを明らかにしている。
【0327】
ウェスタンブロットにおける同じ試料の結果も、CV890がE1AおよびE1BのAFP依存型発現を有することを示している。本発明者らの実験条件下において、Hep3B細胞におけるCV890のE1A発現レベルは、CV802と類似している。しかし、E1B 19kDタンパク質が検出された場合、その発現レベルはCV802 E1Aよりもはるかに低いことがわかった。これまでに、IRES媒介性の第二遺伝子が、より少なく発現することが考察されている(Mizuguchiら、2000、Mol. Ther.、1:376−382)。要約すると、許容Hep3B細胞におけるCV890感染は、正常産生性感染を開始することができる、正常量のE1Aタンパク質およびより少ない量のE1Bタンパク質を産出することができる。しかしAFP−細胞において、この過程は、E1A遺伝子およびE1B遺伝子の転写および翻訳の欠如により減弱された。これらのデータは、E1AおよびE1Bの両遺伝子の発現が、AFP TREの制御下にあり、人工的E1A/E1BバイシストロニックカセットはCV890において適切に機能することを明らかにしている。
【0328】
CV890 の腫瘍細胞および初代細胞におけるインビトロ複製特異性
ウイルス収量のインビトロ比較から、CV890は、CV732よりもより良好な特異性プロフィールを有する(CV732は、E1A遺伝子がAFP−TREの制御下にあるような、AFP産生性細胞特異的アデノウイルス変種である。)。CV890の肝臓癌治療における使用に関する更なる洞察を得るために、より多くの腫瘍細胞株および初代細胞を、インビトロウイルス複製について特徴付けるために試験した。最初に、本試験における全ての細胞を、それらのAFP状態について、AFPイムノアッセイ法により分析した。これらの細胞および培地において産生されたAFPを基に、全ての細胞を、高(>2.5μg/106細胞/10日)、低(<0.6μg/106細胞/10日)および無(本研究においては検出不能)の3群に分けた(表7)。異なる細胞株におけるCV890の複製は、宿主細胞のAFP状態によく相関していることを確認した。肝細胞株群において、CV890のみが、AFP+細胞を良好に複製しており、これはHep3B細胞、HepG2細胞、Huh7、SNU449およびPLC/PRF/5を含む。先に報告されたAFP−細胞(Parkら(1995)Int. J. Cancer、62:276−282)の肝細胞癌細胞株のひとつであるSNU449は、他の細胞と比較して非常に低いAFP(約60ng/106細胞/10日)を産生するので、プロモーター活性に必要とされるAFP量は、非常に低いように見える。しかし例え非常に少量のAFPを用いてさえ、SNU449細胞は、HepG2細胞のような有意に高いレベルのAFPを産生する細胞と同程度まで、依然としてCV890の複製を支持することができる。CV802と比べ、CV890は、肝細胞癌細胞Sk−HeplおよびChang肝細胞、他の腫瘍細胞ならびに初代細胞を含む、AFPを産生しない細胞において1/5,000〜1/100,000まで減弱される。これらの結果をまとめると、CV890は、腫瘍細胞の広範なスペクトルから良好な特異性プロフィールを示すことが指摘された。その中で、AFP産生レベル高〜低までのAFP+肝細胞だけが、CV890許容性である。
【0329】
別の実験において、CV890を、様々な細胞におけるそれらの一段階増殖曲線について、CV802と比較した。結果は、CV890は、AFP低産生細胞においてウイルス収量がわずかに低い(2倍〜8倍)ことを除いて、AFP+細胞における野生型CV802と類似した増殖速度論を有することを明らかにしている。実験誤差を考慮しても、AFP+肝細胞癌細胞におけるCV890およびCV802の複製には劇的な差異はない。しかし、AFP−細胞におけるCV890の増殖曲線は、明確な減弱を示した。5日間の実験では、CV890は、肝細胞癌細胞(Change肝)および初代細胞(nHLFC)を含むAFP−細胞における複製に失敗した。これら全てのインビトロウイルス複製試験から、CV890の複製は、AFP−TREの厳密な制御下にあって、アデノウイルス変種は、AFP産生肝細胞癌細胞を優先的に標的化する優れた特異性プロフィールを有することは明らかである。
【0330】
CV890 のインビボ特異性および効力
更にCV890の特異性を、前立腺癌LNCaP異種移植片を持つ動物において評価した。このインビボ試験において、前立腺異種移植片を有するヌードマウスに、CV890またはCV787のいずれかと共に、前立腺癌特異的アデノウイルス変種(Yuら、Cancer Research、59:4200−4203(1999))を静脈内注射した。腫瘍体積を記録して、LNCaP異種移植片においてCV787のみが有意な抗腫瘍効力を有するが、CV890で処置した動物の腫瘍は、ビヒクル処置群同様、6週間で400mm3からおよそ1200mm3まで増大したことが示された。この試験は、CV890は、LNCaP異種移植片を攻撃せず、インビボ条件下において良好な特異性プロフィールを有することを示している。
【0331】
CV890のインビボ抗腫瘍効力を評価するために、ヒト肝細胞癌異種移植片を宿すヌードマウスモデルにおいて様々な試験を行った。最初に、HepG2細胞またはHep3B細胞の異種移植片を有するBALB/c nu/nuマウスを確立し、動物を更に、CV890の腫瘍塊への(腫瘍内投与、IT)またはそれらの尾静脈への(静脈内投与、IV)、単回投与または反復投与に供した。腫瘍体積および血清AFPレベルを、処置開始後毎週モニターして、その結果処置の効力を決定した。このインビトロ細胞毒性試験は、CV890がCV732よりもより良好な細胞溶解作用を有することを明らかにしている。それらの抗腫瘍活性を更に試験するために、本発明者らは最初に、CV890をCV732と比較する動物実験を行った。Hep3B異種移植片300mm3を宿している動物を群別して(n=6)、ビヒクル単独(対照群)、CV890(1×1011粒子/投与、CV890群)、またはCV732(1×1011粒子/投与、CV732群)を注射した。Hep3B異種移植片は、非常に侵襲性の腫瘍モデルであり、腫瘍増殖は非常に早い。ほとんどの動物が、過剰な腫瘍負荷のために、長期間生存することができない。6週間の試験期間中に、CV890の静脈内単回投与が有意な腫瘍増殖の阻害を示したのに対し、対照マウスは5週目に10倍以上の腫瘍増殖を示した。CV732処置群において、IV注射の単回投与も、対照群と比較して腫瘍増殖を低下させたが、これはCV890と比較して非常に小さい効果であった。例えば、CV890処置群の平均腫瘍体積は、312mm3から219mm3へと低下したのに対し、対照群において処置後5週目に腫瘍体積は308mm3から1542mm3へ増加した。対照群およびCV732群の両群とも、過剰な腫瘍サイズのために、5週目に終了した。以前、5投与量の静脈内投与後から、CV732が肝細胞癌腫瘍の増殖を制限することが明らかにされている。同様の効力を、CV890のわずか1回の静脈内投与により達成することができ、これはインビボ条件下において、肝細胞癌異種移植片に対し、CV890がCV732よりもより良好な効力を有することを示している。この実験において、CV890処置マウス5匹中4匹が、処置の3週間後に腫瘍を有さなかった。しかしCV732群においては、6週間の実験を通じて、2匹のマウスの異種移植片が増殖を停止したが、腫瘍を有さない処置動物はなかった。動物のこの群または対照群において腫瘍の退縮はなかった。統計解析によると、CV890処置腫瘍と、CV732処置腫瘍、またはビヒクル処置腫瘍の間の平均相対腫瘍体積および血清AFP濃度の差異は、有意であった(p<0.01))。要約すると、これらの試験は、CV890が有意な抗腫瘍活性を有し、その腫瘍崩壊(oncolytic)作用は、AvE1a04Iに類似したアデノウイルス変種であるCV732よりも優れており、ここでAFP TREはE1Aのみを制御するために適用される(Hallenbackら(1999)Hum. Gene. Ther.、10:1721−1733)ことを示唆している。
【0332】
化学療法剤と併用した CV890 の相乗的抗腫瘍効力
この実施例において、様々な化学療法剤をCV890と組合せて、Hep3B細胞またはHepG2細胞におけるそれらのインビトロ殺傷作用について試験した。薬物濃度を、それら自身に対して広範な細胞毒性作用を示さない程度に最適化した。このような条件下で、一部の薬物は、CV890との併用においてより高い細胞殺傷作用を示した。これらの中で、現在HCCの治療に使用されている薬物であるドキソルビシンが、CV890と相乗的細胞毒性を示した。ドキソルビシンをCV890と共にHep3B細胞に対し使用する実験において、ドキソルビシン10ng/mlは細胞毒性を示さないが、MOIわずか0.01(pfu/細胞)においてCV890は9日目に細胞の約35%を殺傷した。しかし、両方を一緒に適用した場合、処置後9日目に、90%の細胞が殺傷された。併用療法からの可能性のある相乗作用を決定するために、MTT細胞生存率データを、更に統計解析した。図10は、5日目のドキソルビシンおよびCV890のHep3B細胞に対する代表的IC50アイソボログラムを示している。最初に、ドキソルビシン単独またはCV890単独の用量反応曲線を作製した。スチール(Steel)およびペッカム(Peckham)の原理(1993)ならびにアオエ(Aoe)らの方法(1999)に基づき、3種の等効果曲線(方式1および方式2a、2b)が構築された。このアイソボログラムから、いくつかのデータ点が、相乗領域または相加領域にあり、このことは、CV890およびドキソルビシンの組合せが、Hep3B細胞の殺傷に対し相乗作用を提供することを示している。
【0333】
CV890単独でも良好な抗腫瘍活性を有するが、本発明者らは、相乗性のインビボ評価にドキソルビシンとの併用療法を適用した。300mm3のHep3B異種移植片を有する動物を群別して(n=6)、ビヒクル単独(対照群)、CV890単独(1×1011粒子/一回投与量、CV890群)、ドキソルビシン単独(10mg/kg、ドキソルビシン群)、またはドキソルビシンと組合わせたCV890(併用群)を注射した。図11は、1日目を100%として標準化した相対腫瘍サイズの毎週の変化を示している。本実験において、6週目までに、対照群の全ての動物は基準線の700%まで増大した過剰な腫瘍を有していたのに対し、CV890群および併用群の動物においては、腫瘍がないか、または腫瘍が退縮したかのいずれかであった。CV890で処置したHep3B異種移植片を有する8匹のうち、3匹の動物(37.5%)は、5週目に触知可能な(palpable)腫瘍を有さず、別の3匹の動物では、60%を上回る腫瘍の退縮が起こった。併用群において、8匹中4匹の動物が、5週目から腫瘍を有さず、別の4匹の動物は、約90%腫瘍が退縮した。CV890群および併用群の全ての動物は生存しており、腫瘍は処置後10週目においても抑制されたのに対し、対照動物は、6週後に過剰な腫瘍負荷のために屠殺された。更に、CV890は、これらのマウスにおいて、血清AFP濃度の低下も引き起した。統計解析は、CV890とビヒクル処置群または併用とドキソルビシン処置群の間の、平均相対腫瘍体積および血清AFP濃度における差異は、異なる時点で有意であった(p<0.005)ことを示した。
【0334】
併用療法における強力な効力は、ドキソルビシンと組合わせたCV890の単回IV注射が、ほとんどの動物において侵襲性Hep3B異種移植片を根絶し得ることを示している。
【0335】
【表7】様々な腫瘍細胞におけるAFP産生
【0336】
【表1】IRES配列
【0337】
【表2】IRESに関する論文参照
【0338】
【表3】TRE配列
ヒトウロプラキンII5’隣接領域のヌクレオチド配列。位置+1(翻訳開始部位)に星印をつけた。配列番号:6(配列番号:6の第一位は、翻訳開始部位を基準とした−2239位に対応している)。
マウスウロプラキンII5’隣接領域のヌクレオチド配列。翻訳開始部位に星印をつけた。配列番号:7(配列番号:7の第一位は、翻訳開始部位を基準とした−3592位に対応している)。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例1で記載されたプラスミド構築物CP627の概略図である。
【図2】本明細書に記載される様々なアデノウイルスの一連の概略図である。
【図3】実施例4で記載された様々なウイルスの複製効率を示す。
【図4】異なる細胞型における、様々な肝臓特異的ベクターについてのウイルス収量を示す。
【図5】IRESを有する、または有さない、AFP−TREを含むアデノウイルスベクターの概略図である。
【図6】E3領域を示す。
【図7】本明細書に記載されたアデノウイルスベクターの概略図である。
【図8】IRESを含むCV890のインビボの抗腫瘍活性を示す。この図は、CV790またはCV890で処理したHepG2 Xenographの結果を示す。
【図9】ADPヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図10】第5日目における、Hep3B細胞におけるドキソルビシンおよびCV890のIC50アイソボログラムを示す。
【図11】ドキソルビシンを加えたCV890のインビボにおける有効性を示す。Hep3Bヌードマウスの異種移植片を群別し(n=6)、CV890単独で(1×1011粒子/用量、静脈内)、ドキソルビシン単独で(10 mg/kg、腹腔内)、CV890およびドキソルビシン併用で(CV890 1×1011粒子、尾静脈内、およびドキソルビシン10 mg/kg、腹腔内)処理した、または、溶剤対照とした。腫瘍のサイズを毎週測定し、処理日における腫瘍体積を100%として標準化した。エラーバーは平均値の標準偏差を示す。
【図12】細胞系におけるCV802、CV882およびCV884のウイルス収量を示す。
Claims (58)
- 第一遺伝子および第二遺伝子が標的細胞特異的異種転写調節因子(TRE)の転写制御下にあり、第二遺伝子が、その内在性プロモーターにおける突然変異または内在性プロモーターの欠失を有し、かつ内部リボソーム接近部位(Internal ribosome entry site;IRES)の翻訳制御下にあり、ベクターが、遺伝子に機能的に連結されIRESを欠く標的細胞特異的TREを含むアデノウイルスベクターよりも高い、標的細胞に対する特異性を表す、単一のmRNAとして共転写される第一(first)遺伝子および第二(second)遺伝子を含む、複製受容能のある(replication−competent)アデノウイルスベクター。
- 第一遺伝子および第二遺伝子の少なくとも1つがアデノウイルス遺伝子である、請求項1記載のベクター。
- 第一遺伝子および第二遺伝子の両方がアデノウイルス遺伝子である、請求項2記載のベクター。
- 第一アデノウイルス遺伝子および第二アデノウイルス遺伝子の少なくとも1つがウイルス複製に必須である、請求項2記載のベクター。
- ウイルス複製に必須であるアデノウイルス遺伝子が、アデノウイルス初期遺伝子である、請求項4記載のベクター。
- アデノウイルス初期遺伝子がE1A、E1B、E2、またはE4を含む、請求項5記載のベクター。
- ウイルス複製に必須であるアデノウイルス遺伝子がアデノウイルス後期遺伝子である、請求項4記載のベクター。
- 第一アデノウイルス遺伝子および第二アデノウイルス遺伝子の両方がウイルス複製に必須である、請求項3記載のベクター。
- 第一アデノウイルス遺伝子および第二アデノウイルス遺伝子の少なくとも1つがアデノウイルス初期遺伝子である、請求項8記載のベクター。
- 第一アデノウイルス遺伝子および第二アデノウイルス遺伝子の少なくとも1つがアデノウイルス後期遺伝子である、請求項8記載のベクター。
- 第一アデノウイルス遺伝子がE1Aであり、第二アデノウイルス遺伝子がE1Bである、請求項8記載のベクター。
- E1Aの内在性プロモーターが欠失している、請求項11記載のベクター。
- E1Aが、不活性化したE1AエンハンサーIを有する、請求項11記載のベクター。
- E1Bの内在性プロモーターが不活性化している、請求項11記載のベクター。
- E1Bの19kDa領域が欠失している、請求項11記載のベクター。
- E1Aの内在性プロモーターが不活性化しており、かつ、E1Bの内在性プロモーターが不活性化している、請求項11記載のベクター。
- E1Bの19kDa領域が欠失している、請求項16記載のベクター。
- E1Aが、不活性化したE1AエンハンサーIを有する、請求項16記載のベクター。
- 内部リボソーム接近部位(IRES)がEMCV由来である、請求項1記載のベクター。
- IRESがVEGF由来である、請求項1記載のベクター。
- IRESがHCVの5’UTR;BiPの5’UTR;またはPDGFの5’UTRを含む、請求項1記載のベクター。
- TREが、癌細胞である標的細胞に対して特異的である、請求項1記載のベクター。
- 癌細胞が、前立腺癌細胞、乳癌細胞、肝臓癌細胞、黒色腫細胞、膀胱細胞または結腸癌細胞を含む、請求項22記載のベクター。
- TREが、プロバシン(PB)TRE、前立腺特異的抗原(PSA)TRE、ムチン(MUC1)TRE、α−フェトタンパク質(AFP)TRE、hKLK2 TRE、チロシナーゼTRE、ヒトウロプラキンII(hUPII)TREまたは癌胎児性抗原(CEA)TREを含む、請求項22記載のベクター。
- 第一アデノウイルス遺伝子の内在性プロモーターが欠失している、請求項9記載のベクター。
- 第一アデノウイルス遺伝子がE1Aである、請求項25記載のベクター。
- 第一アデノウイルス遺伝子および/または第二アデノウイルス遺伝子のエンハンサー領域が欠失している、請求項9記載のベクター。
- 第一遺伝子がE1Aであり、エンハンサーがE1AエンハンサーIである、請求項27記載のベクター。
- TREが内在性サイレンサー因子を欠失している、請求項1記載のベクター。
- アデノウイルスベクターがE3領域を含む、請求項1記載のベクター。
- アデノウイルスがE3領域を含む、請求項11記載のアデノウイルスベクター。
- 導入遺伝子をさらに含む、請求項11記載のアデノウイルスベクター。
- メラノサイト特異的TREの転写制御下にある遺伝子を含むアデノウイルスベクター。
- 遺伝子がアデノウイルス遺伝子である、請求項33記載のベクター。
- アデノウイルス遺伝子が複製に必須な遺伝子である、請求項34記載のベクター。
- 導入遺伝子が第一遺伝子および第二遺伝子と共転写され、該導入遺伝子が別々の内部リボソーム接近部位(IRES)の翻訳制御下にある、請求項32記載のベクター。
- IRESがEMCV由来である、請求項36記載のベクター。
- IRESがVEGF由来である、請求項36記載のベクター。
- アデノウイルス死タンパク質遺伝子(ADP)をさらに含む、請求項30記載のベクター。
- 導入遺伝子が細胞毒性遺伝子である、請求項32記載のベクター。
- 第一アデノウイルス遺伝子がウイルス複製に必須であり、第二アデノウイルス遺伝子がアデノウイルス死タンパク質遺伝子(ADP)である、請求項1記載のベクター。
- 第一アデノウイルス遺伝子がE1Aである、請求項41記載のベクター。
- E1Aの内在性プロモーターが欠失している、請求項42記載のベクター。
- E1AがE1AエンハンサーIの欠失を有する、請求項42記載のベクター。
- 第一遺伝子がウイルス複製に必須であり、かつ第二遺伝子がE3である、請求項1記載のベクター。
- 第一遺伝子がE1Aである、請求項45記載のベクター。
- 請求項1記載のベクターを含む組成物。
- 薬学的に許容されうる賦形剤をさらに含む、請求項47記載の組成物。
- 請求項30記載のベクターを含む組成物。
- 薬学的に許容されうる賦形剤をさらに含む、請求項49記載の組成物。
- 請求項1記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項30記載のベクターを含む宿主細胞。
- E1Bが19kDa領域の一部または全部を欠失している、標的細胞特異的異種TREの転写制御下にあるE1Bを含むアデノウイルスベクター。
- 請求項53記載のアデノウイルスベクターを含む宿主細胞。
- 標的細胞特異的TREを含む、複製受容能のあるアデノウイルスベクターを増殖させる方法であり、以下の段階を含む方法:
アデノウイルスベクターが細胞に入り、それにより該アデノウイルスベクターが増殖されるように、請求項1記載のアデノウイルスベクターを、標的細胞特異的TREを機能させる哺乳動物細胞と組み合わせる段階。 - 標的細胞における選択的細胞毒性を与える方法であり、以下の段階を含む方法:
細胞を請求項41記載のアデノウイルスベクターと接触させ、それによりベクターが細胞に入る段階。 - ベクターが細胞に入る、標的細胞の遺伝子型を改変する方法であり、以下の段階を含む方法:
細胞を請求項1記載のアデノウイルスベクターと接触させる段階。 - 腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であり、以下の段階を含む方法:
アデノウイルスベクターが腫瘍細胞に入って、腫瘍細胞に対する選択的細胞毒性を表すように、腫瘍細胞を請求項41記載のアデノウイルスベクターと接触させる段階。
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