KR100746122B1 - Ｒｂ-결합능이 상실된 개선된 종양세포-특이 세포살상능을 나타내는 재조합 아데노바이러스 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 종양세포-특이 세포살상능이 개선된 재조합 아데노바이러스에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 ElA 유전자 서열에 위치한 Rb 결합 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 변이가 발생되어 Rb와의 결합능이 상실되어 있고, E1B 19 유전자 및 E1B 55 유전자 둘 모두 부분적으로 또는 전체적으로 결실되어 있거나, 또는, ElA 유전자 서열에 위치한 Rb 결합 부위인 CR1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 CR2를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 둘 모두에 변이가 발생되어 Rb와의 결합능이 상실된 개선된 종양세포-특이 세포살상능을 나타내는 재조합 아데노바이러스에 관한 것이다.
아데노바이러스, Rb, ElA, E1B, 종양세포, 암

Description

Ｒｂ-결합능이 상실된 개선된 종양세포-특이 세포살상능을 나타내는 재조합 아데노바이러스{Recombinant Adenoviruses with Defective Ｒｂ-Binding Capacity Exhibiting Improved Tumor Cell-Specific Cytotoxicity}
도 1은 본 발명의 E1A 변이형 재조합 아데노바이러스들의 변이 양상을 보여주는 그림이다.
도 2a는 본 발명의 E1A 변이형 재조합 아데노바이러스들의 종양세포 (Hep3B, C33A, A549 및 U343) 살상능을 보여주는 사진이다.
도 2b는 본 발명의 E1A 변이형 재조합 아데노바이러스들의 정상세포 (BJ, 173WE 및 MRC5)를 살상하는 지 여부를 보여주는 사진이다.
도 3a는 본 발명의 가장 바람직한 E1 변이형 재조합 아데노바이러스, Ad-ΔB7의 변이 양상을 보여주는 유전자 지도이다.
도 3b는 본 발명의 Ad-ΔB7 재조합 아데노바이러스의 종양세포 (Hep3B, C33A A549 및 U343) 살상능을 보여주는 사진이다.
도 3c는 본 발명의 Ad-ΔB7 재조합 아데노바이러스가 정상세포 (BJ, 173WE 및 MRC5)를 살상하는 지 여부를 보여주는 사진이다.
도 4는 본 발명의 E1 변이형 재조합 아데노바이러스들의 세포 살상능을 감염 후 시간 변화에 따라 관찰한 결과이다.
도 5는 본 발명의 가장 바람직한 E1 변이형 재조합 아데노바이러스, Ad-ΔB7의 종양세포-특이 복제능을 검증한 면역블롯팅 결과 사진이다.
도 6은 본 발명의 가장 바람직한 E1 변이형 재조합 아데노바이러스, Ad-ΔB7를 투여한 생쥐 (자궁암 이종이식 모델)에서 종양 크기의 변화를 보여주는 그래프이다.
본 발명은 재조합 아데노바이러스에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 종양세포-특이 세포살상능이 개선된 재조합 아데노바이러스에 관한 것이다.
초기의 암유전자 치료에 이용된 아데노바이러스 벡터는 치료유전자가 삽입된 증식 불가능 아데노바이러스로, 일회성의 감염으로 인하여 제한적인 항암 효과가 문제점으로 대두되었다 (Alemany R, et al., Replicative adenoviruses for cancer therapy. Nat Biotech 2000;18:723-727; 및 Zhang W. Development and application of adenoviral vectors for gene therapy of cancer. Cancer Gene Ther 1999;6(2):113-138). 이러한 문제점의 극복을 위하여, 감염된 세포 내에서 복제 및 증식이 가능한 아데노바이러스의 세포 살상능을 이용해 정상 세포에서는 바이러 스의 복제가 제한되어 세포살상이 일어나지 않으면서 종양세포 만을 선택적으로 살상할 수 있는 종양 특이적 살상 아데노바이러스를 개발하려는 연구들이 활발히 진행되고 있다 (Bischoff JR. et al. An adenovirus mutant that replicates selectively in p53-deficient human tumor cells. Science 1996;274:373-376; Heise C. et al. ONYX-015, an E1B gene-attenuated adenovirus, causes tumor-specific cytolysis and antitumoral efficacy that can be augmented by standard chemotherapeutic agents. Nat Med 1997;3:639-645; Nemunaitis J. et al. Selective replication and oncolysis in p53 mutant tumors with ONYX-015, an E1B-55kD gene-deleted adenovirus, in patients with advanced head and neck cancer: a phase II trial. Cancer Res 2000;60:6359-6366; Rodriguez R. et al. Prostate attenuated replication competent adenovirus (ARCA) CN706: a selective cytotoxic for prostate-specific antigen-positive prostate cancer cells. Cancer Res 1997;57:2559-2563; 및 Hallenbeck P. et al. A novel tumor-specific replication-restricted adenoviral vector for gene therapy of hepatocellular carcinoma. Hum Gene Ther 1999;10:1721-1733).
아데노바이러스의 초기 발현 유전자인 E1B는 E1B 19kDa 및 E1B 55kDa 유전자로 이루어져 있으며, 이들 중 E1B 55kDa은 종양 억제 단백질인 p53과 결합하여 바이러스 감염으로 유도되는 세포주기 중지신호 및 세포고사 신호기작을 억제한다 ( Babiss LE. et al. Adenovirus E1B proteins are required for accumulation of late viral mRNA and for effects on cellular mRNA translation and transport. Mol Cell Biol (1985) 5:2552-2558; 및 Bridge E. et al. Interaction of adenoviral E4 and E1b products in late gene expression. Virology 1990;174:345-353).
이를 바탕으로 하여 개발된 E1B 55kDa 유전자가 소실된 ONYX-015(dl1520) 아데노바이러스 (Bischoff, J. et al., Science, 274:373-376(1996))와, 본 연구실에서 개발된 Ad-ΔE1B55(YKL-1) 아데노바이러스는 p53 단백질이 관여하는 세포내 신호전달체계가 손상된 종양세포에서만 선택적으로 복제하여 암세포 특이적 살상을 유도한다는 결과가 보고되었다 (Bischoff JR. et al. An adenovirus mutant that replicates selectively in p53-deficient human tumor cells. Science 1996;274:373-376; Heise C. et al. ONYX-015, an E1B gene-attenuated adenovirus, causes tumor-specific cytolysis and antitumoral efficacy that can be augmented by standard chemotherapeutic agents. Nat Med 1997;3:639-645; 및 Lee, H. et. al., Int J Cancer. 88:454-463(2000)).
E1B 19kDa 유전자는 강력한 세포고사 (apoptosis) 억제제로 알려진 Bcl-2와 염기서열 및 기능이 유사하며, 아데노바이러스에 의해 감염된 세포내에서 일어나는 세포고사를 억제한다 (Boyd JM, et al., Adenovirus E1B19 kDa and Bcl-2 proteins interact with a common set of cellular proteins. Cell 1994;79:341-351; Chio SK, et al., Functional complementation of the adenovirus E1B 19-kilodalton protein with Bcl-2 in the inhibition of apoptosis in infected cells. J Virol 1994;68:6553-6566; 및 Han J, et al., Interaction of E1B19 K with Bax is required to block Bax-induced loss of mitochodrial membrane potential and apoptois. Oncogene 1998;17:2993-3005).
따라서 E1B 19kDa 유전자가 소실된 복제 가능 아데노바이러스는 바이러스의 복제에 따른 세포사멸 뿐만 아니라 세포고사도 함께 유도할 수 있어 세포 살상능이 증가될 수 있으며, 이러한 E1B 19kDa 유전자가 소실된 복제 가능 아데노바이러스의 증대된 세포 살상능은 생체외뿐만 아니라 생체내 항종양 효과 실험에서도 입증되고 있다 (Sauthoff H, et al., Deletion of the adenoviral E1B-19 kD gene enhances tumor cell killing of a replicating adenoviral vector. Hum Gene Ther 2000;11:379-388; 및 Kim J, et al., Evaluation of E1B gene-attenuated replicating adenoviruses for cancer gene therapy. Cancer Gene Ther 2002;9:725-736). 또한, E1B 55kD 유전자와 더불어 E1B 19kDa 유전자가 함께 소실된 복제 가능 아데노바이러스 (Ad-ΔE1B)는, E1B 55kDa 유전자만 소실된 복제 가능 아데노바이러스 (Ad-ΔE1B 55)에 비하여 암세포 선택적 세포 살상능이 더욱 높다(Kim J, et al., Evaluation of E1B gene-attenuated replicating adenoviruses for cancer gene therapy. Cancer Gene Ther 2002;9:725-736).
한편, 암 유전자 치료법에 이용되어지는 복제 가능 아데노바이러스는 종양 특이적으로 세포를 살상할 수 있어야 하며, 또한 종양세포 살상이 효율적으로 이루어져야 한다는 전제조건이 따른다. 따라서, 당업계에서는 현재까지 종양세포 살상능 및 종양세포 특이성, 두 측면을 동시에 개선하기 위한 재조합 아데노바이러스에 대한 연구를 계속적으로 수행하고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌 및 논문이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌 및 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 종래의 재조합 아데노바이러스의 종양세포-특이 세포살상능을 개선하고자 예의 연구 노력한 결과, 아데노바이러스의 ElA 유전자 서열에 위치한 Rb (retinoblastoma) 결합 부위를 조작하여 ElA 단백질의 Rb 결합능을 상실케하고, E1B 19 유전자 및 E1B 55 유전자를 결실시키는 경우에는 재조합 아데노바이러스의 종양세포 살상능뿐만 아니라, 종양세포 특이성도 크게 개선됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 ElA 유전자 서열에 위치한 Rb (retinoblastoma) 결합 부위 및/또는 E1B 19 유전자와 E1B 55 유전자가 조작된 재조합 아데노바이러스를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상술한 신규한 재조합 아데노바이러스를 포함하는 약제학적 항종양 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 ElA 유전자 서열에 위치한 Rb 결합 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 변이가 발생되어 Rb 결합능이 상실되어 있고, E1B 19 유전자 및 E1B 55 유전자 둘 모두 부분적으로 또는 전체적으로 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 개선된 종양세포-특이 세포살상능을 나타내는 재조합 아데노바이러스를 제공한다.
본 발명자들은 우수한 종양세포 살상능을 나타내면서도, 정상적인 세포의 생존에는 영향을 주지 않는 재조합 아데노바이러스를 개발하고자 연구를 수행하였다. 결국, 본 발명자들은 E1B 19 유전자 및 E1B 55 유전자 둘 모두에 결실 변이를 발생시켜, E1B 19 kDa 단백질 및 E1B 55 kDa 단백질의 활성을 제거하고, Rb (retinoblastoma) 결합 부위가 위치한 ElA 유전자 서열에 변이를 발생시켜 E1A 단백질이 Rb에 결합하는 능력을 상실시키는 경우에는, 종래에 개발된 어떤 재조합 아데노바이러스들과 비교하여도 크게 개선된 종양세포-특이적 세포살상능이 나타나는 것을 발견하였다. 즉, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 종양세포에 대하여는 야생형 아데노바이러스와 거의 유사한 세포살상능을 나타내면서도, 정상세포에 대 하여는 거의 영향을 미치는 않는, 매우 우수한 종양세포-특이적 세포살상능을 나타낸다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스에 있어서, E1B 19 유전자 및 E1B 55 유전자는 부분적으로 또는 전체적으로 결실되어 있으며, 바람직하게는 완전하게 E1B 19 kDa 단백질 및 E1B 55 kDa 단백질의 기능을 상실시키기 위하여, 전체적으로 결실된다. 또한, E1B 19 kDa 단백질의 기능, 즉, 세포고사 (apoptosis)의 억제작용을 상실케 하거나, E1B 55 kDa 단백질의 기능, 즉, p53 단백질과의 결합능을 상실케하는 범위 내에서, 부분적 결실 변이도 본 발명에 채용될 수 있다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스에서, ElA 유전자 서열에 위치한 Rb 결합 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 변이가 발생되어, 이에 의해 코딩되는 ElA 단백질은 Rb 결합능을 상실하게 된다. E1A 유전자에서의 변이는 Rb 결합능을 상실케 하는 범위 내에서, 당업계에 공지된 어떠한 변이유발 방법도 채용될 수 있다. 따라서, E1A 유전자에서의 변이는 결실, 치환 및 부가 변이를 포함한다. 바람직하게는, E1A 유전자에서의 변이는 ElA 단백질은 Rb 결합능을 상실케 하면서도 ElA 단백질의 고유한 기능인 아데노바이러스의 복제를 방해하지 않는 범위 내에서의 변이이다.
아데노바이러스 E1A는 감염 직후 가장 먼저 발현되는 단백질로 바이러스 복제에 필수적이며, 세포주기를 조절하는 Rb (retinoblastoma)와 결합하여 E2F-Rb 복합체로부터 E2F의 해리를 유도한다 (Whyte P. et al. Two regions of the adenovirus early region 1A proteins are required for transformation. J Virol 1988;62:257-265; Nielsch U. et al. Adenovirus E1A-p105(Rb) protein interactions play a direct role in the initiation but not the maintenance of the rodent cell transformed phenotype. Oncogene 1991;6:1031-1036; 및 Whyte P. et al. Cellular targets for transformation by the adenovirus E1A proteins. Cell 1989;56:67-75). Rb로부터 해리된 E2F는 아데노바이러스의 E2 프로모터의 활성화를 촉진시킬 뿐만 아니라 세포주기의 진행을 주관하는 여러 유전자들의 전사도 촉진시킨다 (Sherr CJ. Cancer cell cycles. Science. 1996;274:1672-1677). 또한 E2F에 의해 활성화된 세포주기 관여 단백질들은 세포내로 감염된 아데노바이러스 유전자들의 복제에도 관여한다.
Rb가 결합하는 E1A의 두 부위는 CR1 (conserved region 1)의 30-60 아미노산 서열과 CR2 (conserved region 2)의 120-127 아미노산 서열로서, 이들 중 어느 한 부위라도 결손되면 E1A/Rb 복합체의 형성이 이루어지지 않는다 (Whyte P. et al. Two regions of the adenovirus early region 1A proteins are required for transformation. J Virol 1988;62:257-265; Whyte P. et al. Cellular targets for transformation by the adenovirus E1A proteins. Cell 1989;56:67-75; Moran E, et al., Identification of separate domains in the adenovirus E1A gene for immortalization activity and the activation of virus early genes. Mol Cell Bio 1986;6:3470-3474; 및 Jelsma T. et al. Sequences in E1A proteins of human adenovirus required for cell transformation, repression of a transcriptional enhancer, and induction of proliferating cell nuclear antigen. Virology 1989;171:120-124).
이에 근거하여 Fueyo 연구진들은 120-127 아미노산 서열을 결손시킨 Δ24 아데노바이러스를 개발하여 Rb 유전자가 돌연변이된 암세포를 선택적으로 살상할 수 있음을 보고하였다 (Fueyo J. et al., Oncogene, 19:2-12(2000)).
대부분의 정상적인 세포들은 세포주기 G1에서 S기로의 진행 여부를 결정하는 G1-S기 체크포인트 관련 신호 단백질들의 기능이 정상적으로 조절되기 때문에, Go-G1기에서 세포주기가 정지되어 있으나, 많은 종류의 암세포들은 Rb 유전자의 변이뿐만 아니라 Rb 경로, 즉 p16/Rb/E2F 신호전달 경로 등이 비정상적으로 조절되기 때문에, 세포주기가 활발히 진행되고 세포 분열이 왕성해진다. 따라서 Δ24와 같은 Rb와의 결합능이 상실된 복제 가능 아데노바이러스가 Rb 유전자가 비활성화 되어있는 암세포를 감염하면, Rb의 기능 상실로 아데노바이러스의 복제를 억제하지 못하고, 또한 세포는 S 세포주기로 진행할 수 있어 결과적으로 아데노바이러스 복제가 활발히 일어난다.
이에 반하여 Rb의 기능이 정상적인 세포내에서는 Rb와의 결합능이 상실된 복제 가능 아데노바이러스의 E1A가 Rb와 결합할 수 없어 S 세포주기로 진행할 수 없게 되어 결과적으로 바이러스 복제가 일어나지 않게 된다 (Fueyo J. et al., Oncogene, 19:2-12(2000); 및 Heise C, et al., An adenovirus E1A mutant that demonstrates potent and selective systemic anti-tumoral efficacy. Nat Med 2000;6(10):1134-1139). 즉, Rb와의 결합능이 상실된 형태의 E1A 유전자가 내재 된 아데노바이러스는 Go-G1기에서 정지된, 즉 분화가 끝난 대부분의 정상 세포에서는 복제되지 않지만 Rb의 기능이 상실되어 세포주기가 왕성하게 진행되는 종양세포 내에서만 선택적으로 복제가 가능하게 되어 종양 세포 특이적 살상을 유도할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 변이가 발생된 Rb 결합 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 ElA 유전자 서열에 위치한 CR1 (conserved region 1), CR2 (conserved region 2) 또는 CR1과 CR2를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이며, 보다 바람직하게는 CR1과 CR2 두 부위 모두에서 변이가 발생되는 것이다. 상기 변이가 발생된 Rb 결합 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은, 가장 바람직하게는, ElA 단백질의 아미노산 45번, 121-127번, 또는 124번을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다. 상기 서열에서의 변이는 ElA 단백질의 Rb 결합능을 상실케 하면서도 ElA 단백질의 고유한 기능인 아데노바이러스의 복제를 실질적으로 방해하지 않는다.
ElA 단백질의 45번째 Glu 잔기에서의 변이는 다른 아미노산으로 치환하는 변이가 바람직하며, 보다 바람직하게는, Glu 잔기와는 다른 특성을 갖는 아미노산으로 치환시키는 것이며, 가장 바람직하게는 Gly으로 치환하는 것이다.
ElA 단백질의 121-127번째 아미노산 서열에서의 변이는 바람직하게는 부분적 또는 전체적 결실 변이이며, 보다 바람직하게는 전체적 결실 변이이다.
본 발명의 다른 변형예에 따르면, ElA 단백질의 121-127번째 아미노산 서열 에서의 변이는 부분적으로 또는 전체적으로 다른 아미노산으로 치환되는 변이이다. 보다 바람직하게는 전체적으로 치환되는 것이며, 상기 치환은 다른 특성을 갖는 아미노산으로 치환되는 것이며, 가장 바람직하게는 치환되는 아미노산 모두가 Gly으로 치환되는 것이다.
ElA 단백질의 124번째 Cys 잔기에서의 변이는 다른 아미노산으로 치환하는 변이가 바람직하며, 보다 바람직하게는, Cys 잔기와는 다른 특성을 갖는 아미노산으로 치환시키는 것이며, 가장 바람직하게는 Gly으로 치환하는 것이다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스에서, 상술한 Rb 결합 부위-코딩 뉴클레오타이드 서열, E1B 19 유전자 및 E1B 55 유전자에서의 변이 형태를 참조하여, 본 발명의 바람직한 재조합 아데노바이러스를 기재하면 다음과 같다: (ⅰ) Glu::Gly ΔE1B19 ΔE1B55; (ⅱ) Glu::Gly ΔCR2 ΔE1B19 ΔE1B55; (ⅲ) 7 a.a (DLTCHEA):: 7 a.a (GGGGGGG) ΔE1B19 ΔE1B55; (ⅳ) Glu::Gly 7 a.a (DLTCHEA)::7 a.a (GGGGGGG) ΔE1B19 ΔE1B55; (ⅴ) Cys::Gly ΔE1B19 ΔE1B55; 및 (ⅵ) Glu::Gly Cys::Gly ΔE1B19 ΔE1B55.
상기 재조합 아데노바이러스의 다양한 변이체의 기재에서, Glu::Gly는 E1A 전체 아미노산 서열중에서 45번째 Glu가 Gly으로 치환된 것을 나타내고, ΔCR2는E1A 아미노산 서열중에서 121-127번 아미노산 서열이 제거된 것을 나타내며, 7 a.a (DLTCHEA):: 7 a.a (GGGGGGG)는 E1A 아미노산 서열중에서 121-127번 아미노산 서열 전부 Gly으로 치환된 것을 나타내고, Cys::Gly는 124번째 시스테인이 글라이신으로 치환된 것을 나타내며, 그리고 ΔE1B19 ΔE1B55는 E1B 19 유전자 및 E1B 55 유전자의 부분 또는 전체 서열, 바람직하게는 전체 서열이 결실된 것을 나타낸다. 상기 재조합 아데노바이러스 중에서, 종양세포 살상능 및 종양세포에 대한 특이성을 모두 고려하였을 때, Glu::Gly 7 a.a (DLTCHEA)::7 a.a (GGGGGGG) ΔE1B19 ΔE1B55 가 가장 바람직하다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스에 따르면, E1B 55 유전자 결손에 의해 p53의 기능이 손상된 종양세포 내에서만 선택적 복제가 일어나고, E1B 19 유전자 결손에 의해 세포사멸이 더욱 효과적으로 발생하며, Rb 결합 부위가 변형되어 Rb-결합능이 상실됨에 따라 종양세포 선택성이 개선된다. 종래에 개발되었던 Rb 결합능 또는 p53 결합능이 각각 단독으로 소실된 아데노바이러스 변이체와 비교하여, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 크게 개선된 종양세포-특이 살상능을 나타낸다.
본 발명에서의 발견은 크게 둘로 요약될 수 있다. 그 중 하나는, E1A에 위치한 Rb 결합 부위의 변이에 의해 재조합 아데노바이러스의 종양세포-특이적 살상능을 개선하는 데 있어서, E1B 19 유전자 및 E1B 55 유전자의 이중 결실 변이가 상기한 개선을 크게 향상시켜 준다는 것이다. 또 다른 큰 발견은, E1A에 위치한 Rb 결합 부위의 변이 중에서, CR1과 CR2 서열의 이중 변이 형태 (Rb와의 결합능을 상실케 하는 변이)가 재조합 아데노바이러스의 종양세포-특이적 살상능을 개선하는 데 효과적이라는 것이다.
상기한 첫 번째 발견을 중심으로 하여 본 발명의 재조합 아데노바이러스를 표현한 것이 상술한 내용이다.
한편, 상기 두 번째 발견을 중심으로 하여 본 발명의 재조합 아데노바이러스를 표현하면, 본 발명은 ElA 유전자 서열에 위치한 Rb 결합 부위인 CR1를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 CR2를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 둘 모두에 변이를 갖는 개선된 종양세포-특이 세포살상능을 나타내는 재조합 아데노바이러스을 제공한다.
이러한 두 번째 양태의 재조합 아데노바이러스에서, 상기 변이가 발생된 CR1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 ElA 단백질의 아미노산 45번을 코딩하는 서열이고, 변이가 발생된 CR2를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 ElA 단백질의 아미노산 121-127번 또는 124번을 코딩하는 서열이다. 상기 변이가 발생되는 위치 또는 부위는 Rb와의 결합에 중요한 위치 또는 부위이다 (Whyte P. et al., Cell, 56:67-75(1989); Whyte P. et al., Journal of Virology, 62:257-265(1988); 및 Moran E. et al., Molecular and Cellular Biology, 6:3470-3480(1986)).
ElA 단백질의 45번째 Glu 잔기에서의 변이는 다른 아미노산으로 치환하는 변이가 바람직하며, 보다 바람직하게는, Glu 잔기와는 다른 특성을 갖는 아미노산으로 치환시키는 것이며, 가장 바람직하게는 Gly으로 치환하는 것이다.
ElA 단백질의 121-127번째 아미노산 서열에서의 변이는 바람직하게는 부분적 또는 전체적 결실 변이이며, 보다 바람직하게는 전체적 결실 변이이다.
본 발명의 다른 변형예에 따르면, ElA 단백질의 121-127번째 아미노산 서열에서의 변이는 부분적으로 또는 전체적으로 다른 아미노산으로 치환되는 변이이다. 보다 바람직하게는 전체적으로 치환되는 것이며, 상기 치환은 다른 특성을 갖는 아 미노산으로 치환되는 것이며, 가장 바람직하게는 치환되는 아미노산 모두가 Gly으로 치환되는 것이다.
ElA 단백질의 124번째 Cys 잔기에서의 변이는 다른 아미노산으로 치환하는 변이가 바람직하며, 보다 바람직하게는, Cys 잔기와는 다른 특성을 갖는 아미노산으로 치환시키는 것이며, 가장 바람직하게는 Gly으로 치환하는 것이다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스에서, 상술한 Rb 결합 부위-코딩 뉴클레오타이드 서열에서의 변이 형태를 참조하여, 본 발명의 바람직한 재조합 아데노바이러스를 기재하면 다음과 같다: (ⅰ) Glu::Gly; (ⅱ) Glu::Gly ΔCR2; (ⅲ) 7 a.a (DLTCHEA):: 7 a.a (GGGGGGG); (ⅳ) Glu::Gly 7 a.a (DLTCHEA)::7 a.a (GGGGGGG); (ⅴ) Cys::Gly; 및 (ⅵ) Glu::Gly Cys::Gly.
상기 6가지 변이를 갖는 재조합 아데노바이러스 중 가장 바람직한 것은 Glu::Gly 7 a.a (DLTCHEA)::7 a.a (GGGGGGG)이며, 이 변이체는 종양세포에 대한 살상능이 상당히 우수할 뿐만 아니라, 종양세포에 대한 특이성도 매우 우수하다.
상기 Rb 결합 부위-코딩 뉴클레오타이드 서열에서의 변이를 포함하는 본 발명의 재조합 아데노바이러스에서, 바람직하게는 E1B 19 유전자 및/또는 E1B 55 유전자가 결실되어 있고, 보다 바람직하게는 E1B 19 유전자와 E1B 55 유전자 둘 모두 결실되어 있다. 결실의 형태는 부분적 결실 또는 전체적 결실이고, 바람직하게는 전체적 결실이다. 이러한 E1B 19 유전자 및/또는 E1B 55 유전자에서의 결실 변이가 도입되면, Rb 결합 부위 변이체들의 종양세포 살상능 및 종양세포 선택성이 개선된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 E3 유전자가 제거되어 있다. 상기 E3 유전자는 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다 (Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989)). 따라서, 본 발명의 아데노바이러스는 외래 유전자를 운반 및 발현할 수 있는 벡터로서의 용도도 갖게 된다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 그 지놈의 양 말단에 100-200 bp의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함한다. ITR은 재조합 아데노바이러스의 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다.
한편, 본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 Ad-ΔB7 (KCCM-10569)이다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스는 다양한 종양 세포, 예컨대 간암 세포, 자궁암 세포, 뇌종양 세포 및 폐암 세포 등에 대하여 살상능을 갖을 뿐만 아니라, 살상 효율도 다른 종래의 재조합 아데노바이러스 보다 훨씬 월등하다. 또한, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 복제 및 증식 속도도 매우 크기 때문에, 감염된 세포 주위로 확산되는 속도가 매우 크다. 더욱이, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 종양세포에 대한 특이성도 매우 우수하여, 정상적인 세포에 대하여는 거의 악영향을 미치지 않는다.
또한, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 개별적 세포 수준에서의 인 비트로 종양 살상 효과도 우수하지만, 개체 수준에서의 인 비보 종양 살상 효과도 우수하다. 종래에 개발된 다수의 재조합 아데노바이러스가 인 비트로에서만 종양 살상 효과를 나타내고, 인 비보에서는 명확한 효과를 발휘하지 못하였다는 점을 고려하면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 우수성을 파악할 수 있다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스는 종래의 재조합 아데노바이러스와 비교하여 종양세포-특이 세포살상능이 크게 개선되어, 보다 안전하고 효과적인 암 유전자 치료를 가능하게 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 항종양 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 유효성분으로 포함되는 재조합 아데노바이러스는 상술한 본 발명의 재조합 아데노바이러스와 동일한 것이므로, 재조합 아데노바이러스에 대한 상세한 설명은 본 발명의 약제학적 조성물에도 그대로 적용된다. 따라서, 본 명세서의 불필요한 반복 기재에 의한 과도한 복잡성을 피하기 위하여 공통 사항은 그 기재를 생략한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 재조합 아데노바이러스는 상술한 바와 같이, 다양한 종양 세포에 대하여 살상 효능을 나타내므로, 본 발명의 약제학적 조성물은 종양과 관련된 다양한 질병 또는 질환, 예컨대 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암 및 자궁경부암 등의 치료에 이용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "치료"는 (ⅰ) 종양 세포 형성의 예방; (ⅱ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 억제; 및 (ⅲ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 경감을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 "치료학적 유효량"은 상기한 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에서 이용되는 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 난소암에서 복강내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우 에는 주입 방법으로 투여할 수 있고, 두경부암과 유방암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결장암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있고, 방광암의 경우에는 카테테르 내로 직접 주사하여 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 1 x 105 - 1 x 1015 pfu/㎖의 재조합 아데노바이러스를 포함하며, 통상적으로 1 x 1010 pfu를 이틀에 한번씩 2주 동안 주사한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin), 프로카르바진 (procarbazine), 메클로레타민 (mechlorethamine), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실 (chlorambucil), 비술판 (bisulfan), 니트로소우레아 (nitrosourea), 디악티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 독소루비신 (doxorubicin), 블레오마이신 (bleomycin), 플리코마이신 (plicomycin), 미토마이신 (mitomycin), 에토포시드 (etoposide), 탁목시펜 (tamoxifen), 택솔 (taxol), 트랜스플라티눔 (transplatinum), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 빈크리스틴 (vincristin), 빈블라스틴 (vinblastin) 및 메토트렉세이트 (methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 실험방법
대상 세포주 및 세포 배양
실험에 사용된 세포주들은 인체 간암 세포주(Hep3B), 뇌암 세포주(U343), 폐 암 세포주(A549), 자궁암 세포주(C33A) 및 섬유아세포주(BJ, 173WE, MRC5)이며, 모두 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA)에서 구입하였다.
그리고, 아데노바이러스 초기 발현 유전자인 E1 부위가 숙주 유전체 내에 내재되어 있는 293 세포주(ATCC)를 아데노바이러스 생산 세포주로 사용하였다. Hep3B를 제외한 모든 세포주들은 10%의 우태아 혈청(Gibco-BRL, Grand Island, NY)이 포함된 DMEM 배양액으로 항생제 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco-BRL)을 첨가하여 5% CO2의 존재 하에 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다. Hep3B 세포주는 같은 조건하에 MEM 배양액으로 배양하였다.
아데노바이러스들의 제작, 생산 및 역가 산출
아데노바이러스의 E1A 유전자 염기서열 중 Rb 단백질과의 결합에 관여하는 두 결합부위(88-180 bp in CR1, 361-381 bp in CR2)를 결손 또는 치환시키기 위하여, 먼저 야생형 아데노바이러스 E1 셔틀벡터인 pXC1(Microbix, Ontario, Canada)을 BamHI과 XbaI 제한효소로 E1 부위(9875 bp - 1339 bp)를 절단하고, 절단된 E1A DNA를 pSP72 클로닝 벡터(Promega, Madison, WI, USA)의 BamHI/XbaI 부위에 서브클로닝하여 pSP72/XC-BX를 제작하였다.
제작된 pSP72/XC-BX를 주형으로 하고, 위치-지정 변이유발 키트를 (Stratagene, USA)를 이용하여 Rb 결합부위를 결손 또는 치환시켰다. CR1 및 CR2 부위의 치환 및 결손에 따른 돌연변이 양상과 돌연변이 유도 프라이머 세트는 각각 표 1 및 2에 명시되어 있다.
Rb 결합 부위가 결손 또는 치환된 총 10 종류의 pSP72/XC-BX-mt 벡터들에 대한 염기서열 분석을 시행하여 각각의 돌연변이된 부위들의 염기서열들을 확인하였다. 돌연변이된 아데노바이러스 E1 부위를 아데노바이러스 E1 셔틀벡터에 재도입하기 위하여, 10 종류의 pSP72/XC-BX 돌연변이체들을 각각 BamHI/XbaI으로 처리하여 E1 부위를 잘라내고 이를 다시 pXC1의 BamHI/XbaI site에 다시 도입하여 총 10 종류의 아데노바이러스 E1 셔틀벡터들 (pXCmt#1, pXCmt#3∼11)을 제작하였다.
제작된 10 개의 pXC 돌연변이체들을 각각 XmnI으로 처리하여 선형화하고, 이를 BstBI 제한효소로 처리한 아데노바이러스 전체 플라스미드인 pvmdl324Bst(Dr. Verca, University of Fribourg, 스위스; Heider, H. et al., Biotechniques, 28(2):260-265, 268-270(2000))와 함께 상동재조합이 가능한 BJ5183 대장균에 동시 형질전환시켜 Rb 결합 부위가 소실된 아데노바이러스 플라스미드들(pAd-E1mt#1, pAd-E1mt#3∼#11)을 제작하였다. 이들 10 종류의 아데노바이러스 플라스미드들은 PacI 제한효소를 처리하여 선형화한 뒤, 293 세포주에 형질전환하여 아데노바이러스를 생산하였다(도 1).
또한, Rb 결합 부위와 p53 결합 부위가 동시에 소실된 아데노바이러스를 제작하기 위해서는, E1A 변이 바이러스들 중 Ad-E1mt#7를 ScaI/XbaI 제한효소로 처리하여 약 2.2 kb 크기의 E1 부위를 잘라내고, 이를 E1B 부위가 완전히 결손된 pΔE1B19/55 벡터 (KFCC 11288)의 ScaI/XbaI 부위에 도입하여 pΔBmt#7 E1 셔틀벡터를 제작하였다. 제작된 pΔBmt#7 E1 셔틀벡터는 상기한 방법으로 pvmdl324Bst 와 함께 상동재조합된 뒤, 293 세포주에 형질전환시켜 Ad-ΔB7 아데노바이러스를 생산하였다 (도 3a). 상기 Ad-ΔB7 아데노바이러스는 국제기탁기관 한국미생물보존센터에 2004년 4월 23일자로 기탁하고, 기탁번호 KCCM-10569 을 부여받았다.
도 1에서, Glu(E)::Gly(G)는 E1A 전체 아미노산 서열중에서 45번째 Glu가 Gly으로 치환된 것을 나타내고, Deletion of 7 a. a는 121-127번 아미노산 서열이 제거된 것을 나타내며, Deletion of 31 a. a는 30-60번 아미노산 서열이 제거된 것을 나타내고, 7 a.a (DLTCHEA):: 7 a.a (GGGGGGG)은 121-127번째에 위치한 DLTCHEA 아미노산 서열이 7개의 글라이신 잔기로 치환된 것을 나타내며, Cys (C):: Gly (G)는 124번째 시스테인이 글라이신으로 치환된 것을 나타낸다.
대조군으로 사용된 바이러스들은 E1 부위가 완전히 결손되어서 바이러스의 복제가 불가능한 Ad-ΔE1 아데노바이러스와 E1B 55kDa 유전자가 결손된 Ad-ΔE1B55 (YKL-1, 대한민국 특허출원 제 1999-33011 호 참조), 그리고 E1 부위가 야생형인 Ad-wt 아데노바이러스들이었으며, 한정희석분석 (limiting dilution assay)과 분광기를 이용하여 생산된 아데노바이러스들의 역가를 산출하였다.
프라이머 이름 프라이머 서열
CR1(E::G) 센스 5'-CCACCTACCCTTCACGGACTGTATGATTTAGAC-3'
안티센스 5'-GTCTAAATCATACAGTCCGTGAAGGGTAGGTGG-3'
CR2(Δ7a.a) 센스 5'-CTTGTACCGGAGGTGATCGGCTTTCCACCCAGTGACG-3'
안티센스 5'-TCACTGGGTGGAAAGCCGATCACCTCCGGTACAAG-3'
CR1(Δ30a.a) 센스 5'-ATCGAAGAGGTACTGGCTGCGGTTTCGCAGATTTTTC-3'
안티센스 5'-AAATCTGCGAAACCGCAGCCAGTACCTCTTCGAT-3'
CR2(7Gly) 센스 5'-GTACCGGAGGTGATCGGTGGTGGCGGAGGCGGGGGTGGCTTTCCACCCAG-3'
안티센스 5'-CTGGGTGGAAAGCCACCCCCGCCTCCGCCACCACCGATCACCTCCGGTAC-3'
CR2(C::G) 센스 5'-GTGATCGATCTTACCGGCCACGAGGCTGGC-3'
안티센스 5'-GCCAGCCTCGTGGCCGGTAAGATCGATCAC-3'
변이체명 변이 형태
CR1 CR2
Ad-E1Amt#1 E::G -
Ad-E1Amt#3 Δ30a.a -
Ad-E1Amt#4 E::G Δ7a.a
Ad-E1Amt#5 Δ30a.a Δ7a.a
Ad-E1Amt#6 - 7a.a::7Gly
Ad-E1Amt#7 E::G 7a.a::7Gly
Ad-E1Amt#8 Δ30a.a 7a.a::7Gly
Ad-E1Amt#9 - C::G
Ad-E1Amt#10 E::G C::G
Ad-E1Amt#11 Δ30a.a C::G
아데노바이러스의 증식 및 세포 살상능 검증(cytopathic effect assay)
인체 종양세포와 정상세포에 대한 아데노바이러스의 살상능력을 검증하기 위하여, 간암 세포주(Hep3B), 뇌암 세포주(U343), 자궁암 세포주(C33A), 폐암 세포주(A549) 등의 인체 암세포주들과 BJ, 173WE 및 MRC5와 같은 정상 세포주들을 24-웰 플레이트에 분주하고 24시간 후 각각의 아데노바이러스를 여러 역가로 감염시켰다. 가장 낮은 역가의 바이러스로 감염시킨 세포들이 거의 사멸된 시점에 배지를 제거하고 플레이트 바닥에 남아있는 세포들을 0.5% 크리스탈 바이올렛(50% 메탄올)으로 고정하고 염색한 후 아데노바이러스의 세포 살상능을 분석하였다.
MTT 분석
종양 특이적 살상 아데노바이러스의 시간에 따른 세포 살상능을 정량화하기 위해, MTT 분석을 시행하였다. 암 세포주와 정상 세포주들을 24-웰 플레이트에 각각 30-80% 컨플루언시로 분주하고 24시간 후 Ad-ΔE1, Ad-E1mt#7, Ad-ΔE1B, Ad- ΔB7, Ad-ΔE1B55, 또는 Ad-wt 아데노바이러스를 Hep3B는 2 MOI, C33A는 5 MOI, A549와 U343은 10 MOI, 그리고 정상 세포주인 BJ, 173WE, MRC5는 50, 20, 20 MOI로 각각 감염시켰다. 일정 시간 간격으로 200 ㎕의 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide, 2 mg/㎖) 용액을 플레이트 웰에 첨가하여 4시간 동안 37℃에서 반응시킨 후 상층액을 제거하였다. 남아 있는 웰에 1 ㎖의 DMSO (dimethyl sulphoxide)를 첨가하고 37℃ 에서 10분간 반응시킨 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 상대적 생존율을 측정하였다.
면역블롯팅 분석
여러 종류의 종양세포주들과 정상세포주들에 Ad-ΔE1, Ad-E1mt#7, Ad-ΔE1B, Ad-ΔB7, Ad-ΔE1B55, 또는 Ad-wt 아데노바이러스를 각각 10 또는 100 MOI로 감염시키고 48시간 후 감염된 세포를 회수하여 라이시스 완충액 (50mM HEPES containing 0.15M NaCl, 0.5% Nonidet P-40 및 프로테아제 억제제: PMSF, TLCK and TPCK)으로 세포들을 용해시켜 SDS-PAGE를 시행하였다. 전기영동 후 젤에 있는 단백질들을 PVDF (polyvinylidene fluoride) 막에 전기이동 시킨 후, 아데노바이러스 파이버 단백질을 특이적으로 인지하는 항체를 일차 항체 (MS-1026-P; Neomarkers, Fremont, CA)로 혼성화시키고, HRP (horseradish peroxidase)가 결합된 염소 항-토끼 IgG를 이차항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)로 혼성화시킨 뒤, ECL(Amersham, Buckinghamshire, UK) 방법으로 X-선 필름에 감광시켜 아데노바이러스 파이버 단백질의 발현양상을 확인하였다.
종양 특이적 살상 아데노바이러스의 생체내 항종양 효과 검증
생후 7-8주 정도 경과된 누드 생쥐에 1 x 107개의 인체 자궁암 세포주 C33A를 복부 피하에 주사하였다. 종양의 용적이 약 60-80 mm3 정도 되었을 때, 5 x 107 PFU (plaque forming unit)의 Ad-ΔE1B, Ad-ΔE1B7, Ad-E1mt#7 아데노바이러스 또는 음성 대조군으로서 PBS를 각각 이틀 간격으로 세 번 종양 내에 직접 주사한 후 종양의 크기를 2-3일 간격으로 측정하였다. 종양의 용적은 캘리퍼로 종양의 단축과 장축을 측정하여 다음과 같은 공식으로 산출하였다: 종양의 용적(mm3) = (단축 mm)2 x 장축 mm x 0.523
실험 결과
E1A 변이형 아데노바이러스들의 종양세포 및 정상세포 살상능 비교 검증
본 연구에서 제작한 10 종류의 E1A 돌연변이 아데노바이러스들(Ad-E1mt#1, Ad-E1mt#3∼#11)의 종양세포 살상능을 비교 검증하기 위해, 여러 종류의 인체 암세포주들(Hep3B, C33A, A549, U343)을 각각의 아데노바이러스로 감염시키고, 아데노바이러스의 증식능에 따른 세포 살상을 관찰하였다. 복제 불능 바이러스인 Ad-ΔE1과 야생형인 Ad-wt를 각각 음성 대조군과 양성 대조군으로 사용하였으며, 또한 p53 의존적으로 세포를 살상할 수 있는 종양 특이적 살상 아데노바이러스인 Ad-ΔE1B55(YKL-1) 바이러스를 비교 실험 대조군으로 사용하였다.
도 2a에서 보는 바와 같이 음성대조군으로 감염된 세포들에서는 바이러스의 복제가 일어나지 않아 세포 살상 효과가 전혀 관찰되지 않았으나, 복제 가능 아데노바이러스들로 감염된 세포들에서는 각각 다른 정도의 세포 살상효과를 관찰할 수 있었다. E1A 돌연변이 아데노바이러스들 중 31개의 아미노산을 코딩하는 유전자들이 결손된 Ad-mt#3, #5, #8, #11 변이형 아데노바이러스들은 모든 종양 세포주들에서 현격히 낮은 세포 살상능을 유도하였다. 이에 반해서, E1A 유전자의 CR1 또는 CR2 부위 중 하나 또는 두개의 아미노산이 글라이신으로 치환된 아데노바이러스들인 Ad-mt#1, #9, #10들과 일곱 개의 아미노산이 결손 또는 글라이신으로 치환된 Ad-mt#4, #6, #7 변이형 아데노바이러스들은 야생형과 비슷하거나 약간 낮은 암세포 살상능을 유도하였다.
종양세포 살상능이 비교적 높은 Ad-mt#1, #4, #6, #7, #9 및 #10 변이형 아데노바이러스들의 복제능과 이에 따른 세포 살상능이 인체 정상 세포주에서는 어떻게 변화하는지를 조사하기 위하여, 이들 아데노바이러스들을 각각 BJ, 173WE, MRC5와 같은 정상 세포주들에 감염시킨 후 그 변화를 관찰하였다 (도 2b). BJ 정상 세포주에서는 Ad-mt#10을 제외한 E1 변이형 아데노바이러스들과 Ad-ΔE1B55 아데노바이러스가 Ad-wt에 비해 낮은 세포 살상능을 유도하였으며, 173We와 MRC5 세포주에서는 Ad-E1mt#7과 Ad-ΔE1B55 아데노바이러스만이 Ad-wt에 비해 낮은 세포 살상능을 유도하였다.
이러한 결과들을 종합해 보면, Ad-E1mt#7 변이형 아데노바이러스는 여러 종 류의 종양 세포주들에서는 매우 높은 살상능을 유도하는 반면 정상 세포주들에서는 세포 살상능이 현격히 감소하여 종양세포 선택적 살상을 유도할 수 있음을 확인하였다. 특히, Ad-E1mt#7 변이형 아데노바이러스는 암세포 특이적 살상을 유도할 수 있다고 알려진 대조군 Ad-ΔE1B55 아데노바이러스보다도 정상 세포에서의 살상능이 감소하여 암세포 선택적 살상능이 매우 우수함을 알 수 있었다.
Ad-ΔB7 아데노바이러스의 제작 및 종양세포 선택적 살상능 검증
본 연구실에서 보고 된 연구 결과들에 의하여, 세포고사 억제기능을 가진 E1B 19kDa 유전자가 소실되고 동시에 E1B 55kDa 유전자가 소실된 Ad-ΔE1B 아데노바이러스 (KFCC 11288)는 E1B 55kDa 유전자만 소실된 Ad-ΔE1B55 아데노바이러스에 비해서 더 높은 효율의 종양세포 선택적 살상능을 유도한다는 것을 확인한 바 있다
이에 따라, 본 연구에서 확인된 Ad-E1mt#7 변이형 아데노바이러스의 암세포 선택적 살상능을 더욱 개선할 목적으로, Ad-E1mt#7 변이형 아데노바이러스의 E1B 55kDa 유전자와 E1B 19kDa 유전자들을 결손시켜 Ad-ΔB7 종양 특이적 살상 아데노바이러스를 제작하였다 (도 3a).
제작된 Ad-ΔB7 아데노바이러스의 종양세포 및 정상세포 살상능을 검증하기 위해서, 음성대조군으로서 Ad-ΔE1과 실험대조군으로서 Ad-ΔE1B55, Ad-ΔE1B, Ad-E1mt#7, 그리고 Ad-wt 아데노바이러스들과 함께 여러 농도의 역가로 세포들을 감염시킨 후 세포 살상 정도를 비교 관찰하였다. 본 연구에 사용된 모든 암세포주들(Hep3B, C33A, A549, U343)에서 Ad-ΔB7 아데노바이러스는 Ad-ΔE1B55 아데노바이러스에 비해 약 5-50배 정도 높은 세포 살상능을 유도하였으며, 야생형 아데노바이러스인 Ad-wt과는 거의 유사하거나 약 5배 정도 빠른 세포 살상능을 유도하였다 (도 3b).
이에 반하여 정상 세포주들(BJ, 173WE, MRC5)에서는 Ad-ΔB7 아데노바이러스의 세포 살상능이 Ad-wt 아데노바이러스에 비해 약 10-100 배정도 낮았으며, 암세포 선택성이 있는 대조군인 Ad-ΔE1B55 아데노바이러스 보다도 약 5-20배 정도 낮았다 (도 3c).
이러한 결과들을 종합해 볼 때, Ad-ΔB7 아데노바이러스의 세포 살상능은 Ad-ΔE1B55 아데노바이러스에 비해 암 세포들에서는 증가된 반면에 정상세포들에서는 상당히 감소하여, Ad-ΔB7 아데노바이러스의 우수한 암세포 선택적 살상능을 확인할 수 있었다.
E1B 유전자들의 유무 혹은 E1A 유전자의 돌연변이에 따른 아데노바이러스의 시간에 따른 세포 살상능을 정량화하기 위해, 여러 종류의 암세포주들(Hep3B, C33A, A549, U343)과 정상 세포주들(BJ, 173WE, MRC5)을 Ad-ΔE1B55, Ad-ΔE1B, Ad-E1mt#7, Ad-wt와 같은 복제 가능 아데노바이러스와 음성 대조군 아데노바이러스인 Ad-ΔE1로 각각 감염시킨 후 일정시간 간격으로 MTT 분석을 시행하여 세포의 생존율을 측정하였다 (도 4).
각 바이러스 감염에 따른 세포 생존율은 각각의 세포주에 바이러스를 처리하지 않은 경우의 세포 생존율을 100%로 환산하여 상대 비교하였다. 복제 불능 아 데노바이러스인 Ad-ΔE1을 처리한 모든 세포주에서는 바이러스 복제에 따른 세포 살상이 유도되지 않아 바이러스를 처리하지 않은 세포주와 유사한 수준의 세포생존율을 보인 반면, 복제 가능 아데노바이러스들을 투여한 암 세포주들의 경우에는 시간이 경과함에 따라 세포 사멸이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.
특히, Ad-ΔB7 아데노바이러스는 야생형 아데노바이러스인 Ad-wt과 유사하거나 보다 빠른 암 세포 살상을 유도하였다. 이에 반하여, 정상 세포주들에서는 Ad-ΔB7 아데노바이러스의 세포살상능이 현격히 감소하여 암세포 특이적 세포살상능을 확인할 수 있었다. 즉, Ad-ΔB7 아데노바이러스를 BJ, 173WE, 그리고 MRC5 세포주에 각각 50, 20, 20 MOI로 감염시킨 경우, 바이러스 감염 후 약 20, 16, 12일 경에도 거의 대부분의 세포들이 생존하여 바이러스를 처리하지 않은 세포주의 생존율과 비슷한 정도의 높은 세포 생존율을 관찰하였다.
이와는 대조적으로, 정상 세포주들을 Ad-wt 아데노바이러스로 감염시킨 경우에는 바이러스 감염 후 시간이 경과함에 따라 세포 생존율이 급격하게 감소하여 BJ, 173We, MRC5 세포주의 경우에는 바이러스 감염 후 12-20일 경에 각각 약 40%, 35%, 40%의 세포들만이 생존함을 관찰하였다. 실험대조군으로 사용한 종양 특이적 살상 아데노바이러스들인 Ad-ΔE1B55, Ad-ΔE1B, 또는 Ad-E1mt#7를 감염시킨 경우에는, BJ, 173We, MRC5 세포주들에서 약 60-90%의 세포 생존율이 관찰되어 Ad-ΔB7 아데노바이러스에 비하여 정상세포주들에 대한 세포살상능이 높음을 알 수 있었다.
이러한 결과들로, 본 연구에서 제작한 Ad-ΔB7 아데노바이러스의 암세포 특 이적 살상능이 기존의 종양 특이적 살상 아데노바이러스들인 Ad-ΔE1B55, Ad-ΔE1B, 또는 Ad-E1mt#7에 비하여 월등히 우수함을 다시 한번 확인할 수 있었다.
Ad-ΔB7 아데노바이러스의 종양 세포 선택적 복제능 검증
Ad-ΔB7 아데노바이러스의 종양 선택적 복제 여부를 조사하기 위해, 여러 종류의 인체 종양 세포주들과 정상 세포주들을 Ad-ΔE1, Ad-ΔE1B55, Ad-ΔE1B, Ad-E1mt#7, Ad-ΔB7, 또는 Ad-wt 아데노바이러스로 감각 감염시키고, 아데노바이러스에 의해 발현되는 파이버 단백질의 발현 양상을 알아보았다.
도 5에서 볼 수 있듯이, Hep3B, C33A, A549, U343과 같은 종양 세포주들에서는 Ad-ΔE1 바이러스를 제외한 모든 아데노바이러스들의 복제가 활발히 일어나 파이버 단백질이 다량으로 발현된 반면, 정상 세포주들에서는 다양한 파이버 발현 양상이 관찰되었다.
종양 세포 특이성이 없는 Ad-wt 아데노바이러스의 경우에는 감염된 모든 정상 세포주들에서 파이버 단백질이 높게 발현되어 바이러스의 복제가 활발히 일어남을 확인하였다. 이에 반하여 Ad-ΔB7 아데노바이러스로 감염된 모든 정상 세포주들에서는 파이버 단백질이 전혀 발현되지 않아 암세포 특이적 복제능을 확인할 수 있었다. 하지만 대조군 아데노바이러스들(Ad-mt#7, Ad-ΔE1B55, Ad-ΔE1B)을 감염시킨 몇 몇 정상 세포주들(BJ, 173WE, MRC5)에서는 파이버 단백질이 발현되어 야생형 아데노바이러스에 비해서는 제한적이지만 아데노바이러스의 복제가 일어난다는 것을 확인하였다.
이러한 결과들에 따라, Ad-ΔB7 아데노바이러스의 종양 세포 특이적 복제능이 본 연구에서 대조군으로 비교한 여러 종양 특이적 살상 아데노바이러스들(Ad-mt#7, Ad-ΔE1B55, Ad-ΔE1B) 보다 훨씬 우수함을 알 수 있었다. 또한, 본 연구 결과는 앞서 진행한 종양세포 특이적 살상능 검증 실험들(CPE 분석과 MTT 분석)에서 확인된 Ad-ΔB7 아데노바이러스의 우수한 종양 세포 특이적 살상능이 아데노바이러스의 암세포 특이적 복제능에 기인한다는 것을 뒷받침해준다.
Ad-ΔB7 아데노바이러스의 생체내 항종양 효과 검증
Ad-ΔB7 아데노바이러스의 생체내 항종양 효과를 인체 자궁암 이종이식 모델 (xenograft model)에서 확인하였다. C33A 세포를 누드 마우스의 복부 피하에 주사하고 형성된 종양에 5 x 107 PFU의 Ad-ΔE1B, Ad-E1mt#7, 또는 Ad-ΔB7을 이틀 간격으로 3번 종양 내 투여한 후 종양의 성장을 관찰하였다 (도 6). 음성 대조군인 PBS를 투여 받은 생쥐의 경우, 바이러스 투여 후 40일 이후에 종양의 용적이 약 2000 mm3 이상으로 급격히 성장하였으나, 종양 특이적 살상 아데노바이러스인 Ad-ΔE1B, Ad-E1mt#7, 또는 Ad-ΔB7을 주사한 경우에는 종양의 성장이 크게 지연됨을 확인하였다(p<0.01).
즉, Ad-ΔE1B, Ad-E1mt#7, 또는 Ad-ΔB7 아데노바이러스를 투여 받은 생쥐의 경우, 바이러스 투여 후 41일에 종양의 용적이 각각 1042.7 ± 264.5 mm3, 465.3 ± 78.2 mm3, 446.9 ± 122.3 mm3로, 이들 아데노바이러스의 뚜렷한 항종양 효과를 관찰할 수 있었다. 특히, Ad-ΔE7의 항종양 효과는 E1A 유전자에만 변이가 일어난 Ad-E1mt#7 아데노바이러스의 항종양 효과와 유사하였지만, E1B 유전자가 결손된 아데노바이러스인 Ad-ΔE1B의 항종양 효과에 비해서는 우수함을 확인하였다(p<0.05). 또한 Ad-ΔB7 아데노바이러스를 투여한 총 9 마리의 마우스들 중 2 마리는 바이러스 투여 후 25일과 30일 경 이후에 종양이 완전히 소멸되는 것을 관찰할 수 있었다.
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 ElA 유전자 서열에 위치한 Rb 결합 부위 및/또는 E1B 19 유전자와 E1B 55 유전자가 조작된 재조합 아데노바이러스를 제공한다. 또한, 본 발명은 상술한 신규한 재조합 아데노바이러스를 포함하는 약제학적 항종양 조성물을 제공한다. 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 종래의 재조합 아데노바이러스와 비교하여 종양세포-특이 세포살상능이 크게 개선되어, 보다 안전하고 효과적인 암 유전자 치료를 가능하게 한다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (25)

  1. ElA 유전자 서열에 위치한 Rb 결합 부위인 CR1 또는 CR2를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 다음 (a) 및 (b)의 변이가 발생되어 Rb와의 결합능이 상실되어 있고, E1B 19 유전자 및 E1B 55 유전자 둘 모두 결실되어 있는 것을 특징으로 하는, 개선된 종양세포-특이 세포살상능을 나타내는 재조합 아데노바이러스:
    (a) CR1부위로서 ElA 단백질의 45번째 Glu 잔기가 Gly으로 치환된 변이;
    (b) CR2부위로서 ElA 단백질의 121-127번째 아미노산 서열이 전부 Gly으로 치환된 변이
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  25. (a) 상기 제 1 항의 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량; 및
    (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 항종양 조성물.
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