JP6014029B2 - Ｒｅｉｃ発現アデノウイルスベクター - Google Patents

Description

本発明は、プロモーター、エンハンサー等を含み、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質を高発現するアデノウイルスベクターに関する。

以前より、遺伝子発現効率を上昇させるために、ＣＭＶプロモーターやＣＡＧプロモーターなど様々な遺伝子発現プロモーターが開発されている（特許文献１〜４）。しかしながら、バイオテクノロジーの分野では、これらの従来技術を用いても、細胞の種類や遺伝子の種類によって、遺伝子発現がほとんど起こらない、又は発現タンパク質量が極めて少ないといった問題が日常的に発生している。また、この問題は、遺伝子発現を診断や治療に用いる医療の発展において、大きな障壁となっている。
一方、細胞の不死化に関連した遺伝子として、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子が知られており、がん細胞ではこの遺伝子の発現が抑制されていることが報告されており、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子を癌治療に用いることも報告されている（特許文献５）。

特許公報第２８１４４３３号公報 特許公報第２８１４４３４号公報 米国特許第５１６８０６２号明細書 米国特許第５３８５８３９号明細書 国際公開第ＷＯ０１／０３８５２３号パンフレット

本発明は、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質を高発現するアデノウイルスベクターの提供を目的とする。
本発明者らは、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子を癌の遺伝子治療に用いることについて検討を行ってきた。ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子を発現ベクターに組込み、生体内に投与することにより、癌治療に一定の効果を奏することを見出していた。本発明者らは、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子を生体内においてより高発現させることにより、より癌の治療効果が高まる可能性を考慮し、より高発現させる方法について鋭意検討を行った。
本発明者は、プロモーターを利用した遺伝子発現システムにおいて、より高い効率で遺伝子を発現させることができる新しいシステムの開発を試み、様々な遺伝子のプロモーターやエンハンサーの組み合わせによるプロモーター活性の比較、検討を行った。
その結果、プロモーターとしてＣＭＶプロモーターを用い、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｒｏｖｉｒｕｓ）プロモーターの下流にＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡを連結し、該ＤＮＡの下流にｐｏｌｙＡ配列を連結し、さらにその下流にｈＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）エンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー及びＣＭＶエンハンサーをこの順で連結したエンハンサーを連結したコンストラクトをアデノウイルスベクターに挿入し、該アデノウイルスベクターを生体に投与することにより、生体でＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子が著しく高発現し、著しく優れた癌治療効果を発揮することを見出し本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ ５’末端側から、
（ｉ）ＣＭＶプロモーター；
（ｉｉ）以下のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡ：
（ａ） 配列番号１に表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ） 配列番号１に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、癌細胞死誘導活性及び／又は腫瘍細胞増殖抑制活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ） 配列番号１に表わされる塩基配列中の第１番目の塩基に始まり第１１７番目の塩基〜第２３４番目のいずれかの塩基に終わる塩基配列からなるポリヌクレオチド；又は
（ｄ） 配列番号１に表わされる塩基配列中の第１番目の塩基に始まり第１１７番目の塩基〜第２３４番目のいずれかの塩基に終わる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、癌細胞死誘導活性及び／又は腫瘍細胞増殖抑制活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）ｐｏｌｙＡ付加配列；並びに
（ｉｖ）ｈＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）エンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー及びＣＭＶエンハンサーをこの順で連結したエンハンサーを連結した、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡを発現させるためのＤＮＡコンストラクト。
［２］ ｐｏｌｙＡ付加配列がウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリＡ付加配列（ＢＧＡ ｐｏｌｙＡ）である、［１］のＤＮＡコンストラクト。
［３］ 配列番号６に示す、（ｉｉ）ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡ、（ｉｉｉ）ｐｏｌｙＡ付加配列、及び（ｉｖ）ｈＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）エンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー及びＣＭＶエンハンサーをこの順で連結したエンハンサーを連結した塩基配列を含む、［１］又は［２］のＤＮＡコンストラクト。
［４］ ［１］又は［２］のＤＮＡコンストラクトを含むアデノウイルスベクター。
［５］ ［４］のアデノウイルスベクターを含む癌細胞死誘導剤。
［６］ ［４］のアデノウイルスベクターを含む腫瘍細胞増殖抑制剤。
［７］ ［４］のアデノウイルスベクターを含む癌治療薬。
５’末端側から、（ｉ）ＣＭＶプロモーター；（ｉｉ）ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡ；（ｉｉｉ）ｐｏｌｙＡ付加配列；及び（ｉｖ）ｈＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）エンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー及びＣＭＶエンハンサーをこの順で連結したエンハンサーを連結した、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡを発現させるためのＤＮＡコンストラクトを含むアデノウイルスベクターは生体中でＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡを高発現し、ＣＭＶプロモーターやＣＡＧプロモーターの下流にＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡを連結し、上記エンハンサーを有しないＤＮＡコンストラクトを含むアデノウイルスベクターよりも高い発現を示し、癌選択的細胞死を誘導し、腫瘍増殖を抑制し得る。従って、本発明の上記アデノウイルスベクターはＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡを用いた癌の遺伝子治療に好適に用いることができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１１−１１７３２１号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

図１は、本発明のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡ発現用コンストラクトの構造を示す図である。
図２は、本発明のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡ発現用コンストラクトの塩基配列を示す図である。
図３は、作製した本発明のコンストラクトを含むアデノウイルスベクターのインサートの確認の結果を示す図である。
図４は、作製した本発明のコンストラクトを含むアデノウイルスベクターの構造確認の結果を示す図である。
図５は、精製した本発明のコンストラクトを含むアデノウイルスベクターの構造確認の結果を示す図である。
図６は、作製した本発明のコンストラクトを含むアデノウイルスベクターのＲＣＡ（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）チェックの結果を示す図である。
図７は、種々のベクターを用いた場合のＲＥＩＣ−Ｄｋｋ−３遺伝子発現の強さを示す図である。
図８は、種々のベクターを用いた場合の細胞死誘導の程度を示す図である。
図９は、種々のベクターを用いた場合の腫瘍増殖抑制効果を示す図である（その１）。
図１０は、種々のベクターを用いた場合の腫瘍増殖抑制効果を示す治療後の腫瘍を示す図である。
図１１は、種々のベクターを用いた場合の腫瘍増殖抑制効果を示す図である（その２）。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡを含み、ＲＥＩＣタンパク質の発現に用いることができるＤＮＡコンストラクト（ＤＮＡ構築物）であり、さらに該ＤＮＡコンストラクトを含む組換えアデノウイルスベクターである。本発明のＤＮＡコンストラクトの構造を図１に示す。
ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡの塩基配列は、配列番号１に表される。また、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡがコードするＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質のアミノ酸配列は配列番号２に表される。本発明において、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３をＲＥＩＣと呼ぶこともある。
また、本発明のＤＮＡコンストラクトに含まれるＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３のＤＮＡは、配列番号１に表される塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、配列番号１に表される塩基配列と、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の配列同一性を有しているＤＮＡ、又は前記ＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１又は複数若しくは数個（１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１個若しくは２個）のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡなどのうち、癌細胞の細胞死誘導活性及び／又は腫瘍細胞増殖抑制活性を有するタンパクをコードするものである。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「１ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、３７℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．５ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、４２℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．２ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、６５℃」程度の条件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡの単離を期待し得る。ただし、上記のＳＳＣ、ＳＤＳ及び温度の条件の組み合わせは例示であり、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間などを適宜組み合わせることにより、必要なストリンジェンシーを実現することが可能である。「ストリンジェントな条件」は、当業者ならば配列同一性が高いＤＮＡがハイブリダイズする条件として適宜決定することができる。さらに、本発明のＤＮＡコンストラクトに含まれるＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３のＤＮＡは、配列番号２に表されるタンパク質をコードするＤＮＡである。
さらに、本発明のＤＮＡコンストラクトが含有するＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡは、該ＤＮＡの塩基配列の一部塩基配列からなる断片ヌクレオチドであって、癌細胞死誘導活性及び／又は腫瘍細胞増殖抑制活性を有するペプチドをコードするヌクレオチドも含まれる。このような断片ヌクレオチドは、全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡを適当な部位で切断し、癌細胞死誘導活性及び／又は腫瘍細胞増殖抑制活性を有するかどうか測定することにより容易に得ることができる。このような断片ヌクレオチドとして、例えば、配列番号１に表わされるＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡの塩基配列中の第１番目の塩基に始まり第１１７番目の塩基〜第２３４番目のいずれかの塩基に終わる塩基配列からなるポリヌクレオチド、並びに配列番号１に表わされるＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡの塩基配列中の第１番目の塩基に始まり第１１７番目の塩基〜第２３４番目のいずれかの塩基に終わる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、癌細胞死誘導活性及び／又は腫瘍細胞増殖抑制活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。配列番号１に表わされるＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡの塩基配列中の第１番目の塩基に始まり第１１７番目の塩基〜第２３４番目のいずれかの塩基に終わる塩基配列からなるポリヌクレオチドとしては、第１番目の塩基から第１１７番目の塩基からなるポリヌクレオチド（配列番号３）又は第１番目から第２３４番目の塩基からなるポリヌクレオチド（配列番号４）が挙げられる。これらのポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが癌細胞死誘導活性及び／又は腫瘍細胞増殖抑制活性を有することは、例えば、特開２００９−１１４１０３号公報に示される。
ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡは、配列番号１の配列情報に基づいて、ヒト細胞、ヒト組織等から得ることができる。また、ＷＯ０１／０３８５２３号公報の記載に従って得ることも可能である。
上記ＤＮＡコンストラクトは、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡの上流にＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｒｏｖｉｒｕｓ）プロモーターが連結され、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡの下流に、ポリＡ付加配列（ポリアデニル化配列、ｐｏｌｙＡ）が連結される。ポリＡ付加配列（ポリアデニル化配列、ｐｏｌｙＡ）の由来は限定されず、成長ホルモン遺伝子由来のポリＡ付加配列、例えばウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリＡ付加配列（ＢＧＡ ｐｏｌｙＡ）（配列番号５に示す塩基配列に含まれる（１３番目の塩基以降の配列））やヒト成長ホルモン遺伝子由来ポリＡ付加配列、ＳＶ４０ウイルス由来ポリＡ付加配列、ヒトやウサギのβグロビン遺伝子由来のポリＡ付加配列等が挙げられる。ポリＡ付加配列をＤＮＡコンストラクトに含ませることにより、転写効率が増大する。さらに、該ポリＡ付加配列の下流にｈＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）エンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー及びＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｒｏｖｉｒｕｓ）エンハンサーをこの順で連結したもの（３×ｅｎｈ）が連結されている（図２の「３×ｅｎｈ」部分に配列が示され、図２の配列は配列番号６に示す）。すなわち、上記ＤＮＡコンストラクトは、５’末端側から（ｉ）ＣＭＶプロモーター、（ｉｉ）ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡ、（ｉｉｉ）ｐｏｌｙＡ付加配列、並びに（ｉｖ）ｈＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）エンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー及びＣＭＶエンハンサーをこの順で連結したエンハンサーを連結したコンストラクトである。
上記の各エレメントは、機能的に連結している必要がある。ここで、機能的に連結しているとは、それぞれのエレメントがその機能を発揮して、発現させようとする遺伝子の発現が増強されるように連結していることをいう。
上記の発現用カセットは、例えば、市販のＣＭＶプロモーターの下流に外来遺伝子挿入部位を含み、さらにその下流にＢＧＡ ｐｏｌｙＡ配列を含むｐＳｈｕｔｔｌｅベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）にＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡを挿入し、さらにＢＧＡ ｐｏｌｙＡ配列の下流にｈＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）エンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー及びＣＭＶエンハンサーをこの順で連結することにより得ることができる。
本発明のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡを含むＤＮＡコンストラクトのＣＭＶプロモーターを除く部分の構造を図２に示し、配列を配列番号６に示す。図２中、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡと３×ｅｎｈの間にＢＧＡ ｐｏｌｙＡ配列が含まれる。本発明のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡを含むＤＮＡコンストラクトは配列番号４に示す配列の上流（５’側）にＣＭＶプロモーターを有する。
本発明の上記ＤＮＡコンストラクトは、アデノウイルスベクターに導入して用いる。本発明は上記のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡを発現させるための発ＤＮＡコンストラクトを含むアデノウイルスベクターも包含する。本発明のＤＮＡコンストラクトを含むベクターシステムをＳＧＥ（Ｓｕｐｅｒ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）システムと呼び、例えば、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡ及びＣＭＶプロモーターを含むＤＮＡコンストラクトを含むアデノウイルスベクターをＡｄ−ＳＧＥ−ＣＭＶ−ＲＥＩＣと呼ぶ。上記のＤＮＡコンストラクトを含むアデノウイルスベクターは、アデノウイルスベクターに上記ＤＮＡコンストラクトを導入して組換えアデノウイルスを作製することにより得られる。アデノウイルスへのＤＮＡコンストラクトの導入は、例えば上記の本発明のＤＮＡコンストラクトを含むｐＳｈｕｔｔｌｅベクター中のＤＮＡコンストラクトをアデノウイルスに導入することにより行うことができる。
アデノウイルスベクターの特徴として、（１）多くの種類の細胞に遺伝子導入ができる、（２）増殖停止期の細胞に対しても効率よく遺伝子導入ができる、（３）遠心により濃縮が可能であり、高タイター（１０〜１１ＰＦＵ／ｍｌ以上）のウイルスが得られる、（４）ｉｎ ｖｉｖｏの組織細胞への直接の遺伝子導入に適している、といった点が挙げられる。
遺伝子治療用のアデノウイルスとしては、Ｅ１／Ｅ３領域を欠失させた第１世代のアデノウイルスベクター（Ｍｉｙａｋｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９３，１３２０，１９９６）から、Ｅ１／Ｅ３領域に加え、Ｅ２もしくはＥ４領域を欠失させた第２世代のアデノウイルスベクター（Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，８９４４，１９９６；Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ，Ｈ．＆Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０，２０１３，１９９９）、アデノウイルスゲノムをほぼ完全に欠失させた（ＧＵＴＬＥＳＳ）第３世代のアデノウイルスベクター（Ｓｔｅｉｎｗａｅｒｄｅｒ，Ｄ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３，９３０３，１９９９）が開発されているが、本発明に係る遺伝子を導入するには、特に限定されずいずれのアデノウイルスベクターでも使用可能である。
本発明のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡを含むＤＮＡコンストラクトを含む組換えアデノウイルスベクターをヒトやその他の哺乳動物である被験体に投与することにより、被験体の癌細胞に癌治療用遺伝子がデリバリーされ、癌細胞中で遺伝子が発現し、癌細胞に選択的に細胞死を誘導し、及び／又は腫瘍細胞増殖を抑制し癌治療効果を発揮する。本発明は、このようなアデノウイルスベクターを含む癌治療用ウイルス製剤を包含する。治療対象となる癌としては、限定されないが、例えば、脳・神経腫瘍、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝癌、リンパ腫・白血病、結腸癌、膵癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、副腎癌、腎癌、腎盂尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫、中皮腫等が挙げられる。本発明のアデノウイルスベクターは原発性癌の治療にも転移性癌の治療にも用いることができる。さらに、上記アデノウイルスベクターを被験体に投与して癌を治療する方法も包含する。
本発明のアデノウイルスベクターは、遺伝子治療の分野において使用可能な方法、例えば、静脈内投与や動脈内投与などの血管内投与、経口投与、腹腔内投与、気管内投与、気管支内投与、皮下投与、経皮投与等により投与することができる。特に、本発明のアデノウイルスベクターは特定の組織、細胞への指向性が大きく、標的遺伝子を効率的に特定の組織、細胞へデリバリーすることができるので、血管内投与によっても、効率的に診断、治療を行うことができる。
アデノウイルスベクターは、治療上有効量を投与すればよい。治療上の有効量は、遺伝子治療分野の当業者であれば容易に決定することができる。さらに、投与量は、被験者の病態の重篤度、性別、年齢、体重、習慣等によって適宜変更することができる。例えば、アデノウイルスベクターを、０．５×１０^１１〜２．０×１０^１２ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ／ｋｇ体重、好ましくは１．０×１０^１１〜１．０×１０^１２ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ／ｋｇ体重、さらに好ましくは１．０×１０^１１〜５．０×１０^１１ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ／ｋｇ体重の量で投与すればよい。ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅは、アデノウイルスのゲノムの分子数（ウイルス粒子数）を表し、ｐａｒｔｉｃｌｅということもある。製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用しても良い。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助斉助しては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＲＥＩＣ−ＴＳＣプラスミドの作製
ヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子を外来遺伝子（挿入遺伝子）として含む本発明のＤＮＡコンストラクトを作成した。用いたＤＮＡコンストラクトは、市販のｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミドベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＸｂａ１−Ｋｐｎ１の挿入部にＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質をコードするＤＮＡを挿入し、さらに該ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質をコードするＤＮＡの下流のＫｐｎ１−ＥｃｏＲ１の挿入部位に、３つのエンハンサー（ｈＴＥＲＴエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー及びＣＭＶエンハンサー）（これらをＴＳＣと呼ぶ）をＢＧＨ ｐｏｌｙ Ａ＋３つのエンハンサーの形で挿入して構築したコンストラクトであった（図１）。図２にＲＥＩＣをコードするＤＮＡを挿入したコンストラクトの塩基配列を示す（ＣＭＶプロモーターの配列を除く）（配列番号６）。また、配列番号７に上記コンストラクトに含まれるＢＧＨ ｐｏｌｙ Ａと３つのエンハンサーを含む領域の塩基配列を示す。図２の塩基配列中の（１）及び（２）の枠で囲んだ部分は、それぞれＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質をコードするＤＮＡ及び３つのエンハンサー（３ｘｅｎｈ）を示す。上記コンストラクトを含むｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミドベクターをｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＲＥＩＣ−ＴＳＣプラスミドと呼ぶ。

Ａｄ−ＳＧＥ−ＣＭＶ−ＲＥＩＣの作製
さらに、上記コンストラクトを含む組換えアデノウイルスベクターを作製した。
作製には、Ａｄｅｎｏ−Ｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １（ＴａＫａＲａ Ｃｏｄｅ．Ｚ１５１３Ｎ）及びＰｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｃｏｄｅ．１２１４３）を用いた。
図１に示すコンストラクトを含む組換えアデノウイルスベクターをＡｄ−ＳＧＥ−ＣＭＶ−ＲＥＩＣと呼ぶ。
１． Ａｄｅｎｏ−Ｘプラスミドの作製
ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＲＥＩＣ−ＴＳＣプラスミドを制限酵素ＰＩ−ＳｃｅＩ，Ｉ‐ＣｅｕＩにて消化し、目的遺伝子特異的な発現カセットを得た。Ａｄｅｎｏ−Ｘ Ｖｉｒａｌ ＤＮＡにライゲーションし、ＳｗａＩでライゲーション産物を消化した。ライゲーション産物でｅｌｅｃｔｒｏ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ ＤＨ１０Ｂを形質転換し、アンピシリン添加ＬＢ寒天培地にプレーティングした。得られたコロニーをピックアップし、Ａｄｅｎｏ−Ｘ Ｓｙｓｔｅｍ ＰＣＲ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｐｒｉｎｅｒ Ｓｅｔで増幅し、電気泳動にて増幅バンドを確認した。目的遺伝子発現カセットを持つＡｄｅｎｏ−ＸプラスミドＤＮＡは２８７ｂｐの増幅バンドが得られ、選択したコロニー＃１，２，４，５，７は目的のプラスミドであることを確認した（図３）。選択したコロニー＃４について、クローニングサイトＳｗａＩの上流および下流に構築されたプライマーを用いて、シークエンシングを行った。解析結果より、この組換えプラスミドは、正方向に目的遺伝子が挿入され、ライゲーション操作において余分な塩基の挿入や欠失はないことを確認した。
選択したクローン＃４について、大腸菌にトランスフォームし、アンピシリンを含むＬＢ培地で振とう培養を行った。翌日、培養菌体から、ＤＮＡ精製キットによリプラスミドＤＮＡを精製した。一部を制限酵素ＸｈｏＩ、ＰａｃＩにて消化し、アガロースゲル電気泳動にて期待されるフラグメントサイズの泳動バンドを検出した（図４）（ＸｈｏＩ消化：０．６ｋｂｐ、１．４ｋｂｐ、２．６ｋｂｐ、８ｋｂｐ、９ｋｂｐ、１４．５ｋｂｐ
ＰａｃＩ消化：２．９ｋｂｐ、３３．３ｋｂｐ）
これより拡大調製したクローンは、目的とする組換えプラスミドであることを確認した。
２． 組換えアデノウイルスの作製
（ｉ） １次ウイルスの作製
２９３細胞を１／１０容ＦＢＳ、終濃度２ｍＭＬ−グルタミン及び１／１００容ペニシリン・ストレプトマイシン溶液含有ＤＭＥＭ培地にて６ｃｍコラーゲンコートシャーレ１枚に１００％コンフルエントまで培養し、制限酵素ＰａｃＩで消化したＡｄｅｎｏＸ−ＲＥＩＣ−ＴＳＣプラスミド５μｇをＴｒａｎｓＩＴ−２９３を用いてトランスフェクションした。２４時間後に培地交換を行い、１３日目に細胞の変性を確認後、細胞を回収した。紳胞ペレットを培地にて均一に懸濁し、凍結融解を３回繰り返し、その遠心上清を各１次ウイルス液とした。
（ｉｉ） ２次ウイルスの作製
６ｃｍコラーゲンコートシャーレに７０％〜１００％コンフルエントまで培養した２９３細胞に１次ウイルス液を感染させた。ウイルス感染時は１／２０容ＦＢＳ、終濃度２ｍＭＬ−グルタミン及び１／１００容ペニシリン・ストレプトマイシン溶液含有ＤＭＥＭ培地を使用した。２９３細胞の変性を確認した後、細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返し、その遠心上清を２次ウイルスとした。
（ｉｉｉ） ３次ウイルスの作製
Ｔ−７５コラーゲンコートフラスコに７０％〜１００％コンフルエントまで培養した２９３細胞に２次ウイルスを感染させた。２９３細胞の完全変性を確認後、培養液ごと細胞を回収し、超音波処理後、遠心上清を３次ウイルスとした。１ｍＬ／バイアルに分注し、ドライアイスで急凍結後、−８０℃に保管した。
３． 精製組換えアデノウイルスの調製方法
（ｉ） 拡大調製
２９３細胞を多重層型細胞培養フラスコにコンフルエントになるまで培養した。３次ウイルスをＡｄｅｎｏ−Ｘ（商標）−Ｒａｐｉｄ Ｔｉｔｅｒ Ｋｉｔを用いて力価を確認し、２９３細胞に至適条件にて感染した。２９３細胞の完全変性を確認後、細胞を回収し、凍結融解液の遠心上清をウイルス液とした。
（ｉｉ） 塩化セシウム密度勾配遠心法による精製
超遠心チューブにて塩化セシウム溶液及び上記（ｉ）で得られたウイルス液を重層し、４℃、２５，０００ｒｐｍにて２時間遠心した。形成されたウイルスバンドを回収し、更に、塩化セシウム溶液を加え、４℃、３５，０００ｒｐｍにて３時間、超遠心分離して、形成されたウイルスバンドを回収した。２度の超遠心で回収したウイルス液を透析カセットにて、１０％グリセロール含有ＰＢＳ（‐）に透析した。透析回収液を０．５ｍＬずつ分注し、−８０℃で凍結保存した。
４． 精製組換えアデノウイルスの品質検査
（ｉ） 力価測定（ＴＣＩＤ_５０法）
精製ウイルス液を培地にて１×１０^６倍希釈した。これをコラーゲンコート９６ｗｅｌｌプレートで３倍ずつ１１段階希釈し、等量の２９３細胞懸濁液５０μＬを添加し、培養した。コントロールは２９８細胞懸濁液と培地のみを加えて培養した。１４日目に顕微鏡下肉眼観察にて細胞変性の終末点を判定し、下に示すＫａｂｅｒの式を用いて５０％細胞変性終末点（ＴＣＩＤ_５０）を計算した（表１）。本法で算出したＴＣＩＤ_５０の値とｐｆｕはよく一致するため、１ＴＣＩＤ_５０＝１ｐｆｕとした。
Ｋａｂｅｒの式
ＴＣＩＤ_５０＝ （１列目の希釈率） × （系列希釈倍率）Σ^−０５
ただしΣ＝各希釈段階における（変性ウエル数）／（検体数）の総和
（ｉｉ） 構造確認
コラーゲンコート２４ウェルプレートにて７０％〜１００％コンフルエントに培養した２９３細胞に、精製ウイルス液をＰＢＳで１０倍希釈を行ったウイルス液を１μＬを感染させた。細胞が完全に変性していることを確認した後、細胞を回収し、総ＤＮＡを抽出調製し、制限酵素ＸｈｏＩで消化してアガロースゲル電気泳動を行った。期待されるフラグメントサイズ０．６ｋｂｐ、１．４４ｋｂｐ、２．４６ｋｂｐ、６．１ｋｂｐ、８ｋｂｐ、１４．５ｋｂｐを検出し、目的サイズのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した（図５）。
（ｉｉｉ） ＲＣＡ（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）チェック（ＰＣＲ法）
２４ウェルプレートにて７０％〜１００％コンフルエントに培養したＨｅＬａ細胞に、精製ウイルス液をＰＢＳで１０倍希釈を行ったウイルス液を１μＬ感染させ、３日後、細胞を回収して総ＤＮＡを調製した。抽出ＤＮＡを鋳型にＥ１Ａ遺伝子検出プライマーｓｅｎｓｅ：５’−ＡＴＧＡＧＡＣＡＴＡＴＴＡＴＣＴＧＣＣＡＣ−３（配列番号８）及びａｎｔｉｓｅｎｓｅ ：５’−ＧＴＡＡＧＴＣＡＡＴＣＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＣ−３’）（配列番号９）を用いてＰＣＲを行った。その結果、本プライマーで増幅される２４０ｂｐのＥ１遺伝子のバンドはいずれのウイルスサンプルにおいても検出されなかったため、ＲＣＡの混入はないと判断した（図６）。

Ａｄ−ＳＧＥ−ＣＭＶ−ＲＥＩＣを用いての細胞におけるＲＥＩＣタンパク質の発現
ＰＣ３細胞又はＨｅＬａ細胞に、実施例２で作製した組換えアデノウイルスベクターＡｄ−ＳＧＥ−ＣＭＶ−ＲＥＩＣ及びＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡの上流にＣＭＶプロモーターのみを挿入し３×ｅｎｈを有しないコンストラクトを有する組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＣＭＶ−ＲＥＩＣ）を１０ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で無血清培地中にて２時間処理しトランスフェクトし、１２時間後に細胞内でのヒトＲＥＩＣタンパク質の発現をウエスタンブロットで検出した。
結果を図７に示す。図に示すように、Ａｄ−ＳＧＥ−ＣＭＶ−ＲＥＩＣを用いた場合にＡｄ−ＣＭＶ−ＲＥＩＣを用いた場合に比べ、ＲＥＩＣ遺伝子の発現が著しく増強された。
この結果は、Ａｄ−ＳＧＥ−ＣＭＶ−ＲＥＩＣを用いた場合、従来のＡｄ−ＣＭＶ−ＲＥＩＣを用いた場合と比べて、ヒトの癌治療において、同じ投与量（ｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ）での治療効果（抗腫瘍効果）の増大が期待でき、さらにアデノウイルスベクターの投与量を減らすことにより、従来と同等の効果での副作用の軽減が期待できることを示す。

Ａｄ−ＳＧＥ−ＣＭＶ−ＲＥＩＣによる細胞死誘導
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞死誘導を調べるために、細胞を平底６ウェルプレートに播き２４時間培養した。細胞をＡｄ−ＳＧＥ−ＣＭＶ−ＲＥＩＣ、Ａｄ−ＣＭＶ−ＲＥＩＣ及びＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡの上流にＣＭＶエンハンサーとニワトリβ−アクチンプロモーターを連結させた構造を有するＣＡＧプロモーターのみを挿入し３×ｅｎｈを有しないコンストラクトを有する組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＣＡＧ−ＲＥＩＣ）を５０ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で無血清培地中にて２時間処理しトランスフェクトした後、新鮮完全培地に交換した。ＬａｃＺ遺伝子を含むアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＬａｃＺ）を対照として用いた。４８時間のインキュベーション後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２ストック溶液を２μｇ／ｍｌの濃度で添加し、細胞を暗条件下で１０分間インキュベーションした。Ｈｏｅｃｈｔ３３３４２は、インタキレーター染色試薬であり、クロマチンの総量とクロマチンの凝縮程度を調べることができる（Ｂｅｌｌｏｃ Ｆ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １９９４；１７：５９−６５、Ｍａｃｉｏｒｏｗｓｋｉ Ｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １９９８；３２：４４−５０）。蛍光顕微鏡を用いて高度に凝縮し分断した核を有する細胞死が認められた細胞を同定した。細胞死が認められた細胞は、顕微鏡下で３〜５の異なる視野において計数した。
ｉｎ ｖｉｖｏで細胞死が認められた細胞を検出するために、Ｉｎ ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＴＵＮＥＬ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＵＴＰ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）アッセイを行った。すなわち、腫瘍組織を切断し、ＯＣＴ化合物中に入れ、液体窒素中で急速凍結した。凍結切片（１０μｍ）サンプルをメタノールを用いて３０分室温で固定し洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳを浸透させ、ＴＵＮＥＬ反応混合液で染色した。
図８にそれぞれの組換えアデノウイルスを用いた各細胞の細胞死誘導率（％）を示す。図に示すように、Ａｄ−ＳＧＥ−ＣＭＶ−ＲＥＩＣを用いた場合に、他の組換えアデノウイルスを用いた場合に比べ、著しく高い細胞死誘導率（％）が得られた。

Ａｄ−ＳＧＥ−ＣＭＶ−ＲＥＩＣの腫瘍増殖抑制効果（その１）
ＢＡＬＢ／Ｃマウス、雌（６〜８週齢）、１群４匹、治療を開始する７日前（Ｄａｙ［−７］）に、２×１０^５個のＲＥＮＣＡ細胞（マウス腎癌由来細胞）を右大腿部に皮下注入した。０日目（Ｄａｙ０）に、それぞれのマウスで腫瘍が認められ、０日目（Ｄａｙ０）、５×１０^９のｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ／１００μＬ（Ａｄ−ＳＧＥ−ＣＭＶ−ＲＥＩＣ、Ａｄ−ＣＭＶ−ＲＥＩＣ又はＡｄ−ＣＡＧ−ＲＥＩＣ）を含むＰＢＳを腫瘍内に注入した。ＬａｃＺ遺伝子を含むアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＬａｃＺ）を対照として用いた。また、陰性対照として、同量のＰＢＳを注射した。腫瘍の大きさを２週間に１度測定した。腫瘍体積は実験により導き出した式（１／２×（ｗ１×ｗ２×ｗ２）；ｗ１は腫瘍の最大径、ｗ２は腫瘍の最小径を表す）により計算した。
結果を図９に示す。図に示すようにＡｄ−ＳＧＥ−ＣＭＶ−ＲＥＩＣ治療群において、他の４群と比べて、有意に低い腫瘍体積を示し、他の４群と比べて、最も強い腫瘍増殖抑制効果を認められた。
さらに、それぞれの治療群で、１４日目（Ｄａｙ１４）に皮下腫瘍を摘出した、代表的な２匹の腫瘍の写真を図１０に示す。図１０からもＡｄ−ＳＧＥ−ＣＭＶ−ＲＥＩＣ治療群において、他の４群と比べて、有意に低い腫瘍体積であることがわかる。

Ａｄ−ＳＧＥ−ＣＭＶ−ＲＥＩＣの腫瘍増殖抑制効果（その２）
ＢＡＬＢ／Ｃマウス、雌（６〜８週齢）、１群４〜５匹、治療を開始する７日前（Ｄａｙ［−７］）に、２×１０^５個のＲＥＮＣＡ細胞（マウス腎癌由来細胞）を右大腿部に皮下注入した。０日目（Ｄａｙ０）に、それぞれのマウスで腫瘍が認められ、０日目（Ｄａｙ０）、１×１０^９のｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ／１００μＬ（Ａｄ−ＳＧＥ−ＣＭＶ−ＲＥＩＣ、Ａｄ−ＣＭＶ−ＲＥＩＣ又はＡｄ−ＣＡＧ−ＲＥＩＣ）を含むＰＢＳを腫瘍内に注入した。ＬａｃＺ遺伝子を含むアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＬａｃＺ）を対照として用いた。また、陰性対照として、同量のＰＢＳを注射した。腫瘍の大きさを２週間に１度測定した。腫瘍体積は実験により導き出した式（１／２×（ｗ１×ｗ２×ｗ２）；ｗ１は腫瘍の最大径、ｗ２は腫瘍の最小径を表す）により計算した。
結果を図１１に示す。図に示すようにＡｄ−ＳＧＥ−ＣＭＶ−ＲＥＩＣ治療群において、他の４群と比べて、有意に低い腫瘍体積を示し、他の４群と比べて、最も強い腫瘍増殖抑制効果を認められた。

本発明のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ ＤＮＡを含むＤＮＡコンストラクトを含むアデノウイルスベクターは癌治療薬として用いることができる。

配列番号８及び９ プライマー
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］

Claims (9)

1. 5'末端側から、
   (i) CMVプロモーター;
   (ii) 以下のREIC/Dkk-3 DNA:
   (a) 配列番号１に表される塩基配列からなるDNA、
   (b) 配列番号１に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであって、癌細胞死誘導活性及び／又は腫瘍細胞増殖抑制活性を有するタンパク質をコードするDNA、
   (c) 配列番号１に表わされる塩基配列中の第１番目の塩基に始まり第117番目の塩基〜第234番目のいずれかの塩基に終わる塩基配列からなるポリヌクレオチド；又は
   (d) 配列番号１に表わされる塩基配列中の第１番目の塩基に始まり第117番目の塩基〜第234番目のいずれかの塩基に終わる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、癌細胞死誘導活性及び／又は腫瘍細胞増殖抑制活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
   (iii) polyA付加配列；並びに
   (iv) hTERT（Telomerase Reverse Transcriptase）エンハンサー、SV40エンハンサー及びCMVエンハンサーをこの順で連結したエンハンサー、
   を上記の順序で連結した、REIC/Dkk-3 DNAを発現させるためのDNAコンストラクト。
2. polyA付加配列がウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリA付加配列である、請求項１記載のDNAコンストラクト。
3. 配列番号６に示す、(ii) REIC/Dkk-3 DNA、(iii) polyA付加配列、及び(iv) hTERT（Telomerase Reverse Transcriptase）エンハンサー、SV40エンハンサー及びCMVエンハンサーをこの順で連結したエンハンサーを連結した塩基配列を含む、請求項１又は２に記載のDNAコンストラクト。
4. 以下の構造を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のDNAコンストラクト：
   
5. 配列番号６に表される塩基配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のDNAコンストラクト。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のDNAコンストラクトを含むアデノウイルスベクター。
7. 請求項６に記載のアデノウイルスベクターを含む癌細胞死誘導剤。
8. 請求項６に記載のアデノウイルスベクターを含む腫瘍細胞増殖抑制剤。
9. 請求項６に記載のアデノウイルスベクターを含む癌治療薬。