JP5279235B2 - 抗癌剤耐性癌において抗癌剤増強作用を有する癌細胞死誘導剤 - Google Patents
抗癌剤耐性癌において抗癌剤増強作用を有する癌細胞死誘導剤 Download PDFInfo
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Description
[1] 以下のREIC/Dkk-3のDNAを有効成分として含む、抗癌剤耐性を有する癌細胞用の抗癌剤増強作用を有する癌細胞死誘導剤:
(a) 配列番号1に表される塩基配列からなるDNA;
(b) 配列番号1に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであって、細胞死誘導活性を有するタンパク質をコードするDNA;
(c) 配列番号1に表わされる塩基配列中の第1番目の塩基に始まり第117番目の塩基〜第234番目のいずれかの塩基に終わる塩基配列からなるポリヌクレオチド;又は
(d) 配列番号1に表わされる塩基配列中の第1番目の塩基に始まり第117番目の塩基〜第234番目のいずれかの塩基に終わる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、細胞死誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[2] 以下のREIC/Dkk-3のDNAを含むベクターを有効成分として含む抗癌剤増強作用を有する癌細胞死誘導剤:
(a) 配列番号1に表される塩基配列からなるDNA;
(b) 配列番号1に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであって、細胞死誘導活性を有するタンパク質をコードするDNA;
(c) 配列番号1に表わされる塩基配列中の第1番目の塩基に始まり第117番目の塩基〜第234番目のいずれかの塩基に終わる塩基配列からなるポリヌクレオチド;又は
(d) 配列番号1に表わされる塩基配列中の第1番目の塩基に始まり第117番目の塩基〜第234番目のいずれかの塩基に終わる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、細胞死誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[3] ベクターがアデノウイルスベクターである[2]の抗癌剤増強作用を有する癌細胞死誘導剤。
[4] 抗癌剤が抗癌抗生物質である[1]〜[3]のいずれかの抗癌剤増強作用を有する癌細胞死誘導剤。
[5] [1]〜[4]のいずれかの抗癌剤増強作用を有する癌細胞死誘導剤を含む、抗癌剤に対する耐性を有する癌の癌治療薬。
[6] 抗癌剤と[1]〜[4]のいずれかの癌細胞死誘導剤からなるキットである前記抗癌剤に対する耐性を有する癌の癌治療薬。
[7] 抗癌剤が抗癌抗生物質である[6]の前記抗癌剤に対する耐性を有する癌の癌治療薬。
本発明の抗癌剤増強作用を有する癌細胞死(アポトーシス)誘導剤は、REIC/Dkk-3 DNAを有効成分として含む。
また、上記ウイルスを用いることなく、プラスミドベクター等の遺伝子発現ベクターが組み込まれた組換え発現ベクターを用いて、目的遺伝子を細胞や組織に導入することができる。例えば、リポフェクション法、リン酸-カルシウム共沈法、DEAE-デキストラン法、微小ガラス管を用いたDNAの直接注入法などにより細胞内へ遺伝子を導入することができる。また、内包型リポソーム(internal liposome)による遺伝子導入法、静電気型リポソーム(electorostatic type liposome)による遺伝子導入法、HVJ-リポソーム法、改良型HVJ-リポソーム法(HVJ-AVEリポソーム法)、HVJ-E(エンベロープ)ベクターを用いた方法、レセプター介在性遺伝子導入法、パーティクル銃で担体(金属粒子)とともにDNA分子を細胞に移入する方法、naked-DNAの直接導入法、種々のポリマーによる導入法等によっても、組換え発現ベクターを細胞内に取り込ませることが可能である。この場合に用いる発現ベクターとしては、生体内で目的遺伝子を発現させることのできるベクターであれば如何なる発現ベクターも用いることができるが、例えばpCAGGS(Gene 108, 193-200(1991))や、pBK-CMV、pcDNA3、1、pZeoSV(インビトロゲン社、ストラタジーン社)、pVAX1などの発現ベクターが挙げられる。
本実施例において、以下の材料を用い、以下の方法で検討を行った。
本発明の実施例で用いた細胞株は、ヒト乳癌細胞株MCF7/Wt(野生型)、MDA-MB-231、SK-BR-3、HCC1806及びヒト子宮癌細胞株であるHeLaであった。これらの細胞株は、ATCC(American Type Culture Collection)から入手した。抗癌剤耐性乳癌細胞株(多剤耐性乳癌細胞株)MCF7/ADRはユニバーシティーオブネブラスカメディカルセンターのEppley Institute for Research in Cancer and Allied Diseases のK.H.Cowan博士より供与された(Batist G et al. J Biol Chem 1986; 261:15544-15549)。対照細胞としては、ヒト線維芽細胞及びOUMS24を用いた。これらは本発明者等が確立した(Bai L et al. Int J Cancer 1993; 53: 451-456)。それぞれの細胞株は以下の培養液を用いて培養した。
タンパク質の発現は、ウエスタンブロットにより調べた。細胞をPBSで2回洗浄し、溶解バッファー(50 mM HEPES, pH 7.4、250 mM NaCl、1 mM EDTA、1% NP-40、1 mM DTT、1 mM PMSF、5μg/ml ロイペプチン、5μg/ml アプロチニン、2 mM Na3VO4、1 mM NaF、10 mM β-GP)にてタンパク質を抽出した。遠心分離後、上清中のタンパク質量を調整し、同量の2 x SDS sample bufferで希釈し、95℃で5分間加熱した。サンプル(10μgタンパク質)を7.5% SDS-PAGEゲルで泳動し、PVDF膜に転写した。10%無脂肪ミルク粉末、6%グリシン、0.1% Tween-20を含むTris buffered saline (TBS)を用いて室温で1時間ブロッキングを行った。抗ヒト REIC/Dkk-3抗体(1:1000)、抗JNK抗体sc-571 (1:500) (Santa Cruz Biotechnology)、抗c-Jun抗体sc-1694(1:500) (Santa Cruz Biotechnology)、抗リン酸化JNK抗体#9255 (1:500) (Cell Signaling Technology)、抗リン酸化c-Jun抗体#9261 (1:500) (Cell Signaling Technology)、抗開裂カスペース-3抗体#9661 (1:500) (Cell Signaling Technology)、抗チューブリン抗体T5168 (1:8000)(Sigma)、抗P-糖タンパク質抗体C219 (1:250)(Calbiochem)を一次抗体として用いた。TBS(T-TBS)、0.1% Tween-20を用いて十分に洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体を添加した。さらに、T-TBSを用いて十分に洗浄した後、enhanced chemiluminescence detection method (ECL kit)により、発色させた。一部においては、1μMのJNKインヒビターSP600125(A. G. Scientific, Inc.)を添加してJNKのキナーゼ活性を阻害した。
全長REIC/Dkk-3 cDNAをコスミドベクターpAxCAwtに導入し、COS-TPC法(Takara Bio)によりアデノウイルスベクターにトランスファーした(Abarzua F et al. Cancer Res 2005; 65: 9617-9622)。LacZ遺伝子を含むアデノウイルスベクター(Ad-LacZ)を対照として用いた。
in vitroにおける細胞死誘導を調べるために、細胞を平底6ウェルプレートに播き24時間培養した。細胞をAd-LacZ及びAd-REICで種々のMOI(multiplicity of infection)で無血清培地中にて2時間処理した後、新鮮完全培地に交換した。48時間のインキュベーション後、Hoechst33342ストック溶液を2μg/mlの濃度で添加し、細胞を暗条件下で10分間インキュベーションした。Hoecht33342は、インタキレーター染色試薬であり、クロマチンの総量とクロマチンンの凝縮程度を調べることができる(Belloc F et al., Cytometry 1994; 17: 59-65、Maciorowski Z et al., Cytometry 1998; 32: 44-50)。蛍光顕微鏡を用いて高度に凝縮し分断した核を有する細胞死が認められた細胞を同定した。細胞死が認められた細胞は、顕微鏡下で3〜5の異なる視野において計数した。
細胞を96ウェル平底マイクロプレートにウェル当り1000個播いた。24時間のインキュベーション後、細胞を無血清培地中100MOIのAd-LacZ及びAd-REICで2時間処理し、新鮮完全培地に交換した。48時間後浮遊死細胞を培地交換により除去し、付着細胞を種々の濃度のドキソルビシンと共に72時間培養した。インキュベーションの最後に、CellTiter96(登録商標)Aqueous One Sokution Cell Proliferation Assay (Promega Corp.)を用いて細胞生存率を測定した。
細胞を6ウェル平底プレートに播き24時間培養した。24時間のインキュベーション後、細胞を無血清培地中100MOIのAd-LacZ及びAd-REICで2時間処理し、新鮮完全培地に交換した。48時間後浮遊死細胞を培地交換により除去し、付着細胞を10μMのドキソルビシンと共に36時間培養した。インキュベーションの最後に、ドキソルビシンの赤色の自己蛍光を観察し、スキャンした。スキャンした像をScion Image (Scion Corp)を用いてドキソルビシンの集積密度の定量に供した。
5〜6週齢の雌の胸腺欠損(nu/nu)マウスをチャールズリバー研究所より入手した。腫瘍細胞の注入の3日前に、17βエストラジオールペレット(SE-121、 Innovative Research of America)をマウスの右肩領域に皮下注射により移植した。MCF7/Wt細胞 5×106細胞/0.1ml PBS)をマウスの左側背部に注入した。腫瘍を3〜6mmに増加させ、マウスをランダムに7群に分けた。その後、1.2×108プラーク形成ユニット(PFU)のアデノウイルスベクター(Ad-LacZ及びAd-REIC)をPBSで0.1mlに調整し腫瘍内に注射した。陰性対照として、同量のPBSを注射した。腫瘍の大きさを2週間に1度測定した。腫瘍体積は実験により導き出した式(1/2×(w1×w2×w2);w1は腫瘍の最大径、w2は腫瘍の最小径を表す)により計算した。
データは平均±SEで示した。Unpaired Student's t test を2群の間で行い、P<0.05の場合に有意の差があるとした。解析は、Statview 4.5 software program (Abucus concepts)を用いて行った。
種々の細胞株におけるREIC/Dkk-3タンパク質の発現を調べた。用いた細胞は、ヒト乳癌細胞株MCF7/Wt(野生型)、MDA-MB-231、SK-BR-3、HCC1806及びヒト子宮癌細胞株であるHeLaであった。ヒト線維芽細胞及びOUMS24を発現の陽性対照として用いた(Abarzua F et al., Cancer Res 2005; 65: 9617-9622)。チューブリンをローディング対照として用いた初代培養ヒト乳癌上皮細胞(HMEC)において、REIC/Dkk-3蛋白質は分子量60から70kDaの間に明瞭に認められた。これは、ウエスタンブロットにおいてREIC/Dkk-3タンパク質に複数のバンドが認めらることと合致する(barzua F et al., Cancer Res 2005; 65: 9617-9622、Kurose K et al., J Urol 2004; 171: 1314-13181、Hsieh SY, Oncogene 2004; 23: 9183-9189)。図1に結果を示す。図1はREIC/Dkk-3のヒト乳癌細胞株での発現を示す。図1に示すように癌細胞株では、REIC/Dkk-3の発現を示すバンドは認められなかった。
Ad-REICを用いてREIC/Dkk-3を乳癌細胞株で過剰発現させ、REIC/Dkk-3を用いた乳癌の遺伝子治療の可能性を検討した。実験は3から6回行った。結果を図2A及び図2Bに示す。図2Aに示すように、Hoechst33342を用いた細胞死アッセイにおいて、細胞死した細胞は、Ad-REICで処理したMCF7/Wt及びMCF7/ADRにおいて高頻度で認められた。一方で、HMECでは認められなかった。100MOIにおける細胞死の出現率は、HMEC、MCF7/Wt、MCF7/ADR及びSK-BR-3細胞において、それぞれ5.5%、21.2%、25.0%及び15.2%であった(図2B)。対照であるAd-LacZ処理と比較すると、100MOIでのAd-REIC処理はMCF7/Wt及びMCF7/ADR細胞において有意に細胞死を誘導した。Ad-REICとAd-LacZ処理管で有意の差(p<0.05)が認められた。MDA-MB-231細胞においては、Ad-REICと対象との間で細胞死の誘導に差は認められなかった。
癌治療におけるAd-REICのさらなる有用性を検討するために、多剤耐性であるMCF7/ADR細胞を用いて検討を行った。MCF/Wt及びMCF7/ADR細胞を、無処理、Ad-LacZ処理及びAd-REIC処理の3群に分けた。細胞を種々の濃度のドキソルビシンにさらし、REIC/Dkk-3過剰発現が、薬剤耐性から細胞を回復させる能力を評価した。MCF7/Wt細胞においては、処理群による有意の差は認められなかった。図3に結果を示す。図3においては、ドキソルビシン毒性に対する用量反応曲線を示す。図3に示すように、MCF7/ADR細胞ではドキソルビシンの毒性の用量反応曲線はAd-REIC処理で顕著に低濃度にフトした。10μMのドキソルビシンにおいて、細胞の生存率は、無処理、Ad-LacZ及びAd-REIC群でそれぞれ88.1%、85.6%及び32.3%であった。25μMのドキソルビシンの場合、細胞の生存率は、無処理、Ad-LacZ及びAd-REIC群でそれぞれ45.9%、32.1%及び14.3%であった。処理群の間で有意の差(p<0.05)が認められた。
ウエスタンブロットによりREIC/Dkk-3過剰発現下での種々のタンパク質の発現レベルを測定した。細胞を100MOIでAd-LacZ及びAd-REIC処理し、48時間後、浮遊死細胞を除去し、付着細胞を溶解させサンプルとして用いた。Ad−REIC処理においてJNKのキナーゼ活性を阻害するために1μMのJNKインヒビター(SP600125)をAd-REIC処理後直ちに添加した。図4に結果を示す。図4中、p-はリン酸化を示し、P-gpはP-糖タンパク質を示す。Ad-REIC処理により、MCF7/Wt及びMCF7/ADRの両方の細胞でREIC/Dkk-3タンパク質の発現が増大した。両方の細胞のいずれの処理においても、JNKレベルの変化は認められなかった。MCF7/ADR細胞のC-Junタンパク質レベルはMCF7/Wt細胞より大きかった。Ad-REIC処理後のMCF7/Wt及びMCF7/ADR細胞におけるJNKの活性化はリン酸化JNK特異抗体を用いてc-Junのリン酸化を検出することにより行った。REIC/Dkk-3の過剰発現はMCF7/ADR細胞においてP-糖タンパク質を顕著にダウンレギュレートした。JNKインヒビターであるSP600125はJNKのキナーゼ活性を阻害するが、JNKそれ自体のリン酸化は阻害しないことが知られている(Bennett BL et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98: 13681-13686)。Ad-REIC及びSP600125の併用により、JNKの活性は変化しなかった。しかしながら、リン酸化c-Junの発現レベルは減少しMCF7/ADR細胞のP-糖タンパク質レベルが逆転した。P-糖タンパクの発現の変化に対して、MCF7/Wt及びMCF7/ADR細胞における開裂したカスペース-3のレベルはAd-REIC処理によりアップレギュレートし、SP600125により逆転した。
それぞれのタイプの細胞におけるAd-REIC処理のドキソルビシン動態への影響を調べるため、ドキソルビシンの細胞内への蓄積を10μMの濃度で調べた。図5A及び図5Bに結果を示す。図5Aは、処理細胞の蛍光顕微鏡像の代表例を示す。図5Bは赤色蛍光をランダムにスキャンし、集積密度を定量化した結果を示す。それぞれの細胞株において、無処理細胞の平均値を1.0に調整した。図5A及び図5Bに示すように、MCF7/ADR細胞において、Ad-REIC処理はドキソルビシンの細胞内への蓄積を顕著に増大させ、対照群の2倍の蓄積が認められた。Ad-REIC処理とAd-LacZ処理間で有意の差(p<0.05)が認められた。MCF7/Wt細胞においては、処理による差は認められなかった。
REIC/Dkk-3の過剰発現によるin vitroでの細胞死の誘導がMCF/Wt細胞で認められたので、次に腫瘍皮下注射モデルを用いてAd-REICのin vivoでの抗腫瘍効果について検討を行った。図6A、図6B及び図6Cに結果を示す。図6A及び図6Bは、3週間の観察期間の最後におけるAd-LacZ及びAd-REIC処理後の異種移植腫瘍の出現を示し、図6Aは腫瘍が出現したヌードマウスの写真、図6Bは腫瘍の平均体積をそれぞれの群において7頭のマウスについて計算し作成した腫瘍増殖曲線を示す。Ad-REIC処理とAd-LacZ処理間で有意の差(p<0.05)が認められた。図6Cは、ウイルス投与3日後に回収した腫瘍のTUNEL染色の結果を示す。核はDAPI染色により染色した。図6Bに示すように、PBS投与群及びAd-LacZ投与群において、腫瘍サイズは3週間の観察期間において徐々に増大した。一方、Ad-REIC処理群においては、腫瘍体積は2週間の間ほとんど変化せず、その後徐々に減少した。無処理群、Ad-LacZ投与群、Ad-REIC投与群の間で、7日目から3週間目にかけて顕著な差が認められた。REIC/Dkk-3発現及びAd-REIC処理の細胞死効果を確認するため、腫瘍組織をベクター投与の3日後に切除した。図6Cに示すように、Ad-REIC処理腫瘍においては、ウエスタンブロットによりREIC/Dkk-3の過剰発現が認められた。その後、腫瘍切片をTUNEL染色により調べた。Ad-LacZを投与した腫瘍ではほとんど細胞死は認められなかった。一方、Ad-REICを投与した腫瘍では多くのTUNEL陽性細胞が認められた。
正常膀胱癌細胞及び抗癌剤耐性を獲得した膀胱癌細胞を用いて実施例1と同様の検討を行った。
PC3(1 x 105cells)を6ウェルプレートにまき、24時間後に各REIC/Dkk-3フラグメントcDNAを挿入したプラスミドpTracer-EF-A-1(#1: 1-39 aa)、-2(#2: 1-78 aa)、-6(Full: 1-350aa)をTransIT(登録商標) Keratinocyte試薬(トランスフェクション試薬(Mirus Bio Corporation))を用いてPC3に導入した。pTracer-EF-A-1は配列番号2に表されるアミノ酸配列の第1番目〜39番目のアミノ酸をコードするcDNA(配列番号1に表される塩基配列の第1番目〜117番目の塩基からなるcDNA)を含み、pTracer-EF-A-2は配列番号2に表されるアミノ酸配列の第1番目〜78番目のアミノ酸をコードするcDNA(配列番号1に表される塩基配列の第1番目〜234番目の塩基からなるcDNA)を含み、pTracer-EF-A-3は配列番号2に表されるアミノ酸配列の第1番目〜350番目のアミノ酸をコードするcDNA(配列番号1に表される塩基配列の第1番目〜1050番目の塩基からなるcDNA)を含む。OUMS-24に対しては、FuGENE(登録商標)-HD試薬(トランスフェクション試薬(ロシュ アプライド サイエンス))を用いて各プラスミドを導入した。48時間後、細胞を生きたままHoechst33342により核染色し、蛍光顕微鏡にて観察した。細胞死を起こした細胞(核の凝集した細胞)の%は、GFP陽性細胞(プラスミドの入った細胞)を分母にして計算した。
Claims (6)
- 以下のREIC/Dkk-3のDNAを有効成分として含む、抗癌剤耐性を有する癌細胞の抗癌剤感受性を回復させ、癌細胞死を誘導する組成物であって、
抗癌剤耐性が癌細胞におけるP-糖タンパク質のアップレギュレーションにより引き起こされたものである、組成物:
(a) 配列番号1に表される塩基配列からなるDNA;
(b) 配列番号1に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであって、細胞死誘導活性を有するタンパク質をコードするDNA;
(c) 配列番号1に表わされる塩基配列中の第1番目の塩基に始まり第117番目の塩基〜第234番目のいずれかの塩基に終わる塩基配列からなるポリヌクレオチド;又は
(d) 配列番号1に表わされる塩基配列中の第1番目の塩基に始まり第117番目の塩基〜第234番目のいずれかの塩基に終わる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、細胞死誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。 - 抗癌剤が抗癌抗生物質、アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物アルカロイド剤、ホルモン剤、生物機能修飾物質、プロカルバジン、シスプラチン、カルボプラチン、抗男性ホルモン剤及び分子標的薬からなる群から選択され、
抗癌剤耐性を有する癌が脳・神経腫瘍、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝癌、リンパ腫・白血病、結腸癌、膵癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、副腎癌、腎癌、腎盂尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫及び中皮腫からなる群から選択される、
請求項1記載の抗癌剤耐性を有する癌細胞の抗癌剤感受性を回復させ、癌細胞死を誘導する組成物。 - 請求項1又は2に記載のREIC/Dkk-3のDNAを含むベクターを有効成分として含む、抗癌剤耐性を有する癌細胞の抗癌剤感受性を回復させ、癌細胞死を誘導する組成物。
- ベクターがアデノウイルスベクターである請求項3記載の抗癌剤耐性を有する癌細胞の抗癌剤感受性を回復させ、癌細胞死を誘導する組成物。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗癌剤耐性を有する癌細胞の抗癌剤感受性を回復させ、癌細胞死を誘導する組成物を含む、抗癌剤に対する耐性を有する癌の癌治療薬。
- 抗癌剤と請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗癌剤耐性を有する癌細胞の抗癌剤感受性を回復させ、癌細胞死を誘導する組成物からなるキットである前記抗癌剤に対する耐性を有する癌の癌治療薬。
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