KR20150000247A - Zmym2를 유효성분으로 함유하는 항암제 민감성 증진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항암제 민감성 증진용 조성물에 관한 것으로, 자세하게는 ZMYM2(zinc finger, MYM-type 2) 단백질; 또는 ZMYM2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현벡터를 유효성분으로 함유하는 항암제 민감성(sensitivity) 증진용 조성물; 및 ZMYM2 단백질 또는 ZMYM2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 ZMYM2(zinc finger, MYM-type 2)는 소라페닙(sorafenib)의 암세포에 대한 민감성(sensitivity) 증진과 관련된 기능을 가지므로, 이를 이용하여 항암제인 소라페닙의 암세포에 대한 내성을 조절하는 경우, 낮은 농도의 소라페닙의 사용만으로도 암세포의 성장을 억제하거나 사멸을 유도할 수 있어 암 치료에 있어서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ZMYM2를 유효성분으로 함유하는 항암제 민감성 증진용 조성물{Composition for Enhancing Sensitivity to Anti-cancer agent Comprising of ZMYM2}

본 발명은 항암제 민감성 증진용 조성물에 관한 것으로, 자세하게는 ZMYM2(zinc finger, MYM-type 2) 단백질; 또는 ZMYM2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현벡터를 유효성분으로 함유하는 항암제 민감성(sensitivity) 증진용 조성물; 및 ZMYM2 단백질 또는 ZMYM2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.

암은 인간 건강에 가장 치명적인 위협 중의 하나이다. 미국에서만 매년 1백 3십만명 정도의 새로운 암 환자가 발생하고, 이는 심혈관계 질환 다음으로 두 번째로 높은 사망 원인이며, 사망자 4명 중의 대략 1명이 암 환자인 것으로 추정된다. 이러한 사망의 대부분은 고형암으로 인한 것이다. 특정 암의 의학적 치료에는 상당한 진보가 있어 왔지만, 모든 암에 대한 전반적인 5년 생존율은 과거 20년간 약 10％ 정도만 개선되었다. 암, 또는 악성 종양은 제어되지 않는 방식으로 신속하게 전이 및 성장하기 때문에, 제시간에 이를 검출하고 치료하는 것이 극도로 어렵다.

현재, 암의 치료를 위해서는 수술 요법, 방사선 치료 요법 및 화학요법 등이 사용되고 있다. 이중에서, 화학요법은 항암제를 이용하여 암을 치료하는 방법을 말하며 융모막 암(choriocarcinoma)에 메토트레세이트(methotrexate)를 사용하여 완치효과를 얻음으로써 본격적으로 사용되었다. 오늘날에는 약 60여종의 다양한 항암제가 사용되고 있으며, 최근 암 발생 및 암 세포의 특성에 관한 지식이 많이 알려짐에 따라, 새로운 항암제 개발에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

한편, 간암(Hepatocellular carcinoma, HCC) 공격적인 악성종양으로 예후가 나쁘며 매우 복잡한 분자적 과정을 가져 기존의 항암 치료법으로는 성공적인 결과를 나타내지 못하고 있다. 간암은 해마다 50만명이 사망하는, 세계에서 5번째로 일반적인 종양이다(Okuda 2000). 간암 환자의 생존율은 지난 20년에 걸쳐 개선되지 않고 있으며, 사망율과 거의 동일한 발병률을 지니고 있다 (Marrero, Fontana et al. 2005). B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스에 감염되어 발병하는 만성간염 및 아플라톡신 B1 (aflatoxin B1)과 같은 발암물질에의 노출은 간암에 대한 주요 위험 인자로 알려져 있다(Thorgeirsson and Grisham 2002).

현재까지 시중에 나와 있는 항암제로는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산,젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈,에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴,클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴 등 그 종류가 다양하다.

특히 소라페닙(sorafenib)은 종양세포나 종양혈관에 과발현할 것으로 예상되는 수용체 티로신 키네이스(tyrosine kinase)인 VEGFR-2, platelet-derived growth factor receptor(PDGFR)-β, c-kit와 더불어 신호전달경로의 세린/트레오닌 키네이tm(serine/threonine kinase)인 라프 키네이스(Raf kinase)를 동시에 저해하는 경구용 표적항암제로 알려져 있다. 이러한 소라페닙은 다양한 고형종양에 대해 임상연구가 진행되고 있는데, 신세포암종에서 이미 표적항암제로 사용 중이며, 진행 간암(Hepatocellular carcinoma, HCC)에 대한 임상연구가 진행되어 최근 미국 식약청은 절제수술이 불가능한 간암의 치료제로 승인하기도 하였다.

그러나 소라페닙의 간암(Hepatocellular carcinoma, HCC) 치료 효과는 크지 않으며, 단지 진행된 간암환자에서 생존 및 간암 진행의 최소한의 성과만을 보여주는데 그치고 있다. 이러한 소라페닙의 간암에서의 치료 효과의 저하는 항암제 내성(비반응성 또는 저항성)에 기인하는 것이다.

항암제 내성이란 항암화학요법을 이용한 암 치료에 있어서 장애가 되는 요소 중 하나로서, 암 환자에 대한 항암화학요법이 성공하기 위해서는 정상조직이 살아남을 수 있는 혈중농도에서 환자는 부작용을 감수할 수 있어야 하고 암세포는 살해되어야 하는데, 항암제에 대한 약제 내성은 암세포를 죽일 수 있는 농도에 도달할 수 있는 양의 항암제를 투여했음에도 불구하여 암세포가 죽지 않는 경우를 말한다. 항암제 내성은 환자 개개인에 따라 다를 수 있으며 심지어 같은 조직으로부터 유래된 종양들 사이의 유전적 차이 등을 포함한 다양한 인자들에 의해 유발될 수 있다.

상기와 같이, 종래의 암 치료를 위한 방법들 중 하나로 항암제 투여가 있었으나, 암세포의 사멸과 정상세포의 생존을 위한 적절한 농도를 결정하는 데에는 많은 문제점이 여전히 남아있다. 암세포를 더 효과적으로 치료하기 위해 높은 농도의 항암제를 투여하게 되면 정상세포까지 세포사멸을 유도할 수 있다. 때문에 낮은 농도의 항암제를 투여함으로써 암세포의 성장을 억제하거나 사멸을 유도하는 방법의 개발이 필요하다.

이와 관련하여 한국공개특허 제10-2011-0028854호에서는 대장암과 연관된 단백질인 CANu1 조절을 통한 암세포 생장 억제 및 항암제 민감성 증진제를 개시하고 있으나, 현재까지 항암제의 내성과 관련된 다양한 유전자의 규명은 미미한 실정이다.

이에 본 발명자들은 항암제 내성(비반응성 또는 저항성)과 관련된 유전자를 밝히기 위하여 shRNA(short hairpin RNA) 라이브러리를 사용하여 유전자 스크리닝을 수행한 결과 ZMYM2가 소라페닙의 항암세포에 대한 비반응성 또는 저항성과 관련된 유전자임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제10-2011-0028854호

따라서 본 발명의 목적은 ZMYM2(zinc finger, MYM-type 2)의 항암제 민감성(sensitivity) 증진이라는 신규 용도를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 ZMYM2를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 ZMYM2(zinc finger, MYM-type 2) 단백질; 또는 ZMYM2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현벡터를 유효성분으로 함유하는 항암제 민감성(sensitivity) 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 항암제와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 폐암, 위암, 대장암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종, 뇌하수체 선종으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 고형암일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항암제는 소라페닙(sorafenib)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 간암일 수 있다.

또한, 본 발명은 ZMYM2(zinc finger, MYM-type 2) 단백질; 또는 ZMYM2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 폐암, 위암, 대장암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종, 뇌하수체 선종으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 고형암일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 항암제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항암제는 소라페닙(sorafenib)일 수 있다.

본 발명에 따른 ZMYM2(zinc finger, MYM-type 2)는 소라페닙(sorafenib)의 암세포에 대한 민감성(sensitivity) 증진과 관련된 기능을 가지므로, 이를 이용하여 항암제인 소라페닙의 암세포에 대한 내성을 조절하는 경우, 낮은 농도의 소라페닙의 사용만으로도 암세포의 성장을 억제하거나 사멸을 유도할 수 있어 암 치료에 있어서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 소라페닙 저항성 유전자 동정을 위해 shRNA 라이브러리를 포함하는 Hep3B 세포주(Hep3B-pRS-shRNA) 수립 및 여기에 소라페닙 처리에 따른 단계적 생존 세포의 선별과정을 간략하게 나타낸 흐름도이다.
도 2a는 Hep3B 세포에 소라페닙을 농도별(0.01, 0.1, 1, 10μM)로 처리한 후 4일이 경과한 시점에 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 2b는 Hep3B-pRS-shRNA 세포에 소라페닙 처리 후 시간 경과(1, 2, 3, 4일)에 따른 스크리닝 단계별 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 3a는 ZMYM2 siRNA(si-#2-ZMYM2, si-#4-ZMYM2, si-#5-ZMYM2)로 형질전환된 Hep3B 세포에서 ZMYM2의 mRNA 발현양을 qPCR 분석을 통해 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 3b는 ZMYM2 siRNA(si-#2-ZMYM2, si-#4-ZMYM2, si-#5-ZMYM2)로 형질전환된 Hep3B 세포에서 ZMYM2의 단백질의 양을 웨스턴 블랏 분석을 통해 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 3c는 ZMYM2 siRNA(si-#2-ZMYM2, si-#4-ZMYM2, si-#5-ZMYM2)로 형질전환된 Hep3B 세포에서 소라페닙을 농도별(0, 2, 5, 10μM) 로 처리에 따른 세포 생존율을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 간세포암 조직 샘플의 종양 및 비종양 영역에서 ZMYM2 발현 정도를 면역조직화학적 염색을 통해 분석한 결과이다 (A: 중심을 기준으로 오른쪽 부분은 비종양 간세포 경변(cirrhotic hepatocyte)을 나타내며 중심을 기준으로 왼쪽 부분은 종양 영역을 나타냄[×100 magnification], B: 종양 영역[×200 magnification], C: 비종양 영역[×200 magnification]).

하나의 양태로서, 본 발명은 ZMYM2(zinc finger, MYM-type 2) 단백질을 유효성분으로 함유하는 항암제 민감성(sensitivity) 증진용 조성물에 관한 것이다.

ZMYM2(zinc finger, MYM-type 2)는 zinc finger 단백질로서 히스톤 변형을 제거하는 LSD1-CoREST-HDAC1 복합체 안정화에 관여하며, 염색질의 재구성 복합체의 구성성분인 PML(promyelocyte leukemia) nuclear body와 관련이 있는 것으로 알려져 있다(C.B. Gocke, H. Yu, ZNF198 stabilizes the LSD1-CoREST-HDAC1 complex on chromatin through its MYM-type zinc fingers, PLoS One 3 (2008) e3255).

그러나 현재까지 상기 유전자에 대한 자세한 역할은 규명된 바 없으며, 항암제의 내성과 관련하여 연구는 전무한 실정이다.

본 발명자들은 ZMYM2가 항암제인 소라페닙의 암세포에 대한 내성(비반응성 또는 저항성)과 관련된 유전자임을 최초로 규명하였으며, 따라서 본 발명은 ZMYM2의 항암제 민감성 증진이라는 신규 용도를 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명의 하기 실시예 1에서는, shRNA 라이브러리(8000 인간 유전자 억제)의 간암 세포주에 도입을 통한 pRS-shRNA-Hep3B 세포주를 수립한 후, 이들에 소라페닙을 처리에 따른 생존 세포들의 단계적인 스크리닝(screening) 과정을 거쳐 소라페닙에 저항성을 갖는 유전자들을 동정하였으며, 그 결과 ZMYM2가 이러한 기능을 가지는 후보군으로 선별되었다.

또한, 본 발명의 하기 실시예 2에서는, ZMYM2가 실제로 소라페닙에 대한 저항성을 나타내는지를 확인하기 위하여 ZMYM2 siRNA로 형질전환시킨 간암세포주 Hep3B에 소라페닙을 농도별로 처리한 결과, 대조군은 소라페닙의 농도에 의존적으로 세포 생존율이 감소되는 반면, siRNA를 이용하여 ZMYM2을 넉다운시킨 실험군에서는 간암세포의 생존율이 대조군과 비교하여 두드러지게 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이를 통하여 ZMYM2 발현 조절이 소라페닙의 암세포주에 대한 내성(비반응성 또는 저항성)에 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 ZMYM2의 발현 또는 활성이 억제되는 경우 소라페닙과 같은 항암제에 대해 암세포가 내성을 가져 항암제의 활성이 억제되는 것을 알 수 있었다.

그러므로 ZMYM2를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 항암제 민감성을 효과적으로 증진시킬 수 있다.

용어 "siRNA"는 RNA 간섭 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 약 20 뉴클레오티드 크기의 작은 핵산 분자를 의미한다. 최근 유전자 수준에서 단백질의 발현을 조절하기 위한 방법으로 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 현상을 이용한 방법이 연구되고 있으며, 일반적으로 siRNA는 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 단백질 발현을 억제하는 것으로 밝혀졌다.

용어 "shRNA"는 siRNA 타겟 서열의 센스 및 안티센스 서열이 5-9개의 염기로 구성된 루프(loop)를 사이에 두고 위치한 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)를 의미한다. 이러한 shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 프로세싱 효소(Dicer or Rnase Ⅲ)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 목적 유전자의 사일런싱을 유도함이 널리 알려져 있다.

용어 "항암제"란 암세포의 각종 대사경로에 작용하여 암세포에 대하여 세포독성(cytotoxicity)이나 성장억제효과(cytostatic effects)를 나타내는 기존의 암 치료에 사용되는 공지의 약제를 총칭하는 것이며, 지금까지 개발된 대사길항제, 식물성 알칼로이드, 토포이소머라제 저해제(topoisomerase inhibitor), 알킬화제, 항암성 항생물질, 호르몬제 및 기타 약제를 모두 포함하는 것이다.

상기 민감성이 증대될 수 있는 항암제의 종류로는 시중에 판매되는 어떠한 항암제도 될 수 있으나, 예를 들어 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산,젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈,에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴,클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴 등일 수 있다.

본 발명의 실시예에서는, 소라페닙(sorafenib)에 대한 내성(비반응 또는 저항성)에 대하여 확인하였다.

본 발명에서, ZMYM2는 단백질 야생형뿐만 아니라 90% 이상의 아미노산 상동성을 가지고 동일한 단백질 활성을 가지는 기능적 상동체를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "상동성"이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 ZMYM2 단백질은 서열번호 1의 서열로 정의되는 야생형 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

본 기술 분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 90% 이상의 상동성이 유지되고 본 발명에서 ZMYM2 야생형 단백질과 동일한 활성을 보유하는 한 균등한 단백질임을 쉽게 이해할 것이다.

본 발명에 따른 ZMYM2 단백질은 야생형과 동일한 단백질 활성을 보유하는 한 이들의 아미노산 서열 변이체를 포함할 수 있다. 여기서 변이체란 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다.

이러한 변이체는 야생형과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 기능적 상동체 또는 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키는 변형을 가지는 단백질을 포함한다. 바람직하게는 단백질의 물리 화학적 성질이 변형된 변이체이다. 예를 들어, 온도, 수분, pH, 전해질, 환원당, 가압, 건조, 동결, 계면장력, 광선, 동결과 해동의 반복, 고농도 조건 등의 물리적 요인과 산, 알카리, 중성염, 유기용매, 금속이온, 산화환원제, 프로티아제 등의 화학적 요인의 외부 환경에 대한 구조적 안정성이 증대된 변이체이다. 또한 아미노산 서열상의 변이로 효소 활성이 증대된 변이체일 수 있다.

본 발명에 따른 ZMYM2 단백질은 생물체로부터 직접 분리하여 제조하거나, 화학적으로 합성하거나, 유전자 재조합 기술을 이용하여 얻을 수도 있다.

먼저, 본 발명에 따른 ZMYM2 단백질은 생물체로부터 직접 분리하여 제조할 수 있다. 세포에 함유된 본 발명의 ZMYM2 단백질의 분리 및 정제는 많은 공지 방법에 의해 실시할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 ZMYM2 단백질은 화학적으로 합성할 수 있다. 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당 분야에 널리 공지된 폴리펩티드 합성법을 이용하여 얻을 수 있다. 폴리펩티드는 통상의 단계적인 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법을 이용하여 제조할 수 있다. 특히, 바람직한 폴리펩티드의 제조방법은 고체상 합성방법(solid phase syntheses)을 이용하는 것이다. ZMYM2는 보호된 아미노산간의 응축반응(condensation reaction)에 의하여 통상의 고체상 방법으로, C-말단으로부터 시작하여 그 서열에 따라 순차적으로 진행하면서 합성할 수 있다. 응축 반응 후 보호기 및 C-말단 아미노산이 연결된 담체를 산분해(acid decomposition) 또는 아미놀리시스(aminolysis)와 같은 공지의 방법에 의해 제거할 수 있다. 상기 언급된 폴리펩티드 합성법은 관련 서적에 상세히 기술되어 있다.

또한 본 발명에 따른 ZMYM2 단백질은 유전자 재조합 기술을 이용하여 얻을 수도 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, 본 발명의 ZMYM2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(핵산)를 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주세포로 형질전환하여 본 발명의 ZMYM2 단백질이 발현되도록 숙주세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 상기 단백질을 회수하는 과정으로 수득할 수 있다. 단백질은 선택된 숙주 세포에서 발현시킨 후, 분리 및 정제를 위해 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용한다.

본 발명의 항암제 민감성 증진용 조성물은 유효성분으로 ZMYM2 단백질 이외에, 당업계의 공지된 담체 및 희석제와 함께 적절한 제형으로 투여될 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여, 예를 들면, 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하주사, 좌제 등의 제형을 가질 수 있다.

상기 제형들은 약제학적 조성물에 통상적으로 사용되는 적당한 부형제, 충전물, 결합제, 습윤제, 분해제, 윤활제, 계면활성제, 분산제, 완충액, 방부제, 용해보조제, 소독제, 감미료, 향신료, 진통제, 안정화제, 등장액제 등을 이용한 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

상기 기술된 각각의 제형은 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 담체 또는 첨가제의 구체적인 예로는 물, 약학적으로 허용되는 유기용매, 콜라겐, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리딘, 카복시비닐 중합체, 알긴산 나트륨, 수용성 덱스트란, 카복시메틸 나트륨 녹말, 펙틴, 잔탄 고무, 아라비아 고무, 카제인, 겔라틴, 한천, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴 알코올, 스테아린산, 인간 혈청 알부민, 만니톨, 소비톨 및 젖산 등이 있다. 한 개 또는 그 이상의 첨가제가 조제 형태에 따라 선택되거나 또는 적절히 조합될 수 있다. 더 나아가, 본 발명의 조성물 투여방법으로는, 정맥내, 동맥내 투여와 같은 통상적인 전신투여 이외에 표적세포로의 국소적 투여가 행해질 수 있으며, 카테터 기술 및 외과적 수술과 조합된 투여 방법이 사용될 수 있다.

이러한 본 발명의 항암제 민감성 증진용 조성물은 항암제와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있다.

본 발명의 상기 조성물이 치료효과를 나타낼 수 있는 암의 종류로는, 폐암, 위암, 대장암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종, 뇌하수체 선종 등을 들 수 있되, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 소라페닙(sorafenib)의 민감성 증가를 위하여 사용될 수 있으며, 이때 치료효과를 나타낼 수 있는 암의 종류로는 바람직하게는 감암(Hepatocellular Carcinoma, HCC)일 수 있다.

본 발명의 항암제 민감성 증진용 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 체중, 건강상태, 질병의 증상, 투여시간, 투여방법에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 0.1 ~ 100 mg이 투여될 수 있다. 예를 들면, 치료적으로 유효한 투여량은, 초기에는 세포배양을 통한 시험관내 분석을 사용하여 결정할 수 있다. 당 분야에서 과도한 실험을 거치지 않고도 치료에 유효한 양을 결정할 수 있을 것이며, 이러한 정보를 이용하여 인간에서 유용한 투여량을 더욱 정확하게 결정 할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 ZMYM2(zinc finger, MYM-type 2)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현벡터를 유효성분으로 함유하는 항암제 민감성 증진용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 ZMYM2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이를 발현하는 벡터에 의해 제공되어 단백질로 발현될 수 있다.

본 발명에서 상기 ZMYM2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 자연에서 분리되거나 인위적으로 합성 또는 변형된 것일 수 있는데, ZMYM2를 암호화하는 염기서열은 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변형될 수 있으며, 이러한 변형에 의해 발현된 단백질은 이의 생물학적 작용성에 유의한 변화를 포함하지 않아야 한다. 상기한 변형은 이종의 상동성 유전자로의 변형을 포함한다.

따라서 ZMYM2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하되, 이에 한정되지 않고 상기의 핵산서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열로 표시되는 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 본 발명의 ZMYM2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 이를 발현하는 벡터에 작동가능하게 연결된 재조합 발현벡터의 형태로 제공될 수 있다. ZMYM2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 당업계에 공지된 플라스미드, 파지, 코스미드, 바이러스벡터 또는 기타 매개체를 의미한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

ZMYM2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터/인핸서 서열과 같은 발현 조절 서열 및 기타 전사, 해독 또는 프로세싱에 필요한 서열들과 함께 결합될 수 있다. 조절 서열은 뉴클레오타이드의 구성적 발현(constitutive expression)을 지시하는 것뿐만이 아니라 조직-특이적 조절 및/또는 유도성 서열을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 트랜스펙션시킬 숙주 세포, 목적하는 발현 수준 등과 같은 요소에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 ZMYM2 단백질을 발현하는 발현벡터는 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성벡터를 사용할 수 있다.

상기 비바이러스성 벡터로는 플라스미드가 대표적이다. 플라스미드 발현 벡터는 사람에게 사용할 수 있는 FDA의 승인된 유전자 전달방법으로 사람 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로, 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 pRK5(유럽특허 제307,247호), pSV16B(국제특허공개 제91/08291호) 및 pVL1392(PharMingen) 등이 대표적이다.

또한 본 발명의 ZMYM2 단백질을 발현하는 발현벡터로 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 바이러스 벡터는 예를 들어, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노바이러스-연관 바이러스, 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipoxvirus) 등이 포함된다. 바이러스 벡터는 다음의 기준을 충족해야 한다: (1) 목적하는 세포에 감염할 수 있어야 하며 이에 따라 적합한 숙주 범위를 갖는 바이러스 벡터가 선택되어야 하고, (2) 전달된 유전자가 적절한 기간 동안 세포에서 보존되고 발현될 수 있어야 하며, (3) 벡터가 숙주에 안전해야 한다.

상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 제작된 것이다. 유전자 요법을 위한 레트로바이러스 벡터의 주요 장점은 다량의 유전자를 복제세포 내에 전달하고, 세포 DNA 내로 전달된 유전자를 정확하게 통합하며, 유전자 형질 감염 후 연속적인 감염이 유발되지 않는 것이다. FDA에서 인증받은 레트로바이러스 벡터는 PA317 암포트로픽 레트로바이러스 패키지 세포를 이용하여 제조한 것이다(Miller, A.D. and Buttimore, C., Molec. Cell Biol., 6:2895-2902, 1986).

비-레트로바이러스 벡터로는 상기에서 언급한 바와 같은 아데노바이러스가 있다. 아데노바이러스의 주요 장점은 다량의 DNA 단편(36kb 게놈)을 운반하고, 매우 높은 역가로 비-복제세포를 감염시킬 수 있는 능력이 있다는 것이다. 또한, 허피스 바이러스도 사람 유전자 요법을 위해 유용하게 사용될 수 있다(Wolfe, J.H., et al., Nature Genetics,1:379-384, 1992). 이외에도, 공지된 적절한 바이러스 벡터가 본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있다.

세포 내로 유전자 전달을 위해 사용할 수 있는 다른 바이러스 벡터로는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), JC, SV40, 폴리오마, 엡스타인-바르 바이러스 파필로마 바이러스, 백시니아, 폴리오바이러스, 헤르페스 바이러스, 신드비스 바이러스, 렌티 바이러스, 기타 사람 및 동물 바이러스가 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 발현벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).

또 다른 양태로서, 본 발명은 ZMYM2 단백질; 또는 ZMYM2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현벡터를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, ZMYM2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하되, 이에 한정되지 않고 상기의 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 표시될 수 있다.

또한, 본 발명에서 ZMYM2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하되, 이에 한정되지 않고 상기의 핵산서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 염기서열로 표시될 수 있다.

본 발명 항암용 조성물은 유효성분으로서 ZMYM2 단백질 또는 ZMYM2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현벡터 이외에 종래 알려진 항암제를 추가로 더 포함할 수 있다.

상기 항암제의 종류로는 시중에 판매되는 어떠한 항암제도 될 수 있으며, 바람직하게는 소라페닙(sorafenib)일 수 있다.

본 발명 항암용 조성물이 ZMYM2와 함께 항암제를 유효성분으로 함유하는 경우 어떤 형태의 약제로도 구성될 수 있다.

예를 들면, 두 유효성분을 포함한 합제를 구성해도 좋고, 각각 단제로서 구성되어도 좋다. 여기에서 합제란, 하나의 제제에 2 가지 이상의 유효 성분을 배합한 것을 말하며, 단제란 하나의 제제에 하나의 유효 성분을 함유한 것을 말하며, 이때 상기 유효 성분들은 각각의 약리, 약동학적 특성에 따라 각기 다른 제형으로 제조되어 합쳐질 수도 있다. 본 발명에 있어서, 두 유효 성분이 단제인 경우의 치료제는 각각 단일로 이용이 가능한 단제를 조합하여 이용하는 약제를 의미한다. 두 유효 성분이 단제인 경우는, 두 성분을 한 번에 갖춘 형태인 키트의 형태일 수도 있다.

본 발명의 항암용 조성물은, 그들만 혹은 이하에서 설명하는 것과 같은 적당한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 공지의 방법으로 제제화 할 수 있다. 이와 같은 제형의 구체적인 예로서는, 연질캡슐제, 경질캡슐제, 정제, 시럽제 등의 경구제, 주사제 또는 외용제를 들 수 있다.

약제학적으로 허용되는 담체에는 멸균용액, 정제, 코팅정 및 캡슐과 같은 공지된 제형들에 사용되는 표준의 제약학적 담체 중 어느 것이든 포함된다. 전형적으로 이러한 담체는 폴리비닐피롤리돈, 덱스트린, 전분, 밀크, 당, 특정 종류의 클레이, 젤라틴, 스테아린산, 탈크, 식물성 기름 (예를 들면 식용유, 면실유, 코코넛유, 아몬드유, 낙화생유를 들 수 있다) 중성지방산 글리세라이드 등의 유상 에스테르, 광물유, 바세린, 동물유지, 셀룰로오스 유도체(예를 들면 결정셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스를 들 수 있다) 등의 부형제, 또는 기타 다른 공지의 부형제를 포함한다. 이러한 담체에는 또한 산화방지제, 습윤제, 점도안정제, 풍미제, 색소 첨가제 및 다른 성분들이 포함될 수 있다. 이러한 담체를 함유하는 조성물은 주지된 방법에 의해 제형화 될 수 있다.

본 발명의 항암용 조성물은, 매일 투여 또는 간헐적으로 투여할 수도 있으며, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 수회로 나누어 투여하는 것이 가능하다. 두 유효 성분이 각각 단제인 경우의 투여 횟수는 같은 횟수일 수도, 다른 횟수일 수도 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 암 치료를 위해 약학적 유효량으로 투여될 수 있다.

본 발명의 상기 항암용 조성물이 치료효과를 나타낼 수 있는 암의 종류로는, 폐암, 위암, 대장암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종, 뇌하수체 선종 등을 들 수 있되, 바람직하게는 감암(Hepatocellular Carcinoma, HCC)일 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 암 치료용 의약의 제조를 위한 ZMYM2 단백질; 또는 ZMYM2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현벡터를 유효성분으로 함유하는 조성물의 용도에 관한 것이다. ZMYM2 단백질; 또는 ZMYM2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 암 치료용 의약의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 포유동물에게 치료상 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 암 치료방법에 관한 것이다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"이란, 치료하고자 하는 질환(암)에 대해 완화, 억제, 호전 및/또는 완치효과를 나타내는 유효성분의 양을 말한다. 본 발명의 항암제 및 항암제의 투여량은 다양한 요소에 의해 달라질 수 있으며, 그 투여 경로 또한 환자의 연령, 투여기간, 체중, 질환의 중증도, 환자의 의식 여부, 병용 약물의 종류 등과 같은 다양한 요소에 의해 경구 또는 비경구의 다양한 투여 경로를 사용할 수 있다. 또한, 각각을 별개로 동시 또는 연쇄적으로, 혹은 시간을 두고 별개로 투여하는 것도 가능하다.

상기 항암용 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 비 경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 바람직한 투여방식은 정맥 주사, 피하주사, 피내 주사제, 근육주사 및 점적 주사이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

재료준비

하기 실험에서 사용한 shRNA 라이브러리 및 pRS 벡터는 Origene에서 구입하였으며, 소라페닙은 LC laboratories에서 구입하였고, Ampho세포주 및 퓨로마이신은 Invitrogen에서 구입하였다.

통계분석

실험데이터는 분석 GraphPad Prims 5(GraphPad software, La Jolla, CA)를 이용 적어도 3번의 독립적인 반복검증을 통해 나타내었으며, 다른 그룹들 간의 비교는 student's t test with SPSS version 17.0 statistical software package(SPSS Inc., Chicago, IL)에 의해 평가되었다. p-값이 <0.05인 경우를 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.

< 실시예 1>

shRNA 라이브러리를 이용한 소라페닙 저항성 유전자 동정

본 발명자들은 소라페닙 저항성 유전자를 동정하기 위하여, 먼저 shRNA 라이브러리(8000 인간 유전자 억제: Origene)의 간암 세포주에 도입을 통한 pRS-shRNA-Hep3B 세포주를 수립한 후, 이들에 소라페닙을 처리에 따른 생존 세포들의 단계적인 스크리닝(screening) 과정을 거쳐 소라페닙에 저항성을 갖는 유전자들을 동정하였다.

<1-1> 세포배양

Hep3B 세포들을(American Tissue Culture Collection) 1×10⁶/cm₂의 농도로 분주한 후 페니실린-스트렙토마이신(10IU/ml) 및 fungizone (2.5 μg/mL)이 첨가된 10% FBS가 보충된 DMEM 배지를 이용하여 37℃ 인큐베이터(humidified incubator: 5% CO₂ in air)에서 배양하였다.

<1-2> shRNA 라이브러리를 포함하는 Hep3B 세포주 수립

바이러스 생산물을 위해 2μg의 레트로바이러스 pRS 벡터(empty vector) 및 pRS-shRNA 라이브러리를 293 Ampho 세포주(1×10⁶) 내로 형질주입하였다. 형질주입 후 4일이 경과한 시점에, 이들의 상청액을 Hep3B 세포주에 감염시키고 2주 동안 퓨로마이신(1.0μg/ml)을 이용하여 선별하였다.

퓨로마이신 선별 과정 동안, pRS 벡터(empty vector) 또는 pRS-shRNA 라이브러리가 도입된 세포들은 80% 이상 생존한데 반해 mock 세포들은 모두 사멸한 것으로 나타났다.

하기에서는 pRS 벡터(empty vector)가 도입된 Hep3B 세포를 ‘Hep3B-pRS’로 표현하였으며, pRS-shRNA 라이브러리가 도입된 Hep3B 세포를 ‘Hep3B-pRS-shRNA’로 각각 표현하였다.

<1-3> shRNA 라이브러리의 스크리닝을 통한 소라페닙 저항성 세포 선별 및 shRNA 시퀀싱에 의한 타 겟 유전자 동정

상기 실시예<1-2>을 통해 수립한 Hep3B-pRS 또는 Hep3B-pRS-shRNA 세포들은 10μM 농도의 소라페닙 존재 또는 부존재 하에서 배양한 후, 세포 생존율을 WST1 에세이(Roche Applied Science)를 통해 측정하였다.

자세하게는 Hep3B-pRS 또는 Hep3B-pRS-shRNA 세포에 10μM 농도의 소라페닙을 1 내지 4일 동안 처리하였으며, 소라페닙의 세포 처리 후 4일이 경과한 시점에서 Hep3B-pRS 또는 Hep3B-pRS-shRNA 세포 사이에 생존율이 가장 크게 차이가 나는 것을 확인함에 따라 소라페닙의 처리 시간은 4일이 최적이라고 판단하였다. 한편, shRNA 라이브러리 스크리닝을 위한 최적의 소라페닙 처리 농도를 결정하기 위하여, 4일 동안 Mock 세포 및 Hep3B-pRS 세포에 소라페닙을 농도별(0.01, 0.1, 1, 10μM)로 처리하였으며, 세포 생존율을 WST1 에세이로 측정하였다. 그 결과 도 2a에서 나타낸 바와 같이, 소라페닙의 처리 농도에 의존적으로 세포 생존이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 Hep3B-pRS 또는 Hep3B-pRS-shRNA 세포 생존에서 영향을 미칠 수 있는 소라페닙의 농도는 10μM 농도인 것으로 판단되었다.

이에 Hep3B-pRS 또는 Hep3B-pRS-shRNA 세포에 10μM 농도의 소라페닙을 1일 내지 4일 동안 처리하였으며, 그 후 각각의 그룹에서 생존한 세포들을 수거하였다. 이렇게 수득한 상기 세포들은 10cm 플레이트 내에 75%의 세포율(1.8×10⁶/플레이트)에 도달할 때까지 2주간 배양하였으며, 이러한 과정을 3번 반복하여 수행하였다(도 2b 참조).

3번째 스크리닝 후, pRS-shRNA 라이브러리 중에서 살아남은 세포로부터 소라페닙 저항성과 관련된 유전자를 분석하기 위해, pRS-shRNA 라이브러리의 게놈 DNA를 추출하였고, DNA 시퀀싱을 위해 100개의 개별적인 부착비의존적 클론들을 반 고형 배지(semi-solid media)로부터 분리하여 클로닝함으로써 최종적으로 shRNA 시퀀싱을 통해 ZMYM2가 소라페닙 저항성과 관련된 유전자임을 발견하였다.

< 실시예 2>

ZMYM2 siRNA 로 형질전환된 간암세포 내의 ZMYM2 발현 정도 측정

본 발명자들은 먼저 ZMYM2 siRNA가 ZMYM2를 효과적으로 넉다운(knockdown)시킬 수 있는지를 확인하기 위하여 간암세포주인 Hep3B 세포에 Stealth™ RNAi(HSS111672, HSS187844, HSS187845) 각각의 ZMYM2 siRNA를 도입한 후 상기 세포 내의 ZMYM2의 발현정도를 전사 수준 및 단백질 수준에서 측정하였다.

<2-1> ZMYM2 siRNA 준비

본 발명에서 사용한 Stealth™ RNAi duplexes는 이용 가능한 온라인에서 툴(http://www.invitrogen.com)의 도움을 받아 Invitrogen Life Technologies Inc.에 의해 상업적으로 합성되었다. 본 발명에 사용한 Stealth™ RNAi(Cat No: HSS111672, HSS187844, HSS187845)은 인간 ZMYM2 mRNA 서열(NCBI Reference Sequence: NC_001190965)의 코딩 영역의 타겟을 위해 디자인되었다.

<2-2> ZMYM2 siRNA 를 이용한 형질전환

먼저, Hep3B 세포를 60mm dish(10% FBS 함유 DMEM 배지 포함)에 웰 당 4×10⁵ 농도로 분주하였다. 다음 날 프로토콜의 지시에 따라 hiperfect transfection reagent(Qiagen)이용하여 invitrogen社에서 구입한 Stealth™ RNAi duplexes(HSS111672, HSS187844, HSS187845) 각각을 상기 세포로 형질주입하였다(하기 표 1 참조). 이때 Stealth™ RNAi의 최종 농도는 100nM이었으며, 대조군은 siRNA 음성 대조군으로 사용하는 Med GC(Invitrogen Life Technology Inc.)를 이용하였다.

<2-3> 역전사 및 실시간 qPCR 분석

본 실험에서는 세포에 ZMYM2 siRNA의 도입에 따른 유전자 레벨에서 ZMYM2의 발현이 억제되는지를 조사하기 위해, 상기 실시예 <2-2>을 통해 제조된 형질전환 세포에서 ZMYM2 유전자 발현 정도를 qPCR을 수행하여 분석하였다.

NucleoSpin RNA Ⅱ(MN, Germany)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 Hep3B 세포로부터 전체 mRNA을 추출하였다. 전체 RNA 1μg는 Reverse Transcriptase Premix(Elpis Biotech, Korea)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 역전사하였다. TaqMan PCR을 위한 프로브는 Invitrogen으로부터 구입하였으며, RT-PCR은 7500 Fast Real Time PCR System(Applied Biosystem, CA)를 이용하여 수행되었다. 발현 결과들은 내부 대조군으로서 GAPDH를 이용하여 정량 표준화시켰다.

그 결과 도 3a에서 나타낸 바와 같이, ZMYM2 siRNA(si-#2-ZMYM2, si-#4-ZMYM2, si-#5-ZMYM2)로 형질전환된 Hep3B 세포에서 ZMYM2의 mRNA 발현이 두드러지게 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

<2-4> 웨스턴 블랏 분석

상기 실시예 <2-2>을 통해 제조된 형질전환 세포에서 생성되는 ZMYM2 단백질 양을 측정하기 위하여, 먼저 PBS을 이용하여 형질전환된 Hep3B 세포들을 세척한 후, 용해 버퍼를 처리하여 상등액을 수득한 다음 NuPAGE Novex 3-8% Tri-Acetate(Invitrogen)를 이용하여 단백질을 분리하였다. 모든 1차 항체들을 하기 농도에 따라 0.1% 트윈를 포함하는 Tris buffered saline(TBS-T)에서 3% BSA로 희석시켰다; 항-베타-액틴(1:1000, Cell Signaling), 항-ZMYM2 (1:250, Cell Signaling) 및 2차 HRP 컨쥬게이트된 항체(1:2000, Cell signaling). HRP는 Immunobilon Western chemiluminescent HRP substrate kit (Millipore)를 이용하여 검출하였으며, 이미지는 Bio-Rad ChemiDoc XRS System을 이용하여 스캔하였다.

그 결과 도 3b에 나타낸 바와 같이, ZMYM2 siRNA(si-#2-ZMYM2, si-#4-ZMYM2, si-#5-ZMYM2)로 형질전환된 Hep3B 세포에서 ZMYM2의 단백질이 거의 검출되지 않은 것으로 나타났으며, 이를 통해 ZMYM2 siRNA가 ZMYM2 유전자를 효과적으로 넉다운(knockdown)시키는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3>

ZMYM2 유전자 발현이 억제된 세포에 소라페닙의 농도별 처리에 따른 세포 생존율 측정

본 발명자들은 ZMYM2 유전자가 소라페닙 내성(비반응성 또는 저항성)과 관련이 있는지를 확인하기 위하여, ZMYM2 siRNA로 형질전환된 Hep3B 세포주에 소라페닙을 농도별로 처리한 후 상기 암세포의 세포 생존율을 측정하였다.

자세하게는 ZMYM2 siRNA로 형질전환된 Hep3B 세포들을 0, 2, 5,10μM의 소라페닙으로 각각 처리한 후 48시간 동안 배양하였으며, EZ-CyTox cell viability assay kit (Daeillab, Korea)를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 세포가 배양된 96 웰 각각에 EZ-CyTox solution (10 μL)을 첨가한 후, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 흡광도는 ELISA reader at 450 nm (Microplate reader, Bio-Rad)를 이용하여 측정하였다. 세포 생존율은 100% 생존율로 정의된 vehicle-처리된 세포(비형질전환된 세포)에 따른 상대 퍼센트로써 나타내었다.

그 결과 도 3c에서 나타낸 바와 같이, 대조군은 소라페닙의 농도에 의존적으로 세포 생존율이 감소되는 반면, siRNA를 이용하여 ZMYM2을 넉다운시킨 실험군에서는 간암세포의 생존율이 대조군과 비교하여 두드러지게 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이를 통하여 ZMYM2 발현 조절이 소라페닙의 암세포주에 대한 내성(비반응성 또는 저항성)에 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 ZMYM2의 발현 또는 활성이 억제되는 경우 소라페닙과 같은 항암제에 대해 암세포가 내성을 가져 항암제의 활성이 억제되는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

ZMYM2 에 대한 면역조직화학적 염색 분석

본 실험에서는 면역조직화학적 염색 분석을 통해 간세포암 조직 샘플의 종양 및 비종양 영역에서 ZMYM2 발현 여부를 확인하였다.

총 20개의 인간 간세포암 조직 샘플을 면역조직화학적염색으로 분석하였다. 자일렌으로 탈파라핀 후, 섹션들은 antigen retrieving을 위해 고압멸균을 적용하였으며, PBS로 3번 세척하였다. 비특이적 결합을 차단하기 위해, 비오틴이 부착된 2차 항체 및 스트렙트아비딘 퍼옥시다아제 결합은 Streptavidin Biotin Universal System (Immunotech, Marseille, France)를 이용하여 수행하였다. 항-ZMYM2 항체 (1:200, Sigma-Aldrich, MO)는 면역조직화학적 염색 분석을 위해 Antibody Diluted Buffer(Covance, Princeton, NJ)에서 희석된 1차 항체로 사용되었다. 염색을 위하여, AEC Chromogen Kit(Immunotech, Marseille, France)를 사용하였으며, 헤마토실린을 이용하여 대조염색하였다. 조직 내 염색의 강도는 양성 세포들의 강도 및 퍼센트를 따라 점수화하였다. 면역염색 수준은 조직 슬라이드의 3번에 걸친 세심한 관찰 후 0(negative), 1+(weakly positive), +2(moderately positive), +3(strongly positive)로서 점수화하였으며, 그 후 종양 및 비종양 영역의 염색 강도 발현과 비교하였다.

그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 종양 영역보다 비종양 영역에서 과립모양의 세포질의 염색 강도가 통계적으로 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다(p≤0.05). 따라서 이러한 결과를 통해, 종양 영역에서 ZMYM2 단백질 발현이 두드러지게 감소되는 것을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for Enhancing Sensitivity to Anti-cancer agent Comprising of ZMYM2 <130> PN1306-186 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1377 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Thr Ser Ser Val Gly Gly Leu Glu Leu Thr Asp Gln Thr Pro 1 5 10 15 Val Leu Leu Gly Ser Thr Ala Met Ala Thr Ser Leu Thr Asn Val Gly 20 25 30 Asn Ser Phe Ser Gly Pro Ala Asn Pro Leu Val Ser Arg Ser Asn Lys 35 40 45 Phe Gln Asn Ser Ser Val Glu Asp Asp Asp Asp Val Val Phe Ile Glu 50 55 60 Pro Val Gln Pro Pro Pro Pro Ser Val Pro Val Val Ala Asp Gln Arg 65 70 75 80 Thr Ile Thr Phe Thr Ser Ser Lys Asn Glu Glu Leu Gln Gly Asn Asp 85 90 95 Ser Lys Ile Thr Pro Ser Ser Lys Glu Leu Ala Ser Gln Lys Gly Ser 100 105 110 Val Ser Glu Thr Ile Val Ile Asp Asp Glu Glu Asp Met Glu Thr Asn 115 120 125 Gln Gly Gln Glu Lys Asn Ser Ser Asn Phe Ile Glu Arg Arg Pro Pro 130 135 140 Glu Thr Lys Asn Arg Thr Asn Asp Val Asp Phe Ser Thr Ser Ser Phe 145 150 155 160 Ser Arg Ser Lys Val Asn Ala Gly Met Gly Asn Ser Gly Ile Thr Thr 165 170 175 Glu Pro Asp Ser Glu Ile Gln Ile Ala Asn Val Thr Thr Leu Glu Thr 180 185 190 Gly Val Ser Ser Val Asn Asp Gly Gln Leu Glu Asn Thr Asp Gly Arg 195 200 205 Asp Met Asn Leu Met Ile Thr His Val Thr Ser Leu Gln Asn Thr Asn 210 215 220 Leu Gly Asp Val Ser Asn Gly Leu Gln Ser Ser Asn Phe Gly Val Asn 225 230 235 240 Ile Gln Thr Tyr Thr Pro Ser Leu Thr Ser Gln Thr Lys Thr Gly Val 245 250 255 Gly Pro Phe Asn Pro Gly Arg Met Asn Val Ala Gly Asp Val Phe Gln 260 265 270 Asn Gly Glu Ser Ala Thr His His Asn Pro Asp Ser Trp Ile Ser Gln 275 280 285 Ser Ala Ser Phe Pro Arg Asn Gln Lys Gln Pro Gly Val Asp Ser Leu 290 295 300 Ser Pro Val Ala Ser Leu Pro Lys Gln Ile Phe Gln Pro Ser Val Gln 305 310 315 320 Gln Gln Pro Thr Lys Pro Val Lys Val Thr Cys Ala Asn Cys Lys Lys 325 330 335 Pro Leu Gln Lys Gly Gln Thr Ala Tyr Gln Arg Lys Gly Ser Ala His 340 345 350 Leu Phe Cys Ser Thr Thr Cys Leu Ser Ser Phe Ser His Lys Pro Ala 355 360 365 Pro Lys Lys Leu Cys Val Met Cys Lys Lys Asp Ile Thr Thr Met Lys 370 375 380 Gly Thr Ile Val Ala Gln Val Asp Ser Ser Glu Ser Phe Gln Glu Phe 385 390 395 400 Cys Ser Thr Ser Cys Leu Ser Leu Tyr Glu Asp Lys Gln Asn Pro Thr 405 410 415 Lys Gly Ala Leu Asn Lys Ser Arg Cys Thr Ile Cys Gly Lys Leu Thr 420 425 430 Glu Ile Arg His Glu Val Ser Phe Lys Asn Met Thr His Lys Leu Cys 435 440 445 Ser Asp His Cys Phe Asn Arg Tyr Arg Met Ala Asn Gly Leu Ile Met 450 455 460 Asn Cys Cys Glu Gln Cys Gly Glu Tyr Leu Pro Ser Lys Gly Ala Gly 465 470 475 480 Asn Asn Val Leu Val Ile Asp Gly Gln Gln Lys Arg Phe Cys Cys Gln 485 490 495 Ser Cys Val Ser Glu Tyr Lys Gln Val Gly Ser His Pro Ser Phe Leu 500 505 510 Lys Glu Val Arg Asp His Met Gln Asp Ser Phe Leu Met Gln Pro Glu 515 520 525 Lys Tyr Gly Lys Leu Thr Thr Cys Thr Gly Cys Arg Thr Gln Cys Arg 530 535 540 Phe Phe Asp Met Thr Gln Cys Ile Gly Pro Asn Gly Tyr Met Glu Pro 545 550 555 560 Tyr Cys Ser Thr Ala Cys Met Asn Ser His Lys Thr Lys Tyr Ala Lys 565 570 575 Ser Gln Ser Leu Gly Ile Ile Cys His Phe Cys Lys Arg Asn Ser Leu 580 585 590 Pro Gln Tyr Gln Ala Thr Met Pro Asp Gly Lys Leu Tyr Asn Phe Cys 595 600 605 Asn Ser Ser Cys Val Ala Lys Phe Gln Ala Leu Ser Met Gln Ser Ser 610 615 620 Pro Asn Gly Gln Phe Val Ala Pro Ser Asp Ile Gln Leu Lys Cys Asn 625 630 635 640 Tyr Cys Lys Asn Ser Phe Cys Ser Lys Pro Glu Ile Leu Glu Trp Glu 645 650 655 Asn Lys Val His Gln Phe Cys Ser Lys Thr Cys Ser Asp Asp Tyr Lys 660 665 670 Lys Leu His Cys Ile Val Thr Tyr Cys Glu Tyr Cys Gln Glu Glu Lys 675 680 685 Thr Leu His Glu Thr Val Asn Phe Ser Gly Val Lys Arg Pro Phe Cys 690 695 700 Ser Glu Gly Cys Lys Leu Leu Tyr Lys Gln Asp Phe Ala Arg Arg Leu 705 710 715 720 Gly Leu Arg Cys Val Thr Cys Asn Tyr Cys Ser Gln Leu Cys Lys Lys 725 730 735 Gly Ala Thr Lys Glu Leu Asp Gly Val Val Arg Asp Phe Cys Ser Glu 740 745 750 Asp Cys Cys Lys Lys Phe Gln Asp Trp Tyr Tyr Lys Ala Ala Arg Cys 755 760 765 Asp Cys Cys Lys Ser Gln Gly Thr Leu Lys Glu Arg Val Gln Trp Arg 770 775 780 Gly Glu Met Lys His Phe Cys Asp Gln His Cys Leu Leu Arg Phe Tyr 785 790 795 800 Cys Gln Gln Asn Glu Pro Asn Met Thr Thr Gln Lys Gly Pro Glu Asn 805 810 815 Leu His Tyr Asp Gln Gly Cys Gln Thr Ser Arg Thr Lys Met Thr Gly 820 825 830 Ser Ala Pro Pro Pro Ser Pro Thr Pro Asn Lys Glu Met Lys Asn Lys 835 840 845 Ala Val Leu Cys Lys Pro Leu Thr Met Thr Lys Ala Thr Tyr Cys Lys 850 855 860 Pro His Met Gln Thr Lys Ser Cys Gln Thr Asp Asp Thr Trp Arg Thr 865 870 875 880 Glu Tyr Val Pro Val Pro Ile Pro Val Pro Val Tyr Ile Pro Val Pro 885 890 895 Met His Met Tyr Ser Gln Asn Ile Pro Val Pro Thr Thr Val Pro Val 900 905 910 Pro Val Pro Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Pro Leu Asp Ser Ser Glu 915 920 925 Lys Ile Pro Ala Ala Ile Glu Glu Leu Lys Ser Lys Val Ser Ser Asp 930 935 940 Ala Leu Asp Thr Glu Leu Leu Thr Met Thr Asp Met Met Ser Glu Asp 945 950 955 960 Glu Gly Lys Thr Glu Thr Thr Asn Ile Asn Ser Val Ile Ile Glu Thr 965 970 975 Asp Ile Ile Gly Ser Asp Leu Leu Lys Asn Ser Asp Pro Glu Thr Gln 980 985 990 Ser Ser Met Pro Asp Val Pro Tyr Glu Pro Asp Leu Asp Ile Glu Ile 995 1000 1005 Asp Phe Pro Arg Ala Ala Glu Glu Leu Asp Met Glu Asn Glu Phe Leu 1010 1015 1020 Leu Pro Pro Val Phe Gly Glu Glu Tyr Glu Glu Gln Pro Arg Pro Arg 1025 1030 1035 1040 Ser Lys Lys Lys Gly Ala Lys Arg Lys Ala Val Ser Gly Tyr Gln Ser 1045 1050 1055 His Asp Asp Ser Ser Asp Asn Ser Glu Cys Ser Phe Pro Phe Lys Tyr 1060 1065 1070 Thr Tyr Gly Val Asn Ala Trp Lys His Trp Val Lys Thr Arg Gln Leu 1075 1080 1085 Asp Glu Asp Leu Leu Val Leu Asp Glu Leu Lys Ser Ser Lys Ser Val 1090 1095 1100 Lys Leu Lys Glu Asp Leu Leu Ser His Thr Thr Ala Glu Leu Asn Tyr 1105 1110 1115 1120 Gly Leu Ala His Phe Val Asn Glu Ile Arg Arg Pro Asn Gly Glu Asn 1125 1130 1135 Tyr Ala Pro Asp Ser Ile Tyr Tyr Leu Cys Leu Gly Ile Gln Glu Tyr 1140 1145 1150 Leu Cys Gly Ser Asn Arg Lys Asp Asn Ile Phe Ile Asp Pro Gly Tyr 1155 1160 1165 Gln Thr Phe Glu Gln Glu Leu Asn Lys Ile Leu Arg Ser Trp Gln Pro 1170 1175 1180 Ser Ile Leu Pro Asp Gly Ser Ile Phe Ser Arg Val Glu Glu Asp Tyr 1185 1190 1195 1200 Leu Trp Arg Ile Lys Gln Leu Gly Ser His Ser Pro Val Ala Leu Leu 1205 1210 1215 Asn Thr Leu Phe Tyr Phe Asn Thr Lys Tyr Phe Gly Leu Lys Thr Val 1220 1225 1230 Glu Gln His Leu Arg Leu Ser Phe Gly Thr Val Phe Arg His Trp Lys 1235 1240 1245 Lys Asn Pro Leu Thr Met Glu Asn Lys Ala Cys Leu Arg Tyr Gln Val 1250 1255 1260 Ser Ser Leu Cys Gly Thr Asp Asn Glu Asp Lys Ile Thr Thr Gly Lys 1265 1270 1275 1280 Arg Lys His Glu Asp Asp Glu Pro Val Phe Glu Gln Ile Glu Asn Thr 1285 1290 1295 Ala Asn Pro Ser Arg Cys Pro Val Lys Met Phe Glu Cys Tyr Leu Ser 1300 1305 1310 Lys Ser Pro Gln Asn Leu Asn Gln Arg Met Asp Val Phe Tyr Leu Gln 1315 1320 1325 Pro Glu Cys Ser Ser Ser Thr Asp Ser Pro Val Trp Tyr Thr Ser Thr 1330 1335 1340 Ser Leu Asp Arg Asn Thr Leu Glu Asn Met Leu Val Arg Val Leu Leu 1345 1350 1355 1360 Val Lys Asp Ile Tyr Asp Lys Asp Asn Tyr Glu Leu Asp Glu Asp Thr 1365 1370 1375 Asp <210> 2 <211> 10153 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 agaaccgggt gaggcttatc cccgctgtct ttccagtcca gggccgccga gagtgggggt 60 ggctgggagc agcgcagcct ccggaggagg aggcggaggc ggaggcgact agggaggcgg 120 agatgggacc aagaatcgcc ttcagccctg tctggtgcat ccttggcaga aagtgaggag 180 gaaaacaccc ccattgttct ttggcatgga cacaagttca gtgggaggat tagaattgac 240 tgatcagact cctgttttat tagggagtac ggccatggca actagtctca cgaatgtagg 300 aaactcattt agtggtccag ctaatccttt agtgtctaga tctaataagt ttcagaactc 360 gtcagtggaa gatgatgatg atgttgtttt tatcgaacct gtacaacctc ccccaccttc 420 tgtaccagtg gtagctgatc aaagaaccat aacatttaca tcatcaaaaa atgaagaact 480 acaaggaaat gattccaaaa ttactccttc ctcaaaagag ttggcatctc agaagggaag 540 tgtaagtgag acaattgtca ttgatgatga agaggacatg gaaacaaatc aagggcaaga 600 gaaaaattcc tccaatttta ttgaacgaag acctcctgag actaaaaaca gaaccaatga 660 tgtggatttc tccacttcca gtttttcaag aagtaaggta aatgcaggaa tgggtaatag 720 tggtatcacc acagaaccag actctgaaat tcagattgct aatgttacaa ctttagaaac 780 aggtgtaagc tctgtgaatg atggccaatt agaaaatact gacgggcgag atatgaactt 840 aatgattaca catgtaacat cactgcagaa taccaacttg ggagatgtct ctaacggact 900 gcagtcaagt aattttggtg ttaatataca aacatacacc ccatctttaa cttcacagac 960 caagactgga gtaggacctt ttaatcctgg tagaatgaat gtggcaggag acgtttttca 1020 gaatggagaa tctgcaactc atcataatcc tgattcttgg atctcccagt cagcttcatt 1080 tccccgtaat cagaaacaac caggggtgga ctctttatca ccagtggcct cacttcctaa 1140 acagattttc cagccgtctg tccaacagca gcctactaaa ccagttaaag tcacttgtgc 1200 aaactgcaaa aaacctttac agaagggcca gacagcttat caacgaaaag gatcagctca 1260 cctcttttgt tctaccacct gcctttcttc cttctcccac aagcctgctc caaagaaact 1320 ctgtgttatg tgtaaaaaag atataactac aatgaaagga accattgttg ctcaagtgga 1380 ttcaagtgag tccttccagg aattctgtag tacatcttgt ttatctctct atgaagacaa 1440 acagaatcct actaaaggag ctctaaataa atcaagatgt acaatctgtg gtaaactaac 1500 tgagattcgc catgaagtca gctttaaaaa tatgactcat aagctgtgca gtgaccactg 1560 ctttaataga tatagaatgg ccaatggttt aataatgaat tgctgtgaac agtgtggaga 1620 gtacttgccc agtaaaggtg ctggaaataa tgttctggtg attgatggtc aacagaaaag 1680 attttgctgt caaagttgtg tcagtgaata caaacaggta ggtagccatc caagcttcct 1740 gaaggaggtt cgagatcaca tgcaggactc tttcttaatg cagcctgaga aatatggaaa 1800 actgacaact tgtactggtt gccgaacaca gtgcaggttt tttgatatga ctcagtgtat 1860 aggtcctaat ggatatatgg agccatattg ttcaactgct tgtatgaaca gtcacaagac 1920 aaaatatgca aaatcacaaa gtttgggaat tatttgccat ttttgtaagc gaaactcttt 1980 acctcaatac caagccacaa tgcctgatgg aaaactgtac aacttttgca attccagttg 2040 tgtggctaaa tttcaggctc taagtatgca gtcatctcca aatggccagt ttgtagcgcc 2100 aagtgatatt cagttgaaat gcaactactg caaaaattcc ttttgttcaa aaccagaaat 2160 cctggaatgg gagaacaaag tgcatcagtt ctgcagcaaa acttgttcag atgactataa 2220 gaagttgcat tgcatagtta catattgcga atactgtcaa gaggagaaga ctcttcatga 2280 aacagtaaat ttctctggcg ttaagagacc tttctgtagt gaaggctgca aattattata 2340 caaacaggat tttgccagac gtttaggatt gagatgtgtt acttgcaact attgttctca 2400 gctatgtaag aagggagcaa ctaaagaact cgatggtgtt gtgagagatt tctgcagtga 2460 agattgctgt aaaaaatttc aggattggta ctacaaggct gcaaggtgtg actgttgtaa 2520 atctcaagga actcttaaag agcgagttca gtggcgtggg 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tatgtatgtg tgtgtgtata 5100 tatatatata tatatatata tataaatgat tgtaagttga aaacaagatc atcaagacat 5160 ttcctttgta aaaatgtctg gtgaaagtat aaaattctgt tttcttctat gccagccata 5220 agtatctgaa atcctcttca tttatagagg tttgattttt atttcttttt ttccctctta 5280 aggatacaga tcatgctgca atgttagctg tgtagtactc taaaacttag caattttatc 5340 agaattcttg tgcctgttta cattggataa aattgttttt agaaattcca ctcctgaaat 5400 agttacagaa agtcaagcta tgttaaataa gataggatca cattttataa tgaagattac 5460 cagtgtagta attctgatat tgcaaatgat tgaggaacaa acaaagaaac taatagagaa 5520 agtcagtctc agaggaaatc ccatttaatg ttagattgtt tggcttttga aattacttct 5580 tatagaagat tgcattaaaa aaaaaaacaa ctttgtgctt ctgcatagca atttatccat 5640 tcagaccttt tcttttagaa taaggaaact taaaatctac tttctaaaga ctgaacaaag 5700 tgctagctgc aaattatctt gaaatcattt ggctcttttc tagcatgtgt gtaatcatgt 5760 tttcttctga ttcctgaatg accatggtag cattagtgtt tagaaattgt tcaggggaaa 5820 attgagctat tttccatagt ggctagcaat tgctacacat ccttagatac tcctctctcc 5880 cataggataa atgttacagc acacaaaaga aattttctca 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ttttagctct gttggaaatg 8460 gtcagtagag caatttctga atattttgat ggtacggtgt tgatggcatc agtccttttc 8520 tgtggctttc agcccaactt aatacaagag gagttaaaaa tagcacccaa aaggggtagc 8580 tagagcaccc tcaccatgca ctaaagataa atctaaaagg tgttcaagta cattgaatca 8640 agatgagtaa tccaacttct atgttatgta ggatggatgg agcacacaaa ttcttgcaaa 8700 cattgtagag gtttttttaa acttcatcca ctaaggattt ttttataata attacttttg 8760 aaaataaaat ctcaactatt ttccaagtta tgagtgtgct gctcttaacc ctgtgagatg 8820 aaatcttccc atttggatta catatttgta gttctatatc gacatcagca gatggcaata 8880 gtatacaaat agtatacagc atgagccttc cattgctttt atttctttgt ttataagtat 8940 actataatcc ttcatctgaa acccttaggg ttttagaatt cagaattttc cccttttcag 9000 agagaatata tataatgtag attacataac accctcaatg gggcctgggg caacacccca 9060 taatcaaaca ttagtacatt catagtaact gggattaact atgtaaggca gtaagctacc 9120 tgccttacat agtttaggtc aatttttgtc acaaacttat ggaaaaacta ggtttttaga 9180 aattttttgg atctcagaat tcgtgattag ggattgctga cctctgtaag gaaactggtg 9240 tcaggtctag aattttcctt ctaatgaaat acgtagtcat 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attttgaaaa taaaggaacc 10140 attggaaata cga 10153

Claims (13)

1. ZMYM2(zinc finger, MYM-type 2) 단백질; 또는 ZMYM2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현벡터를 유효성분으로 함유하는 항암제 민감성(sensitivity) 증진용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 항암제 민감성 증진용 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 항암제 민감성 증진용 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 항암제와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있는 것을 특징으로 하는 항암제 민감성 증진용 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 암은 폐암, 위암, 대장암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종, 뇌하수체 선종으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 고형암인 것을 특징으로 하는 항암제 민감성 증진용 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 항암제는 소라페닙(sorafenib)인 것을 특징으로 하는 항암제 민감성 증진용 조성물.
7. 제6항에 있어서,
   상기 암은 간암인 것을 특징을 하는 항암제 민감성 증진용 조성물.
8. ZMYM2(zinc finger, MYM-type 2) 단백질; 또는 ZMYM2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현벡터를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물.
9. 제8항에 있어서,
   상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
10. 제8항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
11. 제8항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 위암, 대장암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종, 뇌하수체 선종으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 고형암인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 항암제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
13. 제12항에 있어서,
    상기 항암제는 소라페닙(sorafenib)인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.

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