KR101549667B1 - 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 MAP/미세소관 친화도 조절 키나아제 유전자 및 Raf 키나아제 억제 단백질 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방용 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 종양세포에 대한 방사선 요법으로 인해 종양세포에서 분비된 단백질에 의한 종양세포 및 혈관내피세포의 세포활성도 증가, 종양세포의 세포침윤 증가, 종양세포의 세포이동 증가, 종양세포 및 혈관내피세포의 창상치유 증가 또는 혈관내피세포의 관 형성 증가를 억제함으로써 방사선 요법에 의한 부작용을 억제할 수 있어 항암 보조제로 이용될 수 있다.

Description

방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방용 조성물 및 이의 용도{Composition for ameliorating or preventing side effects from radiation therapy and use thereof}

본 발명은 MAP/미세소관 친화도 조절 키나아제(MAP/microtubule affinity-regulating kinase 4; MARK4) 유전자 및 Raf 키나아제 억제 단백질(Raf Kinase Inhibitor Protein; RKIP) 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

종양세포 조기 노화는 스트레스-유도 조기 노화라고도 하며, 다양한 자극에 의해 종양세포에서 발생하는 노화를 의미한다. 종양세포는, 일정한 횟수만큼만 분열하고 노화되는 정상세포와 달리, 암화 과정에서 복제성 노화의 특성이 변화되어 무한정 분열하는 세포들이므로, 종양세포는 세포 노화과정이 진행되지 않을 것이라는 개념이 일반적이었다. 그러나, 최근 종양세포도 다양한 자극에 의해 세포 노화가 급격히 유도됨이 알려지게 되었고 이를 스트레스-유도 조기 노화 (stress-induced premature senescence)라 한다(Sugrue et al., Proc. Natl. Acad.Sci.USA, 94:9648-9653, 1997; Mason et al., Oncogene, 23;9238-9246, 2004). 종양세포의 노화를 유도할 수 있는 스트레스원으로는 유전적 독성 화학물질 (예, etoposide, cyclophophamide), 방사선, 자외선 등이 보고되었다(Hemann and Narita, Genes & Dev., 21:1-5, 2007; Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:389-394, 2002).

최근 스트레스 유도 조기노화를 이용한 종양세포의 노화를 통한 종양세포 증식 억제가 암 환자 치료를 위한 효율적인 기전으로 제시되었으며 (Roninson et al., Drug Resist Updates, 4:303-313, 2001; Campisi, Science, 309:886-887, 2005), 세포 노화 유도 기전 연구를 통한 암 치료의 효율성 증대가 필수적임이 제안되었다(Narita 및 Lowe, Nature Medicine, 11:920-922, 2005). 또한, 종양의 악성화가 저지된 암 환자의 조직 분석 결과, 종양세포 노화가 효율적으로 유도되었음이 보고되었고(Collado et al., Nature, 436:642, 2005), 종양 억제 단백질 p53이 작용해 세포 노화를 통해 종양조직이 효율적으로 제거됨이 종양모델 동물 실험에서 입증되었다(Wue et al., Nature, 445:656-660, 2007). 이는 종양 치료에 세포 노화가 유용하게 활용될 수 있음을 제시하는 것이다. 실질적으로 종양세포의 노화기전 활성화는 세포사멸 기전 활성화보다 낮은 용량의 항암제나 방사선 투여를 가능하게 함으로서 암치료 부작용을 개선할 수 있고, 세포사멸에 대한 저항성을 획득한 종양세포의 암 치료 저항성 극복에 이용될 수 있다(Rebbaa, Cencer Lett, 219:1-13, 2005).

따라서, 암 치료 저항성 극복하기 위한 방사선 투여와 같은 종양세포 조기 노화를 효과적으로 수행하기 위하여 방사선 투여의 부작용 등에 대한 연구와 이에 대한 개선 또는 예방 방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.

Sugrue et al., Proc. Natl. Acad.Sci.USA, 94:9648-9653, 1997, Wild-type p53 triggers a rapid senescence program in human tumor cells lacking functional p53. Mason et al., Oncogene, 23;9238-9246, 2004, Molecular signature of oncogenic ras-induced senescence. Hemann and Narita, Genes & Dev., 21:1-5, 2007, Oncogenes and senescence: breaking down in the fast lane. Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:389-394, 2002, Molecular determinants of terminal growth arrest induced in tumor cells by a chemotherapeutic agent. Roninson et al., Drug Resist Updates, 4:303-313, 2001, If not apoptosis, then what? Treatment-induced senescence and mitotic catastrophe in tumor cells. Campisi, Science, 309:886-887, 2005, Suppressing cancer: the importance of being senescent. Narita 및 Lowe, Nature Medicine, 11:920-922, 2005, Senescence comes of age. Collado et al., Nature, 436:642, 2005, Tumour biology: senescence in premalignant tumours. Wue et al., Nature, 445:656-660, 2007, Senescence and tumour clearance is triggered by p53 restoration in murine liver carcinomas. Rebbaa, Cencer Lett, 219:1-13, 2005, Targeting senescence pathways to reverse drug resistance in cancer.

MAP/미세소관 친화도 조절 키나아제(MAP/microtubule affinity-regulating kinase 4; MARK4) 유전자 및 Raf 키나아제 억제 단백질(Raf Kinase Inhibitor Protein; RKIP) 유전자는 각각 NCBI(미국 국립생물공학정보센터; National Center for Biotechnology Information) Access No. NM_001199867.1 (서열번호 1) 및 NM_002567.2 (서열번호 2)인 유전자로 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방과 관련하여 알려진 바가 없다.

본 발명자들은 MAP/미세소관 친화도 조절 키나아제 유전자 및 Raf 키나아제 억제 단백질 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 처리할 경우 종양세포에 대한 방사선 요법으로 인해 종양세포에서 분비된 단백질에 의한 종양세포 및 혈관내피세포의 세포활성도 증가, 종양세포의 세포침윤 증가, 종양세포의 세포이동 증가, 종양세포 및 혈관내피세포의 창상치유 증가 또는 혈관내피세포의 관 형성 증가를 억제함으로써 방사선 요법에 의한 부작용을 억제할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방용 조성물 및 이의 용도를 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 MAP/미세소관 친화도 조절 키나아제(MAP/microtubule affinity-regulating kinase 4; MARK4) 유전자 및 Raf 키나아제 억제 단백질(Raf Kinase Inhibitor Protein; RKIP) 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 유전자는 mRNA(messenger Ribonucleic acid)일 수 있으며, 상기 억제제는 상기 mRNA를 억제할 수 있는 siRNA(small interfering RNA)일 수 있다.

본 발명에서 상기 MARK4 유전자 및 RKIP 유전자는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함한다. 또한 상기 MARK4 유전자 또는 RKIP 유전자는 상기 서열번호 1의 염기서열 또는 서열번호 2의 염기서열에서 하나 이상의 염기가 결실, 치환 또는 삽입된 염기서열을 포함한다.

본 발명에서 상기 MARK4 유전자가 암호화하는 단백질은 NP_001186796.1 (서열번호 3)의 폴리펩티드, RKIP 유전자가 암호화하는 단백질은 NP_002558.1 (서열번호 4)의 폴리펩티드를 포함한다. 또한 MARK4 유전자가 암호화하는 단백질 또는 RKIP 유전자가 암호화하는 단백질은 서열번호 3의 폴리펩티드 또는 서열번호 4의 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환 또는 삽입된 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명에서 상기 MARK4 유전자 및 RKIP 유전자의 서열은 예시일 뿐 이에 한정되는 것은 아님은 당업자에게 자명하다. 상기 서열들에 대해 실질적인 서열 동일성 또는 실질적인 서열 상동성을 지닌 서열 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 여기서 사용된 "실질적인 서열 동일성" 또는 "실질적인 서열 상동성"이라는 용어는 서열이 또 다른 서열과의 실질적인 구조적 또는 기능적 동일성을 나타냄을 표현하기 위해 사용된다. 이러한 차이는 예를 들어 다른 종 간의 코돈 용법의 고유의 변이에 기인한다. 2 이상의 다른 서열 사이의 유의적인 양의 서열 중복 또는 유사성이 있는 경우 이들 서열의 길이 또는 구조가 다르더라도 유사한 물리적 특성을 지니는 경우 구조적 차이는 무시할만한 정도가 된다.

본 발명에서 상기 억제제는 MARK4 유전자 또는 RKIP 유전자를 억제할 수 있는 siRNA일 수 있다. 즉, 상기 억제제는 MARK4 유전자 또는 RKIP 유전자에 대한 mRNA의 발현을 억제할 수 있는 siRNA일 수 있다. 상기 siRNA는 MARK4 유전자에 특이적인 서열번호 5의 센스서열(5'-AGU UCA CGC UGG GAU CGA A-3') 및 이에 상보적인 서열번호 6의 안티센스 서열(5'-UUC GAU CCC AGC GUG AAC U-3')인 이중가닥 siRNA 일 수 있다. 또한 상기 siRNA는 RKIP 유전자에 특이적인 서열번호 7의 센스서열(5'-CUG AGU CCA GAA UGG UAC A-3') 및 이에 상보적인 서열번호 8의 안티센스 서열(5'-UGU ACC AUU CUG GAC UCA G-3')인 이중가닥 siRNA 일 수 있다.

상기 siRNA는 센스서열 및/또는 안티센스서열의 3' 말단에 티민 2 염기(dTdT)가 결합된 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 단백질에 대한 억제제는 항체일 수 있다. 상기 항체는 MARK4 유전자 또는 RKIP 유전자가 암호화하는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체, 다클론 항체, 및/또는 재조합 항체 등일 수 있으며, 시판되는 것을 구입하거나 공지의 방법에 의해 직접 제조할 수 있다.

상기 방사선 요법으로 인한 부작용은 종양세포에 대한 방사선 요법으로 인해 종양세포에서 분비된 단백질에 의한 종양세포 및 혈관내피세포의 세포활성도 증가, 종양세포의 세포침윤 증가, 종양세포의 세포이동 증가, 종양세포 및 혈관내피세포의 창상치유 증가 및 혈관내피세포의 관 형성 증가로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에서 상기 종양세포는 암세포일 수 있다. 상기 암은 유방암, 폐암, 대장암, 간암, 위암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골육종 및 중추신경계 종양으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는 상기 세포는 유방암, 폐암 또는 대장암일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방용 조성물은 약학조성물일 수 있으며, 본 발명의 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방용 조성물 중 MARK4 유전자 및 RKIP 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제는 종양세포에 대한 방사선 요법으로 인해 종양세포에서 분비된 단백질에 의한 종양세포 및 혈관내피세포의 세포활성도 증가, 종양세포의 세포침윤 증가, 종양세포의 세포이동 증가, 종양세포 및 혈관내피세포의 창상치유 증가 또는 혈관내피세포의 관 형성 증가를 억제함으로써 방사선 요법에 의한 부작용을 억제할 수 있어 항암 보조제로 이용될 수 있다.

본 발명의 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방용 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 공지된 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방용 조성물은 특히, 방사선 요법으로 인한 부작용을 개선 또는 예방하기 위하여 유전자 억제제, 예를 들어 siRNA 기준으로 성인 1일 1회 0.01ng/kg~100㎎/kg의 용량으로 투여할 수 있고, 단백질 억제제, 예를 들어 항체 기준으로 성인 1일 1회 2~10mg/kg 의 용량으로 투여할 수 있으며, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방용 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 MARK4 유전자 및 RKIP 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 항암 보조제를 제공한다.

상기 항암 보조제는 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방용 조성물일 수 있다.

상기 항암 보조제는 항암제인 방사선 요법에 대한 부작용을 감소시키고 항암제의 치료 효과를 증가시킬 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 MARK4 유전자 및 RKIP 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방용 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방 방법을 제공한다.

상기 방법은 인간을 포함하는 포유동물의 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방하기 위한 방법일 수 있다. 상기 방법은 인간을 제외한 포유동물의 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방하기 위한 방법일 수 있다.

상기 방법은 방사선 요법 전에, 동시에 또는 후에 처리될 수 있다.

상기 방사선 요법의 방사선은 감마선일 수 있으며, 상기 감마선은 2 내지 6 Gy 의 선량으로 조사될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방용 조성물의 제조를 위한 MARK4 유전자 및 RKIP 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제의 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방용 조성물은 종양세포에 대한 방사선 요법으로 인해 종양세포에서 분비된 단백질에 의한 종양세포 및 혈관내피세포의 세포활성도 증가, 종양세포의 세포침윤 증가, 종양세포의 세포이동 증가, 종양세포 및 혈관내피세포의 창상치유 증가 또는 혈관내피세포의 관 형성 증가를 억제함으로써 방사선 요법에 의한 부작용을 억제할 수 있어 항암 보조제로 이용될 수 있다.

도 1은 MCF7 유방암세포주에 선량 6 Gy의 방사선 조사 후 4일째 노화 세포의 형태를 보여주는 위상차 현미경의 세포 사진 및 노화-관련 베타-갈락토시다아제 활성 염색사진이다.
도 2는 H460 폐암세포주에 선량 6 Gy의 방사선 조사 후 4일째 노화 세포의 형태를 보여주는 위상차 현미경의 세포 사진 및 노화-관련 베타-갈락토시다아제 활성 염색사진이다.
도 3은 MCF7 유방암세포주 또는 H460 폐암세포주에 선량 6 Gy의 방사선 조사 후 4일까지 날짜별로 증가하는 노화-관련 베타-갈락토시다아제의 양성을 보이는 세포의 비율(%)을 보여주는 그래프이다.
도 4는 MCF7 유방암세포주 또는 H460 폐암세포주에 다양한 선량(0, 0.5, 1, 2, 4 및 6 Gy)의 방사선을 조사한 후 4일째 노화-관련 베타-갈락토시다아제의 양성을 보이는 세포의 비율(%)을 보여주는 그래프이다.
도 5는 선량 6 Gy의 방사선조사 후 10일 동안 형성된 MCF7 유방암 세포주 또는 H460 폐암세포주의 집락 형성 분석 결과를 보여주는 도이다.
도 6은 MCF7 유방암세포주 또는 H460 폐암세포주에 다양한 선량(0, 0.5, 1, 2, 4 및 6 Gy)의 방사선조사 후 10일째 형성된 집락 형성 비율을 나타내는 그래프이다.
도 7은 선량 6 Gy의 방사선 조사로 노화가 유도된 MCF7 유방암세포주의 배양액을 2차원 전기영동법으로 분리한 단백질 스팟을 보여주는 도이다.
도 8은 선량 6 Gy의 방사선 조사로 노화가 유도된 MCF7 유방암세포주의 세포 시료와 배양액 내에 상기 도 7과 표 1에서 제시한 분비단백질이 검출되는지를 웨스턴 블럿팅으로 확인한 결과이다.
도 9는 선량 6 Gy의 방사선 조사로 노화가 유도된 H460 폐암세포주의 세포 시료와 배양액 내에 상기 도 7과 표 1에서 제시한 분비단백질이 검출되는지를 웨스턴 블럿팅으로 확인한 결과이다.
도 10은 선량 6 Gy의 방사선 조사로 노화가 유도된 HCT116 대장암세포주의 세포 시료와 배양액 내에 상기 도 7과 표 1에서 제시한 분비단백질이 검출되는지를 웨스턴 블럿팅으로 확인한 결과이다.
도 11은 실시예 4.1에 따라 각각 비특이적 작은 간섭 RNA (siRNA), MARK4에 대한 siRNA, AKAP9에 대한 siRNA 또는 RKIP에 대한 siRNA를 처리한 MCF7 유방암세포주에 실시예 2.1에 따라 6 Gy 방사선을 조사하고 36시간 동안 노화를 유도하고, PBS로 3번 세척하고 우태아 혈청과 항생제가 없는 DMEM 배양용액에서 36시간 동안 배양한 후 배양액(방사선-유도 노화세포 적응용배지)을 수거하여 이를 다시 실시예 4.2에 따라 정상 MCF7 유방암세포주 또는 HUVEC 제대혈관내피세포주에 2일간 처리하고 MTT를 통한 세포의 활성도를 관찰한 결과를 보여주는 도이다.
도 12는 실시예 4.1에 따라 각각 비특이적 작은 간섭 RNA (siRNA), MARK4에 대한 siRNA, AKAP9에 대한 siRNA 또는 RKIP에 대한 siRNA를 처리한 MCF7 유방암세포주에 실시예 2.1에 따라 6 Gy 방사선을 조사한 후 36시간 동안 노화를 유도하고, 새로운 DMEM 배양액으로 교환하고 36시간 동안 배양한 배양액(방사선-유도 노화세포 적응용배지)을 수거하여 이를 다시 실시예 4.3 내지 4.6에 따라 정상 MCF7 유방암세포주 또는 HUVEC 제대혈관내피세포주에 각각 16 시간 동안 처리한 각 세포의 침윤성, 이동성, 창상 치유도 및 관 형성능을 관찰한 결과를 보여주는 도이다.

이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.

실시예 1. MCF7 유방암세포주 및 H460 폐암세포에서의 방사선유도노화의 확 인

1.1. 세포배양

유방암 세포주 MCF-7(ATCC, Manassas, VA, USA)은 10% 우태아 혈청{fetal bovine serum: FBS, ㈜ 웰진(WelGene), 대구, 한국}과 항생제인 스트렙토마이신 100 ug/ml과 페니실린 100 유니트/ml (Life Technologies Co., Carlsbad, CA, USA)이 포함된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium; PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria) 배양 배지를 이용하여 5%의 CO₂ 농도 및 37℃ 온도가 항시 유지되는 세포배양기에서 배양하였다. 폐암 세포주 H460 (ATCC, Manassas, VA, USA)은 10% 우태아 혈청{fetal bovine serum: FBS, ㈜ 웰진(WelGene), 대구, 한국}과 항생제인 스트렙토마이신 100 ug/ml과 페니실린 100 유니트/ml (Life Technologies Co., Carlsbad, CA, USA)이 포함된 RPMI 1640 배양 배지 {㈜ 웰진(WelGene), 대구, 한국}를 이용하여 5%의 CO₂ 농도 및 37℃ 온도가 항시 유지되는 세포배양기에서 배양하였다.

상기 종양세포주에 ¹³⁷Cs 감마선 방출기 (Atomic Energy of Canada Ltd., Mississauga, Ontario, Canada)로부터 방출되는 감마-방사선을 3.81 Gy/분의 노출량으로 6 Gy 또는 0.5 ~ 6 Gy의 다양한 선량으로 노출한 후, 5% CO₂농도의 37℃ 항온 배양기에서 1~4 일간 배양하였다.

또한, 상기 종양세포주 중 감마-방사선에 노출되지 않은 세포주를 각 실험에 있어 대조군으로서 비교하였다.

1.2. 노화-관련 베타갈락토시다아제 활성 염색을 이용한 종양세포주의 방사선유도노화 확인

세포의 노화 여부는 상기 실시예 1.1.의 대조군과 방사선 조사 후 4일 경과한 유방암세포주(MCF7) 및 폐암세포주(H460)의 특징적인 세포 형태 변화를 현미경(ECLIPSE TE300; Nikon Corporation, Tokyo, Japan)으로 관찰하고, 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다. 그 결과 대조군과 달리 방사선 조사 후 4일 경과한 유방암세포주 및 폐암세포주는 노화세포의 특징인 세포의 크기가 커지며 평평해진 것을 확인할 수 있다.

또한 종양세포주의 방사선노화를 확인하기 위해, 상기 실시예 1.1의 대조군과 방사선 조사 후 4일 경과한 MCF7 및 H460 종양세포주에 대하여 노화-관련 베타갈락토시다아제 활성 염색을 실시하였다. 상기 염색은 Dimri 등의 방법 (Dimri etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:9363-9367, 1995)에 따라 다음과 같이 수행하였다.

세포를 PBS(phosphate buffered saline)로 2번 세척하고 3% 포름알데히드로 실온에서 3-5분간 고정하였다. 고정된 세포를 PBS로 다시 한 번 세척하고, β-갈락토시다아제 활성 염색 용액 (1 mg/ml의 X-Gal, 40 mM 시트르산 /소듐 포스페이트(pH 6.0), 5 mM 포타슘 페로시아니드, 5 mM 포타슘 페리시아니드, 150 mM 염화클로라이드, 2 mM 마그네슘 클로라이드) 5 ml을 첨가하고, 37℃ 항온 배양기에서 12-16시간 반응시켰다. 반응을 진행하는 동안 빛이 들어가지 않도록 은박 호일로 배양접시를 싸서 배양하여 염색하였다.

베타-갈락토시다아제 활성 정도는 위상차 현미경 (ECLIPSE TE300; Nikon Corporation, Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰하였으며(도 1 및 2 참고), 방사선 6 Gy 조사 후 시간의 경과에 따라 염색된 노화 종양세포의 비율을 도 3에 나타냈다. 도 3은 MCF7 유방암세포주 또는 H460 폐암세포주에 선량 6 Gy의 방사선 조사 후 4일까지 날짜별로 증가하는 노화-관련 베타-갈락토시다아제의 양성을 보이는 세포의 비율(%)을 보여주는 그래프이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 베타-갈락토시다아제의 양성세포가 방사선 조사 후 시간-의존적으로 증가하였다.

또한 0.5 ~ 6 Gy의 다양한 선량의 방사선을 조사하고 4일간 배양하여 암세포의 노화를 유도하고 베타-갈락토시다아제 활성 염색을 한 결과를 도 4에 나타냈다. 대조군은 방사선을 조사하지 않는 것을 제외하고 동일한 방법으로 배양한 후, 베타-갈락토시다아제 활성 염색을 한 결과를 도 4에 나타냈다. 도 4는 MCF7 유방암세포주 또는 H460 폐암세포주에 다양한 선량(0, 0.5, 1, 2, 4 및 6 Gy)의 방사선을 조사한 후 4일째 노화-관련 베타-갈락토시다아제의 양성을 보이는 세포의 비율(%)을 보여주는 그래프이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 베타-갈락토시다아제의 양성세포가 방사선 선량-의존적으로 증가하였다.

즉, 상기 결과로부터 방사선 조사 후 4일 경과 시 종양세포주의 세포노화가 명백하게 진행되었음을 확인하였다.

따라서, 방사선은 종양세포주에 방사선 선량-의존적 및 시간-의존적으로 노화를 유도함을 확인할 수 있었다.

1.3. 집락형성분석 ( Colony formation assay )을 이용한 종양세포주의 방사선유도노화 확인

유방암세포주(MCF7) 및 폐암세포주(H460)를 60mm 직경의 배양접시에 1000개의 세포가 분배하고 상기 실시예 1.1의 대조군과 선량 6 Gy 방사선 조사한 실험군을 7-10일간 세포 배양기에서 배양한 후, Diff Quick 시약(Sysmex Inc., Kobe, Japan)을 이용하여 형성된 세포 집락을 염색하였다. 대조군은 방사선을 조사하지 않는 것을 제외하고 동일한 방법으로 배양한 후, Diff Quick 시약(Sysmex Inc., Kobe, Japan)을 이용하여 형성된 세포 집락을 염색하였다. 먼저, 배지를 제거하고 세포를 PBS로 1번 세척하고 용액 A를 0.5 ml 가하여 부드럽게 섞어주고 제거한 후, 용액 B를 0.5 ml 가하여 다시 부드럽게 섞어준 후 제거하였다. 다시 용액 C를 0.5 ml 가하여 부드럽게 섞어주고 제거하였다. 충분한 증류수로 세포를 세척한 후 실온에서 세포를 건조하였다(도 5 참조).

도 5는 선량 6 Gy의 방사선조사 후 10일 동안 형성된 MCF7 유방암 세포주 또는 H460 폐암세포주의 집락 형성 분석 결과를 보여주는 도이다. 도 5에서 선량 6 Gy의 방사선을 조사한 MCF7 유방암 세포주 또는 H460 폐암세포주는 노화세포 실험군이며, 방사선을 조사하지 않은 MCF7 유방암 세포주 또는 H460 폐암세포주는 증식세포 대조군을 나타낸다. 도 5에서 나타낸 바와 같이, 방사선은 종양세포주인 MCF7 유방암 세포주 또는 H460 폐암세포주에서 집락 형성을 감소시킴을 확인할 수 있었다.

또한 0.5 ~ 6 Gy의 다양한 선량의 방사선을 조사한 유방암세포주(MCF7)와 폐암세포주(H460)를 상기와 방법으로 염색하고 집락계수기(Artek Colony Counter 880; Imaging Products International Inc., Simi Valley, CA, USA)로 집락을 계수하여 집락형성 분석 결과를 도 6에 나타내었다. 대조군은 방사선을 조사하지 않는 것을 제외하고 동일한 방법으로 배양한 후, Diff Quick 시약(Sysmex Inc., Kobe, Japan)을 이용하여 형성된 세포 집락을 염색하고 집락을 계수하여 집락형성 분석 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6은 MCF7 유방암세포주 또는 H460 폐암세포주에 다양한 선량(0, 0.5, 1, 2, 4 및 6 Gy)의 방사선조사 후 10일째 형성된 집락 형성 비율을 나타내는 그래프이다. 도 6에서 나타낸 바와 같이, 집락 형성이 방사선을 조사하지 않은 대조군에 비해 방사선이 조사된 노화 종양세포주인 MCF7 유방암 세포주 또는 H460 폐암세포주에서 방사선 선량-의존적으로 크게 감소함을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 2차 전기영동 및 MALDI - TOP 질량 분석을 통한 방사선유도노화에 의한 분비단백질의 발굴

2.1. 방사선유도 노화 종양세포의 배양액 획득

100mm 직경의 배양접시에 5×10⁴ 개의 MCF7 유방암세포주를 분배하고 24 시간 후, 상기 실시예 1.1의 대조군과 함께 6 Gy의 방사선을 조사한 실험군을 36시간 동안 배양하여 세포노화를 유도하였다. 그 뒤 배지를 제거하고 세포를 PBS로 3번 세척한 후, 우태아 혈청과 항생제가 없는 DMEM 배양용액에서 36시간 동안 배양하였다. 이렇게 만들어진 적응용배지(conditioned media)는 0.2 μm 공극 크기(pore size)의 여과기에서 여과하고 Centricon-10 농축기(Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 10℃에서 5 ~ 30배 농축하였다. 이 때 대조군과 방사선유도 노화 실험군의 농축 적응용배지는 획득한 세포의 수에 따라서 동일 세포수로 보정하여 사용하였다.

구체적으로 매회 실험상에서 대조군과 함께 농축하면서 처리하는 세포수에 대하여 약 10배의 농축이 되도록 조정하여 처리하였다. 예를 들어, 적응용배지를 수거한 후 세포수 측정결과 대조군이 100개, 노화군이 40개 세포였고 처리할 세포수가 20개라면 대조군 적응용배지는 2배 농축하고 노화군의 적응용배지는 5배 농축하였다.

2.2. 2차 전기영동을 통한 방사선유도 노화 종양세포의 분비단백질 분석

2차 전기영동을 위한 농축 적응용배지 완충액은 7 M 요소(urea), 4.5% 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate; CHAPS), 20 mM 디티오트레이톨(ditiothreitol), 0.2% Bio-Lyte ampholyte(Bio-Rad, Richmond, CA, USA)를 이용하여 준비하였고, 이 완충액을 이용하여 샘플을 희석하였다. 샘플은 고정된 linear wide-range IPG [pH 3~10; 24 cm 길이 IPG 스트립{long Immobilized pH gradient(IPG) strips}; Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden]을 이용해서 부하를 걸었고 IEF(isoelectric focusing)는 81,780 Vh, 20℃에서 전개하였다. 2차원 분석은 5시간 동안 9~16% 선형 구배 폴리아크릴아마이드 젤(linear gradient polyacrylamide gels)을 이용하여 40 mA 일정전류로 전기영동하였다. 젤을 고정한 후에 silver staining 방법을 이용하여 염색하였다. 상기 염색은 Chevallet 등의 방법 (Chevallet et al., Nat. Protocols, 1:1852-1858, 2006)에 따라 수행하였다. 염색된 젤의 이미지는 GS-710 Imaging Densitometer (Bio-Rad, Richmond, CA, USA)로 분석하여 유의하게 증가한 스팟(spot)을 표적 분비단백질로 선택하였다(도 7 참조).

도 7은 선량 6 Gy의 방사선 조사로 노화가 유도된 MCF7 유방암세포주의 배양액을 2차원 전기영동법으로 분리한 단백질 스팟을 보여주는 도이다. 도 7에서 방사선을 조사하지 않은 MCF7 유방암세포주의 배양액(대조군)과 선량 6 Gy의 방사선 조사로 노화가 유도된 MCF7 유방암세포주의 배양액(노화실험군)을 2차원 전기영동법으로 분리한 2회 실험 결과를 보여준다. 2회 실험 모두에서 대조군에 비해 분비가 크게 증가된 단백질 스팟을 비교하고, 젤 조각을 분리하여 MALDI-TOP 질량 분석을 통해 분비된 단백질의 종류를 동정한 후, 이를 표 1에 나타냈다.

2.3. MALDI - TOP 질량 분석을 통한 방사선유도노화 분비단백질의 동정

상기 실시예 2.2의 결과로 이미지 분석기 (GS-710 Imaging Densitometer; Bio-Rad, Richmond, CA, USA)를 이용하여 상기 실시예 1.1의 대조군과 방사선을 조사한 실험군(노화실험군)의 분비단백질의 양적인 차이를 보이는 스팟을 확인한 후 의미있는 차이를 보이는 표적 스팟들은 질량분석기(4800 MALDI-TOF/TOF^TM Analyzer; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 분석, 확인하였다. 2차 전기영동 젤로부터 분리한 표적단백질 스팟은 염색을 제거하고 환원하고 알칼리화한 후{Rosenfeld 등에 의한 방법(Rosenfeld et al., Anal. Biochem. 203(1):173-179}에 트립신(20 ng/μl; Promega, Madison, WI, USA)으로 분리하였다. 분리된 펩타이드는 POROS R2, Oligo R3 컬럼 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 농축하고 세척한 후, 알파-시아노-4-하이드록시시남산(alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid; CHCA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 70% 아세토니트릴(acetonitril3), 2% 포름산(formic acid)을 이용하여 Opti-TOP^TM 384-웰 인서트(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 옮겼다. MALDI-TOP 질량분석(matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometer)은 355-nm Nd:YAG laser가 장착된 4800 MALDI-TOP/TOP^TM 분석기(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 연세프로테옴연구원 (Yonsei Proteome Research Cente, Seoul, Korea; http://www.proteomix.org)에 의뢰하여 수행하였다. 단백질의 동정은 펩타이드 질량 지도를 바탕으로 MS/MS Ions Search 데이터베이스 사이트인 MASCOT (http://www.matrixscience.com)을 이용하였으며 단백질 ID (identification)는 SwissProt 데이터베이스 등록번호를 사용하였다(표 1 참조). 대조군에 비해 방사선-유도 노화된 MCF7 유방암 세포주에서 분비가 유의하게 증가한 분비 단백질 동정결과를 표 1에 나타내었다.

[표 1] 방사선-유도 노화된 MCF7 유방암 세포주에서의 분비 단백질 동정

¹SwissProt 데이터베이스 등록번호

²동정된 펩타이드와 일치하는 표적단백질 서열 비율

³동정된 펩타이드와 일치하는 표적단백질 서열수

⁴독립된 2회 실험에서의 평균 증가량

표 1에서 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 방사선-유도 노화된 MCF7 유방암 세포주에서 MARK4, RKIP, AKAP9 및 α-Enolase의 분비가 유의하게 증가함을 확인할 수 있다.

실시예 3. 방사선유도 노화 종양세포에서 동정된 표적단백질의 발현 및 분비

3.1. 방사선유도 노화 종양세포에서 동정된 표적단백질의 발현 및 분비 확인

상기 실시예 1.1에서 준비한, 방사선 조사 후 3일이 경과한 MCF7 유방암 세포주에서 세포 시료와 상층 배양액을 분리한 후, 용해 완충액{50mM Tri-HCl, 1% Nonidet P-40(NP-40), 0.25% 소디움 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 150mM NaCl, 1mM PMSF(phenylmethylsulfonyl Fluoride), 50 mM NaF, 0.2 mM Na₃VO₄, 10g/ml 아프로티닌, 2 g/ml 루펩틴}을 사용하여 단백질을 추출하고, 추출한 단백질은 13,000 rpm으로 10분간 원심분리한 후 상등액만 취하여 세포 시료는 브래드포드법(Bradford, M., Anal. Biochem. 72:248-254 (1976))을 이용하여 정량하고 상층배양액은 세포수에 따라 보정하였다. 20ug의 세포 단백질 및 동일량의 상층 배양액 단백질에 2X SDS 로딩 완충액{60 mm Tris-Cl (pH 6.8), 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4 mM 머캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루}를 가해 95℃에서 5분간 가열하고 8% SDS 폴리아크릴 아마이드 젤에서 80 V로 2시간 전기영동하였다. 전기영동 후 분리된 단백질을 나이트로셀룰로오즈 막 (Whatman plc., Kent, UK)으로 전이시켰다. 단백질이 전이되어 있는 막은 5% 탈지분유가 함유된 PBS 용액에 넣고 실온에서 1시간 동안 방치하여 블록킹(blocking)하고 1:500 ~ 1:1000으로 희석한 일차 항체들을 넣고 4℃에서 16시간동안 반응시켰다. 1차 항체는 다클론 항-RKIP 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), 항-α-enolase 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), 항-AKAP9 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), 항-MARK9 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), 항-p21 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)또는 항-actin 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 사용하였고 2차 항체는 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 복합 항-토끼 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 이용해 ECL (enhanced chemiluminescence) 시약 (Amersham plc., Amersham, UK)으로 확인하고 각 단백질 발현에 대한 결과를 도 8에 나타냈다. 이 때 암세포 노화의 표시자(marker)로 p21단백질의 발현 상승을 이용하였다.

또한 H460 폐암세포주 및 HCT 116 대장암세포주(ATCC, Manassas, VA, USA)에 대한 표적 단백질들의 발현 및 배양액 내 분비 확인을 상기와 동일한 방법으로 실시하여 도 9 및 10에 각각 나타냈다.

도 8은 선량 6 Gy의 방사선 조사로 노화가 유도된 MCF7 유방암세포주의 세포 시료와 배양액 내에 상기 도 7과 표 1에서 제시한 분비단백질이 검출되는지를 웨스턴 블럿팅으로 확인한 결과이다.

도 9는 선량 6 Gy의 방사선 조사로 노화가 유도된 H460 폐암세포주의 세포 시료와 배양액 내에 상기 도 7과 표 1에서 제시한 분비단백질이 검출되는지를 웨스턴 블럿팅으로 확인한 결과이다.

도 10은 선량 6 Gy의 방사선 조사로 노화가 유도된 HCT116 대장암세포주의 세포 시료와 배양액 내에 상기 도 7과 표 1에서 제시한 분비단백질이 검출되는지를 웨스턴 블럿팅으로 확인한 결과이다.

도 8 내지 10에서, 각각의 종양세포주의 대조군(방사선 미조사군) 및 6 Gy의 방사선 조사로 노화가 유도된 노화실험군의 세포 시료(세포) 및 배양액(적응용배지) 내에 분비단백질 발현양을 웨스턴 블러팅으로 확인한 결과를 보여준다.

실험한 3개의 종양세포주(MCF7 유방암세포주, H460 폐암세포주 및 HCT116 대장암세포주) 모두에서 방사선 조사에 의해 유도된 노화 과정 중에 상기 실시예 2.3에서 발굴한 표적단백질의 분비가 모두 증가하고 있음을 확인할 수 있다. 따라서, 방사선 조사에 의해 유도된 노화된 종양세포주에서 MARK4, RKIP, AKAP9 및 α-Enolase의 분비가 유의하게 증가함을 확인할 수 있다.

실시예 4. 방사선유도 노화세포의 적응용배지에 의한 정상 종양세포의 반응 및 표적 분비단백질에 대한 작은 간섭 RNA ( small interfering RNA : siRNA )를 통한 적응용배지의 세포침윤, 세포이동, 창상치유 및 관 형성 작용 억제 확인

4.1. 표적 분비단백질에 대한 작은 간섭 RNA 의 주입 및 적응용배지 제조

상기 실시예 2 및 3에서 발굴한 RKIP, AKAP9 및 MARK4 유전자의 발현량 감소에 의한 효과를 확인하기 위해 MCF-7 유방암세포주를 작은 간섭 RNA의 주입 하루 전, 직경 100 mm 배양접시로 계대배양한 후 9 μl의 RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 OptiMEM®I 배양배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 섞고 각 분비단백질의 유전자에 대한 작은 간섭 RNA[MARK4 유전자에 대한 작은 간섭 RNA {siMARK4; 5'-AGU UCA CGC UGG GAU CGA A-3' (서열번호 5) 및 5'-UUC GAU CCC AGC GUG AAC U-3'(서열번호 6)의 염기서열로 이루어진 이중가닥 siRNA로, 각각의 서열 3' 말단에 티민 2 염기(dTdT)가 결합된 상태임}, RKIP 유전자에 대한 작은 간섭 RNA {siRKIP; 5'-CUG AGU CCA GAA UGG UAC A-3' (서열번호 7) 및 5'-UGU ACC AUU CUG GAC UCA G-3'(서열번호 8)의 염기서열로 이루어진 이중가닥 siRNA로, 각각의 서열 3' 말단에 티민 2 염기(dTdT)가 결합된 상태임}, AKAP9 유전자 (서열번호 9)에 대한 작은 간섭 RNA{siAKAP9; 5'-GAG AAC AGG AAA GCC UAC A-3' (서열번호 10) 및 5'-UGU AGG CUU UCC UGU UCU C-3'(서열번호 11)의 염기서열로 이루어진 이중가닥 siRNA로, 각각의 서열 3' 말단에 티민 2 염기(dTdT)가 결합된 상태임}]를 50 nM의 농도로 세포에 처리하였다.

또한, 상기 MCF-7 유방암세포주 중 비특이적 작은 간섭 RNA {siControl; 5'-CCU ACG CCA CCA AUU UCG U-3'(서열번호 12)과 5'-ACG AAA UUG GUG GCG UAG G-3'(서열번호 13)의 염기서열로 이루어진 이중가닥 siRNA로, 각각의 서열 3' 말단에 티민 2염기(dTdT)가 결합된 상태임}를 주입한 세포주를 대조군으로 하였다.

6시간 후 배양배지를 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배양 배지로 교환한 후, 5% CO₂ 농도의 37℃ 항온 배양기에서 1 일간 배양하였다. 이어 상기 실시예 2.1과 동일한 방법으로 방사선 조사에 의한 종양세포 노화를 유도하고 각 표적 분비단백질이 결손된 노화 종양세포의 적응용배지를 획득하였다. 대조군으로 상기 표적 분비단백질 중 어느 것도 결손되지 않은 노화 종양세포의 적응용배지를 획득하였다.

4.2. 노화 종양세포 적응용배지에 의한 세포 활성도 변화 및 표적 분비단백 질의 영향 확인

노화 종양세포에서 분비된 분비단백질에 의한 종양세포 및 정상세포의 세포 활성도 변화를 확인하기 위하여 96-웰 플레이트에 배양한 MCF7 유방암세포주 및 HUVEC 제대혈관내피세포주 (ATCC, Manassas, VA, USA)에 상기 실시예 4.1에서 획득한 적응용배지를 2일 동안 처리하였다. 이후 기존 배양액을 걷어내고 우태아혈청이 없는 DMEM 배양액에 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 용액 (5 mg/mL; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 50 μg/ml 의 최종 농도로 첨가하여 2시간 동안 37℃ 에서 배양하고, 이후 상층액을 제거한 후 DMSO(dimethylsulfoxide; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 100 μl/웰로 첨가하여 교반기에서 5 분간 흔들어 준 후 ELISA 분석기(Bio-Rad Laboratories Inc, Hercules, CA, USA)로 595 nm에서 흡광도를 측정하고 그 결과를 도 11에 나타냈다.

도 11은 실시예 4.1에 따라 각각 비특이적 작은 간섭 RNA (siRNA), MARK4에 대한 siRNA, AKAP9에 대한 siRNA 또는 RKIP에 대한 siRNA를 처리한 MCF7 유방암세포주에 실시예 2.1에 따라 6 Gy 방사선을 조사하고 36시간 동안 노화를 유도하고, PBS로 3번 세척하고 우태아 혈청과 항생제가 없는 DMEM 배양용액에서 36시간 동안 배양한 후 배양액(방사선-유도 노화세포 적응용배지)을 수거하여 이를 다시 실시예 4.2에 따라 정상 MCF7 유방암세포주 또는 HUVEC 제대혈관내피세포주에 2일간 처리하고 MTT를 통한 세포의 활성도를 관찰한 결과를 보여주는 도이다. 도 11에서 대조군은 방사선-유도 노화세포 적응용 배지 처리 전의 세포 활성도를 1로 볼 때, 비특이적 siRNA(대조군), MARK4에 대한 siRNA(MARK4), AKAP9에 대한 siRNA(AKAP9) 또는 RKIP에 대한 siRNA(RKIP)를 처리한 MCF7 유방암세포주에 6 Gy 방사선을 조사하여 노화를 유도하고, 36시간 동안 제조한 배양액(방사선-유도 노화세포 적응용배지)을 처리하고 2일 후의 세포 활성도를 보여준다.

도 11에서 나타낸 바와 같이, 적응용배지를 처리하지 않은 대조군에 비해 노화 종양세포에서 획득한 대조군의 적응용배지를 처리한 세포의 활성도가 크게 증가되었다. 또한 MARK4 또는 RKIP에 대한 작은 간섭 RNA를 주입한 세포의 적응용배지를 처리한 경우, 대조군 적응용배지를 처리한 세포에 비해 세포의 활성도가 두 가지 세포주 (MCF7 유방암세포주 또는 HUVEC 제대혈관내피세포주) 모두에서 크게 감소하였지만, AKAP9에 대한 작은 간섭 RNA를 주입한 세포의 적응용배지을 처리한 경우 그 효과는 두 가지 세포주(MCF7 유방암세포주 또는 HUVEC 제대혈관내피세포주) 모두에서 덜 나타났다.

따라서, MARK4 또는 RKIP에 대한 작은 간섭 RNA를 주입한 세포의 적응용배지를 처리한 경우, 종양세포주의 세포활성도를 크게 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있다. 즉, MARK4 또는 RKIP에 대한 억제제를 처리할 경우, 종양세포의 방사능 요법의 부작용 중 방사능 유도 노화 세포의 분비 단백질 증가(MARK4 또는 RKIP)로 인한 종양세포 및 혈관내피세포의 세포활성도 증가를 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있다.

4-3. 노화 종양세포 적응용배지에 의한 세포 침윤능 측정 및 표적 분비단백 질의 영향 확인

노화 종양세포에서 분비된 분비단백질에 의한 MCF7 유방암세포주의 세포 침윤능 변화를 확인하기 위하여 매트리젤 (Matrigel) 침윤능 챔버(BD Biosciences, Bedford, MA, USA)를 이용하였다. 매트리젤 (Matrigel)로 코팅된 여과지를 기준으로 상위 챔버에는 우태아 혈청이 제거된 DMEM 배양액 100 μl와 5×10⁴ 개의 종양세포주를 넣고 하위 챔버에 상기 4.1에서 획득한 대조군 및 노화 종양세포의 적응용배지 800 μl를 첨가한 후 16 시간 동안 배양하였다. 필터(filter) 상부에 있는 침윤하지 못한 세포는 제거하고 상위 챔버에서 하위 챔버로 침윤한 세포는 상기 실시예 1.3에서 사용한 Diff Quik 시약 (Sysmex Inc., Kobe, Japan)을 이용하여 염색하였다(도 12 참조; 세포침윤). 도 12의 세포 침윤에서 나타낸 바와 같이, 적응용배지를 처리하지 않은 대조군에 비해 노화 종양세포에서 획득한 대조군의 적응용배지(방사선-유도 노화세포 적응용배지)를 처리한 세포의 침윤능이 크게 증가되었지만, MARK4 또는 RKIP에 대한 작은 간섭 RNA를 주입한 노화 종양세포의 적응용배지(방사선-유도 노화세포 적응용배지)를 처리한 경우, 대조군 적응용배지를 처리한 세포에 비해 세포 침윤능이 크게 감소하지만, AKAP9에 대한 작은 간섭 RNA를 주입한 노화 종양세포의 적응용배지을 처리한 경우 그 효과는 덜 나타났다.

따라서, MARK4 또는 RKIP에 대한 작은 간섭 RNA를 주입한 세포의 적응용배지를 처리한 경우, 종양세포주의 세포침윤능을 크게 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 즉, MARK4 또는 RKIP에 대한 억제제를 처리할 경우, 종양세포의 방사능 요법의 부작용 중 방사능 유도 노화 세포의 분비 단백질 증가 (MARK4 또는 RKIP)로 인한 종양세포의 세포침윤을 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있다.

4.4. 노화 종양세포 적응용배지에 의한 세포이동 측정 및 표적 분비단백질의 영향 확인

노화 종양세포에서 분비된 분비단백질에 의한 MCF7 유방암세포주의 세포이동의 Transwell 세포이동 분석법을 사용하였다. 변화를 확인하기 위하여 변형된 Boyden 챔버의 여과지를 기준으로 상위 챔버에는 우태아혈청이 제거된 DMEM 배양액 100 μl와 5×10⁴ 개의 종양세포주를 넣고 하위 챔버에 상기 실시예 4.1에서 획득한 대조군 및 노화암세포의 적응용배지 800 μl를 첨가한 후 16 시간 동안 배양하였다. 필터 (filter) 상부에 있는 이동하지 못한 세포는 제거하고 상위 챔버에서 하위 챔버로 이동한 세포는 상기 실시예 1.3에서 사용한 Diff Quik 시약 (Sysmex Inc., Kobe, Japan)을 이용하여 염색하였다 (도 12 참조; 세포이동). 도 12의 세포이동에서 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 4.3의 세포침윤 측정 결과와 마찬가지로 대조군에 비해 노화 종양세포에서 획득한 대조군의 적응용배지 (방사선-유도 노화세포 적응용배지)를 처리한 세포에서 이동이 크게 증가되었고, MARK4 또는 RKIP에 대한 작은 간섭 RNA를 주입한 노화 종양세포의 적응용배지 (방사선-유도 노화세포 적응용배지)를 처리한 경우, 세포이동이 적응용배지를 처리하지 않은 대조군 수준으로 크게 감소하였지만, AKAP9에 대한 작은 간섭 RNA를 처리한 경우 그 효과는 덜 나타났다.

따라서, MARK4 또는 RKIP에 대한 작은 간섭 RNA를 주입한 세포의 적응용배지를 처리한 경우, 종양세포주의 세포이동을 크게 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 즉, MARK4 또는 RKIP에 대한 억제제를 처리할 경우, 종양세포의 방사능 요법의 부작용 중 방사능 유도 노화 세포의 분비 단백질 증가 (MARK4 또는 RKIP)로 인한 종양세포의 세포이동을 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있다.

4.5. 노화 종양세포 적응용배지에 의한 창상치유 측정 및 표적 분비단백질의 영향 확인

노화 종양세포에서 분비된 분비단백질에 의한 MCF7 유방암세포주 및 HUVEC 제대혈관내피세포주의 세포이동을 확인하기 위한 또 다른 실험 방법으로 창상 치유 분석을 수행하였다. 단일세포층의 약 90% 정도가 세포 포화도로 배양한 MCF7 유방암세포주 및 HUVEC 제대혈관피세포주가 배양된 용기에 멸균된 주사기 바늘을 이용하여 폭이 약 500 μm의 상처를 만들고 PBS로 세척한 후 상기 실시예 4.1에서 획득한 대조군 및 노화암세포의 적응용배지를 처리한 후 16시간 동안 배양하여 상처의 폭 변화를 관찰하였다 (도 12 참조; 창상치유). 도 12의 창상치유에서 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 4.3의 세포침윤 및 실시예 4.4의 세포이동 측정 결과와 마찬가지로, 대조군에 비해 노화 종양세포에서 획득한 대조군의 적응용배지 (방사선-유도 노화세포 적응용배지)를 처리한 경우 MCF7 유방암세포주 및 HUVEC 제대혈관내피세포주 모두에서 상처 폭이 크게 감소한 반면, MARK4 또는 RKIP에 대한 작은 간섭 RNA를 주입한 노화암세포의 적응용배지 (방사선-유도 노화세포 적응용배지)를 처리한 경우 상처의 폭이 거의 감소하지 않았다. 그러나 AKAP9에 대한 작은 간섭 RNA를 처리한 경우 상처 폭의 감소가 나타났다.

따라서, MARK4 또는 RKIP에 대한 작은 간섭 RNA를 주입한 세포의 적응용배지를 처리한 경우, 종양세포주의 창상치유를 크게 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 즉, MARK4 또는 RKIP에 대한 억제제를 처리할 경우, 종양세포의 방사능 요법의 부작용 중 방사능 유도 노화 세포의 분비 단백질 증가(MARK4 또는 RKIP)로 인한 종양세포 및 혈관내피세포의 창상치유를 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있다.

4.6. 노화암세포 적응용배지에 의한 HUVEC 제대혈관내피세포주의 관 형성 능력 측정 및 표적 분비단백질의 영향 확인

96-웰 플레이트를 성장인자가 제거된 매트리젤 (Matrigel)(BD Biosciences, Bedford, MA, USA) 100μl로 코팅하고 37℃에서 30분 동안 응고시켰다. 그런 다음 HUVEC 제대혈관내피세포주를 각각의 웰에 첨가하고 상기 실시예 4.1에서 획득한 대조군 및 노화암세포의 적응용배지를 처리하고 16시간 동안 배양하였다. 이어 배양액을 제거한 뒤 PBS로 세척하고 크리스탈 바이올렛(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 남아있는 세포를 염색하고 현미경(ECLIPSE TE300; Nikon Corporation, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다(도 12 참조; 관 형성). 도 12의 관 형성에서 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 4.3의 침윤능, 실시예 4.4의 세포이동 및 실시예 4.5의 창상치유 측정 결과와 마찬가지로, 대조군에 비해 노화암세포에서 획득한 대조군의 적응용배지(방사선-유도 노화세포 적응용배지)를 처리한 경우 HUVEC 제대혈관내피세포주에서 관 형성이 크게 증가한 반면, MARK4, RKIP 및 AKAP9에 대한 작은 간섭 RNA를 주입한 노화암세포의 적응용배지 (방사선-유도 노화세포 적응용배지)를 처리한 경우 혈관내피세포의 관 형성이 거의 나타나지 않았다.

따라서, MARK4 또는 RKIP에 대한 작은 간섭 RNA를 주입한 세포의 적응용배지를 처리한 경우, 혈관내피세포의 관 형성을 크게 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 즉, MARK4 또는 RKIP에 대한 억제제를 처리할 경우, 종양세포의 방사능 요법의 부작용 중 방사능 유도 노화 세포의 분비 단백질 증가 (MARK4 또는 RKIP)로 인한 혈관내피세포의 관 형성 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있다.

실시예 4를 통해, MARK4 또는 RKIP에 대한 억제제를 처리할 경우, 종양세포의 방사능 요법의 부작용 중 방사능 유도 노화 세포의 분비 단백질 증가 (MARK4 또는 RKIP)로 인한 종양세포 및 혈관내피세포의 세포활성도 증가, 종양세포의 세포침윤 증가, 종양세포의 세포이동 증가, 종양세포 및 혈관내피세포의 창상치유 증가, 혈관내피세포의 관 형성 증가를 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있다. 따라서, MARK4 또는 RKIP에 대한 억제제는 종양세포에 대한 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방 효과를 가질 수 있음을 확인할 수 있다. 즉, MARK4 또는 RKIP에 대한 억제제는 항암제인 방사선 요법에 대한 부작용을 감소시키고 항암제의 치료 효과를 증가시키는 항암 보조제로서 역할을 할 수 있음을 확인할 수 있다.

<110> Korea Institute of Radiological & Medical Sciences <120> Composition for ameliorating or preventing side effects from radiation therapy and use thereof <130> P13-060-KNUL <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5163 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (1)..(5163) <223> Homo sapiens MAP/microtubule affinity-regulating kinase 4 (MARK4), transcript variant 1, mRNA, Access No. NM_001199867.1 <400> 1 ctgacgtccc ttcctccctc cccagcccct ccaccgcctc cctccgccgc cgcttgggcc 60 ggctccgcgc cccctccgcg gcccccgccc gcccgcctgc ccgccgcccc catggcgccc 120 ggggtccccg ctgcacgggg ccactaggac cctcggcgtc ccttcccctc ccccgccctg 180 ccccctctcc cgccgcgcgg acccgggcgt tctcggcgcc cagcttttga gctcgcgtcc 240 ccaggccggc ggggggggag gggaagagag gggaccctgg gacccccgcc ccccccaccc 300 ggccgcccct gccccccggg acccggagaa gatgtcttcg cggacggtgc tggccccggg 360 caacgatcgg aactcggaca cgcatggcac cttgggcagt ggccgctcct cggacaaagg 420 cccgtcctgg tccagccgct cactgggtgc ccgttgccgg aactccatcg cctcctgtcc 480 cgaggagcag ccccacgtgg gcaactaccg cctgctgagg accattggga agggcaactt 540 tgccaaagtc aagctggctc ggcacatcct cactggtcgg gaggttgcca tcaagattat 600 cgacaaaacc cagctgaatc ccagcagcct gcagaagctg ttccgagaag tccgcatcat 660 gaagggccta aaccacccca acatcgtgaa gctctttgag gtgattgaga ctgagaagac 720 gctgtacctg gtgatggagt acgcaagtgc tggagaagtg tttgactacc tcgtgtcgca 780 tggccgcatg aaggagaagg aagctcgagc caagttccga cagattgttt cggctgtgca 840 ctattgtcac cagaaaaata ttgtacacag ggacctgaag gctgagaacc tcttgctgga 900 tgccgaggcc aacatcaaga ttgctgactt tggcttcagc aacgagttca cgctgggatc 960 gaagctggac acgttctgcg ggagcccccc atatgccgcc ccggagctgt ttcagggcaa 1020 gaagtacgac gggccggagg tggacatctg gagcctggga gtcatcctgt acaccctcgt 1080 cagcggctcc ctgcccttcg acgggcacaa cctcaaggag ctgcgggagc gagtactcag 1140 agggaagtac cgggtccctt tctacatgtc aacagactgt gagagcatcc tgcggagatt 1200 tttggtgctg aacccagcta aacgctgtac tctcgagcaa atcatgaaag acaaatggat 1260 caacatcggc tatgagggtg aggagttgaa gccatacaca gagcccgagg aggacttcgg 1320 ggacaccaag agaattgagg tgatggtggg tatgggctac acacgggaag aaatcaaaga 1380 gtccttgacc agccagaagt acaacgaagt gaccgccacc tacctcctgc tgggcaggaa 1440 gactgaggag ggtggggacc ggggcgcccc agggctggcc ctggcacggg tgcgggcgcc 1500 cagcgacacc accaacggaa caagttccag caaaggcacc agccacagca aagggcagcg 1560 gagttcctct tccacctacc accgccagcg caggcatagc gatttctgtg gcccatcccc 1620 tgcacccctg caccccaaac gcagcccgac gagcacgggg gaggcggagc tgaaggagga 1680 gcggctgcca ggccggaagg cgagctgcag caccgcgggg agtgggagtc gagggctgcc 1740 cccctccagc cccatggtca gcagcgccca caaccccaac aaggcagaga tcccagagcg 1800 gcggaaggac agcacgagca cccccaacaa cctccctcct agcatgatga cccgcagaaa 1860 cacctacgtt tgcacagaac gcccgggggc tgagcgcccg tcactgttgc caaatgggaa 1920 agaaaacagc tcaggcaccc cacgggtgcc ccctgcctcc ccctccagtc acagcctggc 1980 acccccatca ggggagcgga gccgcctggc acgcggttcc accatccgca gcaccttcca 2040 tggtggccag gtccgggacc ggcgggcagg gggtgggggt ggtgggggtg tgcagaatgg 2100 gccccctgcc tctcccacac tggcccatga ggctgcaccc ctgcccgccg ggcggccccg 2160 ccccaccacc aacctcttca ccaagctgac ctccaaactg acccgaaggg tcgcagacga 2220 acctgagaga atcgggggac ctgaggtcac aagttgccat ctaccttggg atcaaacgga 2280 aaccgccccc cggctgctcc gattcccctg gagtgtgaag ctgaccagct cgcgccctcc 2340 tgaggccctg atggcagctc tgcgccaggc cacagcagcc gcccgctgcc gctgccgcca 2400 gccacagccg ttcctgctgg cctgcctgca cgggggtgcg ggcgggcccg agcccctgtc 2460 ccacttcgaa gtggaggtct gccagctgcc ccggccaggc ttgcggggag ttctcttccg 2520 ccgtgtggcg ggcaccgccc tggccttccg caccctcgtc acccgcatct ccaacgacct 2580 cgagctctga gccaccacgg tcccagggcc cttactcttc ctctcccttg tcgccttcac 2640 ttctacagga ggggaagggg ccagggaggg gattctccct ttatcatcac ctcagtttcc 2700 ctgaattata tttgggggca aagattgtcc cctctgctgt tctctggggc cgctcagcac 2760 agaagaagga tgagggggct cagcgggggg agctggcacc ttcctggagc ctccagccag 2820 tcctgtcctc cctcgcccta ccaagagggc acctgaggag actttgggga cagggcaggg 2880 gcagggaggg aaactgagga aatcttccat tcctcccaac agctcaaaat taggccttgg 2940 gcaggggcag ggagagctgc tgagcctaaa gactggagaa tctgggggac tgggagtggg 3000 ggtcagagag gcagattcct tcccctcccg tcccctcacg ctcaaacccc cacttcctgc 3060 cccaggctgg cgcggggcac tttgtacaaa tccttgtaaa taccccacac cctcccctct 3120 gcaaaggtct cttgaggagc tgccgctgtc acctacggtt tttaagttat tacaccccga 3180 ccctcctcct gtcagccccc tcacctgcag cctgttgccc aataaattta agagagtccc 3240 cccctcccca atgctgaccc taggattttc cttccctgcc ctcacctgca aatgagttaa 3300 agaagaggcg tgggaatcca ggcagtggtt tttcctttcg gagcctcggt tttctcatct 3360 gcagaatggg agcggtgggg gtgggaaggt aaggatggtc gtggaagaag gcaggatgga 3420 actcggcctc atccccgagg ccccagttcc tatatcgggc cccccattca tccactcaca 3480 ctcccagcca ccatgttaca ctggactcta agccacttct tactccagta gtaaatttat 3540 tcaataaaca atcattgacc catgcctact ccatgccagg cccagtgctg gacacagaga 3600 catgaagctc tgtctgtggg agacagggat tctgacacag acaccggaca aaccattgtc 3660 ttggggagcc cagaagagaa agtgggcagg gtggggtcat tggggaagat gctctagagg 3720 aattaatgct ggaatggggt gttgaaggat gagtaggagt tagttaggca ttgagtttgc 3780 cctgggcaaa agcccagaag tgggagtatg tggtatatct tcagagaact gggtaatttc 3840 agtgtggctg ctgtgttggg catggatgga gaatcagcaa gagaaatgct gtattaggac 3900 taataatcca tctacgctgc ttaagcaaaa aggtatttgt tggtttatgt tacttaatag 3960 tccaggggca cctggcttca ggtaggtttg atccaggcat caggccattg catctatttt 4020 ttcagtgtaa gttgaattct agtaattttt atcaagtaag ggctcctttc ctggtggcac 4080 agatgacttc agcagttaga agtttctatc cctccagctt tctgcagcag aaagaccctc 4140 attgtcagtt tcccagcaaa agtcccaggg cagactctca ttggcccaaa tgggccatgt 4200 gattttctct aaaccaatca ctgtgactct agagtggcca gactcagagc tgcacttagt 4260 aggggttcct caaaggaagg tcaagtgtca tgagcaggag aaaaggcatg ggagctggac 4320 agattatagt ggttgaagtc tgtgcagtac agaagggcgg agcttattca cacagcacct 4380 ttggggccaa aatgaataag ctggactttc tccccatggc actggggaac catggaagtt 4440 cagggaactt cagggaagag gcttggtcaa ttcctgagag catcctctgt gctggggaca 4500 cagtggtaat caagacagcc ccaacactgc cctcatagag ctcacagtcc aatggaggag 4560 gcagatgtgt cctcaggcag cgactgggca gggctggtat aggggagtcc agaggtgatg 4620 cctgcctcag ccagggaggg cttcctggag gagaaggagc cagctagaca tggataggag 4680 tgcgttttag gcacagcaaa tggcacatac aagggccagg gagcaagaga gaggacaggt 4740 cctcaacaaa tggcatgtga ctttgtaagt gtagaattgc tgtgaggtat ggggctaggg 4800 gcgtcagtag ggccttgaag gttatggaca ggggcctggg ctttcttcca agggcactgg 4860 gggagccatg gcaaggttgt aggtagggta gagatgggcg ggtttgtgct atgtgcaggg 4920 tggaagggag ggaagttgac aggtcagaag atcaggaaag aggtcggggc tggacagatg 4980 gggagagcgc agatagattt aagagagtcc tgtgaggcaa agtgggcagg acctggtaac 5040 aggtgtctgg actgtggctt tggctggctc agaaggtccc cactggcgtg tgtggtctat 5100 gtagcctctg ggtgtggagc tgggatcttc aactggggac agtacagtaa agaacatcac 5160 agc 5163 <210> 2 <211> 1507 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (1)..(1507) <223> Homo sapiens Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP), mRNA, Access No. NM_002567.2 <400> 2 tgggcggcgg ctgaggcgcg tgctctcgcg tggtcgctgg gtctgcgtct tcccgagcca 60 gtgtgctgag ctctccgcgt cgcctctgtc gcccgcgcct ggcctaccgc ggcactcccg 120 gctgcacgct ctgcttggcc tcgccatgcc ggtggacctc agcaagtggt ccgggccctt 180 gagcctgcaa gaagtggacg agcagccgca gcacccgctg catgtcacct acgccggggc 240 ggcggtggac gagctgggca aagtgctgac gcccacccag gttaagaata gacccaccag 300 catttcgtgg gatggtcttg attcagggaa gctctacacc ttggtcctga cagacccgga 360 tgctcccagc aggaaggatc ccaaatacag agaatggcat catttcctgg tggtcaacat 420 gaagggcaat gacatcagca gtggcacagt cctctccgat tatgtgggct cggggcctcc 480 caagggcaca ggcctccacc gctatgtctg gctggtttac gagcaggaca ggccgctaaa 540 gtgtgacgag cccatcctca gcaaccgatc tggagaccac cgtggcaaat tcaaggtggc 600 gtccttccgt aaaaagtatg agctcagggc cccggtggct ggcacgtgtt accaggccga 660 gtgggatgac tatgtgccca aactgtacga gcagctgtct gggaagtagg gggttagctt 720 ggggacctga actgtcctgg aggccccaag ccatgttccc cagttcagtg ttgcatgtat 780 aatagatttc tcctcttcct gccccccttg gcatgggtga gacctgacca gtcagatggt 840 agttgagggt gacttttcct gctgcctggc ctttataatt ttactcactc actctgattt 900 atgttttgat caaatttgaa cttcattttg gggggtattt tggtactgtg atggggtcat 960 caaattatta atctgaaaat agcaacccag aatgtaaaaa agaaaaaact ggggggaaaa 1020 agaccaggtc tacagtgata gagcaaagca tcaaagaatc tttaagggag gtttaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa aaaaagattg gttgcctctg cctttgtgat cctgagtcca gaatggtaca 1140 caatgtgatt ttatggtgat gtcactcacc tagacaacca gaggctggca ttgaggctaa 1200 cctccaacac agtgcatctc agatgcctca gtaggcatca gtatgtcact ctggtccctt 1260 taaagagcaa tcctggaaga agcaggaggg agggtggctt tgctgttgtt gggacatggc 1320 aatctagacc ggtagcagcg ctcgctgaca gcttgggagg aaacctgaga tctgtgtttt 1380 ttaaattgat cgttcttcat gggggtaaga aaagctggtc tggagttgct gaatgttgca 1440 ttaattgtgc tgtttgcttg tagttgaata aaaatagaaa cctgaatgaa gaaaaaaaaa 1500 aaaaaaa 1507 <210> 3 <211> 752 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(752) <223> Homo sapiens MAP/microtubule affinity-regulating kinase 4 isoform 1, protein, NP_001186796.1 <400> 3 Met Ser Ser Arg Thr Val Leu Ala Pro Gly Asn Asp Arg Asn Ser Asp 1 5 10 15 Thr His Gly Thr Leu Gly Ser Gly Arg Ser Ser Asp Lys Gly Pro Ser 20 25 30 Trp Ser Ser Arg Ser Leu Gly Ala Arg Cys Arg Asn Ser Ile Ala Ser 35 40 45 Cys Pro Glu Glu Gln Pro His Val Gly Asn Tyr Arg Leu Leu Arg Thr 50 55 60 Ile Gly Lys Gly Asn Phe Ala Lys Val Lys Leu Ala Arg His Ile Leu 65 70 75 80 Thr Gly Arg Glu Val Ala Ile Lys Ile Ile Asp Lys Thr Gln Leu Asn 85 90 95 Pro Ser Ser Leu Gln Lys Leu Phe Arg Glu Val Arg Ile Met Lys Gly 100 105 110 Leu Asn His Pro Asn Ile Val Lys Leu Phe Glu Val Ile Glu Thr Glu 115 120 125 Lys Thr Leu Tyr Leu Val Met Glu Tyr Ala Ser Ala Gly Glu Val Phe 130 135 140 Asp Tyr Leu Val Ser His Gly Arg Met Lys Glu Lys Glu Ala Arg Ala 145 150 155 160 Lys Phe Arg Gln Ile Val Ser Ala Val His Tyr Cys His Gln Lys Asn 165 170 175 Ile Val His Arg Asp Leu Lys Ala Glu Asn Leu Leu Leu Asp Ala Glu 180 185 190 Ala Asn Ile Lys Ile Ala Asp Phe Gly Phe Ser Asn Glu Phe Thr Leu 195 200 205 Gly Ser Lys Leu Asp Thr Phe Cys Gly Ser Pro Pro Tyr Ala Ala Pro 210 215 220 Glu Leu Phe Gln Gly Lys Lys Tyr Asp Gly Pro Glu Val Asp Ile Trp 225 230 235 240 Ser Leu Gly Val Ile Leu Tyr Thr Leu Val Ser Gly Ser Leu Pro Phe 245 250 255 Asp Gly His Asn Leu Lys Glu Leu Arg Glu Arg Val Leu Arg Gly Lys 260 265 270 Tyr Arg Val Pro Phe Tyr Met Ser Thr Asp Cys Glu Ser Ile Leu Arg 275 280 285 Arg Phe Leu Val Leu Asn Pro Ala Lys Arg Cys Thr Leu Glu Gln Ile 290 295 300 Met Lys Asp Lys Trp Ile Asn Ile Gly Tyr Glu Gly Glu Glu Leu Lys 305 310 315 320 Pro Tyr Thr Glu Pro Glu Glu Asp Phe Gly Asp Thr Lys Arg Ile Glu 325 330 335 Val Met Val Gly Met Gly Tyr Thr Arg Glu Glu Ile Lys Glu Ser Leu 340 345 350 Thr Ser Gln Lys Tyr Asn Glu Val Thr Ala Thr Tyr Leu Leu Leu Gly 355 360 365 Arg Lys Thr Glu Glu Gly Gly Asp Arg Gly Ala Pro Gly Leu Ala Leu 370 375 380 Ala Arg Val Arg Ala Pro Ser Asp Thr Thr Asn Gly Thr Ser Ser Ser 385 390 395 400 Lys Gly Thr Ser His Ser Lys Gly Gln Arg Ser Ser Ser Ser Thr Tyr 405 410 415 His Arg Gln Arg Arg His Ser Asp Phe Cys Gly Pro Ser Pro Ala Pro 420 425 430 Leu His Pro Lys Arg Ser Pro Thr Ser Thr Gly Glu Ala Glu Leu Lys 435 440 445 Glu Glu Arg Leu Pro Gly Arg Lys Ala Ser Cys Ser Thr Ala Gly Ser 450 455 460 Gly Ser Arg Gly Leu Pro Pro Ser Ser Pro Met Val Ser Ser Ala His 465 470 475 480 Asn Pro Asn Lys Ala Glu Ile Pro Glu Arg Arg Lys Asp Ser Thr Ser 485 490 495 Thr Pro Asn Asn Leu Pro Pro Ser Met Met Thr Arg Arg Asn Thr Tyr 500 505 510 Val Cys Thr Glu Arg Pro Gly Ala Glu Arg Pro Ser Leu Leu Pro Asn 515 520 525 Gly Lys Glu Asn Ser Ser Gly Thr Pro Arg Val Pro Pro Ala Ser Pro 530 535 540 Ser Ser His Ser Leu Ala Pro Pro Ser Gly Glu Arg Ser Arg Leu Ala 545 550 555 560 Arg Gly Ser Thr Ile Arg Ser Thr Phe His Gly Gly Gln Val Arg Asp 565 570 575 Arg Arg Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Val Gln Asn Gly Pro Pro 580 585 590 Ala Ser Pro Thr Leu Ala His Glu Ala Ala Pro Leu Pro Ala Gly Arg 595 600 605 Pro Arg Pro Thr Thr Asn Leu Phe Thr Lys Leu Thr Ser Lys Leu Thr 610 615 620 Arg Arg Val Ala Asp Glu Pro Glu Arg Ile Gly Gly Pro Glu Val Thr 625 630 635 640 Ser Cys His Leu Pro Trp Asp Gln Thr Glu Thr Ala Pro Arg Leu Leu 645 650 655 Arg Phe Pro Trp Ser Val Lys Leu Thr Ser Ser Arg Pro Pro Glu Ala 660 665 670 Leu Met Ala Ala Leu Arg Gln Ala Thr Ala Ala Ala Arg Cys Arg Cys 675 680 685 Arg Gln Pro Gln Pro Phe Leu Leu Ala Cys Leu His Gly Gly Ala Gly 690 695 700 Gly Pro Glu Pro Leu Ser His Phe Glu Val Glu Val Cys Gln Leu Pro 705 710 715 720 Arg Pro Gly Leu Arg Gly Val Leu Phe Arg Arg Val Ala Gly Thr Ala 725 730 735 Leu Ala Phe Arg Thr Leu Val Thr Arg Ile Ser Asn Asp Leu Glu Leu 740 745 750 <210> 4 <211> 187 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(187) <223> Homo sapiens Raf Kinase Inhibitor Protein(RKIP), protein, NP_002558.1 <400> 4 Met Pro Val Asp Leu Ser Lys Trp Ser Gly Pro Leu Ser Leu Gln Glu 1 5 10 15 Val Asp Glu Gln Pro Gln His Pro Leu His Val Thr Tyr Ala Gly Ala 20 25 30 Ala Val Asp Glu Leu Gly Lys Val Leu Thr Pro Thr Gln Val Lys Asn 35 40 45 Arg Pro Thr Ser Ile Ser Trp Asp Gly Leu Asp Ser Gly Lys Leu Tyr 50 55 60 Thr Leu Val Leu Thr Asp Pro Asp Ala Pro Ser Arg Lys Asp Pro Lys 65 70 75 80 Tyr Arg Glu Trp His His Phe Leu Val Val Asn Met Lys Gly Asn Asp 85 90 95 Ile Ser Ser Gly Thr Val Leu Ser Asp Tyr Val Gly Ser Gly Pro Pro 100 105 110 Lys Gly Thr Gly Leu His Arg Tyr Val Trp Leu Val Tyr Glu Gln Asp 115 120 125 Arg Pro Leu Lys Cys Asp Glu Pro Ile Leu Ser Asn Arg Ser Gly Asp 130 135 140 His Arg Gly Lys Phe Lys Val Ala Ser Phe Arg Lys Lys Tyr Glu Leu 145 150 155 160 Arg Ala Pro Val Ala Gly Thr Cys Tyr Gln Ala Glu Trp Asp Asp Tyr 165 170 175 Val Pro Lys Leu Tyr Glu Gln Leu Ser Gly Lys 180 185 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence of siRNA for Homo sapiens MAP/microtubule affinity-regulating kinase 4 (MARK4) <400> 5 aguucacgcu gggaucgaa 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence of siRNA for Homo sapiens MAP/microtubule affinity-regulating kinase 4 (MARK4) <400> 6 uucgauccca gcgugaacu 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence of siRNA for Homo sapiens Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP) <400> 7 cugaguccag aaugguaca 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence of siRNA for Homo sapiens Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP) <400> 8 uguaccauuc uggacucag 19 <210> 9 <211> 12463 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (1)..(12463) <223> Homo sapiens A-kinase (PRKA) anchoring (yotiao) protein 9 (AKAP9), transcript variant 2, mRNA, Access No. NM_005751.4 <400> 9 gacgaagatg gcggcggcgg cggcggtgac ggcgcttccc gtgcggctga ggacgatccg 60 ccagtgagcg cggagactgc ttccacttcg ggcgggggag cgccggaccg aatcggctct 120 ctaggccgtg gagcttgccg tcccacctcc gtccaaatcg acctttcctt tctatcccca 180 accacccctc aacccctgtt ttcccctgcc ttccttgcag aggccatgga ggacgaggag 240 agacagaaga agctggaggc cggcaaagcc aagcttgccc agtttcgaca aagaaaagct 300 cagtcggatg ggcagagtcc ttccaagaag cagaaaaaaa agagaaaaac gtcaagcagt 360 aaacatgatg tgtcagcaca ccatgatttg aatattgatc aatcacagtg taatgaaatg 420 tacataaata gttctcagag agtagaatca actgtgattc ctgaatctac aataatgaga 480 actctacata gtggagaaat aaccagtcat gagcagggct tctctgtgga actggaaagt 540 gaaatttcaa ccacagcaga tgactgcagt tcagaggtaa atggttgcag ttttgtgatg 600 agaacaggaa agcctacaaa tttattaagg gaagaagaat ttggtgttga tgattcttat 660 tctgaacaag gagcacaaga cagtccgact catctagaga tgatggaaag tgagttggct 720 gggaagcagc atgagattga agagctaaac agagagctgg aagaaatgag ggttacctat 780 gggactgaag gactgcagca gttacaagaa tttgaagctg ccattaaaca aagagatggc 840 attataaccc agctcactgc taatttacaa caagcaagaa gagaaaagga tgagacaatg 900 agagaatttt tagagttgac agaacagagt caaaaattac agattcaatt tcagcaatta 960 caggctagtg aaactctgag aaacagcact catagtagca cagctgcaga cttactacaa 1020 gccaaacaac agatcctcac tcatcaacag cagcttgaag aacaagacca cttattagaa 1080 gattatcaga aaaagaaaga agacttcaca atgcaaatta gtttcttgca agagaaaatt 1140 aaagtatatg aaatggaaca agataaaaaa gtagaaaact caaataaaga agaaatacag 1200 gaaaaggaga caatcattga agaattaaac acaaaaataa tagaagaaga aaagaaaact 1260 cttgagctaa aggataaatt aacaactgct gataaattac taggagaatt acaagaacag 1320 attgtgcaaa agaaccaaga aataaaaaac atgaaattag agctgactaa ttctaagcaa 1380 aaagaaagac agtcttctga agaaataaaa cagttaatgg ggacagtcga agaacttcag 1440 aagagaaatc ataaagacag ccagttcgaa actgatatag tacaacgaat ggaacaagaa 1500 acacaaagaa agttagaaca actccgggca gagctggatg agatgtatgg gcagcagata 1560 gtgcaaatga aacaagaatt aataagacaa cacatggcac agatggagga aatgaaaaca 1620 cggcataagg gagaaatgga gaatgcttta aggtcatatt caaatattac agttaatgaa 1680 gatcagataa agttaatgaa tgtggcaata aatgaactga atataaaatt gcaagatact 1740 aactctcaaa aggaaaaact caaggaagaa ctaggactaa ttttagaaga aaagtgtgct 1800 ctacagagac agcttgaaga ccttgttgaa gaattgagct tttcaaggga acagattcag 1860 agagctagac agacaatagc tgaacaagaa agtaaactta atgaagcaca taagtccctt 1920 agtacagtgg aagatttgaa agctgagatt gtttctgcat ctgaatccag aaaggaacta 1980 gaattaaaac atgaagcaga agttacaaat tacaagataa aacttgaaat gttagaaaaa 2040 gaaaagaatg ctgtgttaga cagaatggct gaatcacaag aagctgaatt agagaggctg 2100 agaacacagc ttctatttag tcacgaagaa gagctttcca aactgaagga agatttagaa 2160 attgaacatc gaataaatat tgaaaaactt aaagataatt taggcattca ctataaacag 2220 cagatagatg gtttacagaa tgaaatgagt caaaagatag aaaccatgca gtttgaaaag 2280 gacaatttga taactaagca gaatcaatta attttggaaa tttcaaagct aaaagattta 2340 cagcagtctc ttgtaaattc aaagtcagaa gaaatgactc ttcaaatcaa tgaacttcaa 2400 aaagaaattg aaatactcag acaagaagaa aaagaaaagg gtacacttga acaagaagtt 2460 caagaattac aacttaaaac agaattgtta gaaaaacaga tgaaggaaaa agagaatgat 2520 cttcaagaaa aatttgcaca acttgaagca gagaatagca ttcttaaaga tgaaaagaaa 2580 acccttgaag acatgttgaa aatacatact cctgttagcc aagaagaaag attgattttc 2640 ttagactcca ttaagtccaa atccaaagac tctgtgtggg aaaaagaaat agaaatactt 2700 atagaggaaa atgaggacct caaacaacaa tgtattcagc taaatgaaga gattgaaaag 2760 caaaggaaca ctttttcatt tgctgaaaaa aactttgaag ttaactatca agagttacaa 2820 gaggagtatg cttgccttct caaagtaaaa gatgatttag aagacagtaa aaataaacag 2880 gaattagagt ataaaagtaa acttaaagca cttaatgaag agcttcattt gcaaagaata 2940 aatccaacta cagtgaaaat gaaaagttct gtctttgatg aagacaaaac ttttgtagca 3000 gaaacattgg aaatgggtga ggttgttgaa aaggatacaa cagaactcat ggaaaaactt 3060 gaggtaacca agcgagagaa attagagctg tcacagagac tgtctgatct ttctgaacaa 3120 ttgaaacaga aacatggtga gattagtttt ctaaatgaag aagttaaatc tttaaagcaa 3180 gagaaagaac aagtttcatt gagatgtaga gagctagaaa tcattattaa ccacaacagg 3240 gcagaaaatg tacagtcatg tgatactcaa gtaagctctt tattagatgg agttgtgacc 3300 atgacaagca ggggtgctga aggatcagtt tctaaagtaa ataaaagttt tggtgaagaa 3360 tcaaaaataa tggtggaaga taaagtttct tttgaaaata tgactgttgg agaagaaagt 3420 aagcaagaac agttgatttt ggatcactta ccatctgtaa caaaggaatc atcacttaga 3480 gcaactcaac caagtgaaaa tgataaactt cagaaagaac tcaatgtact taaatcagaa 3540 cagaatgatt taaggctaca gatggaagcc caacgcattt gcctctctct ggtttattca 3600 actcatgtgg atcaggttcg tgaatatatg gaaaatgaaa aagataaagc tctttgcagt 3660 cttaaagaag agcttatttt tgctcaagag gaaaagatca aggaacttca gaaaatacac 3720 cagttagaac tacagactat gaaaacacaa gaaacaggtg atgaaggaaa gcctttacat 3780 ctgctcattg gaaaacttca aaaggcagtg tctgaagaat gttcttattt tttacagact 3840 ttatgcagtg tccttggtga atattatact cctgctttaa aatgtgaagt aaatgcagaa 3900 gacaaagaga attctggtga ttacatttct gaaaatgaag atccagaatt acaagattat 3960 agatatgaag ttcaagactt tcaagaaaat atgcacactc ttctcaacaa agtaacagaa 4020 gaatacaaca aactcttggt acttcaaaca cgactaagca agatctgggg acagcagaca 4080 gatggtatga aacttgaatt tggagaagaa aaccttccaa aagaggaaac agagttttta 4140 tcaatccatt ctcagatgac caatttggaa gacattgatg tcaatcataa aagcaagtta 4200 tcttctctgc aagatcttga aaaaactaaa cttgaagaac aagttcaaga attagaaagc 4260 ctcatatcct ctttgcagca acagttgaaa gaaactgaac aaaactatga ggcagagatc 4320 cactgtttac agaagaggct tcaagctgtt agtgagtcca cggttccgcc aagcttacct 4380 gttgattcgg tggtaattac agaatctgat gcacagagaa caatgtaccc tggaagttgt 4440 gtgaaaaaga atattgatgg tacaatagag ttttctggtg aatttggagt gaaagaggaa 4500 acaaatatcg ttaagttgct tgaaaaacaa taccaagaac aattagaaga agaagtagct 4560 aaggttattg tgtcaatgag tatagcattt gctcaacaaa ctgaactgtc tagaatatct 4620 gggggaaaag aaaatactgc atcatcaaag caagcacatg ctgtgtgtca gcaagaacaa 4680 cattatttta atgaaatgaa attatcacag gatcaaattg gttttcagac ttttgagaca 4740 gtggatgtga aatttaaaga agaatttaaa ccacttagta aagagttagg agaacatgga 4800 aaggaaattt tattatcaaa tagtgatccc catgatatac cagaatcaaa ggactgtgtg 4860 ctgactattt cagaagaaat gttctccaaa gataaaacat ttatagttag acagtctatt 4920 catgatgaga tttcagtgtc aagcatggat gcttctagac aactaatgtt gaatgaagaa 4980 cagttggaag atatgagaca ggaacttgta cgacaatacc aagaacatca acaggcaacg 5040 gaattgttaa ggcaagcaca tatgcggcaa atggagagac agcgagaaga ccaggaacag 5100 ctacaagaag agattaagag acttaataga caattagccc agagatcctc catagataat 5160 gaaaacctgg tttcagagag agagagggtg cttttagagg agctggaagc actaaagcag 5220 ctgtctttag ctggaagaga gaagctgtgt tgtgagctgc gcaacagcag tacgcaaaca 5280 cagaatggaa atgaaaacca aggagaagtt gaagaacaaa catttaaaga aaaggaatta 5340 gacagaaaac ctgaagatgt gcctcctgag attttgtcta atgaaaggta tgcactccag 5400 aaagctaata atagactttt gaagatcctc ttagaagttg taaagacaac agcagctgtt 5460 gaagaaacaa ttggtcgcca tgtccttggg attctagata gatctagtaa aagccagtca 5520 tctgccagcc taatttggag gtcagaagca gaggcatctg taaagtcatg tgtccatgag 5580 gaacatacaa gagttacaga tgaatccatt ccctcttatt ctggaagtga tatgccaaga 5640 aatgacatta acatgtggtc aaaagtaact gaggaaggaa cagagctgtc acaacgactt 5700 gtgaggagtg gttttgctgg aactgaaata gaccctgaaa atgaagaact tatgctgaac 5760 attagctctc gactacaagc agcagttgaa aaactcctag aagccataag tgaaactagc 5820 agtcagcttg aacatgcgaa agtgacacag acagagttga tgcgtgagtc atttagacag 5880 aaacaagaag caacagagtc ccttaagtgc caagaggaac ttcgagagcg ccttcatgag 5940 gagtccaggg ccagagaaca gctagctgtg gagctcagta aggctgaggg cgtcattgat 6000 ggctatgcag atgaaaaaac tctttttgaa aggcaaattc aggaaaaaac tgatataata 6060 gatcgtcttg agcaggagtt gttatgtgca agtaacaggt tgcaagaatt ggaggcagag 6120 caacagcaga tccaagaaga aagagaatta ctgtccagac aaaaggaagc tatgaaagca 6180 gaggcaggcc cagttgaaca acaattacta caggagacag aaaaattaat gaaggaaaaa 6240 ctagaagtac aatgtcaagc tgaaaaagta cgtgatgacc ttcaaaaaca agtgaaagct 6300 ctagaaatag atgtggaaga acaagtcagt aggtttatag agctggaaca agaaaaaaat 6360 actgaactaa tggatttaag acagcaaaac caagcattgg aaaagcagtt agaaaaaatg 6420 agaaaatttt tagatgagca agccattgac agagaacatg agagagatgt attccaacag 6480 gaaatacaga aactagaaca gcaacttaag gttgttcctc gattccagcc tatcagtgaa 6540 catcaaacta gagaggttga acagttagca aatcatctga aagaaaaaac agacaaatgc 6600 agtgagcttt tgctctctaa agagcagctt caaagggata tacaagaaag gaatgaagaa 6660 atagagaaac tggagttcag agtaagagaa ctggagcagg cgcttcttgt gagtgcagat 6720 acttttcaaa aggtagagga ccgaaaacac tttggagctg tagaagctaa accagaattg 6780 tccctagaag tacaattgca ggctgaacga gatgccatag acagaaagga aaaagagatt 6840 acaaacttag aagagcaatt agaacagttt agagaagaac tggaaaataa gaatgaagaa 6900 gttcaacaat tacatatgca attagaaata cagaaaaagg aatctactac ccgcctacaa 6960 gaacttgaac aggaaaacaa attatttaag gatgacatgg agaaactggg acttgccata 7020 aaggaatctg atgccatgtc tactcaagac caacatgtgc tatttgggaa atttgctcaa 7080 ataatacagg aaaaagaggt agaaattgac caattaaatg aacaagttac gaaactccag 7140 cagcaactta aaattacaac agataacaag gttattgaag aaaaaaatga actgataagg 7200 gatcttgaaa cccaaataga atgtttgatg agtgatcaag aatgtgtgaa gagaaataga 7260 gaagaagaaa tagagcagct caatgaagtg attgaaaaac ttcaacagga attggcaaat 7320 attggacaga agacatcaat gaatgctcat tccctctcag aagaagcaga cagtttaaaa 7380 catcaattgg atgtggttat agctgaaaag ctggccttgg aacagcaagt agaaaccgct 7440 aatgaagaaa tgaccttcat gaaaaatgta cttaaagaaa ccaattttaa aatgaatcag 7500 ctaacacagg aattattcag cttaaagaga gaacgtgaaa gtgtggaaaa gattcaaagc 7560 ataccagaga atagtgttaa cgtggctata gatcatctga gcaaagacaa acctgaacta 7620 gaagtagtcc ttacagagga tgctcttaaa tccctagaaa atcagacata cttcaaatct 7680 tttgaagaaa atggcaaagg ttccataatt aatttggaaa caaggttgct acaacttgag 7740 agcactgtta gtgcaaagga cttagaactt acccagtgtt ataaacaaat aaaagacatg 7800 caagaacaag gccagtttga aacagaaatg cttcaaaaga agattgtaaa cctacagaaa 7860 atagttgaag aaaaagtggc tgctgctctt gtcagtcaaa tccaacttga ggcagttcag 7920 gaatatgcaa aattctgtca agataatcaa acaatttcat cagaacctga aagaacaaat 7980 attcagaatt taaatcaact aagagaagat gagttggggt cagatatatc agcattaacc 8040 ttgagaatat cagaattaga aagccaggtt gttgaaatgc atactagttt gattttagaa 8100 aaagaacaag tagaaattgc agaaaaaaat gttttagaaa aagaaaagaa gctgctagaa 8160 ctacagaagc tattggaggg caatgagaaa aaacagagag agaaagaaaa gaaaagaagc 8220 cctcaagatg ttgaagttct caagacaact actgagctat ttcatagcaa tgaagaaagt 8280 ggatttttta atgaactcga ggctcttaga gctgaatcag tggctaccaa agcagaactt 8340 gccagttata aagaaaaggc tgaaaaactt caagaagagc ttttggtaaa agaaacaaat 8400 atgacatctc ttcagaaaga cttaagccaa gttagggatc acctcgcaga ggcaaaagag 8460 aaattgtcca ttttagaaaa agaagatgag actgaggtac aagaaagcaa aaaggcctgc 8520 atgtttgagc cacttcctat aaaactgagt aagagcattg catcccagac agatgggact 8580 ctgaagatca gtagcagcaa tcagactcca caaattcttg ttaaaaatgc aggaatacaa 8640 attaatttac agagtgaatg ttcctcagaa gaagttactg aaataatcag tcagtttact 8700 gaaaaaattg agaagatgca agaactacat gctgctgaaa ttttggacat ggaatccaga 8760 catatttcag aaactgaaac cttaaagagg gaacactatg ttgccgttca gttactgaaa 8820 gaggaatgtg gtaccttgaa ggcagtgata cagtgtctga gaagtaaaga gggatcctca 8880 attcctgagc tagcacattc tgatgcttac cagactagag aaatatgctc cagtgattct 8940 ggatcagact ggggtcaggg aatttatctt acacacagtc agggatttga catagcatca 9000 gaaggccgag gagaagaaag tgaaagtgca acagattcct ttccaaagaa aataaaggga 9060 ttactgagag ctgtccataa tgaaggcatg caggtgcttt ctctcactga gtctccctat 9120 agtgatggag aggaccattc tattcagcag gtttcagaac cttggctaga agagagaaaa 9180 gcttacatca atacaatctc atctctaaag gatttaatta caaagatgca actgcaaaga 9240 gaagccgagg tttatgatag ttctcaatct catgagagct tctcagactg gcgaggtgaa 9300 ctactgcttg cccttcaaca agttttctta gaagagcgta gtgttttact agcagcattt 9360 cggacggagc tgacagctct aggtactaca gatgcagttg gtttactaaa ctgtttggaa 9420 cagagaatac aagaacaggg tgttgaatat caagcagcta tggaatgcct ccagaaagca 9480 gatagaagga gtttgttatc tgaaattcag gcactgcatg cacaaatgaa tggtaggaaa 9540 attactctga aaagagaaca agagagtgag aaaccaagcc aagaactctt ggaatataat 9600 atacagcaga agcagtctca aatgctggag atgcaagtgg agctcagcag tatgaaagac 9660 agagcaacgg aactgcagga gcagctgagt tctgagaaaa tggtggttgc tgaactgaag 9720 agtgagcttg cacaaactaa attggaacta gaaacaacac tcaaggcaca gcataaacac 9780 ctaaaagaat tggaggcttt caggttggaa gttaaagata agacagatga agtacatttg 9840 cttaatgaca cattagcaag tgaacagaaa aaatcaagag agctccagtg ggctttggag 9900 aaagagaaag ccaagttggg acgcagtgaa gaacgggata aagaagaact tgaggatctg 9960 aagttttcac ttgagagtca gaaacaaagg aatcttcagc taaatctact tttggaacaa 10020 cagaaacaac tactgaacga atcccagcaa aaaatagaat cacagagaat gctatatgat 10080 gcccagttgt cagaagaaca aggtcgaaac ttagagcttc aggtacttct tgaatctgag 10140 aaagttcgaa ttcgggaaat gagtagtacc ctagataggg agcgggaatt gcacgcacag 10200 ctgcagagca gtgatggtac tggacagtct cggccaccct tgccctcaga ggacctactg 10260 aaagagctgc agaaacagct agaggaaaaa cacagtcgca tagtagaatt gttaaatgag 10320 actgaaaaat ataaactgga ttctttgcaa acacgacagc aaatggaaaa agataggcag 10380 gttcacagga aaacactgca gacagaacag gaggccaaca ctgagggaca gaaaaaaatg 10440 catgagctcc agtccaaagt ggaagatctt cagcgccagc tggaagagaa aagacaacaa 10500 gtttataagt tagaccttga aggacagcga ctacaaggaa tcatgcagga attccagaag 10560 caagaactag aacgagaaga aaaacgagaa agtagaagaa ttctgtatca gaaccttaat 10620 gagccaacca cgtggagctt aaccagtgat agaactagaa attgggttct tcaacagaaa 10680 atagaaggag aaacaaaaga atcaaactac gctaaattga ttgaaatgaa tggaggagga 10740 accggctgta atcatgaatt agaaatgatc agacaaaagc ttcaatgtgt agcttcaaaa 10800 ctacaggttc taccccagaa agcctctgag agactacagt ttgaaacagc agatgatgaa 10860 gatttcattt gggttcagga aaatattgat gaaattattt tacaactaca gaaattaact 10920 ggccagcaag gtgaagagcc cagcttggtg tccccaagta cttcttgtgg ctcattgact 10980 gaaagactac tgagacaaaa tgctgagctg acagggcata tcagtcaact gactgaagag 11040 aagaatgact taaggaacat ggttatgaag ctggaagagc agatcaggtg gtatcgacag 11100 acaggagctg gtagagataa ttcttccagg ttttcattga atggtggtgc caacattgaa 11160 gccatcattg cctctgaaaa agaagtatgg aacagagaaa aattgactct ccagaaatct 11220 ttgaaaaggg cagaggctga agtatacaaa ctgaaagctg aactaagaaa tgactcttta 11280 cttcaaactc tgagccctga ttctgaacat gtcactttaa agagaattta tggtaaatac 11340 ttgagggcag aaagttttcg aaaggctctc atttaccaga agaaatacct gctgctgtta 11400 ctgggtgggt tccaggaatg tgaagatgcc accttggccc tgcttgcccg gatggggggg 11460 cagccagctt tcacggatct agaggtgatc accaatcgcc caaagggctt caccaggttt 11520 cggtcggccg tcagagtatc cattgcaatt tccagaatga aatttttggt tcgacggtgg 11580 catcgagtca caggttctgt ttccatcaat attaacagag atggctttgg actgaatcaa 11640 ggtgcagaaa agactgactc attttatcat tcttctggtg ggctggagtt atatggagaa 11700 ccaagacata ctacgtatcg ctcaagatca gatctggact atattaggtc ccctttacca 11760 tttcagaata ggtacccagg cactccagct gatttcaatc ctggttcttt agcatgttct 11820 cagcttcaga attacgatcc tgacagagcc ctaacagatt atatcactcg gctagaggca 11880 ctgcaaagac gacttggaac tatacagtca ggttcaacta ctcaatttca tgctggcatg 11940 agaagataat cctttgaaac atcattaatt gaagtgattt taaatagatt tccttttgta 12000 aatcaatggt tcttttgtgc ttttgtattg tgaatattca atgggaccaa tatgaacaca 12060 gcttatgatt gtatacaaat cccttgccag cacatgaaaa caaactggaa tttgtatata 12120 taagcattgt gtatgtattc atgcacaata attattgaat tacctgtata tttgtggaat 12180 gctaatttaa aacattaaat tataaacctt gtgtatttat caaatgggtg aaaagattaa 12240 acttttacgc attacaatac tgctgaatgt gtagctcgag gtgtcctgca cttttcttat 12300 aaggctactg aagttacatg ttttgcctaa tatattctac tggtgatgaa gacagataat 12360 atcacttgta gagacctatt tttgtataat ggtagaagtt ttgaatttta tggggtattt 12420 tgtcaagtac tgaaataaaa atgacttcac cattttcacc aca 12463 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence of siRNA for Homo sapiens A-kinase (PRKA) anchoring (yotiao) protein 9 (AKAP9) <400> 10 gagaacagga aagccuaca 19 <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence of siRNA for Homo sapiens A-kinase (PRKA) anchoring (yotiao) protein 9 (AKAP9) <400> 11 uguaggcuuu ccuguucuc 19 <210> 12 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence of non-specific siRNA <400> 12 ccuacgccac caauuucgu 19 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence of non-specific siRNA <400> 13 acgaaauugg uggcguagg 19

Claims (8)

1. MAP/미세소관 친화도 조절 키나아제 (MAP/microtubule affinity-regulating kinase 4; MARK4) 유전자 및 Raf 키나아제 억제 단백질 (Raf Kinase Inhibitor Protein; RKIP) 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 억제제는 siRNA인 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방용 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 siRNA는 센스서열이 서열번호 5, 안티센스 서열이 6인 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방용 조성물.
4. 제2항에 있어서, 상기 siRNA는 센스서열이 서열번호 7, 안티센스 서열이 8인 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방용 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 단백질에 대한 억제제는 항체인 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방용 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 방사선 요법으로 인한 부작용은 종양세포에 대한 방사선 요법으로 인해 종양세포에서 분비된 단백질에 의한 종양세포 및 혈관내피세포의 세포활성도 증가, 종양세포의 세포침윤 증가, 종양세포의 세포이동 증가, 종양세포 및 혈관내피세포의 창상치유 증가 및 혈관내피세포의 관 형성 증가로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방용 조성물.
7. Raf 키나아제 억제 단백질 (Raf Kinase Inhibitor Protein; RKIP) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 항암 보조제.
8. 제7항에 있어서, 상기 항암 보조제는 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방용 조성물인 것인 항암 보조제.

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