KR101701597B1 - 강심 배당체를 이용한 stk11-돌연변이 암 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Na+-K+ ATPase (ATP1A1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 STK11-돌연변이 암 치료용 약학적 조성물, 상기 조성물을 유효성문으로 포함하는 항암제 및 STK11-돌연변이 암 치료제의 스크리닝 방법 등에 관한 것이다. 암세포에서는 다양한 유전자의 돌연변이가 확인되는데 그 중 높은 빈도로 확인되는 STK11-돌연변이 암 세포주에 Na+-K+ ATPase (ATP1A1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질인 강심 배당체(Cardiac glycosides)를 처리함으로써 암 세포의 성장이 현저하게 저해됨을 최초로 규명하였다. 따라서 본 발명에 따른 Na+-K+ ATPase (ATP1A1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질은 STK11-돌연변이 유래 암의 치료 타겟이 될 수 있는 효과가 있다.

Description

강심 배당체를 이용한 STK11-돌연변이 암 치료용 약학적 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF STK11-MUTATED CANCER COMPRISING CARDIAC GLYCOSIDES}
본 발명은 Na+-K+ ATPase(ATP1A1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 STK11-돌연변이 암 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것이다.
폐암은 전 세계적으로 발생율이 증가되고 있는 추세에 있는 종양으로, 크게 암세포가 기관지나 폐포에서 처음 발생한 원발성 폐암과 암세포가 다른 기관에서 생겨나 혈관이나 림프관을 타고 폐로 이동해 자라는 전이성 폐암으로 나눌 수 있다.
조직학적으로 크게 비소세포폐암(NSCLC, non small cell lung cancer)과 소세포폐암(SCLC, small cell lung cancer)으로 분류되고, 비소세포폐암이 전체 폐암분포의 75%를 차지하고 있다. 상기 비소세포폐암(NSCLC)은 다시 선암(adenocarcinoma), 편평상피세포암(squamous cell carcinoma), 대세포암(large cell carcinoma)으로 분류되고, 이 중 선암이 점차적으로 높은 빈도를 보이고 있다.
폐암은 흡연인구의 증가와 대기 오염 등의 원인으로 급속히 그 발생이 증가하고 있음에도 불구하고, 대부분의 폐암은 화학요법과 방사선요법에 의해서는 치료가 어렵다. 소세포암은 그 크기를 축소시킴으로써 화학요법 및 방사선요법이 적용될 수 있으나 이에 의해서는 완전한 치료를 기대할 수 없고, 비소세포폐암은 소세포폐암에 비해 항암제의 효과가 적어 화학요법만으로는 치료가 거의 불가능하므로, 종양을 외과적으로 완전히 제거하는 것이 유일한 효과적인 치료법이다. 그러나 폐암 환자의 30% 이하가 진단시 전부 절제할 수 없는 종양을 가지며, 이들 중의 1/3 이하만이 외과적 절제술 이후 5년간 생존할 뿐이다. 따라서 폐암을 더 효과적으로 치료할 수 있는 방법이 절실히 요망된다.
나아가, 최근 미국 FDA에서 승인된 약물들 중 암 치료제 약물 대부분이 특정 돌연변이형 암종을 타겟으로 한다 (http://www.centerwatch.com/druginformation/fda-approvals/). 이러한 항암제 시장의 변화와 함께 최근 암 치료제 개발은 돌연변이 암종을 특이적으로 조절할 수 있는 타겟 발굴에 초점이 맞추어져 있다.
특히, 폐암에서 STK11(또는 LKB1)은 돌연변이 발생빈도가 높다는 점과 함께 LKB1의 돌연변이 세포에서 폐암의 전이 및 분화가 촉진된다는 보고가 2007년 Nature 저널에 발표된 바 있어, 폐암에서 STK11이 매우 중요한 역할을 한다는 것이 알려져 있다. 특히, 폐암 환자 조직 샘플에서 SKT11은 다른 주요 유전자 돌연변이와는 뚜렷하게 구분되는 발생 양상을 나타내어 STK11 돌연변이형 폐암 환자군 특이적인 항암 약물 개발의 필요성을 보인다. 그러나 현재 폐암에서는, ALK, BRAF, EGFR 등의 유전자 돌연변이에 대한 항암 약물들이 임상적으로 활발히 시도되고 있으나, 가장 빈도가 높은 STK11-돌연변이 암에 대한 타겟 항암제 개발은 보고된 바 없다.
이전 연구는 STK11 시그널링 경로의 유전적 변형(variants)이 제2형 당뇨병과 같은 질환에서 치료적 효과에 영향을 줄 수 있을 것으로 보고되어 있다(Choi J, et al., Biochem Biophys Res Commun. 2011;413:259-63). STK11은 종양저해인자로서 기능을 하는 세린-트레오닌 키나아제를 암호화하고 세포 극성을 조절한다. STK11의 기능-소실 체세포 돌연변이는 폐암의 대략 30%에서 발견되어 왔고, 전이(metastasis)를 촉진하는 것으로 제안되어 왔다(Sung JS, et al., Cancer Res Treat. 2009;41:211-7).
한편, 강심 배당체(Cardiac glycosides)는 디곡신 (Digoxin), 디지톡신 (Digitoxin), 와베인 (Ouabain) 약물의 패밀리로, 기존에 울혈심부전증과 부정맥 등의 치료에 강심제로 사용되어 왔던 약물이다. Cardiac glycosides는 Na+-K+ ATPase(ATP1A1 단백질(ATPase, Na+-K+ transporting, alpha 1 polypeptide)의 기능을 저해하는 물질로, 세포내부의 나트륨과 칼륨의 농도를 조절하는 역할을 한다. ATP1A1 단백질은 세포 내부를 저농도의 나트륨과 고농도의 칼륨으로 유지하는 기능을 하는데, 이는 세포질막의 양면 사이의 전위차를 생성하는 eletrogenic 펌프이다. 또한, 흥분과 수축성 조직의 편광화를 확인하는 기능을 하는데, 탈분극과 재분극은 각각 나트륨의 유입과 칼륨의 방출과 상응된다. Na+-K+ ATPase가 평형을 복원한다. 또한, 플라즈마 멤브레인의 양면 상에 이온 구배와 관련된 포텐셜 에너지를 생성하는 기능을 한다. 이 에너지는 특히 보조적인 활성 수송용으로 이용되는데, 일반적으로 나트륨의 그것과 커플링된다.
일반적으로 알려져 있는 Cardiac glycosides는 인산화 상태에 있을 때, 효소의 세포외 부분에 결합, 즉 칼륨을 결합하여 세포 내로 칼륨을 전달한다. 알파 서브 유닛의 탈 인산화를 유도하는 세포 외 칼륨은 심장 배당체의 효과를 감소시킨다. 심장 배당체는 심근, 심장 전도 조직, 부드러운 근육 및 적혈구와 같은 다른 조직들의 Na+-K+ ATPase(ATP1A1)을 저해한다. 그들은 골격근육의 Na+-K+ ATPase(ATP1A1)에는 거의 영향을 미치지 않는다.
이러한 ATP1A1과 암 질환과 관련된 종래 기술로, 국내특허공개 10-2013-0137562호(2013.12.17. 공개)에는 APOO(Apolipoprotein O), ATP1A1(ATPase, Na+-K+ transporting, alpha 1 polypeptide), CANX(calnexin) 및 DDOST(dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 표적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는 폐암 진단 또는 치료용 조성물이 기재되어 있다. 구체적으로 여기에서는 ATP1A1(ATPase, Na+-K+ transporting, alpha 1 polypeptide)이 폐암 진단에 유효함을 개시하고 있기는 하지만, 그 치료적 효과에 대한 구체적인 언급이 없을 뿐만 아니라 돌연변이 암에 대한 치료적 유효성에 대해서도 전혀 언급된 바 없다.
본 발명의 목적은 STK11-돌연변이 암에 대해 특이적인 치료효과를 나타내는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 Na+-K+ ATPase (ATP1A1 단백질, Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 STK11(Serine/threonine kinase 11)-돌연변이 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 Na+-K+ ATPase (ATP1A1 단백질, Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 STK11(Serine/threonine kinase 11)-돌연변이 암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 Na+-K+ ATPase은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 Na+-K+ ATPase의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질은 강심 배당체(Cardiac glycosides) 및 Na+-K+ ATPase에 특이적으로 결합하는 물질일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 Na+-K+ ATPase에 특이적으로 결합하는 물질은 Na+-K+ ATPase의 칼륨 결합을 비경쟁적- 또는 경쟁적 저해하여 세포 내 칼륨전달을 저해하는 물질일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 Na+-K+ ATPase에 특이적으로 결합하는 물질은 Na+-K+ ATPase 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 및 shRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 강심 배당체에 특이적으로 결합하는 물질은 디곡신(digoxin), 와베인(ouabain) 또는 디기톡신(digitoxin)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 디곡신(digoxin)일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 항암제를 제공한다.
이에 더하여, 본 발명은 상기 조성물을 STK11-돌연변이 암 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 STK11-돌연변이 암의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 개체는 인간, 가축 등을 포함하는 포유류일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 STK11(Serine/threonine kinase 11)-돌연변이 암의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(1) 환자로부터 생물학적 시료를 채취하여 세포를 분리하는 단계;
(2) 상기 세포와 ATP1A1(Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1)의 나트륨-칼륨 수송을 저해하는 물질을 접촉시키는 단계; 및
(3) 상기 세포의 성장이 무처리군에 비해 저해되면 STK11-돌연변이 암일 가능성이 높은 것으로 판정하는 단계.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 (1) 단계의 생물학적 시료는 혈액, 피부 세포, 점막 세포, 소변, 및 모발로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
나아가 본 발명은 하기 단계를 포함하는 STK11-돌연변이 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:
a) 시험관 내(in vitro)에서 STK11-돌연변이 암 세포 및 야생형 암 세포와 ATP1A1(Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1)의 나트륨-칼륨 수송을 저해하는 물질을 접촉시키는 단계;
b) 상기 접촉 후 STK11-돌연변이 암 세포와 야생형 암 세포의 성장률을 비교하는 단계; 및
c) STK11-돌연변이 암 세포의 성장을 저해하는 물질을 STK11-돌연변이 암 치료제로 선정하는 단계.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 암은 전립선암, 유방암, 대장암, 흑색종 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 따르면 암세포에서는 다양한 유전자 돌연변이가 확인되는데 그 중 높은 빈도로 확인되는 STK11-돌연변이 폐암에서 기존에 강심제의 용도로 사용되었던 Cardiac glycosides 물질을 처리함으로써 암 세포의 성장이 저해됨을 확인하였다. 따라서 Cardiac glycosides 물질을 스크리닝하여 STK11-돌연변이 유래 암 치료를 위한 타겟으로 활용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에서 STK11 돌연변이 암에 있어서 유효한 것으로 제안하는 Cardiac glycosides의 구조식을 도시한 것이다.
도 2는 비소세포폐암(NSCLC)에서의 STK11 돌연변이 양상을 확인한 결과이다. 도 2a는 비소세포폐암(NSCLC) 중 가장 높은 비중을 차지하는 하위유형 중 하나인 폐 선암종(Lung adenocarcinoma) 환자에서의 주요 7종의 돌연변이에 대한 유전적 변이 양상을 나타낸 것이다. 도 2b는 폐 선암종의 암 진행에 따른 STK11 변이 비율을 나타낸 것이다.
도 3a는 도 1로 도시한 3개의 Cardiac glycosides 화합물에 대해 60여 암 세포주에서 계층적 클러스터링을 수행한 Heat map이고, 도 3b는 기존에 쓰이고 있는 비소세포폐암(NSCLC) 치료제와 Cardiac glycosides의 STK11 정상발현 세포주에 대한 STK11 돌연변이 세포주에의 상대적인 약물효과(-logGI50의 AUC값)를 측정한 결과이다.
도 4는 도 1로 도시한 각각의 구조를 갖는 화합물들(Digoxin, Digitoxin 및 Ouabain)의 야생형 세포주 대비 돌연변이 세포주들의 enrichment를 -logGI50 watarfall plot으로써 나타낸 것(각각의 화합물에 대응하여, 도 4a, 도 4b, 도 4c)이다.
도 5a는 8종의 폐암 세포주에 대하여 Digoxin, Digitoxin 및 Ouabain을 농도를 달리하면서 STK11-돌연변이 폐암 세포주 및 STK11-야생형 폐암 세포주에 각각 처리(72시간)하여, 도 5b는 STK11-돌연변이 폐암 세포주에 야생형 STK11을 발현시키고 세포 성장 저해를 확인한 결과 그래프이다.
도 6은 STK11 돌연변이 세포주(A549)와 STK11가 회복된 세포주(A549-STK11)에 대하여 Digoxin, Digitoxin 및 Ouabain을 장시간 각각 처리하고, 3일, 7일, 14일차에 세포 성장 저해를 확인(TiterBlue), STK11 정상발현 세포주에 대한 STK11 돌연변이 세포주에의 상대적인 세포 성장 저해 효과를 확인한 결과 그래프이다.
도 7a 및 7b는 폐암 세포주에 ATP1A1 siRNA를 처리(72시간)하여 얻어진 cell viability를 평가한 결과들로, 도 7a는 STK11-돌연변이 폐암 세포주 및 STK11-야생형 폐암 세포주에 각각 처리하여 Titer Blue로, 도 7b는 STK11-돌연변이 폐암 세포주에 야생형 STK11을 발현시키고 Titer Blue로 cell viability를 평가한 결과이다.
도 8은 야생형 STK11를 갖는 두 개의 폐암 세포주에 대하여 ATP1A1 및 STK11를 모두 넉다운(72시간)시켜 얻어진 세포 성장 저해 결과를 비교한 결과 그래프이다.
도 9는 Cardiac glycosides 처리로 인해 STK11-돌연변이 폐암세포주에서 특이적인 세포이동 및 세포분열 억제 효과가 나타남을 확인한 것으로, 도 9a는 세포이동 결과이고, 도 9b는 세포분열 결과이다.
도 10은 STK11-돌연변이 폐암에서 Cardiac glycosides의 전임상적 효과를 확인한 결과로, 도 10a는 A549 세포주가 주입된 동물모델에서 종양의 성장을 확인한 것이고, 도 10b는 STK11를 야생형으로 회복시킨 세포주가 주입된 동물모델에서 종양의 성장을 확인한 것이며, 도 10c와 도 10d 및 도 10e는 각각 60ng/ind. (3 μg/kg)와 180 ng/ind. (9 μg/kg) 농도의 Cardiac glycosides 처리에 의해 STK11 정상발현 세포주가 주입된 동물모델에 대한 STK11-돌연변이 세포가 주입된 동물모델에서의 상대적인 종양 성장 감소를 확인한 그래프 및 사진이다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 Na+-K+ ATPase(ATP1A1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 STK11-돌연변이 암 치료용 약학적 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명에서는 인간 세포주와 조직 데이터의 유용성이 증가되고 있는 상황에서 다양한 데이터셋을 이용하여 암 치료법에 새로운 이해를 제공하는 돌연변이-특이적 암 특징을 분석함으로써, STK11-돌연변이 암 세포에서 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질 처리시 야생형 암 세포주에 비해 암 세포의 성장이 저해된다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
지금까지 알려져 있는 ATP1A1 시그널링 경로는 mTOR의 활성화, AICAR-유도 AMPK 활성화가 ATP1A1 활성의 감소를 촉진시킨다는 것, 미토겐 활성화 단백질(MAPK)의 활성화, 미토콘드리아 활성 산소종(ROS) 활성화 뿐만 아니라 포스포리파제 및 이노시톨 트리포스페이트(IP3) 수용체(IP3R)의 활성화 등을 들 수 있다.
본 발명은 STK11-돌연변이형 암에서 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질, 특히 ATP1A1에 특이적으로 결합하여 세포 내 칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 STK11-돌연변이 유래 암의 치료 타겟으로 확인하였다.
또한, 본 발명의 일실시예에서는 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질로 강심 배당체(Cardiac glycosides)를 처리하였을 때의 암세포 성장 저해 효과가 야생형 암 세포(STK11 단백질의 돌연변이가 나타나지 않은 암 세포)에 비해 STK11 돌연변이형 암 세포에서 현저하게 나타나는 것을 직접 확인하였다.
이에 더하여, 본 발명의 일실시예에서는 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질로 ATP1A1 siRNA를 처리하였을 때 ATP1A1 넉다운이 STK11-돌연변이된 암 세포주의 세포 증식을 저해시킨다는 것을 실험적으로 확인하였다.
상기 결과로부터 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질이 STK11 돌연변이 암 치료에 사용될 수 있음을 될 수 있음을 알 수 있다. 이는 또한 암(특히, STK11-돌연변이된 암)의 진행을 조절하기 위한 치료적 적용에 대한 가능성 있는 수단(route)을 제시한다. 또한, 본 발명은 STK11의 넉다운이 ATP1A1에 대한 유사한 효과로 나타남을 확인하였다. ATP1A1의 넉다운은 STK11 돌연변이체에서 세포 성장의 선택적 감소를 유도하였다. 이는 ATP1A1 발현이 정상적인 STK11 시그널링이 소실되었을 때, 세포의 성장에 중요하다는 것을 의미한다. 이에 더하여, 대부분의 ATP1A1 저해제들은 STK11 야생형 암 세포주보다 STK11 돌연변이 암 세포주에서 우수한 세포 성장 저해 활성을 나타냈다.
종합하면, 본 발명의 결과들은 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 이용한 새로운 치료법을 이용한 STK11 돌연변이형 암의 치료적 가능성을 제시한다. 따라서 본 발명의 접근법은 새로운 효과적 치료 방법에 대한 유용한 실마리를 제공할 수 있다.
이에, 본 발명의 실험결과에 기초하여, 본 발명은 Na+-K+ ATPase(ATP1A1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 STK11-돌연변이 암 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있으며, Na+-K+ ATPase(ATP1A1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 STK11-돌연변이 암 진단용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
STK11-돌연변이는 전립선암, 유방암, 대장암, 림프종, 흑색종, 폐암 등을 포함한 포괄적인 암에서 발견되었다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질, 특히 ATP1A1 펌프에 특이적으로 결합하여 ATP1A1에 칼륨이 결합하지 못하도록 경쟁적- 또는 비경쟁적으로 억제함으로써 ATP1A1의 세포 내 칼륨 수송 기능을 저해하는 역할을 하는 물질이 STK11-돌연변이 암의 성장을 특이적으로 저해시킴을 규명하였다. 가장 바람직하게는 상기 암 중 STK11-돌연변이의 발생 비율이 다른 암에 비해 높게 나타나는 폐암에서 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 이용하여 STK11-돌연변이 폐암을 치료하는 데 효과적으로 적용할 수 있음을 밝혀내었다.
본 발명의 ATP1A1 단백질은 인간에서 유래된 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있으나 이에 한정되지 않고 상기 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 포함할 수 있다.
폐암 세포주 계열에서 ATP1A1의 저해는 야생형 암 세포주가 아닌 STK11-돌연변이 암 세포주에서 세포 성장이 현저히 감소되는 것을 확인하고, ATP1A1가 STK11-돌연변이 암 세포주에서 세포의 생존 또는 증식에 중요한 역할을 하는 것임을 알아내었다. 이와 같은 결과는 ATP1A1이 STK11-돌연변이 암의 진행에 관여한다는 것을 시사하는 것이며, 따라서 ATP1A1 펌프의 기능을 억제하면 STK11-돌연변이 암 세포의 증식이 저해되고 이에 의해 STK11-돌연변이 암을 치료할 수 있음을 의미하는 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질은 강심 배당체(Cardiac glycosides) 또는 ATP1A1에 특이적으로 결합하는 물질로서, 상기 ATP1A1에 특이적으로 결합하는 물질은 ATP1A1 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 및 shRNA로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적 서열 내에서 mRNA와 RNA 간의 올리고머 헤테로이중체를 형성하는 올리고머를 의미한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적서열에 대해 완전하거나 또는 근사한 서열 상보성을 가지며, mRNA의 번역을 차단하거나 저해하고 스플라이싱 변이체를 생성하는 mRNA의 가공 과정을 변화시켜 표적유전자의 발현을 저해할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, ATP1A1 단백질의 발현을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 ATP1A1 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 올리고머일 수 있다.
상기 siRNA는 RNA 간섭 또는 유전자 침묵(gene silencing)을 매개할 수 있는 약 20개의 뉴클레오티드로 구성된 길이의 이중가닥 RNA를 의미하며, shRNA는 siRNA 표적 서열의 센스 및 안티센스 서열이 5개 내지 9개의 염기로 구성된 루프(loop)를 사이에 두고 위치한 짧은 헤어핀 구조의 RNA를 의미한다. siRNA나 shRNA는 상보적인 서열을 갖는 표적 mRNA에 특이적으로 결합하여 표적 유전자의 mRNA의 절단을 통해 RNA 간섭(RNAi: RNA interference)을 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 ATP1A1 단백질의 발현을 저해하는 siRNA 또는 shRNA는 ATP1A1을 코딩하는 유전자의 mRNA에 상보적인 서열로 구성될 수 있다.
siRNA를 제조하는 방법은 siRNA를 직접 화학적으로 합성하거나(Sui G et al, (2002) Proc Natl Acac Sci USA 99:5515-5520), 시험관 내(in vitro) 전사를 이용하여 합성하는 방법(Brummelkamp TR et al, (2002) Science 296:550-553)이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, shRNA는 siRNA의 고가의 합성비용, 낮은 형질감염 효율에 따른 RNA 간섭 효과의 짧은 지속시간 등을 극복하기 위해 이용되며, RNA 중합효소 III의 프로모터로부터 아데노바이러스, 렌티 바이러스, 및 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 세포 내로 도입하여 발현시킬 수 있다. shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 가공 효소(Dicer 또는 RNaseIII)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 표적 유전자의 침묵을 유도하는 것으로 알려져 있다.
또한, 상기 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질은 ATP1A1에 특이적으로 결합하여 펌프 기능을 특이적으로 저해하는 단일클론 항체 또는 다중클론 항체일 수 있다. 상기 항체는 ATP1A1 펌프에 특이적으로 결합하여 ATP1A1의 세포 내 칼륨 수송 기능을 효과적으로 저해할 수 있다. ATP1A1에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법에 의해 제조하거나, 또는 상업적으로 이용가능한 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 또한, ATP1A1에 결합하여 칼륨 펌프 기능을 저해하는 항체는, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 갖는 완전한 형태 외에도, 항체의 기능성 단편을 포함한다. 항체의 기능성 단편은 적어도 항원 결합기능을 보유하는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
이에 더하여, 상기 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질은 공지의 강심 배당체(Cardiac glycosides)일 수 있다. 상기 공지의 Cardiac glycosides는 ATP1A1의 펌프 기능을 억제하는 것으로 알려진 공지의 화합물, 천연물, 추출물, 생리활성물질 등일 수 있으며, 예를 들면, 디곡신(digoxin), 와베인(ouabain) 또는 디기톡신(digitoxin) 등일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
디곡신은 ATP1A1(Na+-K+ ATPase)의 알파-서브유닛의 세포외 측면 상의 사이트에 결합한다. 와베인은 식물로부터 분리된 것으로 특이적으로 나트륨 펌프를 블록킹하기 위해 시험관 내(in vitro) 연구에 있어서 과학자들에 의해 널리 사용되는 화합물이다. 디기톡신은 심장 배당체로서 디곡신과 유사한 구조 및 효과를 나타내나 디곡신보다 효과가 더 오래 유지된다. 상기와 같은 디곡신, 와베인 및 디기톡신은 직접적이고 특이적으로 ATP1A1을 저해하는 것으로 공지된 화합물들이다.
지금까지 알려진 이들 화합물의 연구에 있어서, 디곡신은 다양한 심장 상태의 치료에 널리 사용되어 왔다. 2008년 연구에서, 디곡신은 심장에 유익한 효과뿐만 아니라 특정 암 종의 위험을 줄일 수 있음을 제안하였다. 그러나 이 연구에서는 디곡신이 약물의 치료농도에서 암 위험을 줄이는 효과를 제안했을 뿐이다(Huafeng Zhang, et al., Digoxin and other cardiac glycosides inhibit HIF-1α synthesis and block tumor growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, vol. 105 no. 50, 19579-19586).
와베인과 관련하여서는, Cardiac glycosides인 와베인이 폐암에 유력한 치료 표적이며 폐암 세포의 침입을 지연시키는 것을 확인한 연구(NING LIU, et al., Inhibition of cell migration by ouabain in the A549 human lung cancer cell line, 2013, ONCOLOGY LETTERS 6: 175-479)와, 안드로겐 독립적인 전립선암에 있어서 심장 배당체의 치료 가능성 확인을 위해 와베인에 의한 세포독성 효과 뿐만 아니라 PC-3 세포의 신호 전달 경조를 조사한 연구(Yao-Ting Huang, et al., Investigation of ouabain-induced anticancer effect in human androgen-independent prostate cancer PC-3 cells, 2003, Biochemical Pharmacology 67, 727-733) 등이 있다.
디기톡신과 관련하여서는, 디기톡신과 그 유사체의 암세포에 대한 세포독성에 초점을 맞추고 디기톡신과 유사체가 강력한 화학요법 약물을 개발하는데 있어서의 약리학적 연구를 수행하여, 종래의 ATP1A1에서의 디기톡신의 영향에 있어서의 기전을 새로운 기전으로 정립한 연구가 있다(Hosan A Elbaz. et al., Digitoxin and its analogs as novel cancer therapeutics, 2012, Experimental Hematology & Oncology, 1:4).
그러나 이와 같은 Cardiac glycosides가 STK11-돌연변이 암에 특이적으로 세포성장을 저해함에 대한 연구들은 없었다.
본 발명의 약학적 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 유효성분을 0.0001 내지 50중량%로 포함하는 것이 바람직할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 약학적 조성물로 이용하기 위하여 약학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 국소 주입, 뇌실내 주입, 척수강 주입, 피하 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 바람직하게 본 발명에 따른 약학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-100 ㎎/㎏일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기로부터, 본 발명의 약학적 조성물은 STK-11 돌연변이 암을 치료하기 위한 항암제로서 제공될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물 또는 항암제를 STK-11 돌연변이 암의 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 STK-11 돌연변이 암을 치료하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 개체는 인간을 포함한 영장류, 가축(소, 말, 양, 닭, 돼지, 개, 토끼) 등일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
이에 더하여, ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 처리하여 정상대조군에 비해 세포성장이 저해되면 STK11-돌연변이 암으로 판정하는 단계를 포함하는 STK11-돌연변이 암의 진단방법을 제공할 수 있다.
나아가 본 발명은 시험관 내(in vitro)에서 STK11-돌연변이 암 세포 및 STK11-야생형 암 세포와 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 접촉시키는 단계, 상기 접촉 후 STK11-돌연변이 암 세포와 STK11-야생형 암 세포의 성장률을 비교하는 단계 및 STK11-돌연변이 암 세포의 성장을 특이적으로 저해하는 물질을 STK11-돌연변이 암 치료제로 선정하는 단계를 포함하는 STK11-돌연변이 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서, ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질은 STK11-돌연변이 암세포에서 STK11-야생형 암세포 대비 세포 증식을 저해하는 것으로 확인되었다. 또한, STK11-돌연변이 암세포에서 ATP1A1을 넉아웃 시키면 STK11-돌연변이 암세포의 증식이 저해되는 것으로 나타났다.
따라서, ATP1A1에 특이적으로 결합하여 ATP1A1 펌프의 기능을 억제하는 물질은 STK11-돌연변이 암세포의 증식을 저해하여 암 치료 효과를 발휘할 수 있으며, 이때, 상기 암은 전립선암, 유방암, 대장암, 흑색종 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 STK11-돌연변이 암 세포 및 STK11-야생형 암 세포와 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질(시험 물질)을 접촉시키는 단계는 시험 물질의 형질감염, 형질전환 또는 주입에 의해 수행될 수 있으며, 상기 시험 물질과의 접촉은 상기 세포의 성장을 유지할 수 있는 배지 중에서 이루어질 수 있다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, STK11-돌연변이 암 세포와 STK11-야생형 암 세포의 성장률을 비교하는 단계는 세포 수를 계수함으로써 수행될 수 있으며, 상기 계수는 눈으로 또는 화상 이미지로 촬영한 뒤 소프트웨어를 이용하여 계수하는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 스크리닝 방법에서 시험 물질의 처리 후 STK11-돌연변이 암 세포의 세포 성장률이 야생형 암 세포의 세포 성장률에 비해 저해되었을 경우, 상기 시험 물질은 ATP1A1 펌프 기능을 억제하여 STK11-돌연변이 암 치료를 위해 이용될 수 있는 물질로 선별될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
STK11 유전자형 특이적 화합물의 계층적 클러스터링(Hierarchical clusturing of genotype-specific compounds)
유전자형 특이적 화합물 감응의 패턴을 식별하기 위해, CLEA map 상의 GI50 프로파일 패턴을 사용하여 화합물들의 부분집합을 선택하였다.
우선, -logGI50 값 8(즉, GI50=0.01μM)은 화합물이 NCI60 패널에 있어서 어떤 세포주들에 대해 그 화합물이 민감한지 여부를 결정하는 bipartite cutoff로써 채택되었는데, 그 값이 8보다 크면 그 화합물이 민감한 것이고 8보다 작으면 그렇지 않은 것이다.
다음으로, CLEA 분석에 있어서 enrichment score(AUC 값)를 유전자형-특이적 화합물을 선택하기 위해 사용하였다.
AUC value > 80와 P value < 0.01 들이 화합물이 특정 유전자형에 대한 유의적인 감도를 갖는 가짐을 확인하기 위한 컷오프 값으로 사용되었다. 본 실시예에서는 NCI60 패널에 있어서 적어도 하나의 세포주에 대하여 강한 포텐시(즉, -logGI50값 8)를 보이는 화합물을 포함시켰다.
결과에 따라, 전술한 필터링을 만족한 총 3개의 비중복 화합물들이 컴파일링되었다. STK11 유전자형 카테고리에 대하여 이들 선택된 화합물들에 대해 계층적 클러스터링을 수행하여 이를 도 3a로 나타내었다. 본 실시예에서는 돌연변이 유전형에 기초하여 균일한 감도를 나타내는 세 개의 주요 화합물군을 규명하였다. 이러한 화합물 클러스터는 STK11 유전자에 있어서 유전적 돌연변이에 대해 민감하였다. 이러한 결과는 유사한 응용을 갖는 다양한 화합물들 사이의 거동의 메카니즘(mechamisms of action, MOA)을 이해하는 데 있어서의 직접적인 단서를 제공한다.
또한, 도 3b는 기존에 FDA 승인된 폐암(비소세포폐암; NSCLC) 치료제들보다 Cardiac glycosides이 STK11 돌연변이형 폐암에 더 높은 민감도를 나타냄을 보여주는 것이다.
화합물의 STK11 유전자형 의존성 감도(Genotype-dependent sensitivity of compounds)
도 3a로 도시한 클러스트들로부터, 세 개의 대표 화합물(ouabain, digoxin, digitoxin)을 선택하여 추가적으로 유전형 특이적 세포반응을 분석하였다.
STK11(LKB1)은 도 2a로 도시한 유전적 변이 양상으로부터, 비소세포성폐암(NSCLC) 환자 조직에서 다른 주요 유전자 돌연변이와는 뚜렷하게 구분되는 발생 양상을 나타내어 STK11 돌연변이형 폐암 환자군 특이적인 항암 약물 개발의 필요성을 보인다. 또한, 도 2b로 도시한 암의 진행 단계 별 STK11 돌연변이의 변이 비율 그래프로부터, 폐암이 진행될수록 STK11 돌연변이의 발생 비율이 증가하는 양상을 확인하였다. 그러나 현재 폐암에서는, ALK, BRAF, EGFR 등의 유전자 돌연변이에 대한 항암 약물들이 임상적으로 활발히 시도되고 있으나, 분별적으로 높은 빈도를 보이는 STK11 돌연변이에 대한 타겟 항암제 개발은 보고된 바 없다. 따라서, STK11-돌연변이 폐암에 대해 특이적인 치료효과를 나타내는 약학적 조성물 개발이 필요함을 제안한다.
또한, STK11은 central 신진대사 센서인 AMPK를 직접적으로 인산화하고 활성화하는 세린-트레오닌 키나제를 인코딩한다. AMPK는 간, 근육과 지방 조직같은, 전문적인 대사 조직에 있어서 지질, 콜레스테롤 및 글루코오스 대사를 조절한다. STK11단백질은 암을 초래하는 생물학적으로 중요한 두 가지 경로에 참여하고 있다. 첫째는, STK11은 편광된 상피세포를 유지하는 것을 돕고, 둘째로는 STK11은 세포에너지 균형을 제어하는 AMPK를 활성화한다. STK11 기능으로써의 이러한 통찰은 AMPK 활성의 조절을 통해 새로운 치료전략의 타겟이 될 수 있다는 것을 암시함을 제안한다.
본 실시예에서는 도 3a로 나타낸 것과 같이, ouabain, digoxin 및 digitoxin은 STK11 돌연변이와 연관된 클러스터에서 확인되었고, STK11 돌연변이 잠복의 6개 세포주에서 이들 화합물들이 비교적 높은 감도를 나타내었다.
STK11 돌연변이 잠복의 6개 세포주는 다음 표 1과 같다.
MOLT-4 Leukemia CDKN2A: NOTCH1: NRAS: PTEN: TP53: STK11: CDKN2A
A549 Lung CDKN2A: KRAS: STK11
NCI-H460 Lung CDKN2A: KRAS: PIK3CA: STK11: c-MYC-Amp
NCI-H23 Lung KRAS: STK11: TP53: PTEN: CTNNB1
SK-MEL-5 Melanoma BRAF: CDKN2A: STK11
DU-145 Prostate CDKN2A: MLH1: RB1: STK11: TP53
한편, 도 4는 도 1로 나타낸 것과 같은 각각의 구조를 갖는 화합물들(ouabain, digoxin, digitoxin)의 야생형 세포주 대비 돌연변이 세포주들의 enrichment를 -logGI50 watarfall plot으로써 나타낸 것(각각의 화합물에 대응하여, 도 4a, 도 4b, 도 4c)이다.
도 3 내지 4의 결과로부터 3가지의 Cardiac glycosides 약물들 모두가 STK11 특이적 감응을 명확히 나타냄을 확인하였다.
이로써, Cardiac glycosides 약물들은 STK11-돌연변이 의존적 활성을 갖는 것으로 정의할 수 있다.
Cardiac glycosides의 처리에 따른 STK11 돌연변이 폐암 세포 특이 성장저해효과 분석
(1) 세포주 배양
NCI-60 폐암세포주(NCI-H460, A549, NCI-H322M 및 NCI-H226)는 미국국립암센터(NCI DTP)로부터 입수하였다. 모든 세포는 10% FBS(GIBCO) 및 페니실린/스트렙트아비딘(GIBCO)이 첨가된 RPMI 배지(GIBCO)에서 성장시키고 5% CO2에서 가습된 대기에서 37℃로 유지하였다.
(2) 세포 생존능 분석
도 1로 도시한 것과 같은 구조를 갖는 총 3개의 Cardiac glycosides(chemicals)를 폐암 세포주에 대해 스크리닝하였다. 디곡신(digoxin), 와베인(ouabain) 및 디기톡신(digitoxin)은 각각 Sigma사로부터 구입하였다.
세포는 웰 당 3일 배양을 위해 2,000 세포, 7일 배양을 위해 1,000 세포, 14일 배양을 위해 200세포의 밀도로 96웰 플레이트에 씨딩하였다. 씨딩 24시간 후, 세포를 0.05 μM Digitoxin 및 0.02 μM Ouabain 농도(working concentration)로 희석된 화학제(chemicals)로 처리하였다. 세포는 다시 72시간(3일), 7일, 14일 동안 배양한 후 CellTiterBlue 분석키트를 이용하여 생존율을 측정하였다.
Cardiac glycosides인 Digoxin, Digitoxin 및 Ouabain을 농도를 달리하면서 4종의 STK11-돌연변이 폐암 세포주(A549, H460, H1993, H1395) 및 4종의 STK11-야생형 폐암 세포주(H226, H322M, H82, H524)에 처리(72시간)하여 세포 성장 저해를 확인하여 이를 각각 도 5a에 나타내었다.
도 5a의 결과로부터 각각의 화합물에 대해 감응하는 감도는 STK11-돌연변이 폐암세포주가 STK11-야생형 폐암세포주 대비 높음을 알 수 있다.
이에, 96 well plate를 이용하여, Digoxin, Digitoxin 및 Ouabain의 처리에 따른 세포성장 저해를 확인하였다. 이때, 폐암세포주로는 STK11-돌연변이 세포주(A549)와 STK11를 야생형으로 회복시킨 세포주(A549-STK11)를 각각 사용하였다.
도 5b는 상기 세포주들에 대하여 Digoxin, Digitoxin 및 Ouabain을 각각 처리하여 세포 성장 저해를 확인(TiterBlue)한 결과 그래프로, STK11-돌연변이 세포주와 대비하여 STK11이 회복된 세포주의 경우 처리 화합물들에 대해 내성을 얻었음을 확인할 수 있었다.
또한, 도 6은 Cardiac glycosides들의 장시간 처리에 따른 STK11-돌연변이 세포주(A549)와 STK11를 야생형으로 회복시킨 세포주(A549-STK11)간의 생장 변화량 차이를 나타낸다.
도 6에서, Cardiac glycosides들의 장시간 처리 (3일, 7일, 14일)에 따라 STK11을 야생형으로 회복시킨 세포주 대비 돌연변이형 세포주에 대한 성장 억제 효과가 증가하는 양상을 확인하였다. 따라서 효과적인 약제를 이용한 ATP1A1 저해는 STK11 돌연변이를 포함하는 환자 종양의 효능이 있는 처치를 제공할 수 있다.
이러한 결과들은 Digoxin, Digitoxin이나 Ouabain이 STK11 돌연변이 암에 특이적으로 성장을 저해한다는 것을 보여주는 결과라 할 수 있다.
ATP1A1 넉다운에 따른 STK11 돌연변이 폐암 특이 세포 성장저해효과 분석
(1) siRNA 트랜스펙션
siRNA 트랜스펙션을 위해, 웰 당 3,000 세포를 96웰 플레이트에 플레이팅하였다. 24시간 동안 부착시킨 후, 타겟 siRNA(ATP1A1: 1009769 ; Bioneer, STK11: L-005035-00, Non targeting: D-001810-10 ;Dharmacon)를 CO2 인큐베이터에서 37℃로 6시간 동안 트랜스펙션 배지(GIBCO)에 첨가하였다. 트랜스펙션 후, 세포에 FBS를 포함하는 RPMI를 보충하고 수집과 72시간까지 37℃ 5% CO2에서 배양하였다.
(2) 폐암에서 STK11-돌연변이와 ATP1A1 발현의 상관관계 분석
도 7a 는 4종의 폐암 세포주에 대하여 ATP1A1 siRNA를 처리(72시간)하여 얻어진 세포 생존(viability)을 평가한 결과들로, Titer Blue결과이다.
도 7a 의 결과로부터, ATP1A1 siRNA 처리에 의해 STK11-야생형 폐암세포주인 H226 및 H322과 대비하여 STK11 돌연변이 폐암 세포주인 A549 및 H460의 성장이 현저히 저해됨을 확인할 수 있다. 즉, 폐암 세포주 계열에서 ATP1A1을 넉다운시키는 경우, 세포 성장은 STK11-야생형 세포주가 아닌 STK11-돌연변이 세포주에서 현저히 감소되었다. 그리고 도 7b는 STK11-돌연변이 폐암 세포주인 A549 및 H460에서 야생형 STK11을 발현시킨 결과로서, ATP1A1의 넉다운으로 인한 세포 성장의 감소가 덜 나타남을 알 수 있다.
따라서 ATP1A1은 STK11-돌연변이된 폐암 세포주에서 암 생존 또는 증식에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다.
다음으로, 도 8은 야생형 STK11를 갖는 두 개의 폐암 세포주에 대하여 ATP1A1 및 STK11를 모두 넉다운(72시간)시켜 얻어진 세포 성장 저해 결과로, STK11-야생형 폐암 세포주에서 ATP1A1과 STK11을 모두 넉다운시키는 경우 각각만을 넉다운시키는 경우와 대비하여 상승적으로 세포 성장을 저해함을 확인할 수 있었다.
Cardiac glycosides의 STK11-돌연변이형 특이적 세포이동 및 세포분열 억제 효과
STK11-돌연변이 폐암 세포주인 A549 및 H460 (STK11 mutant)와 STK11를 야생형으로 회복시킨 세포주 A549-STK11 및 H460-STK11 (STK11 restored)에 대하여, Cardiac glycosides인 Digoxin, Digitoxin 또는 Ouabain을 처리하여 세포이동(cell migration)과 세포분열(cell division)에 대한 효과를 평가하였다.
세포이동 분석을 위해, 12 μm의 공극사이즈인 필터가 든 Transwell 세포배양기(Costar 3422, Cambridge, MA)를 사용하였다. 보다 상세하게는, 세포 부유액(5×104 cells/500 μl culture medium)을 상부에 첨가하고 Cardiac glycosides를 처리한 다음, 24시간 후 하부의 바닥에 이동된 세포수를 위상차현미경(phase-contrast microscope)을 이용하여 100x확대율로 10 random fields에서 계수하였다. 또한, 세포분열 분석은 BrdU 분석법을 이용하였다. 보다 상세하게는, 96-well plate에 well당 2,500의 밀도로 세포를 접종하고, 24시간 후 Cardiac glycosides를 처리(Digoxin 100nM, Digitoxin 50nM, Ouabain 50 nM)하여 다시 24시간을 배양한 다음, BrdU(Bromodeoxyuridine)로 2시간동안 라벨링하였다. 그리고 ELISA 리더기(Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric), Roche)로 검출함으로써 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 9a의 세포이동 및 도 9b의 세포분열에 대한 분석 결과에서 확인되는 바와 같이, STK11-돌연변이 폐암세포주에 Cardiac glycosides를 처리함으로써 세포이동 및 분열이 현저하게 감소되는 것을 알 수 있다. 상기 결과는 Cardiac glycosides가 STK11-돌연변이 폐암세포의 이동 및 분열을 억제한다는 것을 의미한다.
동물모델에서 Cardiac glycosides의 STK11-돌연변이 특이적 항암 효과
ATP1A1 저해제가 STK11-돌연변이 폐암에서 전임상적 효과를 가지는지 알아보기 위해, A549 폐암세포주 또는 STK11를 야생형으로 회복시킨 세포주 (A549-LKB1wt)를 이식한 동물모델(mouse tumor xenograft model)을 이용하여 실험을 행하였다. 동물모델은, 무흉선 누드마우스(Oriental Bio Inc)를 구입하여 가톨릭대학교-동물실험 관련 위원회(Catholic University of Korea- Institutional Animal Care and Use Committee; CUK-IACUC)의 표준 가이드라인에 따라 준비하였다. 동물모델은 A549 또는 A549-LKB1wt를 각각 피하주입(3X106)하였으며, 다음과 같이 세 개의 그룹으로 나누었다: (1) 무처리 대조군(n = 10); (2) digoxin 60 ng/kg of body weight 처리군(n = 10); (3) digoxin 180 ng/kg of body weight 처리군(n = 10). Digoxin 또는 vehicle (1.9% DMSO/10% polyethyleneglycol 400/1X PBS: total volume 200ul)은 일주일에 3번씩 5주 동안 경구투여하였으며, 종양 크기는 다음의 식을 통해 각 종양 베이스의 2 직경을 측정하여 계산하였다: 종양 크기 (mm3) = (length × width × height × 0.52). 또한, 종양 크기가 1 cm3에 도달할 때까지 모니터한 후, 동물을 희생시켜 종양을 추출하였다.
도 10a는 Cardiac glycosides인 digoxin의 경구투여가 시간에 의존적으로 A549 세포주가 주입된 동물모델에서 종양의 성장을 저하시킴을 나타내는 결과이고, 도 10b는 STK11를 야생형으로 회복시킨 세포주가 주입된 동물모델에서는 상기와 같은 효과가 나타나지 않음을 확인할 수 있는 결과이다.
이에, STK11-돌연변이형 및 STK11이 회복된 경우(야생형 STK11)에서 종양 크기 변화를 비교분석하였으며, 도 10c, 도 10d 및 도 10e에 나타낸 바와 같이, 야생형 STK11 발현 세포가 주입된 동물모델에 비해 STK11-돌연변이 세포가 주입된 동물모델에서 digoxin의 처리에 의해 종양 성장이 선택적으로 감소함을 알 수 있다. 흥미롭게도 Cardiac glycosides에 대한 선택적인 민감성은 높은 약물량[180 ng/ind. (9 μg/kg)] 보다 낮은 약물량[60 ng/ind. (3 μg/kg)]의 처리 시 현저하게 나타났으며, 기존 임상에서 사용되는 digoxin의 처방 농도가 성인 평균 250mcg/day인 반면, STK11-돌연변이형 폐암에 처방 가능한 기대 농도는 성인 평균 180mcg/day 이하로 매우 낮다는 것을 알 수 있다.
상기 결과는 Cardiac glycosides가 STK11-돌연변이 폐암에 특이적으로 전임상적 항암효과를 나타낸다는 것을 의미한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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Val Val Leu Ser Ala Val Val Ile Ile Thr Gly 130 135 140 Cys Phe Ser Tyr Tyr Gln Glu Ala Lys Ser Ser Lys Ile Met Glu Ser 145 150 155 160 Phe Lys Asn Met Val Pro Gln Gln Ala Leu Val Ile Arg Asn Gly Glu 165 170 175 Lys Met Ser Ile Asn Ala Glu Glu Val Val Val Gly Asp Leu Val Glu 180 185 190 Val Lys Gly Gly Asp Arg Ile Pro Ala Asp Leu Arg Ile Ile Ser Ala 195 200 205 Asn Gly Cys Lys Val Asp Asn Ser Ser Leu Thr Gly Glu Ser Glu Pro 210 215 220 Gln Thr Arg Ser Pro Asp Phe Thr Asn Glu Asn Pro Leu Glu Thr Arg 225 230 235 240 Asn Ile Ala Phe Phe Ser Thr Asn Cys Val Glu Gly Thr Ala Arg Gly 245 250 255 Ile Val Val Tyr Thr Gly Asp Arg Thr Val Met Gly Arg Ile Ala Thr 260 265 270 Leu Ala Ser Gly Leu Glu Gly Gly Gln Thr Pro Ile Ala Ala Glu Ile 275 280 285 Glu His Phe Ile His Ile Ile Thr Gly Val Ala Val Phe Leu Gly Val 290 295 300 Ser Phe Phe Ile Leu Ser Leu Ile Leu Glu Tyr Thr Trp Leu Glu Ala 305 310 315 320 Val Ile Phe Leu Ile Gly Ile Ile Val Ala Asn Val Pro Glu Gly Leu 325 330 335 Leu Ala Thr Val Thr Val Cys Leu Thr Leu Thr Ala Lys Arg Met Ala 340 345 350 Arg Lys Asn Cys Leu Val Lys Asn Leu Glu Ala Val Glu Thr Leu Gly 355 360 365 Ser Thr Ser Thr Ile Cys Ser Asp Lys Thr Gly Thr Leu Thr Gln Asn 370 375 380 Arg Met Thr Val Ala His Met Trp Phe Asp Asn Gln Ile His Glu Ala 385 390 395 400 Asp Thr Thr Glu Asn Gln Ser Gly Val Ser Phe Asp Lys Thr Ser Ala 405 410 415 Thr Trp Leu Ala Leu Ser Arg Ile Ala Gly Leu Cys Asn Arg Ala Val 420 425 430 Phe Gln Ala Asn Gln Glu Asn Leu Pro Ile Leu Lys Arg Ala Val Ala 435 440 445 Gly Asp Ala Ser Glu Ser Ala Leu Leu Lys Cys Ile Glu Leu Cys Cys 450 455 460 Gly Ser Val Lys Glu Met Arg Glu Arg Tyr Ala Lys Ile Val Glu Ile 465 470 475 480 Pro Phe Asn Ser Thr Asn Lys Tyr Gln Leu Ser Ile His Lys Asn Pro 485 490 495 Asn Thr Ser Glu Pro Gln His Leu Leu Val Met Lys Gly Ala Pro Glu 500 505 510 Arg Ile Leu Asp Arg Cys Ser Ser Ile Leu Leu His Gly Lys Glu Gln 515 520 525 Pro Leu Asp Glu Glu Leu Lys Asp Ala Phe Gln Asn Ala Tyr Leu Glu 530 535 540 Leu Gly Gly Leu Gly Glu Arg Val Leu Gly Phe Cys His Leu Phe Leu 545 550 555 560 Pro Asp Glu Gln Phe Pro Glu Gly Phe Gln Phe Asp Thr Asp Asp Val 565 570 575 Asn Phe Pro Ile Asp Asn Leu Cys Phe Val Gly Leu Ile Ser Met Ile 580 585 590 Asp Pro Pro Arg Ala Ala Val Pro Asp Ala Val Gly Lys Cys Arg Ser 595 600 605 Ala Gly Ile Lys Val Ile Met Val Thr Gly Asp His Pro Ile Thr Ala 610 615 620 Lys Ala Ile Ala Lys Gly Val Gly Ile Ile Ser Glu Gly Asn Glu Thr 625 630 635 640 Val Glu Asp Ile Ala Ala Arg Leu Asn Ile Pro Val Ser Gln Val Asn 645 650 655 Pro Arg Asp Ala Lys Ala Cys Val Val His Gly Ser Asp Leu Lys Asp 660 665 670 Met Thr Ser Glu Gln Leu Asp Asp Ile Leu Lys Tyr His Thr Glu Ile 675 680 685 Val Phe Ala Arg Thr Ser Pro Gln Gln Lys Leu Ile Ile Val Glu Gly 690 695 700 Cys Gln Arg Gln Gly Ala Ile Val Ala Val Thr Gly Asp Gly Val Asn 705 710 715 720 Asp Ser Pro Ala Leu Lys Lys Ala Asp Ile Gly Val Ala Met Gly Ile 725 730 735 Ala Gly Ser Asp Val Ser Lys Gln Ala Ala Asp Met Ile Leu Leu Asp 740 745 750 Asp Asn Phe Ala Ser Ile Val Thr Gly Val Glu Glu Gly Arg Leu Ile 755 760 765 Phe Asp Asn Leu Lys Lys Ser Ile Ala Tyr Thr Leu Thr Ser Asn Ile 770 775 780 Pro Glu Ile Thr Pro Phe Leu Ile Phe Ile Ile Ala Asn Ile Pro Leu 785 790 795 800 Pro Leu Gly Thr Val Thr Ile Leu Cys Ile Asp Leu Gly Thr Asp Met 805 810 815 Val Pro Ala Ile Ser Leu Ala Tyr Glu Gln Ala Glu Ser Asp Ile Met 820 825 830 Lys Arg Gln Pro Arg Asn Pro Lys Thr Asp Lys Leu Val Asn Glu Arg 835 840 845 Leu Ile Ser Met Ala Tyr Gly Gln Ile Gly Met Ile Gln Ala Leu Gly 850 855 860 Gly Phe Phe Thr Tyr Phe Val Ile Leu Ala Glu Asn Gly Phe Leu Pro 865 870 875 880 Ile His Leu Leu Gly Leu Arg Val Asp Trp Asp Asp Arg Trp Ile Asn 885 890 895 Asp Val Glu Asp Ser Tyr Gly Gln Gln Trp Thr Tyr Glu Gln Arg Lys 900 905 910 Ile Val Glu Phe Thr Cys His Thr Ala Phe Phe Val Ser Ile Val Val 915 920 925 Val Gln Trp Ala Asp Leu Val Ile Cys Lys Thr Arg Arg Asn Ser Val 930 935 940 Phe Gln Gln Gly Met Lys Asn Lys Ile Leu Ile Phe Gly Leu Phe Glu 945 950 955 960 Glu Thr Ala Leu Ala Ala Phe Leu Ser Tyr Cys Pro Gly Met Gly Val 965 970 975 Ala Leu Arg Met Tyr Pro Leu Lys Pro Thr Trp Trp Phe Cys Ala Phe 980 985 990 Pro Tyr Ser Leu Leu Ile Phe Val Tyr Asp Glu Val Arg Lys Leu Ile 995 1000 1005 Ile Arg Arg Arg Pro Gly Gly Trp Val Glu Lys Glu Thr Tyr Tyr 1010 1015 1020

Claims (13)

  1. Na+-K+ ATPase(ATP1A1, Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는, STK11(Serine/threonine kinase 11)-돌연변이 암 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 Na+-K+ ATPase 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질은 강심 배당체(Cardiac glycosides) 또는 Na+-K+ ATPase에 특이적으로 결합하는 물질이고,
    상기 강심배당체는 디곡신(digoxin), 와베인(ouabain) 및 디기톡신(digitoxin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 Na+-K+ ATPase에 특이적으로 결합하는 물질은 siRNA인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 암은 전립선암, 유방암, 대장암, 흑색종 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 Na+-K+ ATPase은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. Na+-K+ ATPase(ATP1A1, Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는, STK11(Serine/threonine kinase 11)-돌연변이 암 진단용 조성물로서,
    상기 Na+-K+ ATPase 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질은 강심 배당체(Cardiac glycosides) 또는 Na+-K+ ATPase에 특이적으로 결합하는 물질이고,
    상기 강심배당체는 디곡신(digoxin), 와베인(ouabain) 및 디기톡신(digitoxin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 Na+-K+ ATPase에 특이적으로 결합하는 물질은 siRNA인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  9. 하기 단계를 포함하는 STK11(Serine/threonine kinase 11)-돌연변이 암의 진단을 위한 정보제공방법으로서,
    상기 Na+-K+ ATPase 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질은 강심 배당체(Cardiac glycosides) 또는 Na+-K+ ATPase에 특이적으로 결합하는 물질이고,
    상기 강심배당체는 디곡신(digoxin), 와베인(ouabain) 및 디기톡신(digitoxin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 Na+-K+ ATPase에 특이적으로 결합하는 물질은 siRNA인 것을 특징으로 하는, 방법:
    (1) 피검체 유래 생물학적 시료로부터 세포를 분리하는 단계;
    (2) 상기 세포와 Na+-K+ ATPase (ATP1A1, Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 접촉시키는 단계; 및
    (3) 상기 세포의 성장이 무처리군에 비해 저해되면 STK11-돌연변이 암일 가능성이 높은 것으로 판정하는 단계.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 (1) 단계의 생물학적 시료는 혈액, 피부 세포, 점막 세포, 소변, 및 모발로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 암은 전립선암, 유방암, 대장암, 흑색종 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  12. 하기 단계를 포함하는 STK11(Serine/threonine kinase 11)-돌연변이 암 치료제의 스크리닝 방법으로서,
    상기 Na+-K+ ATPase 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질은 강심 배당체(Cardiac glycosides) 또는 Na+-K+ ATPase에 특이적으로 결합하는 물질이고,
    상기 강심배당체는 디곡신(digoxin), 와베인(ouabain) 및 디기톡신(digitoxin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 Na+-K+ ATPase에 특이적으로 결합하는 물질은 siRNA인 것을 특징으로 하는, 방법:
    a) STK11-돌연변이 암 세포 및 STK11-야생형 암 세포와 Na+-K+ ATPase (ATP1A1, Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 접촉시키는 단계;
    b) 상기 접촉 후 STK11-돌연변이 암 세포와 STK11-야생형 암 세포의 성장률을 비교하는 단계; 및
    c) STK11-돌연변이 암 세포의 성장을 저해하는 물질을 STK11-돌연변이 암 치료제로 선정하는 단계.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 암은 전립선암, 유방암, 대장암, 흑색종 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
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