CN101918035A - 在对抗癌剂有抗性的癌中具有抗癌剂增强活性的癌细胞死亡诱导剂 - Google Patents
在对抗癌剂有抗性的癌中具有抗癌剂增强活性的癌细胞死亡诱导剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了能够在获得对抗癌剂的抗性的癌中恢复癌细胞对该抗癌剂的敏感性并且诱导癌细胞的细胞死亡的物质。特别是公开了用于对抗癌剂具有抗性的癌细胞的癌细胞死亡诱导剂，该诱导剂包含REIC/Dkk-3的DNA作为活性成分，并且具有抗癌剂增强活性。
Description
技术领域
本发明涉及用于治疗抗癌药物抗性癌的药物组合物。
背景技术
影响癌细胞对抗癌药物的敏感性和/或抗性的因素为在例如以下方面的变化：此类药物排出细胞外的机制、药物代谢、DNA修复、PI3K-Akt途径和凋亡途径。具体地，已知在许多抗癌药物抗性癌细胞中，抗癌药物的累积降低，而可积极将广泛的抗癌药物泵出细胞外的P-糖蛋白、或多药(抗癌药物)抗性相关蛋白MRP1的表达在细胞膜中增加。已经报道了传统技术的几个实例，例如将编码减弱P-糖蛋白表达的基因在体外导入抗癌药物抗性癌细胞，以减弱该细胞的抗癌药物抗性(Masuda Y.等，Cancer Chemother Pharmacol.1998；42(1)：9-16；Wang FS.等，Hum GeneTher.1999年5月1日；10(7)：1185-95；Yague E.等，Gene Ther.2004年7月；11(14)：1170-4)。然而，此处报道的实例为体外实验的结果，体内有用性从未使用动物证明。另外，即使在上述报道后，也从未报道对该效果的体内确认。
同时，已知REIC/Dkk-3基因为细胞无限增殖相关基因。已经报道该基因的表达在癌细胞中受到抑制(国际专利公开WO01/038523小册子；Tsuji，T.等，BiochemBiophys Res Commun 268，20-4(2000)；Tsuji，T.等，BiochemBiophys Res Commun 289，257-63(2001)；Nozaki，I.等，Int J Oncol 19，117-21(2001)；Kurose，K.等，J Urol 171，1314-8(2004))。
REIC/Dkk-3基因为Dkk家族的成员，并且已经提出其经由Wnt受体抑制Wnt信号转导(Bafico，A.等，Nat Cell Biol 3，683-6(2001)；Hoang，B.H.等，Cancer Res 64，2734-9(2004))。已经报道Wnt基因在诸如细胞生长、分化和癌变等重要的生物学事件中起着多重作用(Moon，R.T.等，Science 296，1644-6(2002))。因此，Dkk家族(其中4种基因目前在人类中已知)在细胞生长、分化和癌变中可能相似地负责重要功能，但其大多数成员仍然未被阐明。
专利文献1国际专利公开WO01/038523小册子
非专利文献1 Masuda Y.等，Cancer chemother Pharmacol.1998；42(1)：9-16
非专利文献2 Wang FS.等，Hum Gene Ther.1999年5月1日；10(7)：1185-95
非专利文献3 Yague E.等，Gene Ther.2004年7月；11(14)：1170-4
非专利文献4 Tsuji，T.等，BiochemBiophys Res Commun 268，20-4(2000)
非专利文献5 Tsuji，T.等，BiochemBiophys Res Commun 289，257-63(2001)
非专利文献6 Nozaki，I.等，Int J Oncol 19，117-21(2001)
非专利文献7 Kurose，K.等，J Urol 171，1314-8(2004)
非专利文献8 Bafico，A.等，Nat Cell Biol 3，683-6(2001)
非专利文献9 Hoang，B.H.等，Cancer Res 64，2734-9(2004)
非专利文献10 Moon，R.T.等，Science 296，1644-6(2002)
发明内容
本发明的目的在于提供在具有获得性抗癌药物抗性的癌的癌细胞中引起癌细胞恢复抗癌药物敏感性和诱导细胞死亡的药物。
如上所述，从未报道过可编码减弱P-糖蛋白表达的基因会减弱体内抗癌药物抗性。这强烈地表明，尚未在能够从体外结果预期的水平上在体内确认抗癌药物敏感性恢复的效果和当组合使用抗癌药物时肿瘤缩小的效果。
本发明人将Ad-REIC(通过将REIC/Dkk-3DNA导入腺病毒载体而制备)施用至对抗癌药物多柔比星(doxorubicin)(阿霉素(adriamycin))具有抗性的癌细胞。这样，本发明人发现恢复了癌细胞对抗癌药物的敏感性并且诱导了癌细胞的细胞死亡(凋亡)。该发现证明Ad-REIC具有引起癌细胞恢复对抗癌药物的敏感性的效果；即，增强抗癌药物的作用并进而诱导癌中的细胞死亡。
因此，基于通过使用腺病毒载体实现的基因转移效率的优越性而对强抗癌药物抗性的消除和诱导癌细胞死亡的效果，因而在抗癌药物抗性癌中具有抗癌药物增强作用的癌细胞死亡诱导剂预期可在体内动物模型中恢复抗癌药物敏感性，和/或当与抗癌药物组合使用时在体内动物模型中发挥肿瘤缩小效果。
本发明包括以下实施方式。
[1]一种对具有抗癌药物抗性的癌细胞具有抗癌药物增强作用的癌细胞死亡诱导剂，该癌细胞死亡诱导剂包含以下REIC/Dkk-3 DNA作为活性成分：
(a)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成的DNA；
(b)在严谨条件下与由和SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的DNA杂交，并且编码具有细胞死亡诱导活性的蛋白质的DNA；
(c)由从SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第1位核苷酸开始，并且在第117位核苷酸～234位核苷酸之间的任一核苷酸处终止的核苷酸序列组成的多核苷酸；或
(d)在严谨条件下与由和从SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第1位核苷酸开始并且在第117位核苷酸～234位核苷酸之间的任一核苷酸处终止的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，并且具有细胞死亡诱导活性的多核苷酸。
[2]一种对具有抗癌药物抗性的癌细胞具有抗癌药物增强作用的癌细胞死亡诱导剂，该癌细胞死亡诱导剂包含含有以下REIC/Dkk-3 DNA的载体作为活性成分：
(a)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成的DNA；
(b)在严谨条件下与由和SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的DNA杂交，并且编码具有细胞死亡诱导活性的蛋白质的DNA；
(c)由从SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第1位核苷酸开始，并且在第117位核苷酸～234位核苷酸之间的任一核苷酸处终止的核苷酸序列组成的多核苷酸；或
(d)在严谨条件下与由和从SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第1位核苷酸开始并且在第117位核苷酸～234位核苷酸之间的任一核苷酸处终止的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，并且编码具有细胞死亡诱导活性的多肽的多核苷酸。
[3]根据[2]所述的具有抗癌药物增强作用的癌细胞死亡诱导剂，其中所述载体为腺病毒载体。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的具有抗癌药物增强作用的癌细胞死亡诱导剂，其中所述抗癌药物为抗癌抗生素。
[5]用于对抗癌药物有抗性的癌的癌症治疗药物，该癌症治疗药物包含根据[1]～[4]中任一项所述的具有抗癌药物增强作用的癌细胞死亡诱导剂。
[6]用于对以上抗癌药物有抗性的癌的癌症治疗药物，其为包括抗癌药物和根据[1]～[4]中任一项所述的癌细胞死亡诱导剂的试剂盒。
[7]根据[6]所述的用于对抗癌药物有抗性的癌的癌症治疗药物，其中所述抗癌药物为抗癌抗生素。
[8]以下REIC/Dkk-3 DNA或包含所述DNA的载体在用于对抗癌药物有抗性的癌的癌症治疗药物制备中的应用：
(a)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成的DNA；
(b)在严谨条件下与由和SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的DNA杂交，并且编码具有细胞死亡诱导活性的蛋白质的DNA；
(c)由从SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第1位核苷酸开始，并且在第117位核苷酸～234位核苷酸之间的任一核苷酸处终止的核苷酸序列组成的多核苷酸；或
(d)在严谨条件下与由和从SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第1位核苷酸开始并且在117位核苷酸～234位核苷酸之间的任一核苷酸处终止的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，并且编码具有细胞死亡诱导活性的多肽的多核苷酸。
[9]根据[8]所述的应用，其中所述载体为腺病毒载体。
[10]根据[8]或[9]所述的应用，其中所述抗癌药物为抗癌抗生素。
[11]在用于对抗癌药物有抗性的癌的利用癌症治疗药物的治疗中使用的REIC/Dkk-3 DNA，所述REIC/Dkk-3 DNA为：
(a)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成的DNA；
(b)在严谨条件下与由和SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的DNA杂交，并且编码具有细胞死亡诱导活性的蛋白质的DNA；
(c)由从SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第1位核苷酸开始，并且在第117位核苷酸～234位核苷酸之间的任一核苷酸处终止的核苷酸序列组成的多核苷酸；或
(d)在严谨条件下与由和从SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第1位核苷酸开始并且在117位核苷酸～234位核苷酸之间的任一核苷酸处终止的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，并且编码具有细胞死亡诱导活性的多肽的多核苷酸。
[12]根据[11]所述的REIC/Dkk-3 DNA，其中载体为腺病毒载体。
[13]根据[11]或[12]所述的REIC/Dkk-3 DNA，其中所述抗癌药物为抗癌抗生素。
[14]在用于对抗癌药物有抗性的癌的利用癌症治疗药物的治疗中使用的包含以下REIC/Dkk-3 DNA的载体：
(a)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成的DNA；
(b)在严谨条件下与由和SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的DNA杂交，并且编码具有细胞死亡诱导活性的蛋白质的DNA；
(c)由从SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第1位核苷酸开始，并且在第117位核苷酸～234位核苷酸之间的任一核苷酸处终止的核苷酸序列组成的多核苷酸；或
(d)在严谨条件下与由和从SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第1位核苷酸开始并且在117位核苷酸～234位核苷酸之间的任一核苷酸处终止的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，并且编码具有细胞死亡诱导活性的多肽的多核苷酸。
[15]包含根据[11]所述的REIC/Dkk-3 DNA的载体，其为腺病毒载体。
[16]包含根据[11]或[12]所述的REIC/Dkk-3 DNA的载体，其中所述抗癌药物为抗癌抗生素。
[17]一种用于对抗癌药物有抗性的癌的癌症治疗药物试剂盒，该癌症治疗药物试剂盒包含以下REIC/Dkk-3 DNA或包含所述DNA的载体和抗癌药物：
(a)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成的DNA；
(b)在严谨条件下与由和SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的DNA杂交，并且编码具有细胞死亡诱导活性的蛋白质的DNA；
(c)由从SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第1位核苷酸开始，并且在第117位核苷酸～234位核苷酸之间的任一核苷酸处终止的核苷酸序列组成的多核苷酸；或
(d)在严谨条件下与由和从SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第1位核苷酸开始并且在117位核苷酸～234位核苷酸之间的任一核苷酸处终止的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，并且编码具有细胞死亡诱导活性的多肽的多核苷酸。
[18]根据[17]所述的用于对抗癌药物有抗性的癌的癌症治疗药物试剂盒，其中所述抗癌药物为抗癌抗生素。
[19]使具有抗癌药物抗性的癌细胞恢复抗癌药物敏感性、然后诱导癌细胞死亡的方法，该方法包括将以下REIC/Dkk-3 DNA或包含所述DNA的载体施用至具有抗癌药物抗性的癌细胞。
[20]根据[19]所述的诱导癌细胞死亡的方法，其中所述载体为腺病毒载体。
[21]根据[19]或[20]所述的诱导癌细胞死亡的方法，其中所述抗癌药物为抗癌抗生素。
[22]治疗患有对抗癌药物有抗性的癌的患者的方法，该方法包括将以下REIC/Dkk-3 DNA或包含所述DNA的载体施用至患有对抗癌药物有抗性的癌的患者。
[23]根据[22]所述的治疗患有对抗癌药物有抗性的癌的患者的方法，其中所述载体为腺病毒载体。
[24]根据[21]或[22]所述的治疗患有对抗癌药物有抗性的癌的患者的方法，其中所述抗癌药物为抗癌抗生素。
[25]治疗患有对抗癌药物有抗性的癌的患者的方法，该方法包括将以下REIC/Dkk-3DNA或包含所述DNA的载体和抗癌药物施用至患有对该抗癌药物有抗性的癌的患者。
[26]根据[25]所述的治疗患有对抗癌药物有抗性的癌的患者的方法，其中所述载体为腺病毒载体。
[27]根据[25]或[26]所述的治疗患有对抗癌药物有抗性的癌的患者的方法，其中所述抗癌药物为抗癌抗生素。
本说明书包括本申请的优先权文件日本专利申请2007-287373号的说明书和/或附图中公开的部分或全部内容。
附图说明
图1显示REIC/Dkk-3在人类乳癌细胞系中的表达。
图2A显示在人类乳癌细胞中由Ad-REIC诱导的体外细胞死亡。具体地，图2A显示处理后MCF7/Wt和MCF7/ADR细胞的Hoechst4452染色的结果。
图2B显示在人类乳癌细胞中由Ad-REIC诱导的体外细胞死亡。具体地，图2B显示处理后人类原代乳上皮细胞(HMEC)和乳癌细胞系的细胞死亡(％)。
图3显示作为用Ad-REIC处理的结果，MCF7/ADR细胞对多柔比星的敏感性的恢复。
图4显示作为用Ad-REIC处理的结果，P-糖蛋白在MCF7/ADR细胞中的表达以磷酸化JNK-c-Jun-依赖性方式的下调。
图5A显示用Ad-REIC处理后，表明多柔比星的细胞内累积的荧光显微图像。
图5B显示用Ad-REIC处理后多柔比星的细胞内累积。
图6A显示在裸鼠中使用Ad-REIC的处理对MCF/Wt肿瘤生长的抑制效果。
图6B显示表现在裸鼠中使用Ad-REIC的处理对MCF/Wt肿瘤生长的抑制效果的肿瘤生长曲线。
图6C显示在对裸鼠施用病毒后第3天收集的肿瘤的TUNEL染色结果。
图7显示对膀胱癌细胞(KK47)和其多柔比星-抗性细胞(KK47/ADR)施用Ad-REIC后诱导凋亡的效果。
图8显示当施用Ad-REIC时KK47/ADR细胞中针对多柔比星的细胞死亡敏感性的变化。
图9显示在KK47/ADR细胞中由施用Ad-REIC导致的受抑制的P-糖蛋白表达。
图10显示由REIC/Dkk-3DNA的各片段诱导的PC3细胞死亡的情况。
图11显示由REIC/Dkk-3DNA的各片段诱导的PC3和OUMS-24细胞死亡的诱导效果。“A”显示PC3的结果，“B”显示OUMS-24的结果。
具体实施方式
下面将对本发明进行详细说明。
本发明的具有抗癌药物增强作用的癌细胞死亡(凋亡)诱导剂包含REIC/Dkk-3 DNA作为活性成分。
REIC/Dkk-3 DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。另外，由REIC/Dkk-3 DNA编码的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
另外，具有抗癌药物增强作用的本发明的癌细胞死亡诱导剂中所含的REIC/Dkk-3 DNA为编码具有癌细胞死亡诱导活性的蛋白质的DNA，例如在严谨条件下与具有和SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交的DNA，与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少85％以上、优选90％以上、进而优选95％以上、特别优选97％以上同一性的DNA，所述同一性使用BLAST(在美国生物信息中心的碱基局部比对检索工具)等(例如使用默认；即初始设定参数)计算，或编码包括下述氨基酸序列的蛋白质的DNA，所述氨基酸序列相对于由上述DNA编码的蛋白质的氨基酸序列具有一个、多个或几个(1～10，优选1～5，进而优选1或2)氨基酸的取代、缺失和/或增添。此处，术语“严谨条件”是指例如约“1×SSC，0.1％SDS，和37℃”的条件。更严谨的条件为约“0.5×SSC，0.1％SDS，和42℃”的条件。进而更严谨的条件为约“0.2×SSC，0.1％SDS，和65℃”的条件。通过更严谨的杂交条件，可以预期与探针序列具有高同源性的DNA的分离。然而，SSC、SDS和温度条件的上述组合仅是示例性的。可以适当地组合探针浓度、探针长度和杂交反应时间等等以能够实现所需的严谨性。此外，本发明的具有抗癌药物增强作用的癌细胞死亡诱导剂中所含的REIC/Dkk-3 DNA是编码SEQ ID NO：2所示的蛋白质的DNA。
此外，具有抗癌药物增强作用的本发明的癌细胞死亡诱导剂中所含的REIC/Dkk-3 DNA是包括所述DNA核苷酸序列的部分核苷酸序列的核苷酸片段。此类片段的实例为编码具有细胞死亡诱导活性的肽的核苷酸片段。此类核苷酸片段能够通过将全长REIC/Dkk-3 DNA在合适的位点切割、然后确定所得物是否具有细胞死亡诱导活性来容易地获得。此类核苷酸片段的实例包括：由从SEQ ID NO：1所示的REIC/Dkk-3 DNA核苷酸序列的第1位核苷酸开始并且在第117位核苷酸～234位核苷酸之间的任一核苷酸处终止的核苷酸序列组成的多核苷酸；和在严谨条件下与由和从SEQ ID NO：1所示的REIC/Dkk-3 DNA核苷酸序列的第1位核苷酸开始并且在第117位核苷酸～234位核苷酸之间的任一核苷酸处终止的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交、并且编码具有细胞死亡诱导活性的多肽的多核苷酸。由从SEQ ID NO：1所示的REIC/Dkk-3DNA核苷酸序列的第1位核苷酸开始并且在第117位核苷酸～234位核苷酸之间的任一核苷酸处终止的核苷酸序列组成的多核苷酸的实例包括由从第1位核苷酸～第117位核苷酸的序列组成的多核苷酸(SEQ ID NO：3)和由从第1位核苷酸～第234位核苷酸的序列组成的多核苷酸(SEQ IDNO：4)。
REIC/Dkk-3 DNA能够基于SEQ ID NO：1的序列信息从人类细胞和人类组织等获得。另外，REIC/Dkk-3 DNA还能够根据WO01/038523的描述获得。
此外，本发明还涉及包含REIC/Dkk-3 DNA的载体。将所述载体导入受试对象，然后在受试对象中使REIC/Dkk-3蛋白体内表达，以使蛋白质能够在具有抗癌药物增强作用的同时发挥诱导癌细胞死亡的效果。
可以通过已知方法将基因治疗的靶基因(DNA)导入受试对象中。用于将此类基因导入受试对象的方法的实例包括使用病毒载体的方法和使用非病毒载体的方法。各种方法是已知的(Experimental Medicine，分卷，Basic Technology for Gene Therapy，YODOSHA，1996；ExperimentalMedicine，分卷，Gene Transfer & Experimental Methods for ExpressionAnalysis，YODOSHA，1997；Ed.，Japan Society of Gene Therapy，Handbookfor Development and Research of Gene Therapy(Idenshi Chiryo KaihatsuKenkyu Handbook)，NTS，1999)。
其代表性实例为使用病毒载体如腺病毒、腺相关病毒或逆转录病毒作为基因转移用病毒载体的方法。靶基因能够通过以下方式导入细胞内：将靶基因导入已经无毒化的DNA病毒或RNA病毒，然后用重组病毒感染细胞，所述DNA病毒或RNA病毒例如有逆转录病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德毕斯病毒(sindbisvirus)、仙台病毒(Sendai virus)、SV40或免疫缺陷病毒(HIV)。
当利用病毒将本发明的基因用于基因治疗时，优选使用腺病毒载体。腺病毒载体的特征在于：(1)其允许将基因导入多种类型的细胞，(2)其允许将基因甚至有效地导入在稳定期的细胞，(3)其使得可通过离心浓缩，以便能够获得高滴度(10PFU/ml～11PFU/ml以上)的病毒；和(4)其适合向组织细胞中的体内直接基因转移。作为基因治疗用腺病毒，已经开发出通过使E1/E3区域缺失而制备的第1代腺病毒载体(Miyake，S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，93，1320，1996)、通过使除了E1/E3区域之外还使E2或E4区域缺失而制备的第2代腺病毒载体(Lieber，A.等，J.Virol.，70，8944，1996；Mizuguchi，H.& Kay，M.A.，Hum.Gene Ther.，10，2013，1999)、和通过使腺病毒基因组几乎全部缺失而制备的第3代腺病毒载体(GUTLESS)(Steinwaerder，D.S.等，J.Virol.，73，9303，1999)。可以使用任何腺病毒载体导入本发明的基因而无特别限制。此外，例如，能够使用通过对AAV染色体赋予整合能力而制备的腺-AAV杂交载体(Recchia，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，96，2615，1999)或能够通过转座子基因的使用而整合入染色体的腺病毒载体。此类腺病毒载体也能够用于实现长期基因表达。另外，可以向腺病毒尾丝的H1环插入具有组织特异转移性的肽序列，以便还能够对腺病毒载体赋予组织特异性(Mizuguchi，H.& Hayakawa，T.，Nippon Rinsho，7，1544，2000)。
在本发明中，将包含REIC/Dkk-3 DNA的腺病毒载体称为Ad-REIC。
另外，不使用上述病毒，还可以使用通过将基因表达载体例如质粒载体整合至其中而制备的重组表达载体，以将靶基因导入细胞或组织。例如，能够通过以下方法将基因导入细胞：脂质转染法、磷酸钙共沉淀法、DEAE-右旋糖苷法、使用微量玻璃管(micro-glass tube)用于DNA的直接注射法等。还能够通过以下方法将重组表达载体整合入细胞：使用内包型脂质体(internal liposome)的基因转移法、使用静电型脂质体的基因转移法、HVJ-脂质体法、改进的HVJ-脂质体法(HVJ-AVE脂质体法)、使用HVJ-E(包膜)载体的方法、受体介导的基因转移法、使用粒子枪将DNA分子与载体(金属颗粒)一起转移入细胞的方法、直接导入裸DNA的方法、使用各种聚合物的导入方法，等等。对于这些情况可以使用任何表达载体，只要其能够使靶基因在体内表达即可。此类表达载体的实例包括pCAGGS(Gene 108，193-200(1991))、pBK-CMV、pcDNA3、1、pZeoSV(Invitrogen Corporation，stratagene)和pVAX1。
包含REIC/Dkk-3DNA的载体可以进一步包括用于适当的基因转录的启动子和增强子、poly A信号、用于标记和/或选择转染有基因的细胞的标记基因，等等。作为此类情况中的启动子，可以使用已知的启动子。
为了将包括REIC/Dkk-3 DNA并且具有抗癌药物增强作用的本发明的癌细胞死亡诱导剂导入受试对象，可以使用涉及直接导入基因治疗剂的体内方法，或者涉及从人类提取某类型的细胞、将基因治疗剂离体导入所述细胞、然后将所述细胞返回入身体的离体方法，例如(NIKKEISCIENCE，Inc.，1994年4月刊，第20-45页；The Pharmaceuticals Monthly，36(1)，23-48(1994)；增刊，Experimental Medicine，12(15)，(1994)；Ed.，Japan Society of Gene Therapy，Handbook for Development and Research ofGene Therapy(Idenshi Chiryo Kaihatsu Kenkyu Handbook)，NTS，1999)。
包含REIC/Dkk-3DNA并且具有抗癌药物增强作用的本发明的癌细胞死亡诱导剂能够用作针对对抗癌药物有抗性的癌的治疗药物。
在本发明中，术语“抗癌药物增强作用”是指减弱癌的抗癌药物抗性和保持抗癌药物的抗癌活性。具体地，具有抗癌药物增强作用的本发明的癌细胞死亡诱导剂可使癌恢复其对抗癌药物的敏感性，并因此诱导癌细胞死亡。
可用于本发明的抗癌药物的实例包括：抗癌抗生素，例如阿霉素(多柔比星)、更生霉素(dactinomycin)、放线素菌(actinomycin)D、色霉素(chromomycin)、道诺霉素(daunomycin)、博来霉素(bleomycin)、培洛霉素(peplomycin)、多诺比星(donorubicin)、表柔比星(epirubicin)、和丝裂霉素(mitomycin)C；烷基化剂，例如亚硝基脲剂、氮芥(例如，环磷酰胺)、达卡巴嗪(dacarbazine)、卡莫西汀(carmustine)(BCNU)、白消安(busulfan)、异环磷酰胺(ifosfamide)、盐酸尼莫司汀(nimustine hydrochloride)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)和雷莫司汀(ranimustine)(MCNU)；抗代谢药，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、氨蝶呤(aminopterin)、6-巯基嘌呤、5-氟尿嘧啶、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、羟基脲(hydroxy carbamide)和吉西他滨(gemcitabine)；植物碱药，例如长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、紫杉醇(paclitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel)，CPT-11(伊立替康(irinotecan))和足叶乙甙(etoposide)；激素剂；改变生物功能的物质，例如蘑菇多糖(lentinan)、必医你舒(picibanil)和苯丁抑制素(bestatin)；丙卡巴肼(procarbazine)；顺铂；和卡铂。其实例还包括抑制雄性激素功能的抗雄激素剂，其用于治疗特别是前列腺癌。抗雄激素剂的实例包括亮丙瑞林(leuplin)、康士得(casodex)、奥达因(odyne)、前列他(prostal)、艾去适(estracyt)和磷雌酚(honvan)。其实例还包括使用癌细胞特异性分子作为指示而发挥抗癌作用的分子靶向药物。分子靶向药物的实例包括：酪氨酸激酶抑制剂，例如甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)、吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)、凡德他尼(vandetanib)和舒尼替尼(sunitinib)；Raf激酶抑制剂，例如舒尼替尼；TNF-α抑制剂，例如依那西普(etanercept)；和单克隆抗体，例如利妥昔单抗(rituximab)、西妥昔单抗(cetuximab)、英利昔单抗(infliximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)和贝伐单抗(bevacizumab)。
本发明靶向的癌症的实例包括脑·神经肿瘤、皮肤癌、胃癌、肺癌、肝癌、淋巴瘤·白血病、结肠癌、胰腺癌、肛门·直肠癌、食道癌、子宫癌、乳癌、肾上腺癌、肾癌、肾盂和输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、骨肿瘤·骨肉瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤和间皮瘤。特别地，优选乳癌和膀胱癌。在癌症的这些实例中，本发明针对以下癌症病例是有效的：特征在于在包括静脉内施用抗癌药物例如阿霉素的治疗后存在该抗癌药物所发挥的肿瘤缩小效果已经对其减弱的癌病变(cancerouslesions)的癌症病例，以及特征在于存在临床上预测该抗癌药物已经对其不发挥肿瘤缩小效果的癌病变的癌症病例。
具有抗癌药物增强作用的本发明的癌细胞死亡诱导剂在癌细胞中引起内质网应激。内质网应激诱导JNK激活，结果P-糖蛋白浓度降低，随后细胞中排出抗癌药物的功能降低，因此认为抗癌药物即使在其较低的浓度下也可诱导癌细胞死亡。此外，通过内质网应激的诱导和JNK激活的介导，细胞内广泛的细胞毒性信号能够起作用从而消除抗癌药物抗性。
具有抗癌药物增强作用的本发明的癌细胞死亡诱导剂包含REIC/Dkk-3 DNA或含有所述DNA的载体以及药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
具有抗癌药物增强作用的本发明的癌细胞死亡诱导剂能够以各种形式施用，例如经由口服施用的片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂或糖浆剂，或经由胃肠外施用的注射制剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、滴眼剂、经鼻制剂或贴附制剂(adhesive preparation)。
具有抗癌药物增强作用的本发明的癌细胞死亡诱导剂还能够局部地施用。例如，癌细胞死亡诱导剂能够通过其经由在癌部位等的注射施用而发挥其作用。
优选地，将所述试剂直接注射入局部癌病变一次或几次，以使所述试剂散布整个癌病变。在注射前后，进行包括静脉内施用抗癌药物例如阿霉素的治疗。
本发明还涉及组合包含抗癌药物和具有该抗癌药物增强作用的癌细胞死亡诱导剂的药物组合物。特别是，本发明包括：作为包含抗癌药物和REIC/Dkk-3 DNA的试剂盒的癌症治疗药物；和包含抗癌药物和REIC/Dkk-3 DNA的癌症治疗用药物组合物。
具有抗癌药物增强作用的本发明的癌细胞死亡诱导剂包含制剂领域常用的载剂、稀释剂和赋形剂。例如对于片剂用载剂或赋形剂，可使用乳糖或硬脂酸镁等。对于注射用水溶液，例如可使用盐水、包含右旋糖和其它佐剂的等渗溶液。还可以组合使用合适的增溶剂，例如醇、例如丙二醇等多元醇或非离子表面活性剂等。对于油性液体，可使用芝麻油或大豆油等。对于增溶剂，还可以组合使用苯甲酸苄酯、苯甲醇等。
剂量随症状、年龄和体重等而不同。可以经由皮下注射、肌肉内注射或静脉内注射以0.001mg～100mg的量进行施用，每数日、数周或数月施用一次。
对染有以上癌症类型、具有确认对抗癌药物的治疗显示抗性的癌病变的癌症患者可以施用具有抗癌药物增强作用的本发明的癌细胞死亡诱导剂。
据确认，具有抗癌药物增强作用的本发明的癌细胞死亡诱导剂即使在单剂施用的情况下也可发挥癌细胞死亡·肿瘤缩小的效果。此外，该试剂与抗癌药物的组合使用可双重引发抗癌效果，因此可预期较强的肿瘤缩小的效果。
在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明，不过本发明不受其限制。
实施例1.REIC/Dkk-3对抗癌药物抗性乳癌细胞的效果
在这些实施例中，使用以下材料通过以下方法进行检查。
细胞和细胞培养
本发明实施例中所用细胞系为人类乳癌细胞系MCF7/Wt(野生型)、MDA-MB-231、SK-BR-3和HCC1806，以及人类子宫癌细胞系HeLa。这些细胞系获自ATCC(American Type Culture Collection)。抗癌药物抗性乳癌细胞系(多药抗性乳癌细胞系)MCF7/ADR由Eppley Institute forResearch in Cancer and Allied Diseases，University of Nebraska，MedicalCenter的K.H.Cowan博士提供(Batist G等J Biol Chem 1986；261：15544-15549)。作为对照细胞，使用人类成纤维细胞和OUMS24。它们由本发明人建立(Bai L等Int J Cancer 1993；53：451-456)。细胞系各自使用以下培养液培养。
OUMS24在5％CO2条件下，使用补充有10％(v/v)胎牛血清、青霉素(100IU/ml)和链霉素(100μg/ml)的Dulbecco氏改进Eagle培养基(Invitrogen)培养。MCF7/ADR使用补充有10％(v/v)胎牛血清、青霉素(100IU/ml)、链霉素(100μg/ml)和10μM多柔比星(adriacin(商标，Kyowa Hakko Kirin Co.，Ltd.))的RPMI-1640培养基(Sigma)培养。其它细胞系使用补充有10％(v/v)胎牛血清、青霉素(100IU/ml)和链霉素(100μg/ml)的RPMI-1640培养基培养。
Western印迹分析
蛋白质表达通过Western印迹检查。将细胞用PBS洗涤两次，然后使用裂解缓冲液(50mM HEPES，pH 7.4，250mM NaCl，1mM EDTA，1％NP-40，1mM DTT，1mM PMSF，5μg/ml亮抑酶肽(leupeptin)，5μg/ml抑肽酶(aprotinin)，2mM Na3VO4，1mM NaF和10mM β-GP)进行蛋白质提取。离心后，调整在上清液中的蛋白质水平。将各所得物用相等量的2×SDS样品缓冲液稀释，然后在95℃加热5分钟。使用7.5％SDS-PAGE凝胶对各样品(10μg蛋白质)进行电泳，然后将所得物转印至PVDF膜。使用包含10％脱脂乳粉、6％甘氨酸和0.1％Tween-20的Tris缓冲盐水(TBS)在室温下进行封闭1小时。此处使用的一抗为：抗人REIC/Dkk-3抗体(1∶1000)；抗JNK抗体sc-571(1∶500)(Santa Cruz Biotechnology)；抗c-Jun抗体sc-1694(1∶500)(Santa Cruz Biotechnology)；抗磷酸化JNK抗体#9255(1∶500)(Cell Signaling Technology)；抗磷酸化c-Jun抗体#9261(1∶500)(Cell Signaling Technology)；抗切割半胱天冬酶-3(cleavage caspase-3)抗体#9661(1∶500)(Cell Signaling Technology)；抗微管蛋白抗体T5168(1∶8000)(Sigma)；和抗P-糖蛋白抗体C219(1∶250)(Calbiochem)。用TBS(T-TBS)和0.1％Tween-20充分洗涤后，添加辣根过氧化物酶偶联的二抗。进而，使用T-TBS充分洗涤后，通过增强化学发光检测法(ECL试剂盒)进行显色。在一些样品中添加1μM JNK抑制剂SP600125(A.G.Scientific，Inc.)，以抑制JNK的激酶活性。
包含REIC/Dkk-3 DNA的腺病毒载体(Ad-REIC)的构建
将全长REIC/Dkk-3 cDNA导入粘粒载体pAxCAwt，然后将所得物通过COS-TPC法(Takara Bio)转移至腺病毒载体(Abarzua F等Cancer Res2005；65：9617-9622)。将包含LacZ基因的腺病毒载体(Ad-LacZ)用作对照。
细胞死亡(凋亡)检测
为了检查体外细胞死亡诱导，将细胞接种在6孔平底板中然后培养24小时。将细胞以各种MOI(感染复数)的Ad-LacZ和Ad-REIC在无血清培养基中处理2小时，然后将所述培养基用新鲜完全培养基更换。温育48小时后，以2μg/ml的浓度添加Hoechst33342储备液。使细胞在黑暗条件下温育10分钟。Hoecht33342为嵌入染色试剂，其可以用于检查染色质的总量和染色质的凝集程度(Belloc F等，Cytometry 1994；17：59-65，Maciorowski Z等，Cytometry 1998；32：44-50)。使用荧光显微镜观察到具有高度凝集和片段化的细胞核的细胞的死亡，然后鉴定此类细胞。将在3～5个不同的视野中确认已经经受细胞死亡的此类细胞在显微镜下计数。
为了体内检测已被确认细胞死亡的细胞，使用荧光素原位细胞检测试剂盒(Roche)进行TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的UTP末端标记)检测。具体地，将肿瘤组织切成切片，并将各切片加入到OCT化合物中，然后在液氮中快速冷冻。将各冷冻切片样品(10μm)使用甲醇在室温下固定30分钟，洗涤，用包含0.1％Triton X-100的PBS浸渍，然后用TUNEL反应混合液染色。
细胞存活率检测
将细胞以1000个细胞/孔接种在96孔平底微孔板中。24小时温育后，将细胞用100MOI的Ad-LacZ和Ad-REIC在无血清培养基中处理2小时，然后以新鲜完全培养基更换。48小时后，通过培养基更换除去漂浮的死亡细胞。将贴附细胞以各种浓度的多柔比星培养72小时。在温育结束时，使用CellTiter96(商标)Aqueous单溶液细胞增殖测试(Promega Corp.)测定细胞存活率。
多柔比星的细胞内累积的检测和定量确定
将细胞接种在6孔平底板中，然后培养24小时。24小时温育后，将细胞用100MOI的Ad-LacZ和Ad-REIC在无血清培养基中处理2小时，然后以新鲜完全培养基更换。48小时后，通过培养基更换除去漂浮的死亡细胞，将贴附细胞以10μM多柔比星培养36小时。在温育结束时，观察到多柔比星的红色自身荧光，并将其扫描。将扫描图像使用Scion Image(Scion Corp)进行多柔比星累积密度的定量确定。
异种移植模型
5～6周龄的雌性无胸腺(nu/nu)小鼠获自Charles River Laboratories International，Inc.。在注射肿瘤细胞前第3天，将17β雌二醇球团(SE-121，Innovative Research of America)经由皮下注射植入到各小鼠的右肩区域。将MCF7/Wt细胞(5×106个细胞/0.1ml PBS)注射入各小鼠的左侧背部，然后使肿瘤增加至3mm～6mm。将小鼠随机地分成7组。随后，将1.2×108噬斑形成单位(PFU)的腺病毒载体(Ad-LacZ和Ad-REIC)用PBS调整至0.1ml，然后将所得物注射入肿瘤。作为阴性对照，注射相同量的PBS。肿瘤大小每两周测定一次。肿瘤体积通过根据实验建立的算式(1/2×(w1×w2×w2)，w1代表肿瘤的最大直径，w2代表肿瘤的最小直径)计算。
统计分析
数据用平均值±SE表示。对2组进行非配对学生t检验(UnpairedStudent′s t test)。“P＜0.05”定义为表示显著差异。使用Statview 4.5软件程序(Abucus concepts)进行分析。
(1)在人类乳癌细胞系中降低的REIC/Dkk-3基因表达
检查各种细胞系中的REIC/Dkk-3蛋白表达。此处所用的细胞系是作为人类乳癌细胞系的MCF7/Wt(野生型)、MDA-MB-231、SK-BR-3和HCC1806，以及作为人类子宫癌细胞系的HeLa。人类成纤维细胞和OUMS24用作表达的阳性对照(Abarzua F等，Cancer Res 2005；65：9617-9622)。在已使用微管蛋白作为内对照(loading control)的原代培养人类乳癌上皮细胞(HMEC)中，在60kDa～70kDa的分子量之间清楚地观察到REIC/Dkk-3蛋白。这与以下结果一致：通过Western印迹分析观察到对应于REIC/Dkk-3蛋白的多个条带(Barzua F等，Cancer Res 2005；65：9617-9622；Kurose K等，J Urol 2004；171：1314-13181；Hsieh SY，Oncogene2004；23：9183-9189)。图1显示该结果。图1显示在人类乳癌细胞系中的REIC/Dkk-3表达。如图1所示，在所述癌细胞系中未观察到指示REIC/Dkk-3表达的条带。
(2)作为Ad-REIC处理结果的MCF7/Wt和MCF7/ADR细胞的细胞死亡的诱导
通过利用Ad-REIC使REIC/Dkk-3在乳癌细胞系中过表达来检查用于乳癌基因治疗的REIC/Dkk-3的可能应用。实验进行3～6次。图2A和图2B显示该结果。如图2A所示，在以Ad-REIC处理的MCF7/Wt和MCF7/ADR中以高频率观察到在利用Hoechst33342的细胞死亡检测中死亡的细胞。然而，此类细胞未在HMEC中观察到。在100MOI时的细胞死亡发生率(％)在HMEC中为5.5％，在MCF7/Wt中为21.2％，在MCF7/ADR中为25.0％，在SK-BR-3细胞中为15.2％(图2B)。当与使用对照Ad-LacZ的处理相比时，利用100MOI的Ad-REIC的处理在MCF7/Wt和MCF7/ADR细胞中显著地诱导细胞死亡。在使用Ad-REIC的处理和使用Ad-LacZ的处理之间观察到显著差异(p＜0.05)。在MDA-MB-231细胞中，在Ad-REIC和对照之间未观察到细胞死亡诱导的差异。
(3)作为Ad-REIC处理结果的多药抗性MCF7/ADR对多柔比星敏感性的增加
使用多药抗性MCF7/ADR细胞来检查Ad-REIC在癌症治疗中的进一步有用性。将MCF/Wt和MCF7/ADR细胞分成3组：未受处理的细胞的组、用Ad-LacZ处理的细胞的组和用Ad-REIC处理的细胞的组。对暴露于各种浓度的多柔比星的细胞进行评价，并评价REIC/Dkk-3过表达使细胞从抗药性恢复的能力。观察到MCF7/Wt细胞未显示依赖于处理组的显著差异。图3显示结果。图3显示剂量响应曲线(对多柔比星毒性的响应)。如图3所示，MCF7/ADR细胞展示了作为用Ad-REIC处理的结果而显著地向较低浓度移动的剂量响应曲线(对多柔比星毒性的响应)。在10μM多柔比星时，细胞存活％在未处理组中为88.1％，在用Ad-LacZ处理的组中为85.6％，在用Ad-REIC处理的组中为32.3％。在25μM多柔比星时，细胞存活率在未处理组中为45.9％，在用Ad-LacZ处理的组中为32.1％，在用Ad-REIC处理的组中为14.3％。在处理组间观察到显著差异(p＜0.05)。
(4)作为用Ad-REIC处理结果的活化JNK-c-Jun依赖性方式的MCF7/ADR细胞中P-糖蛋白的下调
通过Western印迹测定在REIC/Dkk-3过表达下各种蛋白质的表达水平。将细胞以100MOI的Ad-LacZ和Ad-REIC处理。48小时后，除去漂浮的死细胞，将贴附细胞裂解，然后将所得物用作样品。为了在使用Ad-REIC的处理中抑制JNK的激酶活性，在用Ad-REIC处理后立即加入1μM JNK抑制剂(SP600125)。图4显示结果。在图4中，“p-”表示磷酸化，“P-gp”表示P-糖蛋白。作为用Ad-REIC处理的结果，REIC/Dkk-3蛋白表达在MCF7/Wt和MCF7/ADR细胞中均有增加。在进行任何类型处理的各类型细胞中都未观察到JNK水平的变化。MCF7/ADR细胞中的C-Jun蛋白质水平大于MCF7/Wt细胞中的C-Jun蛋白质水平。用Ad-REIC处理后，通过使用磷酸化JNK特异性抗体检测c-Jun的磷酸化从而确认了MCF7/Wt和MCF7/ADR细胞中的JNK激活。REIC/Dkk-3过表达显著下调了在MCF7/ADR细胞中的P-糖蛋白。JNK抑制剂SP600125已知可抑制JNK的激酶活性，但是不抑制JNK自身的磷酸化(Bennett BL等，Proc Natl Acad Sci U.S.A.2001；98：13681-13686)。Ad-REIC和SP600125的组合使用未引起JNK活性的变化。然而，磷酸化c-Jun的表达水平下降，而MCF7/ADR细胞中的P-糖蛋白水平则反转。关于P-糖蛋白表达的这种变化，MCF7/Wt和MCF7/ADR细胞中的切割的半胱天冬酶-3的水平因用Ad-REIC处理而上调，并被SP600125逆转。
(5)作为用Ad-REIC处理结果的多柔比星的细胞内累积
为了检查各类型细胞中使用Ad-REIC的处理对多柔比星动力学的影响，以10μM的浓度检查多柔比星的细胞内累积。图5A和图5B显示结果。图5A显示经处理细胞的荧光显微图像的代表性实例。图5B显示随机扫描红色荧光，然后定量确定累积密度的结果。将未处理细胞的平均值在各细胞系中调整为1.0。如图5A和图5B所示，用Ad-REIC处理显著增加了多柔比星在MCF7/ADR细胞中的细胞内累积，从而观察到该累积为在对照组的两倍。在使用Ad-REIC的处理和使用Ad-LacZ的处理之间观察到显著差异(p＜0.05)。在MCF7/Wt细胞中，未观察到由于处理导致的差异。
(6)作为使用Ad-REIC肿瘤内处理(施用)结果的在乳癌异种移植模型中生长的乳癌的抑制
由于REIC/Dkk-3过度表达导致的体外细胞死亡诱导在MCF/Wt细胞中得到确认。接下来，利用皮下注射肿瘤模型检查Ad-REIC的体内抗肿瘤效果。图6A、图6B和图6C显示结果。图6A和图6B显示在用Ad-LacZ和Ad-REIC处理后3周观察期结束时异种移植肿瘤的出现。图6A显示展示其中出现肿瘤的裸鼠的摄影图像。图6B显示通过计算每组7只小鼠的平均肿瘤体积而各自得出的肿瘤生长曲线。在使用Ad-REIC的处理和使用Ad-LacZ的处理之间观察到显著差异(p＜0.05)。图6C显示在病毒施用后第3天收集的肿瘤的TUNEL染色结果。通过DAPI染色对细胞核染色。如图6B所示，在施用PBS的组和施用Ad-LacZ的组中发现肿瘤尺寸在3周观察期内逐渐增加。另一方面，在用Ad-REIC处理的组中，肿瘤体积在2周内显示几乎无变化，随后其逐渐地减小。从第7天至第3周在未处理组、施用Ad-LacZ的组和施用Ad-REIC的组之间观察到显著差异。为了确认REIC/Dkk-3表达和使用Ad-REIC处理的细胞死亡效果，在载体施用后第3天将肿瘤组织切除。如图6C所示，通过Western印迹在用Ad-REIC处理的肿瘤中观察到REIC/Dkk-3过表达。随后，通过TUNEL染色检查肿瘤切片。在施用Ad-LacZ的肿瘤切片中观察到几乎无细胞死亡。另一方面，在施用Ad-REIC的肿瘤切片中观察到许多TUNEL-阳性细胞。
通过该实施例证明REIC/Dkk-3对于针对癌症的基因治疗是有用的。腺病毒介导的REIC/Dkk-3过表达在乳癌细胞中诱导细胞死亡，并且细胞死亡以JNK磷酸化依赖性方式发生。在小鼠模型中的MCF/Wt肿瘤生长抑制能够通过由使用Ad-REIC的体内处理导致的肿瘤细胞死亡效果来解释。此外，在药物抗性MCF7/ADR乳癌细胞中REIC/Dkk-3过表达通过JNK激活的介导而下调P-糖蛋白表达，从而使细胞系的性质从对药物(多柔比星)有抗性改变为对该药物敏感。
本发明人之前已经报道由于施用Ad-REIC导致的JNK激活在各种癌细胞系的细胞死亡中起主要作用(Abarzua F等，Cancer Res 2005；65：9617-9622，Abarzua F等，Int J Mol Med 2007；20：37-43；Tanimoto R等，Int J Mol Med 2007；19：363-368)。在前列腺癌PC-3细胞中，REIC/Dkk-3过表达激活JNK，降低Bcl-2蛋白水平，诱导BaX蛋白在线粒体中的定位，然后将细胞色素C释放入细胞质，由此引起细胞死亡(凋亡)(AbarzuaF等，Cancer Res 2005，65：9617-9622)。
在该实施例中，证明Ad-REIC的施用在许多乳癌细胞系(MCF7/Wt，MCF7/ADR和SK-BR-3)中诱导细胞死亡，但在原代人类乳上皮细胞中不诱导细胞死亡。此外，在乳癌细胞系中观察到几乎无REIC/Dkk-3蛋白表达，但是在原代上皮细胞中有大量REIC/Dkk-3蛋白。这些结果提示REIC/Dkk-3过表达选择性地在不表达内源性REIC/Dkk-3的乳癌细胞中诱导细胞死亡。该现象与此前报道(Abarzua F等，Cancer Res 2005，65：9617-9622；Abarzua F等，Int J Mol Med 2007，20：37-43；Tanimoto R等，Int J Mol Med 2007，19：363-368)中记录的现象相似，提示REIC/Dkk-3蛋白表达的缺失或不存在对于在癌细胞中的细胞死亡诱导是重要的。对其中不存在REIC/Dkk-3的癌细胞施用Ad-REIC会引起内质网应激(ER应激)，然后以JNK-依赖性方式诱导细胞死亡。令人感兴趣的是，某些种类蛋白质的过表达可引起由内质网应激诱导的JNK激活以及细胞死亡(Cudna RE，Biotechnol Bioeng 2003，81：56-65；Herr I.等，Blood 2001，98：2603-2614)。因此，认为REIC/Dkk-3蛋白的过表达本身可诱导显著的内质网应激，然后激活其中REIC/Dkk-3蛋白表达不存在或不能顺利地发生的癌细胞的内质网中的JNK，从而发生细胞死亡。
P-糖蛋白在抗癌药物的排出中起关键作用，从而增加抵御抗癌药物的细胞存活。另外，P-糖蛋白的上调是癌细胞变得对抗癌药物的毒性作用有抗性的重要机制(Ueda K.等，Proc Natl Acad Sci U.S.A.1987，84：3004-3008；Giai M.等，Eur J Gynaecol Oncol 1991，12：359-373，11)。令人感兴趣的是，此前的检查揭示出转录因子c-Jun对于P-糖蛋白的下调是主要的决定因素(Fujita T等，Iht J Cancer 2005，117：670-682；Miao ZH等，Cancer Res 2003，63：4527-4532)。与P-糖蛋白下调的情况类似，MCF7/ADR细胞中REIC/Dkk-3的过表达以JNK依赖性方式引起c-Jun激活。因此，认为在施用Ad-REIC的细胞中，待通过JNK激活而诱导的磷酸化c-Jun可介导P-糖蛋白依赖性抗多柔比星抗性的逆转。这被以下结果证明：在施用Ad-REIC后在药物抗性MCF7/ADR细胞中的细胞内多柔比星累积显著增加。此外，使用另一多柔比星(阿霉素)抗性癌细胞系(KK47/ADR(KK47/ADM)膀胱癌细胞)确认，由于Ad-REIC导致的REIC/Dkk-3过表达对P-糖蛋白的下调以JNK依赖性和c-Jun依赖性方式发生，从而促进药物抗性(实施例2)。因此，JNK激活可以是依赖于P-糖蛋白的下调，通过施用Ad-REIC使药物抗性逆转的效果的机制。然而，考虑到施用Ad-REIC后显著的细胞死亡诱导，细胞损伤本身能够引起抗癌抗性涉及的细胞内系统中的变化。
在该实施例中，证明了Ad-REIC的施用对乳癌的体外和体内治疗效果。Ad-REIC不仅诱导细胞死亡，还引起细胞对抗癌药物的抗性的恢复，即使在单剂施用的情况下。特别是，当与传统上使用的抗癌药物组合使用时，REIC/Dkk-3能够发挥显著的抗癌效果。
实施例2.REIC/Dkk-3对抗癌药物抗性膀胱癌细胞的效果
使用正常膀胱癌细胞和对抗癌药物具有获得性抗性的膀胱癌细胞进行与实施例1类似的检查。
此处使用的细胞系是作为膀胱癌细胞系的KK47(KK47/Wt)和作为KK47的抗癌药物(多柔比星)抗性细胞系的KK47/ADR(KK47/ADM)(Kimiya K.等，J Urol.1992 Aug，148(2 Pt 1)，441-5；Hasegawa S.等，Br JCancer.1995 May；71(5)：907-13)(所有细胞由Department of Urology，Graduate School of Medical Sciences，Kyushu University提供)。
图7显示在用Ad-REIC处理后诱导细胞死亡的效果。与Ad-LacZ对照组相比，在以100MOI施用Ad-REIC的KK47/Wt和KK47/ADR细胞中细胞死亡发生率显著地增加。
图8显示在用Ad-REIC处理后抗癌药物抗性的变化。施用100MOI的Ad-REIC后，对多柔比星的细胞死亡敏感性显著地增加。
图9显示由于施用Ad-REIC导致的P-糖蛋白表达的抑制。在施用100MOI的Ad-REIC后，P-糖蛋白表达在KK47/ADR细胞中显著受到抑制。所述表达的变化通过JNK蛋白抑制剂的施用使而消除。
实施例3.通过REIC/Dkk-3 DNA片段的细胞死亡诱导
在6孔板中接种PC3(1×105细胞)。24小时后，利用TransIT(商标)Keratinocyte试剂(转染试剂(Mirus Bio Corporation))，以其中已经插入REIC/Dkk-3片段cDNA的pTracer-EF-A-1(#1：1-39aa)、-2(#2：1-78aa)或-6(全长：1-350aa)质粒转染PC3。pTracer-EF-A-1包含编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的第1位氨基酸～第39位氨基酸的序列的cDNA(包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第1位核苷酸～第117位核苷酸的序列的cDNA)。pTracer-EF-A-2包含编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的第1位氨基酸～第78位氨基酸的序列的cDNA(包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第1位核苷酸～第234位核苷酸的序列的cDNA)。pTracer-EF-A-3包含编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的第1位氨基酸～第350位氨基酸的序列的cDNA(包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第1位核苷酸～第1050位核苷酸的序列的cDNA)。利用FuGENE(商标)-HD试剂(转染试剂(Roche Applied Science))，以各质粒转染OUMS-24。48小时后，使用Hoechst33342对细胞进行细胞核活染色，然后经由荧光显微镜观察它们。使用GFP阳性细胞(包含质粒的细胞)的情况作为分母计算已经死亡的细胞(已经经历核固缩的细胞)的比率(％)。
通过不同启动子的使用，用于转染PC3的质粒能够引起插入基因(REIC/Dkk-3片段)和GFP的同时表达。因此，通过检测GFP(绿色)，能够间接检测表达REIC片段的细胞。转染后48小时，评价细胞凋亡诱导。图10显示染色图像。如图10的1和2所示，在GFP阳性细胞中观察到包含已经形成显著程度的聚集体(凋亡)的细胞核(Hoechst染色：蓝色)的细胞。在图10中，(-)表示其中未插入REIC片段的空质粒pTracer-EF-A。
图11A显示当使用PC3时，以GFP阳性细胞(包含质粒的细胞)的情况作为分母来计算细胞死亡(已经经历核固缩的细胞)的比率(％)的结果。发现REIC片段1(#1：1-39aa)和REIC片段2(#2：1-78aa)具有显著的细胞死亡诱导效果。同时，图11B显示使用OUMS-24的结果。在正常OUMS-24成纤维细胞中未观察到在PC3中所观察到的细胞死亡诱导效果。
工业实用性
对于具有抗癌药物抗性的癌细胞具有抗癌药物增强作用的本发明的癌细胞死亡诱导剂即使在单剂施用的情况下也对抗癌药物抗性癌具有癌细胞死亡抗肿瘤效果。此外，当与抗癌药物组合使用时该癌细胞死亡诱导剂能够恢复抗癌药物的作用。该癌细胞死亡诱导剂为具有这种双重效果的局部施用制剂。
可以施用本发明的制剂的病例为具有经观察对抗癌药物治疗有抗性的癌病变的患者的病例。将发现即使在单剂施用的情况下也发挥癌细胞死亡·肿瘤缩小效果的本发明制剂与抗癌药物组合施用，以便双重诱导抗癌作用，因而可期待强的抗肿瘤效果。
抗癌药物抗性癌和药物敏感性癌之间的严格区分在临床上是困难的。本发明的制剂还期望可发挥针对药物敏感性癌的抗癌作用。因此，当靶向抗癌药物抗性癌时，与减弱P-糖蛋白表达传统技术的情况不同，在抗癌药物治疗的起始阶段施用该制剂是可行的。该制剂的有利之处还在于其临床上可应用于宽范围的病例。
本文通过参考并入本文所引用的所有出版物、专利和专利申请的全部内容。
序列表
<110>桃太郎源株式会社
<120>具有抗癌剂增强活性的诱导对抗癌剂有抗性的癌凋亡的药剂
<130>PH-3753-PCT
<150>JP2007/287373
<151>2007-11-05
<160>4
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>1053
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1053)
<400>1
atg cag cgg ctt ggg gcc acc ctg ctg tgc ctg cta ctg gcg gcg gcg 48
Met Gln Arg Leu Gly Ala Thr Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ala Ala Ala
1 5 10 15
gtc ccc acg gcc ccc gcg ccc gct ccg acg gcg acc tcg gct cca gtc 96
Val Pro Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ala Thr Ser Ala Pro Val
20 25 30
aag ccc ggc ccg gct ctc agc tac ccg cag gag gag gcc acc ctc aat 144
Lys Pro Gly Pro Ala Leu Ser Tyr Pro Gln Glu Glu Ala Thr Leu Asn
35 40 45
gag atg ttc cgc gag gtt gag gaa ctg gtg gag gac acg cag cac aaa 192
Glu Met Phe Arg Glu Val Glu Glu Leu Val Glu Asp Thr Gln His Lys
50 55 60
ttg cgc agc gcg gtg gaa gag atg gag gca gaa gaa gct gct gct aaa 240
Leu Arg Ser Ala Val Glu Glu Met Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ala Lys
65 70 75 80
gca tca tca gaa gtg aac ctg gca aac tta cct ccc agc tat cac aat 288
Ala Ser Ser Glu Val Asn Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Tyr His Asn
85 90 95
gag acc aac aca gac acg aag gtt gga aat aat acc atc cat gtg cac 336
Glu Thr Asn Thr Asp Thr Lys Val Gly Asn Asn Thr Ile His Val His
100 105 110
cga gaa att cac aag ata acc aac aac cag gct cga caa atg gtc ttt 384
Arg Glu Ile His Lys Ile Thr Asn Asn Gln Ala Arg Gln Met Val Phe
115 120 125
tca gag aca gtt atc aca tct gtg gga gac gaa gaa ggc aga agg agc 432
Ser Glu Thr Val Ile Thr Ser Val Gly Asp Glu Glu Gly Arg Arg Ser
130 135 140
cac gag tgc atc atc gac gag gac tgt ggg ccc agc atg tac tgc cag 480
His Glu Cys Ile Ile Asp Glu Asp Cys Gly Pro Ser Met Tyr Cys Gln
145 150 155 160
ttt gcc agc ttc cag tac acc tgc cag cca tgc cgg ggc cag agg atg 528
Phe Ala Ser Phe Gln Tyr Thr Cys Gln Pro Cys Arg Gly Gln Arg Met
165 170 175
ctc tgc acc cgg gac agt gag tgc tgt gga gac cag ctg tgt gtc tgg 576
Leu Cys Thr Arg Asp Ser Glu Cys Cys Gly Asp Gln Leu Cys Val Trp
180 185 190
ggt cac tgc acc aaa atg gcc acc agg ggc agc aat ggg acc atc tgt 624
Gly His Cys Thr Lys Met Ala Thr Arg Gly Ser Asn Gly Thr Ile Cys
195 200 205
gac aac cag agg gac tgc cag ccg ggg ctg tgc tgt gcc ttc cag aga 672
Asp Asn Gln Arg Asp Cys Gln Pro Gly Leu Cys Cys Ala Phe Gln Arg
210 215 220
ggc ctg ctg ttc cct gtg tgc ata ccc ctg ccc gtg gag ggc gag ctt 720
Gly Leu Leu Phe Pro Val Cys Ile Pro Leu Pro Val Glu Gly Glu Leu
225 230 235 240
tgc cat gac ccc gcc agc cgg ctt ctg gac ctc atc acc tgg gag cta 768
Cys His Asp Pro Ala Ser Arg Leu Leu Asp Leu Ile Thr Trp Glu Leu
245 250 255
gag cct gat gga gcc ttg gac cga tgc cct tgt gcc agt ggc ctc ctc 816
Glu Pro Asp Gly Ala Leu Asp Arg Cys Pro Cys Ala Ser Gly Leu Leu
260 265 270
tgc cag ccc cac agc cac agc ctg gtg tat gtg tgc aag ccg acc ttc 864
Cys Gln Pro His Ser His Ser Leu Val Tyr Val Cys Lys Pro Thr Phe
275 280 285
gtg ggg agc cgt gac caa gat ggg gag atc ctg ctg ccc aga gag gtc 912
Val Gly Ser Arg Asp Gln Asp Gly Glu Ile Leu Leu Pro Arg Glu Val
290 295 300
ccc gat gag tat gaa gtt ggc agc ttc atg gag gag gtg cgc cag gag 960
Pro Asp Glu Tyr Glu Val Gly Ser Phe Met Glu Glu Val Arg Gln Glu
305 310 315 320
ctg gag gac ctg gag agg agc ctg act gaa gag atg gcg ctg ggg gag 1008
Leu Glu Asp Leu Glu Arg Ser Leu Thr Glu Glu Met Ala Leu Gly Glu
325 330 335
cct gcg gct gcc gcc gct gca ctg ctg gga ggg gaa gag att tag 1053
Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Glu Glu Ile
340 345 350
<210>2
<211>350
<212>PRT
<213>人
<400>2
Met Gln Arg Leu Gly Ala Thr Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ala Ala Ala
1 5 10 15
Val Pro Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ala Thr Ser Ala Pro Val
20 25 30
Lys Pro Gly Pro Ala Leu Ser Tyr Pro Gln Glu Glu Ala Thr Leu Asn
35 40 45
Glu Met Phe Arg Glu Val Glu Glu Leu Val Glu Asp Thr Gln His Lys
50 55 60
Leu Arg Ser Ala Val Glu Glu Met Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ala Lys
65 70 75 80
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85 90 95
Glu Thr Asn Thr Asp Thr Lys Val Gly Asn Asn Thr Ile His Val His
100 105 110
Arg Glu Ile His Lys Ile Thr Asn Asn Gln Ala Arg Gln Met Val Phe
115 120 125
Ser Glu Thr Val Ile Thr Ser Val Gly Asp Glu Glu Gly Arg Arg Ser
130 135 140
His Glu Cys Ile Ile Asp Glu Asp Cys Gly Pro Ser Met Tyr Cys Gln
145 150 155 160
Phe Ala Ser Phe Gln Tyr Thr Cys Gln Pro Cys Arg Gly Gln Arg Met
165 170 175
Leu Cys Thr Arg Asp Ser Glu Cys Cys Gly Asp Gln Leu Cys Val Trp
180 185 190
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195 200 205
Asp Asn Gln Arg Asp Cys Gln Pro Gly Leu Cys Cys Ala Phe Gln Arg
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Val Gly Ser Arg Asp Gln Asp Gly Glu Ile Leu Leu Pro Arg Glu Val
290 295 300
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Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Glu Glu Ile
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<210>3
<211>117
<212>DNA
<213>人
<400>3
atgcagcggc ttggggccac cctgctgtgc ctgctactgg cggcggcggt ccccacggcc 60
cccgcgcccg ctccgacggc gacctcggct ccagtcaagc ccggcccggc tctcagc 117
<210>4
<211>234
<212>DNA
<213>人
<400>4
atgcagcggc ttggggccac cctgctgtgc ctgctactgg cggcggcggt ccccacggcc 60
cccgcgcccg ctccgacggc gacctcggct ccagtcaagc ccggcccggc tctcagctac 120
ccgcaggagg aggccaccct caatgagatg ttccgcgagg ttgaggaact ggtggaggac 180
acgcagcaca aattgcgcag cgcggtggaa gagatggagg cagaagaagc tgct 234
Claims (7)
1.一种对具有抗癌药物抗性的癌细胞具有抗癌药物增强作用的癌细胞死亡诱导剂，所述癌细胞死亡诱导剂包含以下REIC/Dkk-3 DNA作为活性成分：
(a)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成的DNA；
(b)在严谨条件下与由和SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的DNA杂交并且编码具有细胞死亡诱导活性的蛋白质的DNA；
(c)由从SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第1位核苷酸开始并且在第117位核苷酸～234位核苷酸之间的任一核苷酸处终止的核苷酸序列组成的多核苷酸；或
(d)在严谨条件下与由和从SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第1位核苷酸开始并且在117位核苷酸～234位核苷酸之间的任一核苷酸处终止的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交、并且具有细胞死亡诱导活性的多核苷酸。
2.一种对具有抗癌药物抗性的癌细胞具有抗癌药物增强作用的癌细胞死亡诱导剂，所述癌细胞死亡诱导剂包含含有以下REIC/Dkk-3 DNA的载体作为活性成分：
(a)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成的DNA；
(b)在严谨条件下与由和SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的DNA杂交并且编码具有细胞死亡诱导活性的蛋白质的DNA；
(c)由从SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第1位核苷酸开始并且在第117位核苷酸～234位核苷酸之间的任一核苷酸处终止的核苷酸序列组成的多核苷酸；或
(d)在严谨条件下与由和从SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第1位核苷酸开始并且在117位核苷酸～234位核苷酸之间的任一核苷酸处终止的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交、并且编码具有细胞死亡诱导活性的多肽的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的具有抗癌药物增强作用的癌细胞死亡诱导剂，其中所述载体为腺病毒载体。
4.如权利要求1～3中任一项所述的具有抗癌药物增强作用的癌细胞死亡诱导剂，其中所述抗癌药物为抗癌抗生素。
5.一种用于对抗癌药物有抗性的癌的治疗药物，所述治疗药物包含如权利要求1～4中任一项所述的具有抗癌药物增强作用的癌细胞死亡诱导剂。
6.一种用于对抗癌药物有抗性的癌的治疗药物，所述治疗药物是包含所述抗癌药物和如权利要求1～4中任一项所述的癌细胞死亡诱导剂的试剂盒。
7.如权利要求6所述的用于对抗癌药物有抗性的癌的治疗药物，其中所述抗癌药物为抗癌抗生素。
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