WO2015199039A1 - 細胞の多核化を誘導するペプチドおよびその利用 - Google Patents

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菜穂子 ベイリー小林
徹彦 吉田
誠 澤田
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東亞合成株式会社
国立大学法人名古屋大学
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Definitions

  • the present invention relates to a synthetic peptide capable of polynucleating a target cell and use thereof. Specifically, the present invention relates to a multinucleation-inducing agent (pharmaceutical composition) containing the peptide and a method for inducing multinucleation using the peptide.
  • a multinucleation-inducing agent pharmaceutical composition
  • this application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2014-128431 filed on June 23, 2014, the entire contents of which are incorporated herein by reference. ing.
  • multinucleated cells are known. Examples of multinucleated cells that normally exist in a living body (cells that exhibit normal functions in the form of multinucleated cells) include megakaryocytes and osteoclasts. Osteoclasts are multinucleated cells differentiated from hematopoietic stem cells and are responsible for destroying old bone tissue (bone resorption) and are involved in bone remodeling (bone remodeling) and bone growth (non- Patent Document 1).
  • Non-patent Document 2 Megakaryocytes are multinucleated cells differentiated from hematopoietic stem cells and are responsible for producing platelets.
  • platelets are essential blood components (cell components in blood) for blood coagulation and hemostasis, and are in high demand in leukemia, bone marrow transplantation, surgical operations and the like.
  • blood products by blood donation are used in many platelet transfusions for patients who require administration of platelets.
  • the supply of platelets for blood transfusion tends to be unstable due to a short storage period (effective period) after blood collection and a decrease in donors.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • hematopoietic stem cells iPS cells, also called induced pluripotent stem cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • hematopoietic stem cells iPS cells, also called embryonic stem cells
  • hematopoietic stem cells iPS cells, also called embryonic stem cells
  • hematopoietic stem cells hematopoietic stem cells
  • Patent Document 1 describes a technique for establishing a megakaryocyte progenitor cell line immortalized by forcibly expressing a specific gene.
  • Patent Document 2 discloses that a specific gene is forcibly expressed in order to improve the production amount of functional platelets (platelets retaining in vivo activity such as hemostasis) from megakaryocytes in vitro. A technique for promoting multinucleation of megakaryocytes is described.
  • tumor cells are more active and cell growth rate is significantly higher than normal cells. Therefore, many anticancer drugs aimed at killing or inhibiting the growth of tumor cells use drugs that inhibit cell division of tumor cells (cancer cells). Examples of such drugs that inhibit cell division include alkylating agents, antimetabolites, and microtubule agents.
  • An alkylating agent acts on DNA to crosslink double-stranded bases
  • an antimetabolite such as 5-FU inhibits DNA synthesis
  • a microtubule-acting agent is a microtubule polymerization or Inhibition of mitosis by inhibition of depolymerization inhibits cell division of tumor cells (cancer cells), respectively.
  • anticancer agents anticancer compositions
  • drugs that are more effective and have a lower risk of side effects, or drugs that are highly effective and inexpensive.
  • a tumor cell can be inhibited by dividing the tumor cell artificially and actively into a multinuclear cell, it can be used as a new anticancer technique (anticancer agent).
  • the present invention was created with the object of developing a technique capable of artificially multinucleating target cells. Specifically, it is a peptide having a relatively short chain length that can be artificially synthesized.
  • An object of the present invention is to provide an artificial peptide that serves the purpose of inducing multinucleation of target cells.
  • Another object is to provide a multinucleation inducer (pharmaceutical composition) containing such a peptide.
  • Another object of the present invention is to provide a method for inducing multinucleation in a target cell using such a peptide.
  • the present inventors diligently researched various peptides to contribute to the purpose of inducing multinucleation for the target cells. And surprisingly, by supplying a peptide synthesized to contain the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 to the target cell, it was found that the cell can be multinucleated or multinucleated can be promoted, The present invention has been completed. In addition, by inducing multinucleation of tumor cells, the present inventors can inhibit normal cell division, and can prevent or suppress the growth of target (target) tumor cells (cancer cells). It was confirmed.
  • the cell in order to achieve the above object, can be multinucleated when supplied to a target cell (typically when added to a medium in which the cell is cultured), or the cell There is provided an artificially synthesized peptide characterized by having the ability to promote the multinucleation of the peptide (hereinafter also referred to as “multinucleation-inducing activity”).
  • the synthetic peptide disclosed here includes the following amino acid sequences (A) and (B) in the peptide chain: (A) an amino acid sequence constituting a membrane-permeable peptide sequence; and (B) CPDGAKARC (SEQ ID NO: 1) constituting a multinucleation-inducing peptide sequence having an activity of inducing multinucleation in at least one eukaryotic cell.
  • CPDGAKARC SEQ ID NO: 1
  • CSRRSSKSKC SEQ ID NO: 2
  • a modified amino acid sequence in which one or several amino acid residues in the amino acid sequence are substituted, deleted, and / or added.
  • a modified amino acid sequence constituting a multinucleation-inducing peptide sequence having an activity of inducing multinucleation in at least one eukaryotic cell It is an artificially synthesized peptide having the activity of inducing multinucleation against at least one eukaryotic cell characterized by having
  • a synthetic peptide (including a peptide comprising the above-mentioned modified amino acid sequence) containing a multinucleation-inducing peptide sequence and a membrane-permeable peptide sequence, that is, a synthetic peptide having multinucleation-inducing activity is referred to as “multinucleation-inducing property. Also called “synthetic peptide”.
  • the multinucleation-inducing synthetic peptide disclosed herein has a multinucleation-inducing peptide sequence as shown in (B) above in the peptide chain.
  • a target (target) cell typically in a medium in which the cell is cultured
  • the target cell is induced to multinucleate or promote multinucleation. can do.
  • such a multinucleation-inducing synthetic peptide has a membrane-permeable peptide sequence as shown in (A) above in the peptide chain, a cell (typically the cell) targeting the peptide (target) In the culture medium), the above-described multinucleation-inducing peptide sequence can be efficiently transferred from the outside of the eukaryotic cell (outside the cell membrane) into the cell.
  • polynucleation can be induced in the target cells by supplying a synthetic peptide, there is no concern about insertion of a foreign gene into the genome due to gene transfer.
  • the target by a simple processing method of supplying a multinucleation-inducing synthetic peptide to a target (target) cell (typically in a medium in which the cell is cultured). Induction of multinucleation of cells can be realized.
  • the multinucleation-inducing synthetic peptide disclosed here can be easily and artificially produced by chemical synthesis (or biosynthesis). When such a multinucleation-inducing synthetic peptide is used, the target cell is multinucleated without using a large amount of expensive humoral factors such as cytokines (typically as an alternative to humoral factors). Therefore, multinucleation induction of target (target) cells can be realized at low cost.
  • the multinucleation-inducing synthetic peptide disclosed here has a simple structure (typically a linear peptide chain), and has high structural stability, so that it is excellent in handleability.
  • the amino acid sequence constituting the (A) membrane-permeable peptide sequence is any one selected from SEQ ID NOs: 3 to 11 Or a modified amino acid sequence in which one or several amino acid residues in the amino acid sequence are substituted, deleted, and / or added, and constitutes a membrane-permeable peptide sequence. It is characterized by being. All of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 11 are typical examples of amino acid sequences constituting a membrane-permeable peptide, and can be suitably employed as the membrane-permeable peptide sequence shown in (A) above.
  • any amino acid sequence (typically SEQ ID NO: 3 to 6) which is a signal sequence for localizing a protein to a nucleolus in a nucleus and known as a nucleolus localization signal (NoLS). It is preferable to employ the amino acid sequence shown in FIG.
  • the membrane-permeable peptide sequence composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is a typical example of the NoLS, and is particularly preferable from the viewpoint of the efficiency of transferring the multinucleation-inducing peptide sequence into cells.
  • a preferred embodiment of the synthetic peptide (multinucleation-inducing synthetic peptide) disclosed herein is characterized in that the total amino acid sequence constituting the peptide chain is 30 or less.
  • a peptide consisting of such a short peptide chain is easy to synthesize chemically, has a relatively low production cost, and is excellent in handleability. For this reason, for example, it can be preferably used as a component of a multinucleation inducer.
  • the synthetic peptide multinucleation-inducing synthetic peptide
  • the following amino acid sequence KKRTLRRKNDRKKRGCPDGAKARC (SEQ ID NO: 12); and KKRTLRKNDRKRKGCSRRSSKSK (SEQ ID NO: 13); It is characterized by having any of these.
  • Such multinucleation-inducing synthetic peptides are particularly suitable for use in inducing multinucleation of cells derived from humans or non-human mammals.
  • the present invention provides a multinucleation inducer used for inducing multinucleation of at least one eukaryotic cell, wherein the multinucleation induction according to any of the embodiments disclosed herein is performed.
  • Multinucleation-inducing agent comprising a synthetic synthetic peptide and a pharmaceutically acceptable carrier (for example, at least one base material that contributes to improving the stability of the peptide, or a liquid medium such as physiological saline or various buffer solutions) (Pharmaceutical composition) is provided.
  • the composition (the multinucleation-inducing synthetic peptide) is included in the composition (the multinucleation-inducing synthetic peptide) because the composition includes the above-described multinucleation-inducing peptide sequence (the multinucleation-inducing synthetic peptide).
  • the multinucleation inducer disclosed here is preferably used for the purpose of multinucleating tumor cells derived from humans or mammals other than humans.
  • target cells include malignant tumor cells (cancer cells), such as squamous cell carcinoma cells and adenocarcinoma cells.
  • cancer cells malignant tumor cells
  • the multinucleation inducer disclosed here By inducing multinucleation in tumor cells with the multinucleation inducer disclosed here, cell division of the multinucleated cells (multinucleated cells) is inhibited, and as a result, the growth of tumor cells is prevented or suppressed. can do.
  • the multinucleation-inducing agent disclosed herein can be used as a composition for suppressing the growth of tumor cells derived from humans or non-human mammals. That is, since the multinucleation inducer disclosed here can exert an antitumor effect on the target tumor cells, it can be suitably used as an antitumor composition (anticancer agent).
  • the present invention provides a method for multinucleating at least one eukaryotic cell in vivo or in vitro.
  • One preferred embodiment is a method for inducing multinucleation on at least one eukaryotic cell in vitro, comprising: Preparing a cell culture containing the cells of interest in vitro, and in the cell culture, the multinucleation-inducing synthetic peptide of any of the embodiments disclosed herein (or a multinucleation-inducing agent containing the synthetic peptide) Is provided at least once, and culturing the cell culture supplied with the peptide.
  • the target cell (and the cell) can be obtained by a simple method using a synthetic peptide (or a multinucleation inducing agent containing the synthetic peptide) having a simple structure as a multinucleation inducer as described above. It is possible to efficiently induce multinucleation (to promote multinucleation).
  • the above-described method for inducing multinucleation disclosed herein can be suitably implemented for the purpose of inducing multinucleation of tumor cells derived from humans or mammals other than humans.
  • the method for inducing multinucleation disclosed herein in particular, induction of multinucleation of malignant tumor cells (cancer cells), for example, cells derived from squamous cell carcinoma or adenocarcinoma can be easily realized. That is, the method for inducing multinucleation disclosed herein can inhibit cell division of tumor cells derived from humans or mammals other than humans, and can prevent or suppress the proliferation of such cells. Therefore, the multinucleation induction method disclosed here can be used as a method for treating a tumor (cancer).
  • the multinucleation-inducing synthetic peptide (or multinucleation-inducing agent containing the peptide) disclosed herein is a multinucleated cell and a pre-multinucleated cell before multinucleation (for example, a meganuclear blast before multinucleation or osteoclast before multinucleation) It can be suitably used for the purpose of inducing multinucleation of progenitor cells and the like. Thereby, increase in the number of nuclei in the multinucleated cell (promotion of multinucleation) and production (manufacturing) of a multinucleated cell (for example, megakaryocyte, osteoclast) can be realized.
  • a multinucleated cell for example, megakaryocyte, osteoclast
  • a multinucleated cell can be produced (manufactured) by a simple method in which a synthetic peptide having a simple structure (that is, a multinucleation inducer containing the synthetic peptide) is used as a multinucleation inducer. This is preferable because it is possible.
  • multinucleated cells eg, megakaryocytes, osteoclasts, etc.
  • multinucleated cells eg, megakaryocytes, osteoclasts, etc.
  • cells produced from the multinucleated cells for example, platelets
  • biosynthetic materials for example, physiologically active substances such as secretory proteins and hormones
  • megakaryocytes produced (manufactured) by the method disclosed herein that is, megakaryocytes that are sufficiently multinucleated
  • produce cells for transplantation typically for bone marrow transplantation
  • platelets in vitro can be used as a cultured cell line.
  • a platelet preparation blood preparation
  • a platelet preparation can be produced by using platelets produced from megakaryocytes produced (manufactured) by the method disclosed herein. Thereby, supply of platelets (platelet preparation) independent of blood donation can be realized.
  • FIG. 1 is a fluorescence micrograph (image) obtained by examining the state of the HeLaS3 cell after adding the multinucleation-inducing synthetic peptide (sample 1) according to one example to the culture medium of HeLaS3 cell and culturing. It is an image obtained by superimposing (merging) a nuclear staining image by DAPI and a fluorescence image showing a result of examination by a cell immunostaining method using an anti-calreticulin antibody.
  • FIG. 1 is a fluorescence micrograph (image) obtained by examining the state of the HeLaS3 cell after adding the multinucleation-inducing synthetic peptide (sample 1) according to the culture medium of HeLaS3 cell and culturing. It is an image obtained by superimposing (merging) a nuclear staining image by DAPI and a fluorescence image showing a result of examination by a cell immunostaining method using an anti-calreticulin antibody.
  • FIG. 1 is a flu
  • FIG. 2 is a fluorescence micrograph (image) of examining the state of the HeLaS3 cells after culturing by adding the multinucleation-inducing synthetic peptide (sample 2) according to one example to the culture solution of HeLaS3 cells, It is an image obtained by superimposing (merging) a nuclear staining image by DAPI and a fluorescence image showing a result of examination by a cell immunostaining method using an anti-calreticulin antibody.
  • FIG. 3 shows the state of the HeLaS3 cells after culturing by adding a synthetic peptide (sample 3) constructed only with an amino acid sequence constituting a membrane-permeable peptide sequence as a comparative example to a culture solution of HeLaS3 cells.
  • FIG. 4 is a fluorescence micrograph (image) of the state of the HeLaS3 cells after culturing HeLaS3 cells without the addition of a multinucleation-inducing synthetic peptide, a nuclear staining image by DAPI, and an anti-calreticulin antibody. It is the image which overlap
  • amino acids are represented by one-letter code (in the sequence table, three-letter code) based on the nomenclature related to amino acids shown in the IUPAC-IUB guidelines.
  • sequence table three-letter code
  • synthetic peptide refers to an artificial chemical synthesis or biosynthesis (ie, production based on genetic engineering) that is not a peptide chain that exists independently and stably in nature. , Refers to a peptide fragment that can exist stably in a predetermined composition (for example, a multinucleation-inducing agent capable of inducing multinucleation in a subject cell).
  • a predetermined composition for example, a multinucleation-inducing agent capable of inducing multinucleation in a subject cell.
  • the “peptide” is a term indicating an amino acid polymer having a plurality of peptide bonds, and is not limited by the number of amino acid residues contained in the peptide chain, but typically the total number of amino acid residues.
  • amino acid residue is a term encompassing the N-terminal amino acid and the C-terminal amino acid of a peptide chain, unless otherwise specified. In the amino acid sequences described herein, the left side is always the N-terminal side and the right side is the C-terminal side.
  • a “modified amino acid sequence” with respect to a predetermined amino acid sequence refers to a function possessed by the predetermined amino acid sequence (for example, a cell possessed by the multinucleation-inducing activity or membrane-permeable peptide possessed by the multinucleation-inducing synthetic peptide) 1 or several (typically 1 to 5, for example 1, 2 or 3) amino acid residues are substituted, deleted and / or lost without impairing the ability to migrate from outside to inside the cell) Or an amino acid sequence formed by addition (insertion).
  • sequences resulting from conservative ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ amino ⁇ acid replacement where one or several (typically two or three) amino acid residues are conservatively substituted
  • a sequence substituted with a basic amino acid residue for example, mutual substitution of a lysine residue and an arginine residue), or one or several (typically about 1 to 5, for example, 1) of a given amino acid sequence
  • a sequence in which (2, 2 or 3) amino acid residues are added (inserted) or deleted is a typical example included in the modified amino acid sequence referred to in the present specification. Therefore, the multinucleation-inducing synthetic peptide disclosed herein includes one or several amino acids in the amino acid sequence shown in each SEQ ID NO.
  • Synthetic peptides composed of amino acid sequences in which amino acid residues are substituted (for example, the above-mentioned conservative substitutions), deleted and / or added, and similarly include synthetic peptides exhibiting multinucleation-inducing activity.
  • tumor is a term that is interpreted in a broad sense and refers to tumors in general (typically malignant tumors) including carcinomas and sarcomas or blood and hematopoietic tissue lesions (leukemia, lymphoma, etc.).
  • the “tumor cell” refers to a cell that forms such a tumor. Typically, it refers to a cell (so-called cancerous cell) that has abnormally grown independently of the surrounding normal tissue. Therefore, unless otherwise specified, a cell that is classified as a tumor cell (cancer cell) rather than a normal cell is referred to as a tumor cell regardless of the origin and properties of the cell.
  • Epithelial tumors (squamous cell carcinoma, adenocarcinoma, etc.), non-epithelial tumors (various sarcomas, osteosarcomas, etc.), various cell tumors (neuroblastoma, retinoblastoma, etc.), lymphomas, melanomas, etc.
  • the constituent cells can be included in the tumor cells referred to herein.
  • multinucleated cell is a term that means a cell that normally exists as a cell having a plurality of nuclei (typically 2 or more, for example, 4 or more) in vivo, that is, in vivo. Is a term that means a cell whose normal form is a form having multiple nuclei. Examples include megakaryocytes, osteoclasts, skeletal muscle cells, syncytial trophoblast cells present in placental villi, and foreign body giant cells that are macrophage-derived phagocytes.
  • pre-multinuclear cell before multinucleation refers to a polynuclear cell that has not been polyploidized, and is typically a mononuclear cell (with two nuclei in the mitotic phase (M phase)). Cell).
  • pre-multinucleated cells before multinucleation include megakaryocyte precursor cells (megakaryoblasts), osteoclast precursor cells (osteoclast precursor cells), and the like.
  • inducing multinucleation or “promoting multinucleation” means relatively increasing the number of nuclei in a cell as compared with a cell before inducing (promoting) multinucleation. It means to make it. For example, obtaining a cell having 2 or more (typically 4 or more, for example, 8 or more) nuclei from a mononuclear cell, or increasing the number of nuclei in a multinucleated cell induces multinucleation. (Promotion). In addition, typically, the ploidy becomes higher as the number of nuclei in the cell increases, so that “inducing (promoting) multinucleation” is relatively more ploidy than the cell before multinucleation induction.
  • a cell having a chromosome number of 2N obtaining a cell having a chromosome number of 4N or more (typically 8N or more, for example, 16N or more) is called induction (promotion) of multinucleation. it can.
  • the multinucleation-inducing synthetic peptide disclosed herein is supplied to a cultured cell of a predetermined eukaryotic cell (typically, a cell derived from a human or non-human mammal, bird, or other animal) ( It is typically added to the medium in which the cells are cultured) and can induce multinucleation or promote multinucleation (ie, increase the number of nuclei in the cells).
  • a synthetic peptide ie, a multinucleation-inducing synthetic peptide first discovered by the present inventors to have an action, ie, a multinucleation-inducing activity.
  • the multinucleation inducer disclosed herein is a composition (pharmaceutical composition) capable of inducing (promoting) multinucleation to a target cell, and is at least one of the above-mentioned multinucleation-inducing synthetic peptides. Is contained as an active ingredient (that is, a substance involved in inducing multinucleation of a target cell).
  • the multinucleation-inducing synthetic peptide disclosed herein includes, as a partial amino acid sequence (peptide motif), an amino acid sequence constituting the membrane-permeable peptide sequence defined in (A) above and (B) above. And the amino acid sequence constituting the multinucleation-inducing peptide sequence defined in (1).
  • the (B) multinucleation-inducing peptide sequence of the multinucleation-inducing synthetic peptide is a sequence having multinucleation-inducing activity, and (A) a peptide having good multinucleation-inducing activity by combining with a membrane-permeable peptide sequence.
  • the multinucleation-inducing peptide sequence has the following amino acid sequence: CPDGAKARC (SEQ ID NO: 1); and CSRRSKSKC (SEQ ID NO: 2); Or a modified amino acid sequence thereof.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is the first amino acid sequence from the N-terminal side of the amino acid sequence information obtained by the inventor by independently translating the RNA sequence constituting the human-derived centrin 2 siRNA. 2nd, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th amino acid residues from the C-terminal side to the 1st, 2nd, respectively Total 9 amino acids obtained by reversing and rearranging to the 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th amino acid residues An artificial amino acid sequence of residues.
  • centrin is a centrosome-related protein that exists in the centrosome of eukaryotes and is involved in centriole duplication and microtubule cleavage as one of the centrosome constituent proteins. It is one of the proteins belonging to the Centrin family (typically Centrin 1, Centrin 2, Centrin 3, etc.) (Non-patent Document 3).
  • the amino acid sequence constituting the (A) membrane-permeable peptide sequence of the multinucleation-inducing synthetic peptide disclosed herein is particularly an amino acid sequence that constitutes a membrane-permeable peptide that can pass through the cell membrane and / or the nuclear membrane.
  • Many amino acid sequences that can function suitably as membrane-permeable peptides ie, membrane-permeable peptide sequences
  • amino acid sequences related to NoLS (Nucleolar localization signal) (modified) (Including the amino acid sequence) is preferable as the amino acid sequence of the membrane-permeable peptide sequence of the multinucleation-inducing synthetic peptide.
  • Preferred examples of the membrane-permeable peptide sequence related to the NoLS and other membrane-permeable peptide sequences (including modified amino acid sequences) are shown in SEQ ID NOs: 3 to 11. Specifically, it is as follows.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is from the 491st amino acid residue to the 503rd amino acid residue of LIM kinase 2 (LIM Kinase 2) present in human endothelial cells, which is one type of protein kinase involved in intracellular signal transduction.
  • LIM Kinase 2 LIM Kinase 2
  • SEQ ID NO: 4 corresponds to NoLS consisting of a total of 14 amino acid residues derived from FGF2 (basic fibroblast growth factor).
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 corresponds to NoLS consisting of a total of 8 amino acid residues contained in the N protein (nucleocapsid protein) of IBV (avian infectious bronchitis virus).
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 corresponds to NoLS consisting of a total of 13 amino acid residues derived from adenovirus PTP (pre-terminal protein) 1 and PTP2.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 corresponds to a membrane-permeable peptide sequence consisting of a total of 11 amino acid residues derived from a protein transduction domain contained in TAT of HIV (Human Immunodeficiency Virus).
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 corresponds to a membrane-permeable peptide sequence consisting of a total of 11 amino acid residues of the protein transduction domain (PTD4) modified with the TAT.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 corresponds to a membrane-permeable peptide sequence consisting of a total of 16 amino acid sequences derived from Antennapedia ANT, a mutant of Drosophila.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 corresponds to a membrane-permeable peptide sequence consisting of a total of 9 consecutive arginine residues as polyarginine.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 corresponds to a membrane-permeable peptide sequence consisting of a total of 19 amino acid residues derived from a MyoD (myoblast determination) family inhibitory domain-containing protein.
  • the above-mentioned membrane-permeable peptide sequences shown in the sequence listing are merely examples, and usable peptide sequences are not limited thereto.
  • Various membrane-permeable peptide sequences that can be used in the practice of the present invention are described in numerous publications published at the time of filing this application. The amino acid sequences of these membrane-permeable peptide sequences can be easily known by general search means.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (including the modified amino acid sequence) described in Patent Document 3 is preferable as the membrane-permeable peptide sequence.
  • the membrane-permeable peptide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and the above-described multinucleation-inducing peptide sequence, a synthetic peptide having high multinucleation-inducing activity can be obtained.
  • the peptide chain (amino acid sequence) of the multinucleation-inducing synthetic peptide disclosed here is constructed by appropriately combining (B) the multinucleation-inducing peptide sequence and (A) the membrane-permeable peptide sequence as described above. can do. Any of the multinucleation-inducing peptide sequence and the membrane-permeable peptide sequence may be arranged relatively on the C-terminal side (N-terminal side). In addition, the multinucleation-inducing peptide sequence and the membrane-permeable peptide sequence are preferably arranged adjacent to each other.
  • the number of residues is about 1 to 3 preferable.
  • one or several (typically one, two or three) amino acid residues (eg one or two) that function as a linker between a multinucleation-inducing peptide sequence and a membrane-permeable peptide sequence Several glycine (G) residues).
  • the multinucleation-inducing synthetic peptide disclosed herein is preferably one in which at least one amino acid residue is amidated. By amidating the carboxyl group of an amino acid residue (typically the C-terminal amino acid residue of the peptide chain), the structural stability (eg, protease resistance) of the synthetic peptide can be improved.
  • the multinucleation-inducing synthetic peptide disclosed herein is a sequence (amino acid residue) other than the amino acid sequence constituting the multinucleation-inducing peptide sequence and the membrane-permeable peptide sequence as long as the multinucleation-inducing activity is not lost. May include a portion.
  • a partial amino acid sequence is preferably a sequence capable of maintaining the three-dimensional shape (typically a linear shape) of the multinucleation-inducing synthetic peptide sequence and the membrane-permeable peptide sequence portion.
  • the total number of amino acid residues constituting the peptide chain is suitably 100 or less, desirably 60 or less, and preferably 50 or less.
  • a synthetic peptide of 30 or less is particularly preferable.
  • Such a peptide having a short chain length is easy to chemically synthesize, and can provide a multinucleation-inducing synthetic peptide at low cost.
  • the peptide conformation (three-dimensional structure) is not limited as long as it exhibits multinucleation-inducing activity that induces multinucleation on the target eukaryotic cell in the environment used (in vitro or in vivo).
  • the multinucleation-inducing synthetic peptide applied to the multinucleation-inducing agent is linear and has a relatively low molecular weight (typically 50 amino acid residues or less, particularly preferably 30 or less amino acid residues). Base number) is preferred.
  • Proportion of the multinucleation-inducing peptide sequence and the membrane-permeable peptide sequence to the entire amino acid sequence (peptide chain) ie, the multinucleation-inducing peptide occupying the total number of amino acid residues constituting the peptide chain of the multinucleation-inducing synthetic peptide
  • the number of amino acid residues constituting the sequence and the membrane-permeable peptide sequence is not particularly limited as long as it does not lose the multinucleation-inducing activity for inducing multinucleation in the target cell, but the ratio is approximately 60% or more. Is preferable, and 80% or more is preferable. 90% or more is particularly preferable.
  • a peptide consisting of a multinucleation-inducing peptide sequence and a membrane-permeable peptide sequence that is, if these sequences are 100% of the total amino acid sequence or contain one to several linkers occupy other than the linker.
  • the multinucleation-inducing synthetic peptide of the present invention is preferably one in which all amino acid residues are L-type amino acids, but does not lose the multinucleation-inducing activity for inducing multinucleation in the target eukaryotic cell. As long as a part or all of the amino acid residue is substituted with a D-type amino acid.
  • a preferred embodiment of the multinucleation-inducing synthetic peptide disclosed herein is the following amino acid sequence: KKRTLRRKNDRKKRGCPDGAKARC (SEQ ID NO: 12); and KKRTLRKNDRKRKGCSRRSSKSK (SEQ ID NO: 13);
  • the amino acid sequence selected from any of the above or a modified amino acid sequence of the selected amino acid sequence is particularly preferably contained.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13 comprises a multinucleation-inducing peptide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and an amino acid sequence derived from NoLS of LIM kinase 2 shown in SEQ ID NO: 3. It is an amino acid sequence consisting of a total of 24 amino acid residues constructed by combining via a linker consisting of one glycine (G) residue.
  • the multinucleation-inducing synthetic peptide disclosed here can be easily produced according to a general chemical synthesis method.
  • any conventionally known solid phase synthesis method or liquid phase synthesis method may be employed.
  • a solid phase synthesis method in which Boc (t-butyloxycarbonyl) or Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) is applied as an amino-protecting group is preferred.
  • the multinucleation-inducing synthetic peptide disclosed here is obtained by a solid phase synthesis method using a commercially available peptide synthesizer (for example, available from Intavis AG, Protein Technologies, etc.), Peptide chains having modified (such as C-terminal amidation) moieties can be synthesized.
  • a multinucleation-inducing synthetic peptide may be biosynthesized based on a genetic engineering technique. That is, a polynucleotide (typically DNA) having a nucleotide sequence (including the ATG start codon) encoding the amino acid sequence of a desired multinucleation-inducing synthetic peptide is synthesized. And it includes various regulatory elements (promoter, ribosome binding site, terminator, enhancer, and various cis elements that control the expression level) for expressing the synthesized polynucleotide (DNA) and the amino acid sequence in the host cell.
  • a recombinant vector having a gene construct for expression consisting of) is constructed according to the host cell.
  • This recombinant vector is introduced into a predetermined host cell (for example, yeast, insect cell, plant cell) by a general technique, and the host cell or a tissue or an individual containing the cell is cultured under a predetermined condition. Thereby, the target peptide can be expressed and produced in the cell. Then, the target multinucleation-inducing synthetic peptide can be obtained by isolating the peptide from the host cell (in the medium if secreted) and performing refolding, purification, etc. as necessary.
  • a predetermined host cell for example, yeast, insect cell, plant cell
  • a method for constructing a recombinant vector and a method for introducing the constructed recombinant vector into a host cell a method conventionally used in the field may be employed as it is, and such method itself particularly characterizes the present invention. Since it is not a thing, detailed description is abbreviate
  • a fusion protein expression system can be used for efficient mass production in a host cell. That is, a gene (DNA) encoding an amino acid sequence of a target multinucleation-inducing synthetic peptide is chemically synthesized, and the synthetic gene is converted into an appropriate fusion protein expression vector (for example, pET series and Amersham Bio provided by Novagen). It is introduced into a suitable site of GST (Glutathione S-transferase) fusion protein expression vector such as pGEX series provided by Science. A host cell (typically E. coli) is transformed with the vector. The obtained transformant is cultured to prepare the desired fusion protein. The protein is then extracted and purified.
  • a gene DNA
  • encoding an amino acid sequence of a target multinucleation-inducing synthetic peptide is chemically synthesized, and the synthetic gene is converted into an appropriate fusion protein expression vector (for example, pET series and Amersham Bio provided by Novagen). It is introduced into a suitable site of GST
  • the obtained purified fusion protein is cleaved with a predetermined enzyme (protease), and the released target peptide fragment (designed multinucleation-inducing synthetic peptide) is recovered by a method such as affinity chromatography. Further, refolding is performed by an appropriate method as necessary.
  • a conventionally known fusion protein expression system for example, the GST / His system provided by Amersham Biosciences can be used
  • the multinucleation-inducing synthetic peptide disclosed herein is produced. Can do.
  • a template DNA for a cell-free protein synthesis system that is, a synthetic gene fragment containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of a multinucleation-inducing synthetic peptide
  • various compounds ATP, RNA polymerase necessary for peptide synthesis
  • the target polypeptide can be synthesized in vitro using a so-called cell-free protein synthesis system.
  • cell-free protein synthesis systems for example, Shimizu et al. (Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755 (2001)), Madin et al. (Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • a single-stranded or double-stranded polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding the multinucleation-inducing synthetic peptide disclosed herein and / or a nucleotide sequence complementary to the sequence can be easily produced by a conventionally known method ( Synthesis). That is, by selecting a codon corresponding to each amino acid residue constituting the designed amino acid sequence, a nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence of the multinucleation-inducing synthetic peptide is easily determined and provided.
  • a polynucleotide (single strand) corresponding to the desired nucleotide sequence can be easily obtained using a DNA synthesizer or the like. Furthermore, using the obtained single-stranded DNA as a template, various enzymatic synthesis means (typically PCR) can be employed to obtain the desired double-stranded DNA.
  • the polynucleotide may be in the form of DNA or RNA (mRNA or the like). DNA can be provided as double-stranded or single-stranded. When provided as a single strand, it may be a coding strand (sense strand) or a non-coding strand (antisense strand) having a sequence complementary thereto.
  • the polynucleotide thus obtained is a material for constructing a recombinant gene (expression cassette) for producing a multinucleated inducible synthetic peptide in various host cells or in a cell-free protein synthesis system as described above. Can be used as
  • the multinucleation-inducing synthetic peptide disclosed here may be in the form of a salt as long as the multinucleation-inducing activity is not impaired.
  • a salt for example, an acid addition salt of the peptide that can be obtained by addition reaction of an inorganic acid or an organic acid usually used according to a conventional method can be used.
  • another salt for example, metal salt
  • the “peptide” described in the present specification and claims includes such a salt form.
  • the multinucleation-inducing agent disclosed herein is pharmaceutically (pharmaceutical) acceptable depending on the form of use as long as the multinucleation-inducing synthetic peptide that is an active ingredient can be retained without losing its multinucleation-inducing activity.
  • Various (at least one) carriers that can be made can be included. Carriers generally used in peptide medicine as diluents, excipients and the like are preferred. Typically, water, a physiological buffer, and various organic solvents can be mentioned, although it may vary depending on the use and form of the multinucleation inducer. It can be a non-drying oil such as an aqueous solution of alcohol (such as ethanol) of a suitable concentration, glycerol, olive oil.
  • the secondary component that can be contained in the multinucleation inducer include various fillers, extenders, binders, moistening agents, surfactants, dyes, and fragrances.
  • the form of the multinucleation inducer includes solutions, suspensions, emulsions, aerosols, foams, granules, powders, tablets, capsules, ointments, aqueous gels and the like.
  • it can also be set as the freeze-dried material and granulated material for melt
  • compositions using multinucleation-inducing synthetic peptides (main components) and various carriers (subcomponents) as materials may be in accordance with conventionally known methods. Since the formulation method itself does not characterize the present invention, a detailed description is omitted. As a detailed information source on prescription, for example, Comprehensive Medicinal Chemistry, supervised by Corwin Hansch, published by Pergamon Press (1990) can be mentioned. The entire contents of this book are incorporated herein by reference.
  • the cells to which the multinucleation inducer (multinucleation-inducing synthetic peptide) disclosed herein is not particularly limited, and induces multinucleation in eukaryotic cells of various species (or induces multinucleation). Can be promoted).
  • cells of humans or non-human animals typically vertebrates, particularly mammals
  • tumor cells particularly malignant tumor cells (cancer cells), for example, squamous cell carcinoma cells and adenocarcinoma cells are suitable as target cells.
  • multinucleated cells for example, megakaryocytes and osteoclasts
  • pre-multinucleated cells before multinucleation for example, megakaryocytes or osteoclasts
  • a cell or a precursor cell of a megakaryocyte before multinucleation for example, a megakaryocyte before multinucleation
  • an osteoclast precursor cell before multinucleation osteoclast precursor cell
  • the multinucleation-inducing agent (multinucleation-inducing synthetic peptide) disclosed herein can be used in a method or dosage depending on its form and purpose. For example, when inducing multinucleation on a target cell (eg, tumor cell, or multinucleated cell or pre-multinucleated cell before multinucleation) cultured (passaged) in vitro (in vitro), An appropriate amount of the disclosed multinucleation-inducing agent (ie, a multinucleation-inducing synthetic peptide) is applied to a cultured cell (cell culture) to be subjected to multinucleation at any stage (preferably for a predetermined period).
  • a target cell eg, tumor cell, or multinucleated cell or pre-multinucleated cell before multinucleation
  • An appropriate amount of the disclosed multinucleation-inducing agent ie, a multinucleation-inducing synthetic peptide
  • the cultured cells include established cell lines and primary cultured cells, cell materials (cells, living tissues, cell masses, etc.) temporarily or permanently removed from living organisms, or stem cells (eg, iPS cells and ES).
  • Cell material typically cells including tissues, cell masses, organs, etc. obtained by inducing differentiation from cells, hematopoietic stem cells, and the like.
  • the supply amount and the supply frequency of the multinucleation inducer are the conditions such as the type of cultured cells, cell density (cell density at the start of culture), passage number, culture conditions, type of medium, etc.
  • the concentration of the polynuclearization-inducing synthetic peptide in the medium is generally within the range of 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably Is supplied to a cultured cell (cell culture) one or more times so that it falls within a range of 0.5 ⁇ M to 80 ⁇ M (for example, 1 ⁇ M to 50 ⁇ M) It is preferable that additional supply is made according to the circumstances.
  • the multinucleation inducer disclosed herein ie, An appropriate amount of the polynuclearization-inducing synthetic peptide
  • a target cell for example, a tumor cell, a multinuclear cell or a multinucleated cell before multinucleation
  • the multinucleation inducer disclosed herein ie, An appropriate amount of the polynuclearization-inducing synthetic peptide
  • a solid form such as a tablet or a gel or aqueous jelly such as an ointment is directly applied to a target tissue (for example, an affected area of a tumor or a tissue in which multinucleation of target cells such as bone marrow or bone) occurs. It can be administered in the vicinity of the tissue. Alternatively, it may be administered orally or in the form of suppositories. Thereby, multinucleation can be induced with respect to cells in a living body, typically target cells existing in or around the target tissue.
  • derivation agent namely, multinucleation induction synthetic peptide
  • the multinucleation inducer (multinucleation inducing synthetic peptide) disclosed here is used in combination with a humoral factor (eg, cytokine) or a composition (eg, inhibitor) according to the type and purpose of the target cell. can do.
  • a humoral factor eg, cytokine
  • a composition eg, inhibitor
  • anticancer agents include alkylating agents, antimetabolites, microtubule agonists, platinum preparations, anticancer antibiotics, hormone agents, molecular targeted therapeutic agents, and the like.
  • multinucleation-inducing factors include, for example, thrombopoietin (TPO), various interleukins (for example, IL) in the case of inducing (promoting) multinucleation to megakaryocytes (or megakaryocytes before multinucleation).
  • TPO thrombopoietin
  • IL interleukins
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony-stimulating factor
  • EPO Erythropoietin, erythropoietin
  • SCF stem cell factor
  • ROCK Ro-associated coiled-coil forming kinase inhibitors
  • HDAC histone deacetylase
  • TNF tumor necrosis factor
  • RANKL receptor activator of NF- ⁇ B ligand
  • Tumor necrosis factor a factor belonging to the superfamily
  • M-CSF macrophage colony stimulating factor
  • the multinucleation-inducing agent multinucleation-inducing synthetic peptide
  • the multinucleation-inducing activity causes the tumor cells to become multinucleated.
  • the cell division of the tumor cell can be suppressed (inhibited), and the cell proliferation of the tumor cell can be suppressed (inhibited).
  • the multinucleation inducer disclosed here can be used as a pharmaceutical composition (antitumor composition, anticancer agent) that can be used for tumor treatment (cancer treatment).
  • the multinucleation-inducing agent (multinucleation-inducing synthetic peptide) disclosed herein is administered so that multinucleated cells (for example, megakaryocytes, osteoclasts, etc.) in the body are supplied to the tissue that becomes multinucleated.
  • multinucleated cells eg, megakaryocytes and osteoclasts
  • pre-multinucleated cells prior to multinucleation eg, megakaryoblasts before multinucleation, osteoclast precursor cells before multinucleation
  • an appropriate amount of a multinucleation-inducing agent (multinucleation-inducing synthetic peptide) is applied to a target cell (for example, a multinuclear cell or a pre-multinuclear cell before multinucleation), and the target cell is induced to be multinucleated.
  • a target cell for example, a multinuclear cell or a pre-multinuclear cell before multinucleation
  • the target cell is induced to be multinucleated.
  • a cell material live tissue or cell mass, for example, cell culture
  • a stem cell cultured in vitro (passaged) Predetermined cells (including tissues and organs composed of the cells) obtained by inducing differentiation from iPS cells (for example, iPS cells, ES cells, hematopoietic stem cells, etc.) can be used.
  • iPS cells for example, iPS cells, ES cells, hematopoietic stem cells, etc.
  • a cell ie, a multinucleated cell produced by the technology disclosed herein, or a multinucleated cell having an increased number of nuclei in the cell
  • a tissue in which the cell functions ie, in a patient's body
  • multinucleated cell material multinucleated cells, or a cell mass or tissue containing multinucleated cells
  • cells and biosynthetic products for example, secreted proteins and Physiologically active substances such as hormones
  • the technique disclosed here can be suitably used in a method for producing platelets from megakaryocytes.
  • Sufficiently multinucleated megakaryocytes produce a larger number of platelets per cell (tens to hundreds of times) than megakaryocytes that are insufficiently multinucleated, thus producing platelets per megakaryocyte In order to increase the amount, it is important to promote multinucleation of megakaryocytes.
  • a blood product (platelet product) can be manufactured using the platelets produced (manufactured) according to the present invention.
  • Example 1 Peptide synthesis> A total of three types of peptides (samples 1 to 3) were produced using the peptide synthesizer described below. Table 1 lists information such as amino acid sequences of these synthetic peptides.
  • the peptides according to Samples 1 and 2 have a multinucleation-inducing synthetic peptide sequence on the C-terminal side of the peptide chain, and two glycine (G) residues on the N-terminal side.
  • the peptide of sample 2 (SEQ ID NO: 13) is a peptide having a total of 24 amino acid residues having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 as a multinucleation-inducing synthetic peptide sequence.
  • the peptide according to sample 3 is a peptide having a total of 13 amino acid residues consisting of only the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) derived from LIM kinase 2 which is a membrane-permeable peptide sequence.
  • the synthetic peptides according to Samples 1 to 3 are linear peptides, and the synthetic peptide is a solid phase synthesis method (Fmoc method) according to the manual using a commercially available peptide synthesizer (product of Intavis AG). And synthesized. In addition, since the usage mode itself of the peptide synthesizer does not characterize the present invention, detailed description thereof is omitted.
  • the synthesized peptides according to samples 1 to 3 were dissolved in PBS ( ⁇ ) or DMSO to prepare a peptide stock solution.
  • Example 2 Test for evaluating the multinucleation-inducing activity of synthetic peptides against tumor cells-1> Regarding the multinucleation-inducing activity of the multinucleation-inducing synthetic peptides (sample 1 and sample 2) obtained in Example 1 above, cell immunostaining (fluorescence immunostaining) employing calreticulin as a cytoplasmic marker was performed. Evaluation was performed by performing nuclear staining with DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole). HeLaS3 cells (ATCC (registered trademark), CCL2.2), which is a cultured cell line derived from human cervical cancer, were used as test cells. Details of the evaluation test are as follows.
  • HeLaS3 cells were seeded in each well of a 4-well (well) cell culture slide (also referred to as a chamber) so that the number of cells was about 1 ⁇ 10 3 per well, and 5% CO 2 at 37 ° C. The culture was performed overnight in an incubator under conditions.
  • the medium is a general DMEM medium, that is, a DMEM (manufactured by Wako Pure Chemicals, Cat No. 043-30085) containing 10% FBS, 100 units / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin. Using.
  • the medium in the culture vessel was added to the above-mentioned DMEM medium containing FBS, penicillin and streptomycin, and the peptide of any of Sample 1, Sample 2 and Sample 3 in an amount of 50 ⁇ M peptide concentration was contained.
  • the medium was exchanged, and the culture was continued for 4 days under the same conditions.
  • a peptide-free group in which only the same amount of PBS (-) as the peptide stock solution added to the sample addition group was added was provided.
  • the multinucleated state in the cells of each test group was examined by the following cell immunostaining.
  • PBS ( ⁇ ) containing 3% BSA PBS ( ⁇ ) containing 3% BSA
  • blocking treatment was performed at room temperature for 1 hour.
  • 3% BSA-containing PBS ( ⁇ ) was removed and washed 3 times with cold PBS ( ⁇ ).
  • cell immunostaining for calreticulin was performed using an anti-calreticulin antibody and a secondary antibody that recognizes the antibody.
  • an anti-calreticulin monoclonal [FMC75] antibody (derived from mouse, manufactured by Abcam, Cat No. ab22683) was diluted 400 times with 1% BSA / PBS ( ⁇ ) (PBS ( ⁇ ) containing 1% BSA).
  • the diluted primary antibody was added to the above HeLaS3 cell culture vessel and allowed to stand at 4 ° C. overnight (about 16 to 18 hours). After a predetermined time, the primary antibody dilution was removed and washed 6 times with cold 0.1% BSA / PBS ( ⁇ ) (PBS ( ⁇ ) containing 0.1% BSA). Next, a secondary antibody obtained by diluting an anti-mouse IgG antibody (goat: Life Technologies, A11029) labeled with a fluorescent dye (Alexa (registered trademark) 488) as a secondary antibody 200-fold with 1% BSA / PBS ( ⁇ ) Diluent was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • a fluorescent dye Alexa (registered trademark) 488
  • the secondary antibody diluted solution was removed and washed 6 times with cold 0.1% BSA / PBS ( ⁇ ). Then, the cells of each test section subjected to the above-described cell immunostaining were encapsulated using a DAPI-containing encapsulating solution, Slow Fade (Life Technologies, Cat. No. S36936) and a cover glass, and a confocal laser microscope was used. Fluorescence observation was performed.
  • FIGS. These drawings are fluorescent micrographs showing the state of multinucleation of cells in each test group. Fluorescence images showing the results of examining the expression state of calreticulin by the above immunofluorescent antibody method, nuclear staining images by DAPI, and Is an image that is superimposed (merged). FIGS. 1 to 3 show the results of the samples 1 to 3 added group corresponding to the numbers of the figures, respectively, and FIG. 4 shows the results of the peptide-free group.
  • Example 3 Evaluation test 2 of multinucleation-inducing activity of synthetic peptide against tumor cells> The multinucleation induction ratio of the multinucleation-inducing synthetic peptides (sample 1 and sample 2) obtained in Example 1 was examined. As a test cell, the same HeLaS3 cell as used in Example 2 was used. Details of the evaluation test are as follows.
  • HeLaS3 cells were seeded in each well of an 8-well cell culture slide (also referred to as a chamber) so that the number of cells was about 0.5 ⁇ 10 3 per well, and 5% CO 2 , 37 The culture was performed overnight in an incubator under the condition of ° C.
  • the medium is a general DMEM medium, that is, a DMEM (manufactured by Wako Pure Chemicals, Cat No. 043-30085) containing 10% FBS, 100 units / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin. Using.
  • the medium in the culture vessel was further mixed with DMEM medium containing 3% FBS, 100 units / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin in the above-mentioned DMEM in an amount of a sample having a peptide concentration of 50 ⁇ M. Or it replaced
  • a peptide-free group in which only the same amount of PBS (-) as the peptide stock solution added to the sample addition group was added was provided.
  • cytoplasmic marker calreticulin
  • cell immunostaining and nuclear staining of cytoplasmic marker were performed on the cells in each test group in the same manner as in Example 2. Then, the cells in each test section after cell immunostaining and nuclear staining are observed with fluorescence using a confocal laser microscope, and the total number of cells and two or more nuclei are observed for the cells observed in one field of view. And the number of cells (number of multinucleated cells) that were observed.
  • multinucleation induction rate ratio of the number of cells having two or more nuclei to the total number of cells observed in one visual field of microscopic observation:%
  • multinucleation induction rate (%) (Number of cells having two or more nuclei) / (total number of cells) ⁇ 100;
  • the test on the conditions similar to the evaluation test of the said multinucleation induction rate was repeated 3 times mutually independently, and the average multinucleation induction rate was computed by averaging the multinucleation induction rate obtained by each test. The results are shown in Table 2.
  • the synthetic peptide (multinucleation-inducing synthetic peptide) according to sample 1 or sample 2 is at least 30% or more of the test tumor cells (human cervical cancer cells: HeLaS3 cells) within 4 days after supplying the peptides. It was confirmed that multinucleation can be induced on cells (typically 35% or more).
  • the efficiency (multinucleation induction rate, multinucleation induction frequency) of the synthetic peptide (multinucleation-inducing synthetic peptide) according to sample 1 or sample 2 to induce multinucleation on the test tumor cells (HeLaS3 cells) is , At least 30% or more (typically 35% or more).
  • the average multinucleation induction efficiency of the synthetic peptide according to sample 1 is 40% or more, and can induce multinucleation more efficiently than the synthetic peptide according to sample 2 (that is, has high multinucleation induction activity). It was confirmed.
  • the multinucleation-inducing synthetic peptide disclosed herein (that is, the multinucleation-inducing agent containing the peptide) has high multinucleation-inducing activity against eukaryotic cells (for example, human-derived tumor cells). It is shown that.
  • Example 4 Cell proliferation inhibitory activity evaluation test of synthetic peptide against tumor cells> Regarding the cell growth inhibitory activity of the polynuclearization-inducing synthetic peptides (sample 1 and sample 2) obtained in Example 1 above, a cell proliferation test (WST-8) by an absorbance method using WST-8 (water-soluble tetrazolium salt). Assay). As a test cell, the same HeLaS3 cell as used in Example 2 was used. Details of the evaluation test are as follows.
  • HeLaS3 cells were seeded into each well of a 96-well (well) plates such that the number of cells is approximately 5 ⁇ 10 3 cells per well, for 6 hours of culture in a 5% CO 2, 37 incubator under conditions of °C It was.
  • the medium is a general DMEM medium, that is, DMEM containing 2 mM L-glutamine (Gibco, product number 11965-092), 10% FBS (Hyclone Laboratories, KSD28662), 100 units / mg penicillin and Using a medium containing 100 ⁇ g / mL streptomycin (hereinafter, this medium is also referred to as “basic medium for proliferation assay”), the amount of medium per well was set to 100 ⁇ L.
  • the medium in the culture vessel was replaced with a medium in which the peptide according to Sample 1 or 2 having a peptide concentration of 50 ⁇ M was further added to the basic medium for proliferation assay.
  • a peptide-free group in which only the same amount of PBS (-) as the peptide stock solution added to the sample addition group was added was provided.
  • a 96-well (well) plate was placed in a CO 2 incubator and statically cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 conditions. Then, when the peptide was added (at the start of treatment, Day 0) and at one day (24 hours) after the start of the culture in the presence of the peptide (Day 1), the survival state (number of viable cells) of the test cells was measured by a commercially available color measurement. Measurement was performed using a kit (Cell counting kit-8, manufactured by Dojindo Laboratories).
  • the amount of water-soluble formazan in the medium is measured by the absorbance method (measurement wavelength: 450 nm, reference wavelength: 650 nm).
  • the number of viable cells was measured by In addition, it performed according to the manual attached to the said measurement kit except the operation explained in full detail below. Specifically, 10 ⁇ L / well of a reagent containing “water-soluble tetrazolium salt (WST-8)” as a coloring substrate is added to the cell culture well after the predetermined culture time has elapsed, and 5% CO 2 , 37 Incubated for 1 hour under the condition of ° C.
  • WST-8 water-soluble tetrazolium salt
  • the absorbance at a wavelength of 450 nm (A 450 ) and the absorbance at a wavelength of 650 nm (A 650 ) were measured using a spectrophotometer (microplate reader) for the cell culture medium to which the coloring reagent was added, and A 450 was measured as A 650.
  • the value A 450-650 corrected by the above was calculated.
  • cell survival rate (%) ⁇ (A 450 of the sample addition group Day1 -650) / (a 450-650 sample addition group Day0) ⁇ ⁇ ⁇ (a 450-650 of a 450-650) / (no peptide addition group Day 0 peptide untreated silage Day1) ⁇ ⁇ 100; calculated by .
  • the test tumor cells human cervical cancer cells: HeLaS3 cells
  • the test tumor cells markedly suppressed cell proliferation as compared with the cells in the group without addition of peptide.
  • any of the synthetic peptides (multinucleation-inducing synthetic peptides) according to Sample 1 or Sample 2 induces multinucleation on the test tumor cells (HeLaS3 cells), so that the multinucleated cells (multinuclear cells) Cell division), and as a result, it was confirmed that the growth of tumor cells could be prevented or suppressed.
  • the cell growth inhibition rate of the synthetic peptides (multinucleation-inducing synthetic peptides) according to Sample 1 and Sample 2 with respect to the test tumor cells (HeLaS3 cells) was at least 20% or more.
  • the cell growth inhibition rate of the synthetic peptide according to Sample 1 was 30% or more, and it was confirmed that the synthetic peptide according to Sample 2 has a higher cell growth inhibitory activity than the synthetic peptide according to Sample 2.
  • Example 5 Preparation of granules> After mixing 50 mg of the synthetic peptide (multinucleation-inducing synthetic peptide) according to Sample 1 and Sample 2, 50 mg of crystallized cellulose and 400 mg of lactose, 1 mL of a mixed solution of ethanol and water was added and kneaded. This kneaded product was granulated according to a conventional method to obtain a granule (granular composition) mainly composed of the multinucleation-inducing synthetic peptide disclosed herein.
  • the target eukaryotic cell has a multinucleation-inducing activity that multinucleates the target eukaryotic cell
  • the target eukaryotic cell (particularly derived from a human). It can be suitably used for the purpose of inducing multinucleation of cells). For example, it can be used for the purpose of suppressing the growth of tumor cells by inducing multinucleation of tumor cells. Alternatively, it can be used for the purpose of promoting megakaryocyte maturation by inducing multinucleation of megakaryocytes before multinucleation (that is, megakaryocyte progenitor cells), thereby promoting the production of platelets. Therefore, the multinucleation inducer disclosed here can be suitably used as, for example, a composition for regenerative medicine or a composition for cancer treatment.

Abstract

対象細胞を多核化させ得る多核化誘導活性を有する合成ペプチド、該ペプチドを含む多核化誘導剤、ならびに該ペプチドを用いた多核化誘導方法を提供する。本発明によって提供される合成ペプチドは、（Ａ）膜透過性ペプチド配列と、（Ｂ）多核化誘導性ペプチド配列とを含み、ヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の少なくとも一種の真核細胞を多核化させ得る人為的に合成されたペプチドである。該多核化誘導性ペプチド配列は、配列番号１又は配列番号２に示すアミノ酸配列又はその改変アミノ酸配列から構成される。

Description

細胞の多核化を誘導するペプチドおよびその利用
　本発明は、対象細胞を多核化し得る合成ペプチドとその利用に関する。詳しくは、該ペプチドを含む多核化誘導剤（薬学的組成物）ならびに該ペプチドを使用した多核化誘導方法に関する。
　なお、本出願は２０１４年６月２３日に出願された日本国特許出願２０１４－１２８４３１号に基づく優先権を主張しており、当該日本国出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
　ヒトの体を構成する細胞の多くは、通常、１つの細胞内に１つの核を有する細胞（即ち単核細胞）であるが、ある種の細胞では一つの細胞内に複数の核を有すること（即ち多核細胞）が知られている。
　生体内に通常存在する多核細胞（多核細胞の形態で正常な機能を発揮する細胞）の例として、巨核球や破骨細胞が挙げられる。破骨細胞は造血幹細胞から分化した多核細胞であって、古い骨組織を破壊（骨吸収）する役割を担う細胞であり、骨の再構築（骨リモデリング）や骨の成長に関与する（非特許文献１）。また、上記骨吸収により骨中のカルシウムを血液中に供給することで、血中カルシウム濃度の調整（恒常性の維持）にも関与する（非特許文献２）。巨核球は、造血幹細胞から分化した多核細胞であり、血小板を産生する役割を担う細胞である。
　ところで、血小板とは、血液凝固および止血のために必須の血液成分（血液中の細胞成分）であり、白血病、骨髄移植、外科的手術等において需要が高い。現在、血小板の投与が必要な患者に対する血小板輸血の多くには、献血による血液製剤（血小板製剤）が用いられる。しかし、輸血用の血小板（血小板製剤）は採血後の保存期間（有効期間）が短いことや、献血ドナーの減少から、その供給が不安定になりがちである。そこで、生体（例えば患者）由来、あるいは誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞、induced pluripotent stem cellともいう）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞、embryonic stem cellともいう）あるいは造血幹細胞等の幹細胞由来の細胞（例えば巨核球の前駆細胞）から血小板産生性の巨核球を産生する技術および該巨核球から血小板を産生する技術は、献血に依存しない血小板（血小板製剤）の安定供給に重要な技術として期待されている。これに関する技術として、例えば、特許文献１には、特定遺伝子を強制発現することで不死化した巨核前駆細胞株を樹立する技術について記載されている。また、特許文献２には、インビトロにおける巨核球からの機能的な血小板（止血作用など生体内における活性を保持している血小板）の産生量向上のために、特定遺伝子を強制発現させることでより巨核球の多核化を促進する技術について記載されている。
　また、腫瘍細胞（がん細胞）の一つの特徴として、正常細胞に比べて細胞分裂が活発であり細胞増殖速度が著しく高いことが挙げられる。従って、腫瘍細胞の死滅若しくは増殖阻害を目的とする抗がん剤の多くは、腫瘍細胞(がん細胞)の細胞分裂を阻害する薬剤が使用されている。このような細胞分裂を阻害する薬剤として、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管作用薬等が挙げられる。アルキル化剤はＤＮＡに作用して二重鎖の塩基どうしを架橋する作用機序、５－ＦＵ等の代謝拮抗剤はＤＮＡ合成を阻害する作用機序、微小管作用薬は微小管の重合または脱重合の阻害により有糸分裂を阻害する作用機序により、それぞれ腫瘍細胞(がん細胞)の細胞分裂を阻害する。現在までに多くの抗がん剤（抗腫瘍組成物）が開発されたが、より効果が高く副作用のリスクが低い薬剤、或いは高効果かつ安価な薬剤等に対する要求は依然として高い。例えば、腫瘍細胞を人為的且つ積極的に多核化させることにより当該腫瘍細胞の細胞分裂を阻害することができれば、新たな抗がん技術（抗がん剤）として利用することができる。
　上述した例のように、巨核球、破骨細胞等の生体内において高度に専門化された役割を果たす多核細胞を人為的に産生し得る技術、あるいは、腫瘍細胞（がん細胞）の多核化による細胞分裂阻害を実現する技術の確立は、再生医療あるいはがん治療において重要な一つの課題であり得る。
国際公開第２０１１／０３４０７３号 国際公開第２０１２／１５７５８６号 国際公開第２００９／０９３６９２号
クリニカル・ケミストリー（Clinical Chemistry）、４５巻（８号）、１９９９年、ｐｐ．１３５３－１３５８ バイオファクター（Biofactors）、３７巻（３号）、２０１１年、ｐｐ．１５９－１６７ カレント・バイオロジー（Current Biology）、１２巻、２００２年、ｐｐ．１２８７－１２９２
　そこで本発明は、対象とする細胞を人為的に多核化させ得る技術の開発を課題として創出されたものであり、具体的には、人為的に合成可能な比較的短い鎖長のペプチドであって、対象細胞に対して多核化を誘導する目的に資する人工ペプチドの提供を目的とする。また、そのようなペプチドを含む多核化誘導剤（薬学的組成物）の提供を他の目的とする。また、そのようなペプチドを使用して対象細胞に多核化を誘導する方法の提供を目的とする。
　本発明者らは、対象細胞に対して多核化を誘導する目的に資するべく種々のペプチドの研究を鋭意推進した。そして、驚くべきことに、配列番号１または２に示すアミノ酸配列を含むように合成したペプチドを対象細胞に供給することで、当該細胞を多核化させ得る或いは多核化を促進し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。また、本発明者らは、腫瘍細胞に対して多核化を誘導することによって、正常な細胞分裂が阻害され、対象（標的）とする腫瘍細胞（がん細胞）の増殖を阻止若しくは抑制し得ることを確認した。
　本発明によると、上記目的を実現すべく、対象細胞に供給された際（典型的には該細胞を培養している培地に添加された際）に、該細胞を多核化させ得る或いは該細胞の多核化を促進し得る能力（以下、「多核化誘導活性」ともいう）を有することで特徴付けられる人為的に合成されたペプチドが提供される。
　即ち、ここで開示される合成ペプチドは、そのペプチド鎖中に、以下の（Ａ）および（Ｂ）のアミノ酸配列：
　（Ａ）膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列；および
　（Ｂ）少なくとも一種の真核細胞に対して多核化を誘導する活性を有する多核化誘導性ペプチド配列を構成するＣＰＤＧＡＫＡＲＣ（配列番号１）またはＣＳＲＲＳＫＳＫＣ（配列番号２）のいずれかで表されるアミノ酸配列、若しくは、該アミノ酸配列のうちの１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加された改変アミノ酸配列であって、少なくとも一種の真核細胞に対して多核化を誘導する活性を有する多核化誘導性ペプチド配列を構成する改変アミノ酸配列；
　を有することを特徴とする少なくとも一種の真核細胞に対して多核化を誘導する活性を有する人為的に合成されたペプチドである。
　なお、本明細書において、多核化誘導性ペプチド配列および膜透過性ペプチド配列を含む合成ペプチド（上記改変アミノ酸配列からなるペプチドを含む）、即ち多核化誘導活性を有する合成ペプチドを「多核化誘導性合成ペプチド」とも呼称する。
　ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドは、ペプチド鎖中に上記（Ｂ）に示すとおりの多核化誘導性ペプチド配列を有することを特徴とする。このことにより、該合成ペプチドを対象（標的）とする細胞（典型的には当該細胞を培養する培地中）に供給することにより、該対象細胞に対して多核化を誘導する又は多核化を促進することができる。また、かかる多核化誘導性合成ペプチドは、ペプチド鎖中に上記（Ａ）に示すとおりの膜透過性ぺプチド配列を有するため、該ペプチドを対象（標的）とする細胞（典型的には当該細胞を培養する培地中）に供給することにより、上記多核化誘導性ペプチド配列を該真核細胞の外部(細胞膜の外側)から細胞内に高効率に移送することができる。また、合成ペプチドの供給によって対象細胞に対して多核化を誘導し得るため、遺伝子導入に起因するゲノムへの外来遺伝子の挿入の心配がない。このように、ここで開示される技術によると、対象（標的）とする細胞（典型的には当該細胞を培養する培地中）に多核化誘導性合成ペプチドを供給するという簡易な処理方法による対象細胞の多核化誘導を実現することができる。
　また、ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドは、化学合成（若しくは生合成）によって容易に人為的に製造することができる。このような多核化誘導性合成ペプチドを用いると、サイトカインに代表される高価な液性因子等を大量に使用することなく（典型的には液性因子等の代替物として）対象細胞を多核化させることができるため、対象（標的）細胞の多核化誘導を低コストで実現することができる。さらに、ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドは、単純な構造（典型的には直鎖状のペプチド鎖）であり、構造安定性が高いため、取扱い性に優れる。
　ここで開示される合成ペプチド（多核化誘導性合成ペプチド）の好ましい一態様では、上記（Ａ）膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列は、配列番号３～１１のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列、若しくは、該アミノ酸配列のうちの１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加された改変アミノ酸配列であって膜透過性ペプチド配列を構成する改変アミノ酸配列であることを特徴とする。
　配列番号３～１１に示すアミノ酸配列はいずれも膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列の典型例であり、上記（Ａ）に示す膜透過性ペプチド配列として好適に採用することができる。なかでも、タンパク質を核内の核小体へ局在させるシグナル配列であり核小体局在シグナル（ＮｏＬＳ：Nucleolar localization signal）として知られるいずれかのアミノ酸配列（典型的には配列番号３～６に示すアミノ酸配列）を採用することが好ましい。特に、配列番号３に示すアミノ酸配列から構成される膜透過性ペプチド配列は、上記ＮｏＬＳの典型例であり、多核化誘導性ペプチド配列を細胞内へ移送する効率の観点から特に好ましい。
　また、ここで開示される好ましい一態様の合成ペプチド（多核化誘導性合成ペプチド）は、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸配列が３０以下であることを特徴とする。このような短いペプチド鎖からなるペプチドは化学合成が容易であり、且つ、比較的製造コストが安価で取扱性に優れる。このため、例えば多核化誘導剤の成分として好ましく使用し得る。
　また、ここで開示される合成ペプチド（多核化誘導性合成ペプチド）の好ましい一態様では、以下のアミノ酸配列：
　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＰＤＧＡＫＡＲＣ（配列番号１２）；および
　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＳＲＲＳＫＳＫＣ（配列番号１３）；
　のうちのいずれかを有することを特徴とする。
　このような多核化誘導性合成ペプチドは、特にヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の細胞に対して多核化を誘導する用途に好適である。
　また、本発明は、他の側面として、少なくとも一種の真核細胞に対して多核化を誘導するために用いられる多核化誘導剤であって、ここで開示されるいずれかの態様の多核化誘導性合成ペプチドと、薬学的に許容可能な担体（例えば上記ペプチドの安定性向上に資する少なくとも１種の基材、或いは生理食塩水や各種の緩衝液等の液状媒体）を含む、多核化誘導剤（薬学的組成物）を提供する。
　かかる構成の組成物によると、上記多核化誘導性ペプチド配列を有する合成ペプチド（多核化誘導性合成ペプチド）を含むため、該組成物（該多核化誘導性合成ペプチド）を対象（標的）とする細胞（典型的には当該細胞を培養する培地中）に供給することにより、該対象細胞の多核化を誘導すること（多核化を促進すること）ができる。
　また、ここで開示される多核化誘導剤は、ヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の腫瘍細胞を多核化させる目的で好適に使用される。特に好ましい対象細胞として、悪性腫瘍細胞（がん細胞）、例えば扁平上皮癌の細胞や腺癌の細胞が挙げられる。
　ここで開示される多核化誘導剤により腫瘍細胞に多核化を誘導することで、該多核化された細胞（多核化細胞）の細胞分裂が阻害され、その結果、腫瘍細胞の増殖を阻止若しくは抑制することができる。換言すると、ここで開示される多核化誘導剤は、ヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の腫瘍細胞の増殖を抑制するための組成物として使用することができる。即ち、ここで開示される多核化誘導剤は、対象の腫瘍細胞に対して抗腫瘍効果を発揮し得るため、抗腫瘍組成物（抗がん剤）として好適に使用することができる。
　また、本発明は、他の側面として、少なくとも１種の真核細胞をインビボ（in vivo）又はインビトロ（in vitro）において多核化させる方法を提供する。
　好ましい一態様は、インビトロにおいて、少なくとも一種の真核細胞に対して多核化を誘導する方法であって、
　インビトロにおいて対象の細胞を含む細胞培養物を準備すること、当該細胞培養物中に、ここで開示されるいずれかの態様の多核化誘導性合成ペプチド（あるいは該合成ペプチドを含む多核化誘導剤）を少なくとも１回供給すること、および、該ペプチドを供給した上記細胞培養物を培養すること、を含む多核化誘導方法である。
　かかる多核化誘導方法によると、上述のとおり単純な構成の合成ペプチド（あるいは該合成ペプチドを含む多核化誘導剤）を多核化誘導因子として使用するという簡易な方法によって、目的の細胞（および該細胞からなる組織体）に対して効率的に多核化を誘導すること（多核化を促進すること）ができる。
　ここで開示される上記多核化誘導方法は、ヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の腫瘍細胞の多核化誘導の目的に好適に実施することができる。ここで開示される多核化誘導方法によると、特に、悪性腫瘍細胞（がん細胞）、例えば扁平上皮癌由来の細胞や腺癌由来の細胞の多核化誘導を容易に実現することができる。即ち、ここで開示される多核化誘導方法により、ヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の腫瘍細胞の細胞分裂を阻害し、かかる細胞の増殖を阻止もしくは抑制することができる。したがって、ここで開示される多核化誘導方法は、腫瘍（がん）の治療方法として利用することができる。
　ここで開示される多核化誘導性合成ペプチド（あるいは該ペプチドを含む多核化誘導剤）は、多核細胞および多核化前のプレ多核細胞（例えば多核化前の巨核芽球や多核化前の破骨前駆細胞等）に対して多核化を誘導する目的で好適に使用することができる。これにより、多核細胞中の核数の増大（多核化の促進）や多核細胞（例えば巨核球や破骨細胞等）の生産（製造）を実現することができる。
　換言すれば、多核細胞および多核化前のプレ多核細胞を対象にここで開示される多核化誘導性合成ペプチドを供給することを特徴とする多核化誘導方法を実施することにより、十分に多核化が誘導（促進）された多核細胞（例えば巨核球や破骨細胞等）を生産（製造）することができる。かかる方法によると、上述のとおり単純な構成の合成ペプチド（即ち、該合成ペプチドを含む多核化誘導剤）を多核化誘導因子として使用するという簡易な方法によって多核細胞を生産（製造）することができるため好ましい。
　或いはまた、ここで開示される方法（典型的にはインビトロでの多核化誘導方法）により生産（製造）した多核細胞（例えば巨核球や破骨細胞等）や、該多核細胞より産生される細胞（例えば血小板）および生合成物（例えば分泌タンパク質やホルモン等の生理活性物質等）を再生医療に用いる細胞資源として用いることができる。例えば、ここで開示される方法により生産（製造）した巨核球（即ち、十分に多核化が進んだ巨核球）は、移植用（典型的には骨髄移植用）細胞やインビトロで血小板を産生するための培養細胞株として利用し得る。また、ここで開示される方法で生産（製造）した巨核球より産生される血小板を用いることで、血小板製剤（血液製剤）を製造することができる。これにより、献血に依存しない血小板（血小板製剤）の供給が実現可能となる。
図１は、ＨｅＬａＳ３細胞の培養液に一実施例に係る多核化誘導性合成ペプチド（サンプル１）を添加して培養した後の当該ＨｅＬａＳ３細胞の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、ＤＡＰＩによる核染色画像と、抗カルレティキュリン抗体を使用した細胞免疫染色法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。 図２は、ＨｅＬａＳ３細胞の培養液に一実施例に係る多核化誘導性合成ペプチド（サンプル２）を添加して培養した後の当該ＨｅＬａＳ３細胞の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、ＤＡＰＩによる核染色画像と、抗カルレティキュリン抗体を使用した細胞免疫染色法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。 図３は、ＨｅＬａＳ３細胞の培養液に一比較例として膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列のみで構築した合成ペプチド（サンプル３）を添加して培養した後の当該ＨｅＬａＳ３細胞の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、ＤＡＰＩによる核染色画像と、抗カルレティキュリン抗体を使用した細胞免疫染色法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。 図４は、ＨｅＬａＳ３細胞を多核化誘導性合成ペプチド無添加で培養した後の当該ＨｅＬａＳ３細胞の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、ＤＡＰＩによる核染色画像と、抗カルレティキュリン抗体を使用した細胞免疫染色法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。
　以下、本発明の好適な実施形態を説明する。本明細書において特に言及している事項（例えばここで開示される合成ペプチドの一次構造や鎖長）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えばペプチドの化学合成法、細胞培養技法、ペプチドを成分とする薬学的組成物の調製に関するような一般的事項）は、細胞工学、生理学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、遺伝学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、以下の説明では、場合に応じてアミノ酸をIUPAC-IUBガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記（但し配列表では３文字表記）で表す。
　また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
　本明細書において「合成ペプチド」とは、そのペプチド鎖がそれのみ独立して自然界に安定的に存在するものではなく、人為的な化学合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって製造され、所定の組成物（例えば対象の細胞に対して多核化を誘導させ得る多核化誘導剤）中で安定して存在し得るペプチド断片をいう。
　また、本明細書において「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されないが、典型的には全アミノ酸残基数が概ね１００以下（好ましくは５０以下、より好ましくは３０以下）のような比較的分子量の小さいものをいう。
　また、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を包含する用語である。
　なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がＮ末端側であり右側がＣ末端側である。
　本明細書において所定のアミノ酸配列に対して「改変アミノ酸配列」とは、当該所定のアミノ酸配列が有する機能（例えば上記多核化誘導性合成ペプチドが有する多核化誘導活性や膜透過性ペプチドが有する細胞外から細胞内への移行能）を損なうことなく、１個又は数個（典型的には１～５個、例えば１個、２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列をいう。例えば、１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列（例えば塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列：例えばリジン残基とアルギニン残基との相互置換）、或いは、所定のアミノ酸配列について１個又は数個（典型的には１～５個程度、例えば１個、２個又は３個）のアミノ酸残基が付加（挿入）した若しくは欠失した配列等は、本明細書でいうところの改変アミノ酸配列に包含される典型例である。従って、ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドには、各配列番号のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列で構成される合成ペプチドに加え、各配列番号に示すアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸残基が置換（例えば上記同類置換）、欠失及び／又は付加したアミノ酸配列で構成される合成ペプチドであって、同様に多核化誘導活性を示す合成ペプチドを包含する。
　本明細書において「腫瘍」とは、広義に解釈される用語であり、癌腫及び肉腫或いは血液や造血組織の病変（白血病、リンパ腫等）を含む腫瘍一般（典型的には悪性腫瘍）をいう。また、「腫瘍細胞」とは、そのような腫瘍を形成する細胞をいう。典型的には周辺の正常組織とは独立して異常に増殖を行うに至った細胞（所謂がん化した細胞）をいう。従って、特別に規定しない限り、正常細胞ではなく腫瘍細胞（がん細胞）に区分される細胞であれば、該細胞の起源や性状に関わりなく腫瘍細胞と呼称される。上皮性腫瘍（扁平上皮癌、腺癌等）、非上皮性腫瘍（各種の肉腫、骨肉腫等）、各種の細胞腫（神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫等）、リンパ腫、メラノーマ、等を構成する細胞は、ここでいう腫瘍細胞に包含され得る。
　本明細書において「多核細胞」とは、生体内において、通常複数（典型的には２個以上、例えば４個以上）の核を有する細胞として存在する細胞を意味する用語、即ち、生体内での正常な形態が複数の核を有する形態である細胞を意味する用語である。例えば、巨核球、破骨細胞、骨格筋細胞、胎盤の絨毛に存在する合胞体性栄養膜細胞、マクロファージ由来の食細胞である異物巨細胞等が挙げられる。
　また、本明細書において「多核化前のプレ多核細胞」とは、多倍体化していない多核細胞をいい、典型的には単核の細胞（有糸分裂期（Ｍ期）に２核となる細胞を含む）をいう。多核化前のプレ多核細胞の具体例として、巨核球の前駆細胞（巨核芽球）、破骨細胞の前駆細胞（破骨前駆細胞）、等が例示される。
　本明細書において、「多核化を誘導する」又は「多核化を促進する」とは、多核化を誘導（促進）する前の細胞と比較して、細胞内の核の数を相対的に増大させることをいう。例えば、単核の細胞から２個以上（典型的には４個以上、例えば８個以上）の核を有する細胞を得ること、あるいは、多核細胞内の核数を増大させることを多核化の誘導（促進）ということができる。また、典型的に、細胞内の核数が増大するに伴い倍数性が高くなるので、「多核化を誘導（促進）する」ことを、多核化誘導前の細胞よりも相対的に倍数性が増大させることとして把握することもできる。例えば、染色体数が２Ｎの細胞に本発明を適用することで４Ｎ以上（典型的には８Ｎ以上、例えば１６Ｎ以上）の染色体数を有する細胞を得ることを多核化の誘導（促進）ということができる。
　ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドは、所定の真核細胞（典型的には、ヒトもしくはヒト以外の哺乳類、鳥類、あるいはその他の動物由来の細胞）の培養細胞に供給された際（典型的には該細胞を培養している培地中に添加される）に該細胞に対して多核化を誘導し得る或いは多核化を促進し得る（即ち細胞中の核数を増大させ得る）という作用、即ち多核化誘導活性を有することが、本発明者らによって初めて見出された合成ペプチド（即ち多核化誘導性合成ペプチド）である。また、ここで開示される多核化誘導剤は、対象の細胞に対して多核化を誘導（促進）し得る組成物（薬学的組成物）であり、上記多核化誘導性合成ペプチドの少なくとも１種を有効成分（即ち対象細胞の多核化誘導に関与する物質）として含むことで特徴付けられる。
　上述のとおり、ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドは、部分アミノ酸配列（ペプチドモチーフ）として、上記（Ａ）で規定される膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列と、上記（Ｂ）で規定される多核化誘導性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列とを有する。
　多核化誘導性合成ペプチドの（Ｂ）多核化誘導性ペプチド配列は、多核化誘導活性を有する配列であり、（Ａ）膜透過性ペプチド配列と組み合わせることにより、良好な多核化誘導活性を有するペプチドを構築し得ることが本発明者らによって見出されたアミノ酸配列（ペプチドモチーフ）である。具体的には、多核化誘導性ペプチド配列は、以下のアミノ酸配列：
　　　ＣＰＤＧＡＫＡＲＣ（配列番号１）；および
　　　ＣＳＲＲＳＫＳＫＣ（配列番号２）；
　のうちのいずれか若しくはその改変アミノ酸配列からなる。配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列は、本発明者がヒト由来のセントリン２のｓｉＲＮＡを構成するＲＮＡ配列を独自に翻訳して得たアミノ酸配列情報について、Ｎ末端側から１個目、２個目、３個目、４個目、５個目、６個目、７個目、８個目、９個目のアミノ酸残基が、それぞれＣ末端側から１個目、２個目、３個目、４個目、５個目、６個目、７個目、８個目、９個目のアミノ酸残基となるように逆転して再配列することで得られた合計９アミノ酸残基の人為的なアミノ酸配列である。
　ここで、セントリンとは、真核生物の中心体に存在し、中心子の構成タンパク質の一つとして中心子の複製や微小管の切断に関与する中心体関連タンパク質であり、セントリン２とは、セントリンファミリー（典型的には、セントリン１、セントリン２、セントリン３等）に属するタンパク質のうちの一つである（非特許文献３）。
　ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドの（Ａ）膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列は、細胞膜及び／又は核膜を通過し得る膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列であれば特に限定なく使用することができる。膜透過性ペプチドとして好適に機能し得る多くのアミノ酸配列（即ち膜透過性ペプチド配列）が知られているが、特にＮｏＬＳ（核小体局在シグナル、Nucleolar localization signal）に関連するアミノ酸配列（改変アミノ酸配列を含む）が多核化誘導性合成ペプチドの膜透過性ペプチド配列のアミノ酸配列として好ましい。配列番号３～１１に、上記ＮｏＬＳに関連する膜透過性ペプチド配列および他の膜透過性ペプチド配列（改変アミノ酸配列を含む）の好適例を挙げる。具体的には以下のとおりである。
　即ち、配列番号３のアミノ酸配列は、細胞内情報伝達に関与するプロテインキナーゼの１種であるヒト内皮細胞に存在するＬＩＭキナーゼ２（LIM Kinase 2）の第４９１番目のアミノ酸残基から第５０３番目のアミノ酸残基までの合計１３アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
　配列番号４のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２（塩基性線維芽細胞増殖因子）由来の合計１４アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
　配列番号５のアミノ酸配列は、ＩＢＶ（トリ伝染性気管支炎ウイルス：avian infectious bronchitis virus）のＮタンパク質（nucleocapsid protein）に含まれる合計８アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
　配列番号６のアミノ酸配列は、アデノウイルスのＰＴＰ（新生末端タンパク質：pre-terminal protein）１及びＰＴＰ２由来の合計１３アミノ酸残基からなるＮｏＬＳに対応する。
　配列番号７のアミノ酸配列は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：Human Immunodeficiency Virus）のＴＡＴに含まれるタンパク質導入ドメイン由来の合計１１アミノ酸残基から成る膜透過性ペプチド配列に対応する。
　配列番号８のアミノ酸配列は、上記ＴＡＴを改変したタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ４）の合計１１アミノ酸残基から成る膜透過性ペプチド配列に対応する。
　配列番号９のアミノ酸配列は、ショウジョウバエ（Drosophila）の変異体であるAntennapediaのＡＮＴ由来の合計１６アミノ酸配列から成る膜透過性ペプチド配列に対応する。
　配列番号１０のアミノ酸配列は、ポリアルギニンとして、連続した合計９個のアルギニン残基から成る膜透過性ペプチド配列に対応する。
　配列番号１１のアミノ酸配列は、ＭｙｏＤ（筋芽細胞決定因子：myoblast determination）ファミリー阻害ドメイン含有タンパク質由来の合計１９アミノ酸残基から成る膜透過性ペプチド配列に対応する。
　なお、配列表に示した上述の膜透過性ペプチド配列はあくまでも例示であり、使用可能なペプチド配列はこれに限定されない。本発明の実施に使用可能な様々な膜透過性ペプチド配列が本願出願当時に出版されている数々の文献に記載されている。それら膜透過性ペプチド配列のアミノ酸配列は一般的な検索手段によって容易に知ることができる。
　特に、特許文献３にも記載されている配列番号３に示すアミノ酸配列（改変アミノ酸配列を含む）が膜透過性ペプチド配列として好ましい。かかる配列番号３に示す膜透過性ペプチド配列と上述の多核化誘導性ペプチド配列とを組み合わせることにより、高い多核化誘導活性を有する合成ペプチドを得ることができる。
　ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドのペプチド鎖（アミノ酸配列）は、上述したような（Ｂ）多核化誘導性ペプチド配列と、（Ａ）膜透過性ペプチド配列とを適宜組み合わせることにより構築することができる。多核化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列の何れが相対的にＣ末端側（Ｎ末端側）に配置されてもよい。また、多核化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列とは隣接して配置されるのが好ましい。即ち、多核化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列との間には、両配列部分に包含されないアミノ酸残基が存在しないか或いは存在していても該残基数が１～３個程度が好ましい。例えば、多核化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列との間にリンカーとして機能する１個又は数個（典型的には１個、２個又は３個）のアミノ酸残基（例えば１個又は数個のグリシン（G）残基）を含むものであり得る。
　ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミド化されているものが好ましい。アミノ酸残基（典型的にはペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基）のカルボキシル基のアミド化により、合成ペプチドの構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）を向上させることができる。
　また、ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドは、多核化誘導活性を失わない限りにおいて、多核化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列以外の配列（アミノ酸残基）部分を含み得る。特に限定するものではないが、かかる部分アミノ酸配列としては多核化誘導性合成ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列部分の３次元形状（典型的には直鎖形状）を維持し得る配列が好ましい。該多核化誘導性合成ペプチドは、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が１００以下が適当であり、６０以下が望ましく、５０以下が好ましい。例えば３０以下の合成ペプチドが特に好ましい。
　このような鎖長の短いペプチドは、化学合成が容易であり、安価に多核化誘導性合成ペプチドを提供することができる。なお、ペプチドのコンホメーション（立体構造）については、使用する環境下（生体外若しくは生体内）で対象の真核細胞に対して多核化を誘導する多核化誘導活性を発揮する限りにおいて、特に限定されるものではないが、免疫原（抗原）になり難いという観点から直鎖状又はヘリックス状のものが好ましい。このような形状のペプチドはエピトープを構成し難い。かかる観点から、多核化誘導剤に適用する多核化誘導性合成ペプチドとしては、直鎖状であり比較的低分子量（典型的には５０以下のアミノ酸残基数、特に好ましくは３０以下のアミノ酸残基数）のものが好適である。
　全体のアミノ酸配列（ペプチド鎖）に対する多核化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列の占める割合（即ち多核化誘導性合成ペプチドのペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数に占める多核化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸残基数の個数％）は、対象細胞に対して多核化を誘導する多核化誘導活性を失わない限り特に限定されないが、当該割合は概ね６０％以上が望ましく、８０％以上が好ましい。９０％以上が特に好ましい。多核化誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列とから成る（即ち、これらの配列が全アミノ酸配列の１００％であるか或いは１～数個のリンカーを含む場合は該リンカー以外を占める）ペプチドは好適な一形態である。
　なお、本発明の多核化誘導性合成ペプチドとしては、全てのアミノ酸残基がＬ型アミノ酸であるものが好ましいが、対象の真核細胞に対して多核化を誘導する多核化誘導活性を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部又は全部がＤ型アミノ酸に置換されているものであってもよい。
　　ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドの好適な一態様は、以下のアミノ酸配列：
　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＰＤＧＡＫＡＲＣ（配列番号１２）；および
　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＳＲＲＳＫＳＫＣ（配列番号１３）；
　のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列または該選択されたアミノ酸配列の改変アミノ酸配列を特に好ましく含有する。配列番号１２又は配列番号１３に示すアミノ酸配列は、上記配列番号１又は配列番号２に示す多核化誘導性ペプチド配列と、上記配列番号３に示すＬＩＭキナーゼ２のＮｏＬＳ由来のアミノ酸配列とを、２個のグリシン（Ｇ）残基から成るリンカーを介して組み合わせることにより構築された合計２４アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
　ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドは、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）或いはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。
　ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドは、市販のペプチド合成機（例えば、Intavis AG社、Protein Technologies社等から入手可能である。）を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｃ末端アミド化等）部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
　或いは、遺伝子工学的手法に基づいて多核化誘導性合成ペプチドを生合成してもよい。すなわち、所望する多核化誘導性合成ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）を合成する。そして、合成したポリヌクレオチド（ＤＮＡ）と該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
　一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からペプチドを単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的の多核化誘導性合成ペプチドを得ることができる。
　なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
　例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。すなわち、目的の多核化誘導性合成ペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクター（例えばノバジェン社から提供されているｐＥＴシリーズ及びアマシャムバイオサイエンス社から提供されているｐＧＥＸシリーズのようなＧＳＴ(Glutathione S-transferase)融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該ベクターにより宿主細胞（典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出し、精製する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した目的のペプチド断片（設計した多核化誘導性合成ペプチド）をアフィニティクロマトグラフィー等の方法によって回収する。また、必要に応じて適当な方法によってリフォールディングする。このような従来公知の融合タンパク質発現システム（例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供されるＧＳＴ／Ｈｉｓシステムを利用し得る。）を用いることによって、ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドを製造することができる。
　或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ち多核化誘導性合成ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の（株）セルフリーサイエンスから入手可能なPROTEIOS（商標）Wheat germ cell-free protein synthesis kit）が市販されている。
　ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって容易に製造（合成）することができる。すなわち、設計したアミノ酸配列を構成する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、多核化誘導性合成ペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、ＤＮＡ合成機等を利用して、所望するヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、種々の酵素的合成手段（典型的にはＰＣＲ）を採用して目的の二本鎖ＤＮＡを得ることができる。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもよく、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）の形態であってもよい。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖（センス鎖）であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
　こうして得られるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、多核化誘導性合成ペプチド生産のための組換え遺伝子（発現カセット）を構築するための材料として使用することができる。
　ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドは、上記多核化誘導活性を損なわない限りにおいて塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸又は有機酸を付加反応させることにより得られ得る該ペプチドの酸付加塩を使用することができる。或いは、上記多核化誘導活性を有する限り、他の塩（例えば金属塩）であってもよい。従って、本明細書及び特許請求の範囲に記載の「ペプチド」は、かかる塩形態のものを包含する。
　ここで開示される多核化誘導剤は、有効成分である多核化誘導性合成ペプチドをその多核化誘導活性が失われない状態で保持し得る限りにおいて、使用形態に応じて薬学（医薬）上許容され得る種々の（少なくとも一種以上の）担体を含み得る。希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体が好ましい。多核化誘導剤の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。或いはリポソームであってもよい。また、多核化誘導剤に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
　多核化誘導剤の形態に関して特に限定はない。例えば、典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、水性ジェル剤等が挙げられる。また、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
　なお、多核化誘導性合成ペプチド（主成分）及び種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。この書籍の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
　ここで開示される多核化誘導剤（多核化誘導性合成ペプチド）の適用対象細胞は特に制限されず、種々の生物種の真核細胞に対して多核化を誘導する(若しくは多核化の誘導を促進する)ことが可能である。特に、ヒト又はヒト以外の動物（典型的には脊椎動物、特に哺乳動物）の細胞が適用対象として好ましい。医学上の利用価値の観点から、腫瘍細胞、特に、悪性腫瘍細胞（がん細胞）、例えば扁平上皮癌の細胞や腺癌の細胞が対象細胞として好適である。或いはまた、医学上の利用価値の観点（特に再生医療への応用の観点）から、多核細胞（例えば、巨核球や破骨細胞）又は多核化前のプレ多核細胞、例えば、巨核球若しくは破骨細胞又は多核化前の巨核球の前駆細胞（例えば多核化前の巨核芽球）若しくは多核化前の破骨細胞の前駆細胞（破骨前駆細胞）が対象細胞として好適である。
　ここで開示される多核化誘導剤（多核化誘導性合成ペプチド）は、その形態及び目的に応じた方法や用量で使用することができる。
　例えば、生体外（インビトロ）で培養（継代）している対象細胞（例えば、腫瘍細胞、又は多核細胞若しくは多核化前のプレ多核細胞等）に対して多核化を誘導する場合は、ここで開示される多核化誘導剤（即ち多核化誘導性合成ペプチド）の適当量を、多核化を行う対象の培養細胞（細胞培養物）に対し、培養過程のいずれかの段階（好ましくは所定期間の培養（増殖）や継代を行った後）で培地に少なくとも１回供給するとよい。上記培養細胞の例としては、樹立細胞株および初代培養細胞、あるいは生体から一時的に又は永久的に摘出した細胞材料（細胞、あるいは生組織や細胞塊等)、あるいは幹細胞(例えばｉＰＳ細胞やＥＳ細胞、造血幹細胞等）から分化誘導して得られる細胞材料（組織、細胞塊、器官等を含む、典型的には細胞）等が挙げられる。
　多核化誘導剤（即ち多核化誘導性合成ペプチド）の供給量及び供給回数は、培養細胞の種類、細胞密度（培養開始時の細胞密度）、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されない。例えば、ヒト又はヒト以外の動物（典型的には脊椎動物、特に哺乳動物）由来の細胞を培養する場合、培地中の多核化誘導性合成ペプチド濃度が概ね０．１μＭ～１００μＭの範囲内、好ましくは０．５μＭ～８０μＭ（例えば１μＭ～５０μＭ）の範囲内となるように、培養細胞（細胞培養物）に対して１～複数回供給する（例えば培養開始時ならびに細胞の継代時や培地交換時に合わせて追加供給する）ことが好ましい。
　或いはまた、生体内（インビボ）で対象細胞（例えば、腫瘍細胞、又は多核細胞若しくは多核化前の多核細胞等）の多核化を誘導する場合においては、ここで開示される多核化誘導剤（即ち多核化誘導性合成ペプチド）の適当量を液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔への注射によって患者（即ち生体内）に所望する量だけ投与することができる。或いは、錠剤等の固体形態のものや軟膏等のゲル状若しくは水性ジェリー状のものを、直接、目的の組織（例えば腫瘍の患部、あるいは骨髄や骨などの目的細胞の多核化が起こる組織）あるいは該組織の近傍に投与することができる。或いは経口投与若しくは座薬の形態で投与してもよい。これにより、生体内の細胞、典型的には目的の組織又はその周辺に存在する目的細胞に対して多核化を誘導することができる。なお、多核化誘導剤（即ち多核化誘導性合成ペプチド）の投与量及び投与回数は、多核化を誘導する目的細胞の種類、存在部位、等の条件によって異なり得るため特に限定されない。
　また、ここで開示される多核化誘導剤（多核化誘導性合成ペプチド）は、対象細胞の種類や目的に応じ、液性因子（例えばサイトカイン等）や組成物（例えば阻害剤等）等を併用することができる。
　例えば、腫瘍細胞に対して多核化を誘導する場合であれば、他の抗腫瘍効果を有する組成物（抗がん剤）と併用することができる。かかる抗がん剤としては、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管作用薬、白金製剤、抗がん性抗生物質、ホルモン剤、分子標的治療薬等が挙げられる。
　あるいは、多核細胞または多核化前のプレ多核細胞に対して多核化を誘導する場合であれば、他の多核化誘導因子および分化誘導因子等や、多核化誘導効果を有する組成物と併用することができる。かかる多核化誘導因子としては、巨核球（若しくは多核化前の巨核球）に対して多核化を誘導（促進）する場合であれば、例えば、トロンボポエチン（Thrombopoietin、ＴＰＯ）、各種インターロイキン（例えばＩＬ－１、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１１等）、ＧＭ－ＣＳＦ（granulocyte macrophage colony-stimulating factor、顆粒球単球コロニー刺激因子）、ＥＰＯ（Erythropoietin、エリスロポエチン）、ＳＣＦ（stem cell factor、幹細胞因子）、その他のサイトカインファミリーに属する因子、ＲＯＣＫ（Rho-associated coiled-coil forming kinase、Rho結合キナーゼ）阻害剤、ＨＤＡＣ（histone deacetylase、ヒストン脱アセチル化酵素）阻害剤等が挙げられる。また、破骨細胞（若しくは多核化前の破骨細胞）に対して多核化を誘導（促進）する場合であれば、例えば、ＲＡＮＫＬ（receptor activator of NF-κB ligand）等のＴＮＦ（tumor necrosis factor、腫瘍壊死因子）スーパーファミリーに属する因子、Ｍ－ＣＳＦ（macrophage colony stimulating factor）、ＴＧＦ－β１等のＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する因子、その他のサイトカインファミリーに属する因子、等が挙げられる。
　例えば、ここで開示される多核化誘導剤（多核化誘導性合成ペプチド）を腫瘍（がん）の患部に供給されるように投与することにより、その多核化誘導活性によって、腫瘍細胞を多核化し、該腫瘍細胞の細胞分裂を抑制（阻害）して腫瘍細胞の細胞増殖を抑制（阻害）することができる。換言すると、ここで開示される多核化誘導剤は、腫瘍の治療（がん治療）に使用可能な薬学的組成物（抗腫瘍組成物、抗がん剤）として使用することができる。
　また、例えば、ここで開示される多核化誘導剤（多核化誘導性合成ペプチド）を生体内の多核細胞（例えば巨核球や破骨細胞等）が多核化する組織に供給されるように投与することにより、その多核化誘導活性によって、多核細胞(例えば巨核細胞および破骨細胞等）または多核化前のプレ多核細胞 (例えば多核化前の巨核芽球、多核化前の破骨前駆細胞等）に対して多核化を誘導することができる。これにより、多核細胞（例えば巨核球や破骨細胞）が生体内において担う機能の増強、例えば、血小板の産生効率の向上または骨代謝の調整および血中Ｃａ濃度の維持等を実現することに資する薬学的組成物として使用することができる。
　或いはまた、対象細胞（例えば多核細胞又は多核化前のプレ多核細胞等）に、適当量の多核化誘導剤（多核化誘導性合成ペプチド）を付与し、対象細胞に多核化が誘導されるまで培養することによって（即ち、ここで開示される多核化誘導方法を採用することによって）、対象細胞の多核化誘導を生体外(インビトロ)で効率よく行うことができる。これにより、多核細胞を効率よく生産することが可能であり、また、多核細胞中の核数を増大させること（多核化の促進）も可能である。なお、上記対象細胞としては、例えば、生体から一時的に又は永久的に摘出した細胞材料（生組織や細胞塊、例えば細胞の培養物)、あるいは、インビトロで培養（継代）している幹細胞(例えばｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等)から分化誘導して得られる所定の細胞（該細胞により構成される組織、器官等を含む）等を用いることができる。
　また、ここで開示される多核化誘導方法（インビトロでの多核化誘導方法）や多核化誘導性合成ペプチドを採用することによって生体外（インビトロ）で効率よく多核化を誘導（促進）された目的細胞（即ち、ここで開示される技術によって生産された多核細胞、又は細胞内の核数を増大された多核細胞）を該細胞が機能する組織（即ち患者の生体内）に導入することにより、該細胞の多核化に要する時間を短縮することができる。
　或いはまた、インビトロ培養系で大量に生産した多核細胞材料(多核細胞、あるいは多核細胞を含む細胞塊や組織）を利用することで、該細胞より産生される細胞および生合成物（例えば分泌タンパク質やホルモン等の生理活性物質等）等を生産することができる。例えば、ここで開示される技術は、巨核球から血小板を産生する方法に好適に利用することができる。十分に多核化した巨核球は多核化が不十分な巨核球と比較して１細胞あたりが産生する血小板数が極めて多い（数十～数百倍）ため、巨核球１細胞あたりの血小板の産生量の増大には巨核球の多核化促進が重要である。このため、ここで開示する技術によって十分に多核化を誘導した巨核球を利用することで、高効率に血小板を産生することができる。また、本発明により産生（製造）した血小板を用いて血液製剤（血小板製剤）を製造することができる。
　以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。
＜実施例１：ペプチド合成＞
　合計３種類のペプチド（サンプル１～３）を後述するペプチド合成機を用いて製造した。表１には、これら合成ペプチドのアミノ酸配列等の情報を列挙している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、サンプル１および２に係るペプチドは、ペプチド鎖のＣ末端側に多核化誘導性合成ペプチド配列を有し、そのＮ末端側に、２個のグリシン（Ｇ）残基から成るリンカー領域を介して膜透過性ペプチド配列であるＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列（配列番号３）を有する多核化誘導性合成ペプチドである。
　即ち、サンプル１のペプチド（配列番号１２）は、多核化誘導性合成ペプチド配列として配列番号１に示すアミノ酸配列を有する合計２４アミノ酸残基のペプチドである。
　また、サンプル２のペプチド（配列番号１３）は、多核化誘導性合成ペプチド配列として配列番号２に示すアミノ酸配列を有する合計２４アミノ酸残基のペプチドである。
　また、サンプル３に係るペプチドは、表１に示すように、膜透過性ペプチド配列であるＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列（配列番号３）のみから成る合計１３アミノ酸残基のペプチドである。
　ここで、上記サンプル１～３に係る合成ペプチドは直鎖状のペプチドであり、上記合成ペプチドは市販のペプチド合成機（Intavis AG社製品）を用いてマニュアルどおりに固相合成法（Ｆｍｏｃ法）を実施して合成した。なお、ペプチド合成機の使用態様自体は本発明を特徴づけるものではないため、詳細な説明は省略する。
　合成したサンプル１～３に係るペプチドは、ＰＢＳ（－）又はＤＭＳＯに溶かし、ペプチドストック液を調製した。
＜実施例２：腫瘍細胞に対する合成ペプチドの多核化誘導活性評価試験－１＞
　上記実施例１で得られた多核化誘導性合成ペプチド（サンプル１およびサンプル２）の多核化誘導活性について、細胞質のマーカーとしてカルレティキュリンを採用した細胞免疫染色（蛍光免疫染色）を行うとともに、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）による核染色を行うことで評価した。供試細胞としてヒト子宮頸癌由来の培養細胞株であるＨｅＬａＳ３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＣＣＬ２．２）を用いた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
　ＨｅＬａＳ３細胞を細胞数が１ウェルあたり凡そ１×１０３個となるように、４穴（ウェル）の細胞培養スライド（チャンバーともいう）の各ウェル中に播種し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下のインキュベータで一晩培養を行った。培地は一般的なＤＭＥＭ培地、即ち、ここではＤＭＥＭ（和光純薬社製、Cat No. 043-30085）に１０％のＦＢＳ、１００ユニット／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有したものを用いた。その一晩培養後、培養容器中の培地を、上記ＦＢＳ、ペニシリン及びストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地に更にペプチド濃度５０μＭとなる量のサンプル１、サンプル２、サンプル３のうちのいずれかのペプチドを含有させた培地に交換し、同条件で４日間培養を継続した。なお、コントロール区として、サンプル添加区に添加したペプチドストック液と同容量のＰＢＳ（－）のみを添加したペプチド無添加区を設けた。
　上記培養終了後、各試験区の細胞における多核化状態を、以下の細胞免疫染色により調べた。
　まず、各試験区の細胞を固定し、その後ブロッキング処理を行った。具体的には、まず、各試験区の培養容器中の培地を除去し、冷ＰＢＳ（－）で２回洗浄した。次いで、メタノール１容量とアセトン１容量とを混和した溶液（メタノール／アセトン＝１：１溶液）を添加し、氷上に１５分静置してＨｅＬａＳ３細胞を固定した。その後、メタノール／アセトン＝１：１溶液を除去し、冷ＰＢＳ（－）で３回洗浄した。そして、３％のＢＳＡ含有ＰＢＳ（－）（３％のＢＳＡを含むＰＢＳ（－））を添加して室温で１時間のブロッキング処理を行った。所定時間経過後、３％のＢＳＡ含有ＰＢＳ（－）を除去し、冷ＰＢＳ（－）で３回洗浄した。
　次に、抗カルレティキュリン抗体と該抗体を認識する二次抗体とを用いて、カルレティキュリンに対する細胞免疫染色を行った。まず、抗カルレティキュリンモノクローナル[ＦＭＣ７５]抗体（マウス由来、Abcam社製、Cat No. ab22683）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（－）（１％のＢＳＡを含むＰＢＳ（－））で４００倍希釈した一次抗体希釈液を上記ＨｅＬａＳ３細胞の培養容器中に添加し、４℃で一晩（約１６～１８時間）静置した。そして、所定時間経過後、上記一次抗体希釈液を除去し、冷０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（－）（０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ（－））で６回洗浄した。次いで、二次抗体として蛍光色素（Alexa（登録商標）４８８）で標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ヤギ：Life Technologies社製品、A11029）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（－）で２００倍希釈した二次抗体希釈液を添加し、室温で２時間静置した。上記所定時間経過後、二次抗体希釈液を除去し、冷０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（－）で６回洗浄した。
　そして、上記の細胞免疫染色を行った各試験区の細胞をＤＡＰＩ含有封入液であるSlow Fade（Life Technologies社製、Cat. No. S36936）とカバーガラスを用いて封入し、共焦点レーザー顕微鏡による蛍光観察を行った。
　共焦点レーザー顕微鏡による蛍光観察を行った結果を図１～図４に示す。これらの図面は各試験区における細胞の多核化状態を調べた蛍光顕微鏡写真であり、上記免疫蛍光抗体法でカルレティキュリンの発現状態を調べた結果を示す蛍光画像とＤＡＰＩによる核染色画像とを重ねた（マージした）画像である。図１～図３にはそれぞれ図の番号に対応してサンプル１～サンプル３添加区の結果を示し、図４にはペプチド無添加区の結果を示す。
　上記評価試験の結果、サンプル１またはサンプル２に係る合成ペプチド（多核化誘導性合成ペプチド）を添加したＨｅＬａＳ３細胞の蛍光顕微鏡画像（サンプル１添加区については図１、サンプル２添加区については図２）に示されるように、サンプル１添加区およびサンプル２添加区では複数の核が形成された細胞を観察した。これに対し、サンプル３添加区およびペプチド無添加区におけるＨｅＬａＳ３細胞（サンプル３添加区については図３、ペプチド無添加区について図４）では、複数の核が形成された細胞は観察されなかった。即ち、サンプル１およびサンプル２に係る合成ペプチドが、ＨｅＬａＳ３細胞に対して多核化を誘導することを確認した。これらの結果は、ここで開示される多核化誘導性合成ペプチド（即ち、該ペプチドを含む多核化誘導剤）が真核細胞（例えばヒト由来の腫瘍細胞）に対して多核化を誘導し得ることを示している。なお、サンプル１添加区の多核化細胞の中には、サンプル２添加区で確認されるいくつかの多核化細胞と比較して、１細胞あたりの核数が顕著に多い細胞が存在することを観察した。
＜実施例３：腫瘍細胞に対する合成ペプチドの多核化誘導活性評価試験－２＞
　上記実施例１で得られた多核化誘導性合成ペプチド（サンプル１およびサンプル２）について、多核化誘導率を調べた。供試細胞として、実施例２と同様のＨｅＬａＳ３細胞を用いた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
　ＨｅＬａＳ３細胞を細胞数が１ウェルあたり凡そ０．５×１０３個となるように、８穴（ウェル）の細胞培養スライド（チャンバーともいう）の各ウェル中に播種し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下のインキュベータで一晩培養を行った。培地は一般的なＤＭＥＭ培地、即ち、ここではＤＭＥＭ（和光純薬社製、Cat No. 043-30085）に１０％のＦＢＳ、１００ユニット／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有したものを用いた。その一晩培養後、培養容器中の培地を、上記ＤＭＥＭ中に３％のＦＢＳ、１００ユニット／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有させたＤＭＥＭ培地中に更にペプチド濃度５０μＭとなる量のサンプル１またはサンプル２を含有させた培地に交換し、同条件で４日間培養を継続した。なお、コントロール区として、サンプル添加区に添加したペプチドストック液と同容量のＰＢＳ（－）のみを添加したペプチド無添加区を設けた。
　上記培養終了後、各試験区の細胞について、実施例２と同様にして細胞質マーカー（カルレティキュリン）の細胞免疫染色と核染色を行った。そして、細胞免疫染色と核染色を行った後の各試験区の細胞を共焦点レーザー顕微鏡を用いて蛍光観察し、１視野中に観察される細胞について、全細胞数と、２つ以上の核が認められた細胞の細胞数（多核化細胞数）と、を数えた。そして多核化誘導率（顕微鏡観察の１視野中に観察される全細胞数に対し、２個以上の核を有する細胞数の割合：％）を、以下の式：多核化誘導率（％）＝（２つ以上の核を有する細胞数）÷（全細胞数）×１００；により算出した。なお、上記多核化誘導率の評価試験と同様の条件での試験を相互に独立して３回繰り返し、各試験で得られた多核化誘導率を平均して平均多核化誘導率を算出した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、ペプチド無添加区の多核化誘導率（０％）と比較して、サンプル１添加区またはサンプル２添加区では多核化誘導率が顕著に増大することを確認した。即ち、サンプル１またはサンプル２に係る合成ペプチド（多核化誘導性合成ペプチド）は、ペプチド供給後４日以内に、供試腫瘍細胞（ヒト子宮頸癌細胞：ＨｅＬａＳ３細胞）のうちの少なくとも３０％以上（典型的には３５％以上）の細胞に対して多核化を誘導し得ることを確認した。換言すると、サンプル１またはサンプル２に係る合成ペプチド（多核化誘導性合成ペプチド）が供試腫瘍細胞（ＨｅＬａＳ３細胞）に対して多核化を誘導する効率（多核化誘導率、多核化誘導頻度）は、少なくとも３０％以上（典型的には３５％以上）であることを確認した。特に、サンプル１に係る合成ペプチドの平均多核化誘導効率は４０％以上であり、サンプル２に係る合成ペプチドよりも高効率に多核化を誘導し得る（即ち、高い多核化誘導活性を有する）ことを確認した。
　これらの結果は、ここで開示される多核化誘導性合成ペプチド（即ち、該ペプチドを含む多核化誘導剤）が真核細胞（例えばヒト由来の腫瘍細胞）に対して高い多核化誘導活性を有することを示している。
＜実施例４：腫瘍細胞に対する合成ペプチドの細胞増殖阻害活性評価試験＞
　上記実施例１で得られた多核化誘導性合成ペプチド（サンプル１およびサンプル２）の細胞増殖阻害活性について、ＷＳＴ－８（水溶性テトラゾリウム塩）を用いた吸光度法による細胞増殖試験（ＷＳＴ－８アッセイ）を行うことで評価した。供試細胞として、実施例２と同様のＨｅＬａＳ３細胞を用いた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
　ＨｅＬａＳ３細胞を細胞数が１ウェルあたり凡そ５×１０３個となるように９６穴（ウェル）プレートの各ウェルに播種し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下のインキュベータで６時間培養を行った。培地は一般的なＤＭＥＭ培地、即ち２ｍＭのＬ－グルタミンを含むＤＭＥＭ（Gibco社製、製品番号11965-092）に１０％のＦＢＳ（Hyclone Laboratories 社製、KSD28662）と、１００ユニット／ｍｇのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンと、を含有させた培地（以下、該培地を「増殖アッセイ用基本培地」ともいう）を用い、１ウェルあたりの培地量を１００μＬとした。
　上記所定時間の培養後、培養容器中の培地を、上記増殖アッセイ用基本培地に更にペプチド濃度５０μＭとなる量のサンプル１または２に係るペプチドを含有させた培地に交換した。なお、コントロール区として、サンプル添加区に添加したペプチドストック液と同容量のＰＢＳ（－）のみを添加したペプチド無添加区を設けた。
　上記のようにしてサンプルペプチドを添加した後、９６穴（ウェル）プレートを、ＣＯ２インキュベータ内に配置し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で静置培養した。そして、ペプチド添加時（処理開始時、Ｄａｙ０）およびペプチド存在下での培養開始から１日（２４時間）経過時点（Ｄａｙ１）において、供試細胞の生存状態（生細胞数）を市販の発色測定キット（Cell counting kit-8、同仁化学研究所社製）を使用して測定した。即ち、生細胞の酵素活性により試薬中のテトラゾリウム塩が還元されて水溶性ホルマザンが生成されることを利用し、培地中の水溶性ホルマザン量を吸光度法（測定波長：４５０ｎｍ、参照波長：６５０ｎｍ）により測定して生細胞数を測定した。なお、以下に詳述する操作以外は上記測定キットに添付のマニュアルどおりに行った。
　具体的には、上記所定の培養時間が経過した細胞培養ウェル中に、発色基材として「水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ－８）」含む試薬を１ウェルあたり１０μＬ添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で１時間インキュベートした。その後、該発色試薬を添加した細胞培養液について、波長４５０ｎｍの吸光度（Ａ４５０）および波長６５０ｎｍの吸光度（Ａ６５０）を分光光度計（マイクロプレートリーダ）を用いて測定し、Ａ４５０をＡ６５０で補正した値Ａ４５０-６５０を算出した。そして、ペプチド無添加区における細胞生存率を１００％としたときの各サンプル添加区の細胞生存率（％）を、以下の式：細胞生存率（％）＝｛（サンプル添加区Ｄａｙ１のＡ４５０-６５０）／（サンプル添加区Ｄａｙ０のＡ４５０-６５０）｝÷｛（ペプチド無添加区Ｄａｙ１のＡ４５０-６５０）／（ペプチド無添加区Ｄａｙ０のＡ４５０-６５０）｝×１００；により算出した。そして、ペプチド無添加区の細胞生存率（％）を基準として、各サンプル添加区の細胞生存率の減少率を細胞増殖阻害率（％）として算出した。即ち、以下の式：細胞増殖阻害率（％）＝１００－（サンプル添加区の細胞生存率）；より細胞増殖阻害率を算出した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示すように、サンプル１添加区またはサンプル２添加区の供試腫瘍細胞（ヒト子宮頸癌細胞：ＨｅＬａＳ３細胞）は、ペプチド無添加区の細胞と比較して、細胞増殖が顕著に抑制されることを確認した。即ち、サンプル１またはサンプル２に係る合成ペプチド（多核化誘導性合成ペプチド）は、何れも供試腫瘍細胞（ＨｅＬａＳ３細胞）に対して多核化を誘導することで、該多核化された細胞（多核化細胞）の細胞分裂を阻害し、その結果、腫瘍細胞の増殖を阻止若しくは抑制し得ることを確認した。
　また、サンプル１およびサンプル２に係る合成ペプチド（多核化誘導性合成ペプチド）の供試腫瘍細胞（ＨｅＬａＳ３細胞）に対する細胞増殖阻害率は少なくとも２０％以上であることを確認した。特に、サンプル１に係る合成ペプチドの細胞増殖阻害率は３０％以上であり、サンプル２に係る合成ペプチドよりも高い細胞増殖阻害活性を有することを確認した。
　これらの結果は、ここで開示される多核化誘導性合成ペプチド（即ち、該ペプチドを含む多核化誘導剤）が腫瘍細胞（例えばヒト由来の腫瘍細胞）に対して高い抗腫瘍活性（腫瘍細胞増殖阻害活性）を有することを示している。
＜実施例５：顆粒剤の調製＞
　上記サンプル１およびサンプル２に係る合成ペプチド（多核化誘導性合成ペプチド）５０ｍｇと結晶化セルロース５０ｍｇ及び乳糖４００ｍｇとを混合した後、エタノールと水の混合液１ｍＬを加え混練した。この混練物を常法に従って造粒し、ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドを主成分とする顆粒剤（顆粒状組成物）を得た。
　上述のように、ここで開示される多核化誘導性合成ペプチドは、対象とする真核細胞を多核化させる多核化誘導活性を有しているため、対象とする真核細胞（特にヒト由来の細胞）に対して多核化を誘導する目的に好適に使用し得る。例えば、腫瘍細胞に対して多核化を誘導することによって、腫瘍細胞の増殖を抑制する目的に使用し得る。或いはまた、多核化前の巨核球（即ち巨核球前駆細胞）に対して多核化を誘導することによって、巨核球の成熟を促進し、延いては血小板の産生を促進する目的に使用し得る。したがって、ここで開示される多核化誘導剤は、例えば再生医療用途の組成物やがんの治療用途の組成物として好適に利用することができる。
配列番号１～１３　　合成ペプチド

Claims (9)

  1. 　ペプチド鎖中に、以下の（Ａ）および（Ｂ）のアミノ酸配列：
    　（Ａ）膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列；および
    　（Ｂ）少なくとも一種の真核細胞に対して多核化を誘導する活性を有する多核化誘導性ペプチド配列を構成するＣＰＤＧＡＫＡＲＣ（配列番号１）またはＣＳＲＲＳＫＳＫＣ（配列番号２）のいずれかで表されるアミノ酸配列、若しくは、該アミノ酸配列のうちの１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加された改変アミノ酸配列であって、少なくとも一種の真核細胞に対して多核化を誘導する活性を有する多核化誘導性ペプチド配列を構成する改変アミノ酸配列；
    　を有する、少なくとも一種の真核細胞に対して多核化を誘導する活性を有する人為的に合成されたペプチド。
  2. 　前記（Ａ）膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列は、配列番号３～１１のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列、若しくは、該アミノ酸配列のうちの１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加された改変アミノ酸配列であって膜透過性ペプチド配列を構成する改変アミノ酸配列である、請求項１に記載の合成ペプチド。
  3. 　前記（Ａ）膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列：
    　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号３）
    　である、請求項１または２に記載の合成ペプチド。
  4. 　ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が３０以下である、請求項１～３のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
  5. 　以下のアミノ酸配列：
    　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＰＤＧＡＫＡＲＣ（配列番号１２）；および
    　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＳＲＲＳＫＳＫＣ（配列番号１３）；
    　のうちのいずれかを有する、請求項４に記載の合成ペプチド。
  6. 　少なくとも一種の真核細胞に対して多核化を誘導するために用いられる多核化誘導剤であって、
    　請求項１～５のいずれか一項に記載の合成ペプチドと、
    　薬学的に許容可能な担体と、
    を含む、多核化誘導剤。
  7. 　前記真核細胞がヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の腫瘍細胞である、請求項６に記載の多核化誘導剤。
  8. 　インビトロにおいて、少なくとも一種の真核細胞に対して多核化を誘導する方法であって、
    　インビトロにおいて対象の細胞を含む細胞培養物を準備すること、
    　前記細胞培養物中に、請求項１～５の何れか一項に記載の合成ペプチドのいずれかを少なくとも１回供給すること、および
    　該ペプチドを供給した前記細胞培養物を培養すること、
    を含む、多核化誘導方法。
  9. 　前記真核細胞がヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の腫瘍細胞である、請求項８に記載の多核化誘導方法。
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