WO2012157586A1 - 多核化巨核球細胞、及び血小板の製造方法 - Google Patents

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浩之 江藤
啓光 中内
直也 高山
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    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for efficiently multinucleating megakaryocytes prior to multinucleation, a method for producing platelets from such megakaryocytes, and the like.
  • platelets which are essential for blood clotting and hemostasis, are one of the most important blood cells. Platelets are in great demand for leukemia, bone marrow transplantation, anticancer treatment, etc., and the need for a stable supply is high. So far, platelets have been secured by methods of collecting TPO-like mimetic preparations, methods of differentiating megakaryocytes from umbilical cord blood or bone marrow cells, in addition to methods of collecting blood by donating blood from donors. . Recently, a technique for preparing blood cells such as platelets by inducing differentiation of pluripotent stem cells such as ES cells or iPS cells in vitro has also been developed.
  • Patent Document 1 The inventors have established a technique for inducing differentiation of megakaryocytes and platelets from human ES cells and have shown the effectiveness of ES cells as a source of platelets.
  • Patent Document 2 the inventors have established a method for preparing megakaryocytes and platelets from iPS cells, and it has been difficult to avoid by transfusion of ES cell-derived platelets, which is a problem of compatibility with human leukocyte antigen (HLA).
  • HLA human leukocyte antigen
  • megakaryocytes form pseudopodial formations called proplatelets (platelet precursors), fragmenting the cytoplasm and releasing platelets. Megakaryocytes are thought to become multinucleated by endomitosis before releasing platelets. Meganuclear cell nuclear fission is multipolar mitosis due to abnormalities of fission and cytokinesis, without fission formation and spindle elongation, resulting in the formation of cells with several lobulated nuclei Is done. Such intranuclear fission occurs repeatedly, which induces multinucleation of megakaryocytes. Many research results have been reported so far regarding meganuclear nucleation. Lodier et al.
  • Non-patent Document 1 show that, in the nuclear division of megakaryocytes, the division groove is formed, but the localization of the non-myocyte myosin II to the contractile ring is not observed, and the contraction ring formation and the spindle elongation. It was clarified that there was a defect. And it was shown that these abnormalities of contraction rings and spindle elongation become more prominent by inhibiting the activity of RhoA and Rock (Non-patent Document 2). RhoA accumulates in the division groove and promotes activation of several effector factors including Rho kinase (Rock), citron kinase, LIM kinase and mDia / formins.
  • Rho kinase Rock
  • citron kinase citron kinase
  • LIM kinase and mDia / formins.
  • Non-patent Document 3 transcription factor alltrans retinoic acid
  • valproic acid known as an inhibitor of histone deacetylase
  • Non-Patent Document 5 culturing immature megakaryocytes at 39 ° C, higher than the normal culture temperature, promotes the induction of multinucleated mature megakaryocytes and the formation of proplatelets.
  • the present inventors have found that the amount of functional platelets obtained from megakaryocytes that have not progressed to “multinucleation” (platelets that retain in vivo activity such as hemostasis and are characterized as CD42b +) is clinical. It was found that there was very little to implement the application development, and in order to efficiently produce functional platelets in vitro, it was considered necessary to promote multinucleation of megakaryocyte cells. Therefore, the present invention provides a method for promoting multinucleation of megakaryocyte cells and preparing more multinucleated multinucleated megakaryocyte cells, a method for efficiently producing platelets from multinucleated megakaryocyte cells, and the like. Let it be an issue.
  • the present inventors have attempted to promote multinucleation of megakaryocyte cells prepared from pluripotent stem cells (ES cells, iPS cells, etc.) that have not undergone multinucleation.
  • ES cells pluripotent stem cells
  • iPS cells pluripotent stem cells
  • the present inventors performed this trial using an immortalized megakaryocyte progenitor cell line (see Patent Document 3) prepared from a pluripotent stem cell developed by himself.
  • This immortalized megakaryocyte progenitor cell line increases the proliferative ability by expressing oncogenes such as MYC and genes such as BMI1 in megakaryocyte progenitor cells derived from pluripotent stem cells. ).
  • the present inventors forced the expression of an apoptosis-suppressing gene when suppressing the expression of an oncogene and a polycomb gene. We succeeded in proceeding efficiently. In addition to the forced expression of apoptosis-suppressing genes, it was confirmed that the efficiency of multinucleation was further increased by inhibiting the expression or function of the p53 gene product.
  • the above megakaryocyte progenitor cell line can be treated with ROCK (Rho-associated coiled-coil forming kinase / Rho-binding kinase) inhibitor, HDAC inhibitor, culture at 39 ° C., etc.
  • the megakaryocyte cells produced by the present invention and promoted multinucleation have a higher proportion of 4N or 8N or more megakaryocyte cells than previously reported, and mature megakaryocytes produced in vivo The ratio was found to be very high compared to cells. Furthermore, the present inventors significantly increase the number of platelets produced from a single megakaryocyte cell by suppressing the forced expression of the apoptosis-suppressing gene in mature megakaryocyte cells that are sufficiently multinucleated. In addition, we confirmed that it is possible to further increase the platelet production efficiency by culturing with a ROCK inhibitor added to the medium, etc., and investigating the optimal conditions such as the culture period and culture temperature. It came to be completed.
  • a function inhibitor of actomyosin complex complex of actin and myosin
  • the present invention [1] A method for producing a multinucleated megakaryocyte cell, comprising a step of forcibly expressing an apoptosis-suppressing gene in a megakaryocyte cell before multinucleation and culturing the cell; [2] The method according to [1] above, wherein the apoptosis-suppressing gene is a BCL-XL gene; [3] The method according to [1] or [2] above, wherein the expression or function of the p53 gene product is inhibited in the culturing step; [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein in the culturing step, at least one of the following (a) to (c) is performed on megakaryocyte cells before multinucleation: Method: (a) treatment with an actomyosin complex function inhibitor; (b) treatment with a ROCK inhibitor; and (c) treatment with an HDAC inhibitor; [5] The method according to [4]
  • the megakaryocyte cell before multinucleation is In any of the differentiation stages from hematopoietic progenitor cells to megakaryocyte cells prior to multinucleation, an oncogene and any of the following genes (i) to (iii) are forcibly expressed in the cells,
  • the hematopoietic progenitor cells are derived from iPS cells, ES cells, and cells selected from the group consisting of cord
  • the present invention it is possible to artificially promote multinucleation of megakaryocyte cells.
  • the present invention is effective in promoting multinucleation of megakaryocyte cells prepared in vitro as reported previously, and megakaryocytes having a higher degree of multinucleation compared to megakaryocytes obtained from living bodies. It is possible to obtain cells (for example, a megakaryocyte population having a high proportion of megakaryocyte cells of 4N or more).
  • the number of platelets produced from one multinucleated megakaryocyte can be remarkably increased.
  • a megakaryocyte cell before multinucleation is induced from a stem cell, and the megakaryocyte cell before multinucleation is proliferated by, for example, the method described in Patent Document 3, and according to the method of the present invention, the megakaryocyte cell before multinucleation is produced.
  • the obtained platelets are CD42b positive and greatly contribute to clinical application.
  • the outline of the experiment conducted in order to investigate the cytokine dependence of iMKPC-type I proliferation is shown.
  • iMKPC-type I was cultured.
  • the change in cell number is shown.
  • the result of analyzing the expression of the surface marker of iMKPC-type I with a flow cytometer on the 8th day of the schedule shown in FIG. 1A is shown.
  • the results of forced expression of c-MYC and BMI1 in cord blood-derived CD34-positive cells to promote the proliferation of megakaryocytes before multinucleation are shown.
  • the result of having investigated the influence of the cytokine with respect to the proliferation of iMKPC-type II is shown.
  • the result of having investigated the expression of CD41a and CD42b in iMKPC-type II is shown.
  • the result of observing with a microscope the polynuclearization when the forced expression of BCL-XL and the suppression of the expression of the p53 gene in iMKPC-type II and the addition of blebbistatin to the medium are observed.
  • the result of having investigated the influence of BCL-XL on the proliferation of iMKPC-type II is shown. Effect of ROCK inhibitor on multinucleation of megakaryocytes.
  • ROCK inhibitor (Y27632) (10 ⁇ M) was added and cultured for 7 days. I examined the degree. A shows that cells without ROCK inhibitor added (vehicle) and cells added (Rock i) are stained with Hoechst that stains the nucleus, then CD41a, a megakaryocyte marker, is stained with anti-CD41a antibody, and flow cytometer It is the result of analysis. B is a graph of the results of A. The results of examining the expression level of genes related to megakaryocyte maturation in culture at 39 ° C.
  • MYC / BMI1 in megakaryocytes was suppressed, BCL-XL was expressed in the presence of a ROCK inhibitor (10 ⁇ M), cultured for 7 days, and the degree of multinucleation was examined.
  • A shows MYC / BMI1-expressing cells (left), MYC / BMI1-expressed cells treated with ROCK inhibitor (middle), MYC / BMI1 expression suppressed and ROCK inhibitor treated, BCL-
  • the results are obtained by staining the cells expressing XL (right) with Hoechst that stains each nucleus, then staining the megakaryocyte marker CD41a with an anti-CD41a antibody, and analyzing with a flow cytometer.
  • B is a graph of the results of A.
  • C is a photomicrograph of cells having nuclei of 2N, 4N, 8N and 8N or more.
  • Growth curve of BCL-XL expressing cells Suppresses the expression of MYC / BMI1 in megakaryocytes, and in the presence of a ROCK inhibitor (10 ⁇ M), cells expressing BCL-XL (CD41a + ) ( ⁇ ) and cells not expressing (CD41a + ) ( ⁇ ) Is a result of graphing the change in the number of cells against the number of days of culture. Effect of p53 knockdown on multinucleation.
  • A shows a control cell (control) in which p53 is not knocked down and a cell in which p53 is knocked down (SiP53) are stained with Hoechst that stains the nucleus, respectively, and then megakaryocyte marker CD41a is stained with an anti-CD41a antibody. It is the result analyzed by the flow cytometer.
  • B is a graph of the results of A.
  • valproic acid treatment Suppresses expression of MYC / BMI1 in megakaryocytes, expresses BCL-XL in the presence of ROCK inhibitor (10 ⁇ M), knocks down p53 gene, and then treats with valproic acid (0.5mM), 39 °C After culturing for 7 days, the degree of multinucleation of CD41a + cells was examined. A shows that cells not treated with valproic acid (Si P53) and cells treated with valproic acid (SiP53 VLP) are stained with Hoechst that stains the nucleus, respectively, and then megakaryocyte marker CD41a is stained with an anti-CD41a antibody.
  • B is a graph of the results of A. Effect of myosin heavy chain IIA / B ATPase inhibitor (Actomyosin complex function inhibitor) on multinucleation of megakaryocytes. After suppressing the expression of MYC / BMI1 in megakaryocytes (culture in the presence of doxycycline and in the absence of estradiol), add myosin heavy chain IIA / B ATPase inhibitor blebbistatin (10 ⁇ g / ml), After culturing for 7 days, the degree of multinucleation was examined.
  • myosin heavy chain IIA / B ATPase inhibitor Actomyosin complex function inhibitor
  • A shows a case in which cells ( ⁇ ) to which blebbistatin was not added and cells (+) to which blebbistatin (10 ⁇ g / ml) was added were stained with Hoechst that stains the nucleus, and then CD41a, which is a megakaryocyte marker, was detected with an anti-CD41a antibody. This is the result of staining and analysis with a flow cytometer.
  • B is a graph of the results of A. Effect on nucleation of megakaryocytes when blebbistatin treatment is combined with other treatments.
  • B is a graph of the results of A.
  • Cell growth curve using blebbistatin treatment in combination with other treatments. Suppressed expression of MYC / BMI1 in megakaryocytes, expressed BCL-XL in the presence of Y27632 (10 ⁇ M) and valproic acid (0.5 mM), knocked down p53 gene, and treated with blebbistatin (CD41a + ) ( ⁇ ) and changes in the number of cells not treated with blebbistatin (CD41a + ) ( ⁇ ) were plotted against the number of culture days (A). Also, B shows micrographs of these cells.
  • FIG. 15 shows the results of counting the number of cells when ON / OFF of BCL-XL expression based on the same results as FIG. A shows the number of CD42b positive platelets, B shows the number of CD41a positive / CD42b positive megakaryocyte cells, and C shows the number of CD41a positive megakaryocyte cells.
  • A shows the number of CD42b positive platelets
  • B shows the number of CD41a positive / CD42b positive megakaryocyte cells
  • C shows the number of CD41a positive megakaryocyte cells.
  • the following shows the results of examining the influence on the platelet count when the culture temperature was set to 35 ° C., 37 ° C., and 39 ° C. when the expression of BCL-XL was suppressed or not during the platelet release phase.
  • the result of having investigated the influence which the presence or absence of serum, feeder cells, and blebbistatin has on the platelet count is shown.
  • the result of having investigated the influence which the presence or absence of serum, a feeder cell, and blebbistatin has on the ratio of CD42b platelets is shown.
  • An example of suitable culture conditions for the multinucleation process of megakaryocytes (MCB expansion) and the platelet release phase (Platelet production) is shown. It shows that the ratio of CD42b platelets increased by suppressing the expression of BCL-XL, and the ratio of CD42b platelets was further increased by removing serum and feeder cells from the medium and adding blebbistatin.
  • Platelets of human peripheral blood were pseudo-degraded by adding the platelet damage agent CCCPM100 ⁇ M in the presence of KP-457, added CCCP in the absence of KP-457, and fresh platelets were transfused to contribute to thrombus formation. The result of measuring the number of platelets was shown.
  • the present invention provides a method for preparing multinucleated megakaryocyte cells by promoting multinucleation of megakaryocyte cells.
  • One aspect of the method for producing a multinucleated megakaryocyte cell according to the present invention includes a step of forcibly expressing an apoptosis-suppressing gene in a megakaryocyte cell before multinucleation and culturing the cell.
  • the “megakaryocyte cell before multinucleation” in the present invention is not particularly limited, and may be a megakaryocyte cell that has not undergone multinucleation obtained from umbilical cord blood or bone marrow cell, and is also an ES cell, iPS cell, It may be a megakaryocyte cell that has not undergone multinucleation and is induced to differentiate from cord blood, bone marrow blood, peripheral blood-derived hematopoietic stem cells and progenitor cells.
  • the “megakaryocyte cell before multinucleation” in the present invention includes, for example, cells characterized as CD41a positive / CD42a positive / CD42b positive.
  • multinucleated megakaryocyte or “multinucleated megakaryocyte” refers to a cell or a group of cells having a relatively increased number of nuclei as compared to “a megakaryocyte before multinucleation”. For example, when the nucleus of a megakaryocyte to which the method of the present invention is applied is 2N, 4N or more cells become “multinucleated megakaryocyte” or “multinucleated megakaryocyte”. Even in megakaryocytes before multinucleation, the number of nuclei is not necessarily one.
  • the cell group before the period has passed is called a megakaryocyte cell before multinucleation
  • the cell group after the period has passed It is sometimes called megakaryocyte cells that are multinucleated.
  • the present invention is also applicable to pre-multinucleated megakaryocytes derived from pluripotent stem cells (such as ES cells and iPS cells), hematopoietic stem cells and progenitor cells derived from umbilical cord blood, bone marrow blood, and peripheral blood. can do.
  • pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells
  • megakaryocyte cells obtained from net-like structures prepared from ES cells or iPS cells also referred to as ES-sac or iPS-sac
  • net-like structure prepared from ES cells or iPS cells is a three-dimensional sac-like structure (with internal space) derived from ES cells or iPS cells, such as an endothelial cell population.
  • ES cells used in the present invention are not particularly limited, and generally, fertilized eggs at the blastocyst stage are cultured together with feeder cells, and the cells derived from the proliferated inner cell mass are separated, Furthermore, it is possible to use what was finally established as an ES cell line by repeating the planting operation.
  • differentiation pluripotency factors genes that impart differentiation pluripotency to somatic cells (for example, fibroblasts, blood cells, etc.) Any cell derived from any cell may be used as long as it has acquired the same pluripotency as ES cells.
  • differentiation pluripotency factors are not limited, for example, the Oct family (for example, Oct3 / 4), the SOX family (for example, SOX2, SOX1, SOX3, SOX15 and SOX17, etc.) ), Klf family (for example, Klf4, Klf2, etc.), MYC family (for example, c-MYC, N-MYC, L-MYC, etc.), NANOG, LIN28 and the like.
  • the Oct family for example, Oct3 / 4
  • SOX family for example, SOX2, SOX1, SOX3, SOX15 and SOX17, etc.
  • Klf family for example, Klf4, Klf2, etc.
  • MYC family for example, c-MYC, N-MYC, L-MYC, etc.
  • NANOG LIN28 and the like.
  • the present inventors have developed oncogenes such as MYC, BMI1, etc. in megakaryocytes before multinucleation derived from pluripotent stem cells (including those described as “megakary precursor cells” in Patent Document 3). Have been reported to enhance the proliferation ability of the megakaryocyte cells (Patent Document 3, JEM, 207: 2817-2830 2010). Megakaryocytes before multinucleation prepared by this method can be suitably used for the method of the present invention.
  • a gene obtained by forcibly expressing a gene and any of the following genes (i) to (iii) and culturing and proliferating the cells can be used.
  • a gene that suppresses expression of the p16 gene or the p19 gene can be used.
  • a gene that suppresses the expression of the Ink4a / Arf gene can be used.
  • oncogenes examples include MYC family genes, Src family genes, Ras family genes, Raf family genes, protein kinase family genes such as c-Kit, PDGFR, and Abl.
  • genes (i) to (iii) include BMI1, Mel18, Ring1a / b, Phc1 / 2/3, Cbx2 / 4/6/7/8, Ezh2, Eed, Suz12, HADC, Dnmt1 / Although 3a / 3b can be mentioned, the BMI1 gene is particularly preferred.
  • the expression control of oncogene and polycomb gene can be performed by those skilled in the art according to conventional methods, and for example, a method described in detail in Patent Document 3 can be used.
  • the oncogene and the genes (i) to (iii) may be introduced into the cells at any stage of differentiation from hematopoietic progenitor cells into megakaryocyte cells before multinucleation.
  • the expression of those genes should just be induced
  • the oncogenes used in the present invention and the genes (i) to (iii) have homology to these known cDNA sequences as well as genes whose cDNA sequences have already been disclosed. Also included are homologs identified on the basis of the prior art.
  • the c-MYC gene is a gene consisting of the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, for example.
  • the homologue of the c-MYC gene is a gene whose cDNA sequence is substantially the same as the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, for example.
  • the cDNA comprising the sequence substantially identical to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , 97%, 98%, most preferably about 99% identity or hybridizing under stringent conditions with DNA consisting of a sequence complementary to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 DNA that can be produced, and the protein encoded by these DNAs contributes to the amplification of cells at the differentiation stage, such as megakaryocytes before multinucleation.
  • the BMI1 gene is a gene consisting of the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, for example.
  • the homologue of the BMI1 gene is a gene whose cDNA sequence is substantially the same as the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, for example.
  • the cDNA consisting of a sequence substantially identical to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , 97%, 98%, most preferably about 99% identity, or DNA consisting of a sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 under stringent conditions DNA that can be produced, and that the protein encoded by the DNA suppresses oncogene-induced cell senescence that occurs in cells in which oncogenes such as the MYC family genes are expressed, and promotes the amplification of the cells It is.
  • the “apoptosis suppressor gene” is not particularly limited as long as it is a gene that suppresses apoptosis, and examples thereof include BCL2 gene, BCL-XL gene, Survivin, MCL1 and the like.
  • BCL2 gene a gene that suppresses apoptosis
  • BCL-XL gene a gene that suppresses apoptosis
  • Survivin MCL1 and the like.
  • megakaryocytes continue to proliferate for a long time by forcibly expressing an apoptosis-inhibiting gene.
  • the genes that suppress apoptosis such as BCL-XL gene and BCL2 gene used in the present invention are based on the homology of these known cDNA sequences as well as genes whose cDNA sequences have already been disclosed.
  • the homologue identified by is also included.
  • the BCL-XL gene which is one of the genes that suppress apoptosis, is a gene consisting of the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the homologue of the BCL-XL gene is a gene whose cDNA sequence is substantially the same as the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, for example.
  • the cDNA comprising the sequence substantially identical to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is about 60% or more, preferably about 70% or more, and more preferably about DNA, comprising the sequence represented by SEQ ID NO: 3. 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , 97%, 98%, most preferably about 99% identity DNA, or DNA consisting of a sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and hybridizing under stringent conditions A DNA that can be produced, and a protein encoded by the DNA has an effect of suppressing apoptosis.
  • stringent conditions are hybridization conditions that are easily determined by those skilled in the art, and are generally empirical experimental conditions that depend on the probe length, washing temperature, and salt concentration. In general, the longer the probe, the higher the temperature for proper annealing, and the shorter the probe, the lower the temperature. Hybridization generally relies on the ability to reanneal in an environment where the complementary strand is slightly below its melting point.
  • low stringency conditions include washing in a 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS solution at a temperature of 37 ° C. to 42 ° C. in the filter washing step after hybridization.
  • highly stringent conditions include washing in 65 ° C., 5 ⁇ SSC and 0.1% SDS in the washing step.
  • a gene such as an oncogene, a gene of (i) to (iii), or an apoptosis-suppressing gene is forcibly expressed in a cell
  • the gene may be carried out by any method known to those skilled in the art.
  • the gene may be introduced into cells and expressed using a gene transfer system such as a retrovirus.
  • the gene When gene expression is performed using a viral gene transfer vector, the gene may be operably linked downstream of an appropriate promoter, inserted into the gene transfer vector, and introduced into the cell to express the target gene.
  • “operably linked” means that the promoter and the target gene are linked so that the target gene is controlled in cis by the promoter and the desired expression of the target gene is realized.
  • a target gene may be expressed constitutively using a CMV promoter, EF1 promoter or the like, or an element whose activity is controlled by a trans factor such as a drug response element such as tetracycline.
  • an appropriate promoter inducible promoter
  • the target gene can be expressed inductively by controlling drug addition or the like.
  • a drug gene expression system can be easily selected by those skilled in the art.
  • a commercially available kit or the like may be used.
  • the oncogene that is the target gene for expression control and the genes (i) to (iii) may be inserted into separate vectors or into the same vector.
  • suppression of the expression of oncogenes and (i) to (iii) genes in megakaryocytes is achieved, for example, by releasing the induction of expression by the inductive expression system described above by removing the drug, etc. May be.
  • the introduced oncogene and the genes (i) to (iii) may be removed using a Cre / lox system or the like, and the expression of these genes may be controlled in a suppressive manner.
  • a commercially available kit or the like can be appropriately used.
  • One aspect of the method for producing a multinucleated megakaryocyte cell according to the present invention includes a step of simultaneously inhibiting the expression or function of the p53 gene product in a cell in which an apoptosis-suppressing gene is forcibly expressed.
  • the expression is used in a concept including transcription and translation, and when the expression is inhibited, it can include inhibition at the transcription level and inhibition at the translation level.
  • the p53 gene product is widely known as a tumor suppressor gene, and gene sequences and the like in various animal species are also known.
  • a method for inhibiting the function of the p53 gene product in megakaryocytes can be achieved by conventional techniques in the art.
  • a method of inhibiting the production of the gene product by introducing a mutation (substitution, insertion or deletion, or modification or modification) into the p53 gene or a method of directly inhibiting the function of the gene product And so on.
  • Methods for introducing mutations (substitutions, insertions or deletions, or alterations or modifications) into genes include the use of appropriate gene targeting vectors to destroy the entire p53 gene by homologous recombination, the Cre / lox system And the like, and a method for introducing a mutation into a region important for the activity of the gene product.
  • a dominant negative method may be used as a method of inhibiting the function of the p53 gene product.
  • the dominant negative method expresses a large amount of p53 protein that has been reduced or lost by introducing mutations in the cell, increasing the ratio of inactive p53 protein to normal p53 protein in the cell, As a result, it is a method of obtaining a cell exhibiting a behavior in which the function of the p53 protein cannot be obtained.
  • an antisense method As a method for suppressing the expression of the p53 gene product, an antisense method, a ribozyme method, an RNAi method, or the like may be used.
  • the antisense method has a base sequence complementary to a target gene (basically, mRNA which is a transcription product), generally 10 to 100 bases long, preferably 15 to 30 bases long. This is a method of suppressing gene expression using a single-stranded nucleic acid.
  • a target gene basically, mRNA which is a transcription product
  • the antisense nucleic acid may not be completely complementary to the target gene as long as the effect of inhibiting the expression of the target gene is obtained.
  • Antisense nucleic acids can be appropriately designed by those skilled in the art using known software or the like.
  • the antisense nucleic acid may be any of DNA, RNA, DNA-RNA chimera, and may be modified.
  • Ribozymes are nucleic acid molecules that catalytically hydrolyze target RNA, and are composed of an antisense region having a sequence complementary to the target RNA and a catalytic center region responsible for the cleavage reaction.
  • the ribozyme can be appropriately designed by those skilled in the art according to known methods. Ribozymes are generally RNA molecules, but DNA-RNA chimeric molecules can also be used.
  • the RNAi method is a sequence-specific gene expression suppression mechanism induced by a double-stranded nucleic acid.
  • the target specificity is very high, and it is highly safe because it uses a gene expression suppression mechanism that originally exists in vivo.
  • Examples of the double-stranded nucleic acid having an RNAi effect include siRNA.
  • siRNA When used for mammalian cells, siRNA is a double-stranded RNA of usually about 19 to 30 bases, preferably about 21 to 25 bases.
  • a double-stranded nucleic acid having an RNAi effect has one base sequence complementary to a part of the target nucleic acid and the other complementary sequence.
  • a double-stranded nucleic acid having an RNAi effect can be designed according to a known method based on the base sequence of the target gene.
  • the double-stranded nucleic acid having an RNAi effect may be a double-stranded RNA or a DNA-RNA chimera-type double-stranded nucleic acid, and may be an artificial nucleic acid or a nucleic acid subjected to various modifications. There may be.
  • siRNA, antisense nucleic acid, and ribozyme can be expressed in a cell by introducing a vector (for example, a lentiviral vector) containing the nucleic acid encoding each into the cell.
  • DNA encoding each of the double strands may be used, or DNA encoding a single-stranded nucleic acid formed by linking double-stranded nucleic acids via a loop may be used.
  • the single-stranded RNA obtained by transcription in the cell has a complementary structure hybridized in the molecule and takes a hairpin type structure. This RNA is called shRNA (short hairpin RNA).
  • shRNA short hairpin RNA
  • the loop part is cleaved by the enzyme (Dicer), and it becomes double-stranded RNA and exerts the RNAi effect.
  • Other methods of inhibiting the function of the p53 gene product in megakaryocytes include directly or indirectly inhibiting the function of the p53 gene product, and indirectly inhibiting p53 activation by inhibiting p53 phosphorylation. It may be a method of inhibiting.
  • megakaryocytes before forced expression of the apoptosis-suppressing gene and inhibition of expression or function of the p53 gene product continue to grow, but cytokine dependence is SCF and is released Platelets also include those that are not CD42b positive.
  • cytokine dependence is SCF and is released Platelets also include those that are not CD42b positive.
  • One aspect of the method for producing a multinucleated megakaryocyte cell according to the present invention is the step of (a) treating cells cultured by forcibly expressing an apoptosis-suppressing gene with an actomyosin complex function inhibitor, (b) At least one of a step of treating with a ROCK inhibitor and a step of treating with a HDAC inhibitor.
  • the actomyosin complex is a complex of actin and myosin II, and constitutes, for example, a contraction ring that appears during cytokinesis.
  • myosin II functions as a motor protein while interacting with actin and is involved in the contraction movement of the contraction ring.
  • the “actomyosin complex function inhibitor” of the present invention may inhibit its function by any mechanism.
  • the function of the actomyosin complex is inhibited by inhibiting the formation of the actomyosin complex.
  • Inhibiting myosin light chain kinase (MLCK), inhibiting myosin heavy chain (MHC) IIA / B ATPase inhibition of the function of actomyosin complex, myosin light chain kinase (MLCK) Along with this, those that inhibit the function of the actomyosin complex are included.
  • Myosin heavy chain IIA / B ATPase is a molecule that plays an important role in the contractile movement of the contractile ring during cytokinesis.
  • Myosin light chain kinase phosphorylates L2 of the myosin light chain and acts on actin- Induces sliding movement between myosins.
  • ROCK inhibitors have been reported to suppress meganuclear cell nuclear division and promote multinucleation, but myosin heavy chain IIA / B regulates the formation or function of actomyosin complex ATPase and myosin light chain kinase function downstream of the ROCK signal, and more directly control the contractile movement of the contractile ring through the formation or function regulation of the actomyosin complex. Therefore, it is considered that the actomyosin complex function inhibitor effectively suppresses the nuclear division of megakaryocytes and further promotes multinucleation more than the ROCK inhibitor.
  • actomyosin complex function inhibitor examples include myosin heavy chain IIA / B ATPase inhibitor, blebbistatin (Science, 299: 1743-1747 2003). Moreover, ML7 etc. which are myosin light chain kinase inhibitors can be mentioned.
  • myosin heavy chain IIA / B ATPase inhibitor or myosin light chain kinase inhibitor a nucleic acid (for example, shRNA) or an antibody that inhibits the activity of myosin heavy chain IIA / B ATPase or myosin light chain kinase is also used. be able to.
  • treatment refers to an operation in which the effect of an inhibitor or the like is exerted on a target cell.
  • an appropriate amount of an inhibitor or the like is added to a cell culture solution. It is to put it in a state where it can be taken into cells.
  • an operation that promotes uptake into cells may be used in combination.
  • One aspect of the method for producing megakaryocyte cells according to the present invention includes a step of treating cells cultured by forced expression of an apoptosis-suppressing gene with a Rock inhibitor.
  • ROCK Ra-associated coiled-coil forming kinase
  • examples of ROCK (Rho-associated coiled-coil forming kinase) inhibitors include [(R)-(+)-trans-N- (4-pyridyl) -4- (1-aminoethyl)- In some cases, such as cyclohexanecarboxamide, 2HCl, H 2 O] (Y27632), antibodies that inhibit Rho kinase activity, or nucleic acids (eg, shRNA) should also be used as ROCK inhibitors. Can do.
  • One aspect of the method for producing megakaryocyte cells according to the present invention includes a step of treating cells cultured by forced expression of an apoptosis-suppressing gene with an HDAC inhibitor.
  • the HDAC inhibitor has an action of inhibiting histone deacetylase (HDAC) activity.
  • HDAC inhibitors include valproic acid, trichostatin A, SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid), APHA (aroylpyrrolylhydroxyamide), etc.
  • Valproic acid, trichostatin A and the like can be preferably used.
  • the drug used has a salt form, it may be used in a salt form.
  • blebbistatin which is a myosin heavy chain II ATPase inhibitor
  • the culture period is, for example, 5 to 10 days. About 6 to 7 days is preferable.
  • RO276 inhibitor Y27632 is used at 5 to 15 ⁇ M, or 8 to 12 ⁇ M, preferably about 10 ⁇ M
  • HDAC inhibitor valproic acid is 0.1 to 1 mM, or 0.2 to 0.7 mM, preferably Can be used at about 0.5 mM.
  • the treatment time for Y27632 and valproic acid is 10 to 21 days, preferably about 14 days.
  • One embodiment of the method for producing a multinucleated megakaryocyte cell according to the present invention includes placing cells cultured by forcibly expressing an apoptosis-inhibiting gene at a temperature of 37 ° C. or higher. Further, it has been confirmed that culturing megakaryocyte cells at a normal temperature of 37 ° C. or higher promotes differentiation of multinucleated megakaryocyte cells.
  • the temperature of 37 ° C. or higher is appropriate as a temperature that does not damage cells, and is preferably about 37 ° C. to about 42 ° C., preferably about 37 to about 39 ° C.
  • the culture period at a temperature of 37 ° C. or higher can be appropriately determined while monitoring the number of multinucleated megakaryocyte cells. For example, the culture period can be 10 to 28 days, preferably 14 days to About 21 days.
  • culture conditions for the step of forced expression of the apoptosis-suppressing gene in megakaryocyte cells prior to multinucleation are not particularly limited as long as the effect of the present invention is suitably obtained, and known culture conditions and conditions equivalent thereto Can be used.
  • two or more of these may be combined and added to the medium.
  • the multinucleated megakaryocyte obtained by the above method efficiently produces CD42b-positive functional platelets.
  • CD42b positive platelets have a high thrombus formation ability in vivo and invitro.
  • multinucleated megakaryocytes can produce functional platelets even after thawing after cryopreservation.
  • the present invention also provides a blood cell composition having a high content of multinucleated megakaryocyte cells.
  • the “blood cell composition” includes “multinucleated megakaryocyte cells” whose multinucleation has been promoted by the method of the present invention, megakaryocyte cells prepared by other methods, or other blood Cells may be included.
  • multinucleated megakaryocyte cells whose multinucleation has been promoted by the method of the present invention, megakaryocyte cells prepared by other methods, or other blood Cells may be included.
  • differentiation into 4N or more multinucleated megakaryocytes can be promoted. Therefore, for example, by applying the method of the present invention to a megakaryocyte population differentiated from pluripotent stem cells or the like, a blood cell composition having a high content of multinucleated megakaryocyte cells of 4N or more is obtained.
  • the content of 4N or more multinucleated megakaryocyte cells is at least 20% or more, 30% or more, preferably 40% or more, 50% or more, more preferably Can be increased to 80% or more (see, for example, FIG. 11B). Therefore, according to the method of the present invention, it is possible to prepare a megakaryocyte cell population or a blood cell population having a high abundance ratio of multinucleated megakaryocyte cells. Such blood cell compositions can also be stored frozen. Therefore, it may be distributed in a cryopreserved state, and the platelet production method described later may be performed by the user.
  • Megakaryocyte cells and the like that have been treated by the method of the present invention to promote multinucleation are also effective for transplanting in vivo and producing functional platelets in vivo by an appropriate method.
  • bone marrow transplantation and umbilical cord blood transplantation are performed as a method for transplanting hematopoietic stem cells.
  • umbilical cord blood transplantation can alleviate problems in bone marrow transplantation such as a shortage of donors and the burden on donors.
  • opportunities for umbilical cord blood transplantation have increased.
  • megakaryocytes produced in vivo by umbilical cord blood transplantation have a low degree of multinucleation, and it takes time to produce sufficient platelets in vivo, and rapidly increase the ability to produce platelets.
  • Transplantation of multinucleated megakaryocytes obtained by the method of the present invention can solve the problem of insufficient donor number and donor burden in bone marrow transplantation, and in vivo platelet production ability in cord blood transplantation. Therefore, it can be said that it is a very excellent method compared with the conventional transplantation method.
  • the method for producing platelets according to the present invention produces platelets in vitro from multinucleated megakaryocyte cells or the like obtained by the method of the present invention.
  • the method for producing platelets according to the present invention includes a step of culturing multinucleated megakaryocyte cells obtained by the above-described method and collecting platelets from the culture.
  • the culture conditions are not limited. For example, in the presence of TPO (10 to 200 ng / mL, preferably about 50 to 100 ng / mL), or TPO (10 to 200 ng / mL, preferably 50 to 100 ng / mL).
  • the cells may be cultured for about 7 to 15 days.
  • apoptotic gene in the step of culturing multinucleated megakaryocyte cells, forced expression of the apoptotic gene is suppressed or the apoptosis suppressing gene is removed from the multinucleated megakaryocyte cell.
  • Inhibition of the expression of an apoptosis-suppressing gene may be achieved, for example, by releasing the induction of expression by the above-described inducible expression system by removing a drug or the like.
  • the introduced apoptosis-suppressing genes may be removed using a Cre / lox system or the like, and the expression of these genes may be controlled in a suppressive manner.
  • a commercially available kit or the like can be used as appropriate in order to suppressively regulate the expression of the apoptosis-suppressing gene.
  • the suppression or removal of the apoptosis-suppressing gene expression is performed from 15 days before platelet collection, preferably from 10 days before, more preferably from 3 to 7 days before, and more preferably from about 3 days before.
  • the exogenous apoptosis suppressing gene not only the exogenous apoptosis suppressing gene but also the expression of the endogenous apoptosis suppressing gene may be suppressed.
  • expression or function inhibition of the p53 gene product may be continued in this step.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as the effects of the present invention can be obtained, and can be performed at 35 ° C. to 40 ° C. However, as shown in the Examples, 37 ° C. to 39 ° C. is preferable.
  • the step of culturing the multinucleated megakaryocyte cells may be performed under serum-free and / or feeder cell-free conditions.
  • serum-free and / or feeder cell-free conditions As shown in the examples, in the method according to the present invention, there was no significant difference in the amount of platelets produced when fetal calf serum was added to the medium and when cultured in the serum-free medium. The percentage of CD42b positive platelets was higher when cultured in serum-free medium or feeder cell-free medium. If the platelet production process can be performed free of serum and feeder cells, immunogenicity problems are unlikely to occur when the obtained platelets are used clinically.
  • a conditioned medium may be used.
  • the conditioned medium is not particularly limited and can be prepared according to methods known to those skilled in the art.
  • the conditioned medium can be obtained by appropriately culturing feeder cells and removing the feeder cells from the culture with a filter.
  • a ROCK inhibitor and / or an actomyosin complex function inhibitor is added to the medium.
  • a ROCK inhibitor and an actomyosin complex function inhibitor the same thing as what was used with the manufacturing method of the multinucleated megakaryocyte cell mentioned above can be used.
  • the ROCK inhibitor include Y27632.
  • the actomyosin complex function inhibitor include blebbistatin, which is a myosin heavy chain II ATPase inhibitor.
  • a ROCK inhibitor may be added alone, a ROCK inhibitor and an actomyosin complex function inhibitor may be added alone, or a combination thereof may be added.
  • the ROCK inhibitor and / or actomyosin complex function inhibitor is preferably added at 0.1 ⁇ M to 30 ⁇ M, for example, 0.5 ⁇ M to 25 ⁇ M, 5 ⁇ M to 20 ⁇ M, and the like.
  • the culture period after adding the ROCK inhibitor and / or the actomyosin complex function inhibitor may be 1 to 15 days, and may be 3 days, 5 days, 7 days, or the like.
  • An embodiment of the present invention includes a kit for promoting multinucleation of megakaryocyte cells and producing mature megakaryocyte cells and / or platelets.
  • the kit includes an oncogene, the above genes (i) to (iii), an expression vector and a reagent necessary for expressing the BCL-XL gene and the like in a cell, a medium for cell culture, Supplements such as serum and growth factors (for example, TPO, EPO, SCF, Heparin, IL-6, IL-11, etc.), antibiotics and the like are included.
  • kits for example, when using cells derived from ES cells or iPS cells, antibodies for marker confirmation for identifying net-like structures prepared from these cells (for example, Flk1, CD31, CD34, UEA-I lectin) For example).
  • Reagents, antibodies, and the like contained in the kit are supplied into any type of container in which the constituents are kept active for a long period of time, are not adsorbed by the material of the container, and do not undergo alteration.
  • the kit of the present invention may include a megakaryocyte cell before multinucleation in which the oncogene and the genes (i) to (iii) described above are forcibly expressed.
  • the origin of the “cell” described in the present specification is a human or non-human animal (eg, mouse, rat, cow, horse, pig, sheep, monkey, dog, cat, bird, etc.) and is not particularly limited. But. Particularly preferred are human-derived cells.
  • pMx tet off c-MYC 2A BMI1 vector expresses c-MYC and BMI1 genes in the presence of estradiol, while c-MYC and BMI1 genes are expressed in the presence of doxycycline (Dox) and absence of estradiol Suppress.
  • Estradiol 2 mM was added at the same time as the first infection, and the virus was removed 12 hours after the last infection. At this time, even when c-MYC gene and BMI1 gene expression was turned off, CD42b-positive platelets were released little, and it was considered to be immature megakaryocytes. Hereinafter, this cell may be referred to as “iMKPC-type I”.
  • iMKPC-type I In order to examine the cytokine dependence of iMKPC-type I, 2 ⁇ 10 5 iMKPC-type I were seeded on 10T1 / 2 feeder cells, and SCF (50 ng / ml), TPO (50 ng) at 37 ° C. in the presence of 2 uM ⁇ -estradiol.
  • FIGS. 1B and C As shown in FIG. 1B, iMKPC-type I proliferation was strongly dependent on SCF. Further, as shown in FIG. 1A, the group in which growth was confirmed measured the number of cells and replated at 2 ⁇ 10 5 cells. Otherwise, the medium was changed. On days 8 and 14, the number of cells was measured and replated at 2 ⁇ 10 5 cells. On day 8, some cells were stained with CD41 antibody, CD42b antibody and GPA antibody. The analysis was performed. The results are shown in FIGS. 1B and C. As shown in FIG. 1B, iMKPC-type I proliferation was strongly dependent on SCF. Further, as shown in FIG.
  • CD41 + / CD42b ⁇ group is a group with good proliferation among iMKPC-type I. It was suggested that iMKPC-type I is an immature megakaryocyte from the fact that it is dependent on SCF.
  • megakaryocyte cells before nucleation were prepared from umbilical cord blood-derived CD34-positive cells in the same manner as ES cells and iPS cells.
  • the cord blood-derived CD34-positive cells were infected with pMx-c-MYC and DNsam BMI1 virus (both retroviral vectors) at MOI10 three times, and then FACS was used on the 14th and 21st cells.
  • CD41a megakaryocyte marker
  • Mock Empty vector
  • FG12-sh p53 lentiviral vector was infected to knock down the p53 gene.
  • this cell may be referred to as “iMKPC-type II”.
  • ROCK inhibitor In order to suppress the expression of MYC gene and BMI1 gene in the proliferated megakaryocyte cell line, change to the condition in the presence of doxycycline and in the absence of estradiol, and the effect on the polynuclearization of ROCK inhibitor (Y27632; Wako Pure Chemical Industries) In order to observe the above, Y27632 was added to the culture solution to 10 ⁇ M, and the culture was further continued. On the 7th day after the addition of Y27632, the degree of multinucleation was examined by FACS (FIG. 5). Cells with ROCK inhibitor added (Fig. 5, upper figure (Rocki), lower figure, white) have more than 4N cells compared to cells without addition (Fig. 5, upper figure, vehicle, lower figure are black). Increased. From this, it became clear that ROCK inhibitors promote multinucleation against megakaryocytes before multinucleation, which were derived from ES cells and acquired proliferation ability by expression of c-MYC gene and BMI1 gene
  • BCL-XL-expressing cell lines (FIG. 7B, hatched bars) have a significant increase in multinucleated cells of 8N or more compared to cell lines not expressing BCL-XL (FIG. 7B, open bars). confirmed.
  • the number of cells not expressing BCL-XL decreases (Fig. 8, ⁇ ), whereas the number of cells expressing BCL-XL grows slowly. Observed (FIG. 8, ⁇ ).
  • genes that suppress apoptosis such as BCL-XL gene are effective. It was shown that
  • cells treated with blebbistatin (FIG. 11, white bars) have an increased number of cells of 8N or more and are multinucleated. Has been promoted. Next, the degree of polynucleation when other treatments and blebbistatin treatment were combined was examined. 2-7-5. In addition to the above treatment, the cells were treated with blebbistatin to examine the effect on multinucleation.
  • the group in which the expression of BclxL was suppressed by Dox OFF mainly consisted of mature megakaryocyte expressing CD42b.
  • B platelets released from them increased in proportion of those expressing CD42b necessary for functional expression compared to platelets (C) released from megakaryocytes of BCL-XL ON ( D).
  • FIG. 15 shows the results obtained by measuring the number of cells when BCL-XL expression was turned on / off based on the same results as above. In the group with suppressed BCL-XL expression, the platelet count increased significantly.
  • A shows the number of CD42b positive platelets
  • B shows the number of CD41a positive / CD42b positive megakaryocyte cells
  • C shows the number of CD41a positive megakaryocyte cells.
  • the number of megakaryocytes expressing CD41 is not affected by the expression of BclxL (C), but the CD42b expression ratio in CD41 + is increased by suppressing the expression of BclxL, and more mature megakaryocytes are increasing. I can say.
  • FIG. 16 shows the average value and standard deviation of the number of CD41 + CD42b + platelets in each group, with 37 ° C. Dox + being 1.
  • the culture temperature was found to be 37 ° C or 39 ° C. In subsequent experiments, the culture temperature was 37 ° C.
  • Conditioned Medium is seeded with 8x10 5 MMC-treated 10T1 / 2 in a 10cm dish coated with Gelatin and differentiated with 15% serum containing SCF (50ng / ml) and TPO (50ng / ml) the next day (after cell attachment) Replace with medium (EBM) or serum-free differentiation medium 10 ml, collect medium 24 hours later, add 10 ml of fresh medium (containing SCF, TPO), pool 3 days of Conditioned Medium, and add 0.22 ⁇ m A filter was prepared by removing 10T1 / 2. When used for the test, SCF and TPO were newly added.
  • the feeder cell use group 2 to 3 ⁇ 10 5 iMKPC-type II were seeded on 10T1 / 2 feeder cells, and in the non-use group, cells were similarly seeded on gelatin-coated dishes.
  • the serum medium use group used differentiation medium or Conditioned Medium containing 15% serum, and the blebbistatin administration group added 5 ⁇ M blebbistatin to the medium.
  • the culture was performed at 37 ° C. for 3 days. Platelets contained in the culture supernatant were stained with CD41 antibody and CD42b antibody and analyzed with a flow cytometer.
  • FIG. 17 is a graph showing the average value and the standard deviation of the ratio of the CD41 + CD42b + platelet count of each group with respect to the normal condition as a normal condition when cultured with feeder cells without blebbistatin and 15% serum added. Shown in There was no significant difference in the amount of platelet production in any group.
  • FIG. 18 shows a comparison of the expression level of CD42b in each group of CD41-positive platelets (the ratio of the average fluorescence intensity of each group to the average fluorescence intensity of the normal condition). Platelets with the highest CD42b expression were produced in the absence of serum and feeder cells. There was no effect of blebbistatin.
  • FIG. 20 shows the ratio of CD41 positive and CD42b (also referred to as GPIba) positive platelets when cultured under these conditions.
  • CD41 positive and CD42b also referred to as GPIba
  • FIG. 20 shows the ratio of CD41 positive and CD42b (also referred to as GPIba) positive platelets when cultured under these conditions.
  • GPIba CD41 positive and CD42b
  • about 20% of the platelets obtained from the multinucleated megakaryocyte cells obtained by the present invention are CD41-positive and CD42b-positive, and the ratio thereof is 55% by suppressing the expression of BCL-XL. It was possible to increase to 81% by further culturing without feeder cells and serum.
  • HIP1 antibody is a functional inhibitory antibody of GPIba. Suspend 1x10 8 platelets in 50% plasma, add HIP1 antibody, pre-incubate for 3 minutes at 37 ° C to inhibit GPIba effect, then add ristocetin (final concentration 2mg / ml) to aggregate The reaction was triggered and the light transmission was monitored for 7 minutes.
  • FIG. 21 shows a bar graph showing the maximum light transmittance (indicating the strength of aggregation) of each group.
  • the HPI1 antibody completely inhibited aggregation due to GPIb / alpha-von Willebrand factor (vWF) association at a concentration of 10 ⁇ g / ml or more.
  • HIP1 antibody or control IgG 100 ug of HIP1 antibody or control IgG was administered into NOG mice, and platelets stained with TAMRA (red pigment) were transfused.
  • the blood vessel endothelium was damaged by laser irradiation to induce thrombus formation, and the number of human platelets (red) that contributed to thrombus formation was counted.
  • the average value and standard error of the values obtained by correcting the number of human platelets in the thrombus by the unit blood vessel length are shown in a bar graph (FIG. 22).
  • the contribution of human platelets to thrombus was inhibited. From the above, it can be seen that GPIba (CD42b) is a molecule that plays an important role in thrombus formation in vivo and in vitro.
  • the present invention provides a method for promoting multinucleation of megakaryocyte progenitor cells and further efficiently releasing platelets.
  • the method of the present invention is very effective in preparing megakaryocytes and platelets in vitro from various stem cells and the like, and greatly contributes to the development of therapeutic methods and blood products in the medical field.

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Abstract

　本発明は、巨核球細胞の多核化を促進し、より多核化した多核化巨核球細胞をする方法、さらに多核化巨核球細胞から効率よく血小板を産生させる方法等を提供することを課題とする。本発明は、多核化巨核球細胞を製造する方法であって、多核化前の巨核球細胞において、アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させて、該細胞を培養する工程を含む方法を提供する。

Description

多核化巨核球細胞、及び血小板の製造方法
　本発明は、多核化前の巨核球細胞を効率よく多核化させる方法、及びかかる巨核球細胞から血小板を製造する方法等に関する。
　血液関連疾患の治療や、外科的な治療には、多くの血液細胞が必要とされる。血液細胞の中でも、血液凝固及び止血のために必須の細胞である血小板は特に重要な血液細胞の1つである。血小板は、白血病、骨髄移植、抗癌治療などにおいて需要が多く、安定供給の必要性は高い。これまでに、血小板は、ドナーからの献血により採取する方法の他、TPO様類似構造 (ミメティクス)製剤を投与する方法、臍帯血又は骨髄細胞から巨核球細胞を分化させる方法などにより確保されてきた。最近では、ES細胞又はiPS細胞などの多能性幹細胞をインビトロにおいて分化誘導し、血小板などの血液細胞を調製する技術も開発されている。
　発明者らは、ヒトES細胞から巨核球細胞及び血小板を分化誘導する技術を確立し、血小板のソースとしてのES細胞の有効性を示している（特許文献１及び非特許文献１）。また、発明者らは、iPS細胞からの巨核球細胞及び血小板の調製法を確立させ、ES細胞由来の血小板の輸血では回避困難であった、白血球抗原（human leukocyte antigen; ＨＬＡ）適合性の問題を解決可能にした（特許文献２）。
　さらに、発明者らは、幹細胞から調製される血小板等の量的な問題に対し、幹細胞をもとに不死化した巨核球前駆細胞株の樹立方法を見いだすことでその調製を行い、インビトロにおいて血小板等を大量に調製するために重要な技術を開発した（特許文献３）
　生体において、巨核球は、proplatelets(血小板前駆体)と呼ばれる偽足形状（pseudopodial formation）を形成し、その細胞質を断片化して血小板を放出する。巨核球は、血小板を放出するまでに、核内分裂(endomitosis)によって多核化すると考えられている。巨核球の核内分裂は、分裂溝形成及び紡錘体伸長を伴わない、核分裂及び細胞質分裂の異常による多極性有糸分裂であり、その結果、幾つかに分葉化した核を含む細胞が形成される。このような核内分裂が繰り返し生じることで、巨核球の多核化が誘導される。
　巨核球の多核化に関し、これまでに多くの研究結果が報告されている。Lodierらは（非特許文献１）、巨核球の核内分裂において、分裂溝は形成されるものの、非筋細胞ミオシンIIの収縮環への局在が認められず、収縮環形成及び紡錘体伸長に欠陥が生じていることを明らかにした。そして、これら収縮環や紡錘体伸長の異常は、RhoA及びRockの活性を阻害することにより、より顕著になることが示された（非特許文献２）。RhoAは分裂溝に蓄積し、Rhoキナーゼ(Ｒｏｃｋ)、citron kinase、LIM kinase及びmDia/forminsなどを含む幾つかのエフェクター因子の活性化を促進する。これらの結果から、RhoA及びRockなど収縮環形成などに関与する因子の活性を阻害することで、巨核球の核内分裂が促進されることが示唆されている。また、integrin alpha2/beta1下流に位置するRhoのシグナルが増強されると、未熟な多核化していない巨核球のproplatelet形成が阻害されるとの報告もある。
　転写因子であるオールトランスレチノイン酸（ATRA；all trans retinoic acid）、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤として知られるバルプロ酸が巨核球の分化に関与していることが報告されている。Schweinfurthらは、オールトランスレチノイン酸又はバルプロ酸で未成熟な巨核球を処理すると多核化が促進されることを見出している（非特許文献３）。さらに、癌抑制遺伝子産物であるp53をノックダウンすると巨核球の多核化を促進すること（非特許文献４）も報告されている。
　その他、巨核球の分化過程に対する影響として、未成熟な巨核球を、通常の培養温度より高温の39℃で培養すると多核化した成熟巨核球の誘導及びproplateletsの形成を促進することなども示されている（非特許文献５）。
WO2008/041370 WO2009/122747 WO2011/034073
Takayamaら,Blood,111：5298-5306 2008 Lordierら,Blood,112：3164-3174 2009 Schweinfurthら,Platelets,21：648-657 2010 Fuhrken羅,J.Biol.Chem.,283：15589-15600 2008 Proulxら,Biotechnol.Bioeng.,88：675-680 2004
　本発明者らは、「多核化」が進んでいない巨核球細胞から得られる機能的な血小板（止血作用など生体内における活性を保持している血小板で、CD42b+として特徴付けられる）の量が臨床応用展開を実施するためには非常に少ないことを見出し、インビトロにおいて機能的な血小板を効率よく産生させるためには、巨核球細胞の多核化を促進する必要があると考えた。
　そこで、本発明は、巨核球細胞の多核化を促進し、より多核化した多核化巨核球細胞を調製する方法、さらに多核化巨核球細胞から効率よく血小板を産生させる方法等を提供することを課題とする。
　上記課題に鑑み、本発明者らは、多能性幹細胞（ES細胞、iPS細胞など）から調製した多核化が進んでいない巨核球細胞の多核化を促進することを試みた。まず、本発明者らは、この試みを、自ら開発した多能性幹細胞から調製した不死化巨核球前駆細胞株（特許文献３参照）を用いて行った。この不死化巨核球前駆細胞株は、多能性幹細胞から誘導した巨核球の前駆細胞内で、MYCなどの癌遺伝子及びBMI1などの遺伝子を発現させることにより、増殖能を高め、株化（不死化）したものである。
　発明者らは、この不死化巨核球前駆細胞株を用いて多核化を促進するために、癌遺伝子及びポリコーム遺伝子の発現抑制を行う際、アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させることで、多核化をより効率よく進めることに成功した。
　また、アポトーシス抑制遺伝子の強制発現に加え、p53遺伝子産物の発現又は機能を阻害することにより、多核化の効率が一層上昇することを確認した。また、上記巨核球前駆細胞株に対して、ROCK（Rho-associated coiled－coil forming kinase/Rho結合キナーゼ）阻害剤、HDAC阻害剤、39℃に於ける培養などの処理を行うことも、多核化の誘導に有効であることを確認し、さらに、アクトミオシン複合体（アクチンとミオシンの複合体）の機能阻害剤で処理すると、多核化がより高度に促進されることを見出した。
　そして、本発明によって産生される多核化が促進された巨核球細胞は、4N、あるいは、8N以上の巨核球細胞の割合が既報のものよりも高く、また、生体内で生成される成熟巨核球細胞と比べてもその割合が非常に高いことを見出した。
　さらに、本発明者らは、十分に多核化した成熟巨核球細胞において、上記アポトーシス抑制遺伝子の強制発現を抑制することにより、一つの巨核球細胞から産生される血小板の数が飛躍的に増えることを見出すとともに、培地にROCK阻害剤を加えて培養すること等で、血小板産生効率をさらに上げることが可能であることを確認し、培養期間、培養温度等の最適な条件を調べて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕多核化巨核球細胞を製造する方法であって、多核化前の巨核球細胞において、アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させて、該細胞を培養する工程を含む、方法；
〔２〕前記アポトーシス抑制遺伝子が、BCL－XL遺伝子である、上記〔１〕に記載の方法；
〔３〕前記培養工程において、p53遺伝子産物の発現又は機能を阻害する、上記〔１〕または〔２〕に記載の方法；
〔４〕前記培養工程において、多核化前の巨核球細胞に対して以下の(a)～(c)の少なくとも1つを行う、上記〔１〕から〔３〕のいずれか１項に記載の方法：
(a)アクトミオシン複合体機能阻害剤による処理；
(b)ROCK阻害剤による処理；及び
(c)HDAC阻害剤による処理；
〔５〕前記ROCK阻害剤がY27632であり、前記HDAC阻害剤がバルプロ酸であり、前記アクトミオシン複合体機能阻害剤がブレビスタチンである、上記〔４〕に記載の方法；
〔６〕前記培養工程を37℃より高い温度で行う、上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項に記載の方法；
〔７〕前記多核化前の巨核球細胞は、
　造血前駆細胞から多核化前の巨核球細胞に至る分化段階のいずれかで、該細胞において、癌遺伝子と以下の(i)～(iii)のいずれかの遺伝子とを強制発現させ、該細胞を培養して増殖させる工程によって得られたものである、上記〔１〕から〔６〕のいずれか１項に記載の方法：
(i)p16遺伝子又はp19遺伝子の発現を抑制する遺伝子；
(ii)Ink4a/Arf遺伝子の発現を抑制する遺伝子；及び
(iii)ポリコーム遺伝子；
〔８〕前記癌遺伝子としてc-MYC遺伝子を、前記(i)～(iii)の遺伝子としてBMI1を用いる、上記〔７〕に記載の方法；
〔９〕前記造血前駆細胞は、iPS細胞、ES細胞、並びに、臍帯血、骨髄血若しくは末梢血由来の造血幹細胞及び造血幹細胞からなる群より選択される細胞に由来する、上記〔７〕又は〔８〕に記載の方法；
〔１０〕上記〔１〕から〔９〕のいずれか１項に記載の方法で製造された多核化巨核球細胞を含む血液細胞組成物；
〔１１〕血小板の製造方法であって、
　上記〔１〕から〔９〕のいずれか１項に記載の方法で多核化巨核球細胞を得て、これを培養する工程と、
　前記多核化巨核球細胞の培養物から血小板を回収する工程と、を含む方法；
〔１２〕前記多核化巨核球細胞の培養工程は、前記アポトーシス抑制遺伝子の強制発現を抑制して、又は、前記アポトーシス抑制遺伝子を細胞から除去して行う、上記〔１１〕に記載の方法；
〔１３〕前記多核化巨核球細胞の培養工程は、血清なし、及び／又はフィーダー細胞なしで行う、上記〔１１〕又は〔１２〕に記載の方法；
〔１４〕前記多核化巨核球細胞の培養工程を、1日から15日間行う、上記〔１１〕から〔１３〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１５〕前記多核化巨核球細胞の培養工程は、37℃で行う、上記〔１１〕から〔１４〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１６〕前記多核化巨核球細胞の培養工程で、培地にROCK阻害剤及び／又はアクトミオシン複合体機能阻害剤を加える、上記〔１１〕から〔１５〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１７〕前記ROCK阻害剤がY27632であり、アクトミオシン複合体機能阻害剤がブレビスタチンである、上記〔１６〕に記載の方法；
〔１８〕上記〔１１〕から〔１７〕のいずれか１項に記載の方法で製造された血小板；及び
〔１９〕上記〔１８〕に記載の血小板を含む血液製剤、
に関する。
　本発明によれば、巨核球細胞の多核化を人為的に促進することが可能となる。特に、本発明は、既報のインビトロで調製した巨核球細胞の多核化の促進にも効果的であり、生体から得られる巨核球細胞と比較しても、より多核化の程度が進んだ巨核球細胞（例えば、4N以上の巨核球細胞の割合の高い巨核球細胞集団）を取得することを可能にする。
　また、本発明によれば、多核化した巨核球細胞1個当たりから産生される血小板の数を著しく増加させることが可能となる。
　幹細胞から多核化前の巨核球細胞を誘導し、例えば特許文献３に記載された方法でこの多核化前の巨核球細胞を増殖させ、本発明の方法にしたがって、当該多核化前の巨核球細胞を多核化させて血小板を産生させることにより、幹細胞から血小板を製造するのに要する時間を飛躍的に短縮させて、大量調製を可能にする。さらに、得られた血小板は、CD42b陽性であり、臨床応用にも大きく貢献する。
iMKPC－typeIの増殖のサイトカイン依存性を調べるために行った実験の概要を示す。 図１Ａに示すスケジュールにしたがって、SCFとTPO（S＋T）、SCFとEPO（S＋E）、SCF（S）、TPO（T）及びEPO（E）を培地に加えてiMKPC－typeIを培養したときの、細胞数の変化を示す。 図１Ａに示すスケジュールの8日目に、iMKPC－typeIの表面マーカーの発現をフローサイトメーターで解析した結果を示す。 臍帯血由来CD34陽性細胞でc-MYCとBMI1を強制発現させ、多核化前の巨核球細胞の増殖を促進させた結果を示す。 iMKPC－typeIIの増殖に対するサイトカインの影響を調べた結果を示す。 iMKPC－typeIIにおけるCD41aとCD42bの発現を調べた結果を示す。 iMKPC－typeIIにおいてBCL－XLの強制発現とp53遺伝子の発現抑制を行ったときの多核化と、さらにブレビスタチンを培地に添加した場合の多核化を顕微鏡で観察した結果を示す。 iMKPC－typeIIの増殖に対するBCL－XLの影響を調べた結果を示す。 ROCK阻害剤の巨核球細胞の多核化への影響。巨核球細胞中のMYC／BMI1の発現を抑えた後(ドキシサイクリン存在下、エストラジオール非存在下での培養)、ROCK阻害剤（Y27632）（10μM）を添加し、７日間培養した後、多核化の程度を調べた。Ａは、ROCK阻害剤を加えていない細胞（vehicle）と加えた細胞（Rock i）を、核を染めるヘキストで染色後、巨核球マーカーであるCD41aを抗CD41a抗体で染色し、フローサイトメーターで解析した結果である。Ｂは、Ａの結果をグラフ化したものである。 39℃で培養における、巨核球の成熟に関連する遺伝子の発現量を調べた結果。巨核球細胞中のMYC／BMI1の発現を抑えた後、39℃で５日間培養した後、巨核球の成熟に必須である遺伝子群（GATA1（Ａ）、PF4（Ｂ）、NFE2（Ｃ）、β－チューブリン（Ｄ））の発現量を定量PCR（q-PCR）法により検討した。発現量は、GAPDHの発現量に対する割合を示す。 アポトーシス抑制遺伝子の1つであるBCL－XLの巨核球細胞の多核化に対する影響を検討した結果。巨核球細胞中のMYC／BMI1の発現を抑え、ROCK阻害剤（10μM）存在下、BCL－XLを発現させ、7日間培養した後、多核化の程度を調べた。Ａは、MYC／BMI1発現細胞（左図）、MYC／BMI1の発現を抑制しROCK阻害剤処理を行った細胞（中図）、MYC／BMI1の発現抑制及びROCK阻害剤処理に加え、BCL－XLを発現させた細胞（右図）を、各々、核を染めるヘキストで染色後、巨核球マーカーであるCD41aを抗CD41a抗体で染色し、フローサイトメーターで解析した結果である。Ｂは、Ａの結果をグラフ化したものである。また、Ｃは、核が2N、4N、8N及び8N以上になっている細胞の顕微鏡写真である。 BCL－XL発現細胞の増殖曲線。巨核球細胞中のMYC／BMI1の発現を抑制し、ROCK阻害剤（10μM）存在下、BCL－XLを発現させた細胞（CD41a＋）（■）と発現させていない細胞（CD41a＋）（▲）の細胞数の変化を培養日数に対しグラフ化した結果である。 p53ノックダウンの多核化への影響。巨核球細胞中のMYC／BMI1の発現を抑え、ROCK阻害剤（10μM）存在下、BCL－XLを発現させ、さらに、p53遺伝子をノックダウンした後、39℃で7日間培養し、CD41a＋細胞の多核化の程度を調べた。Ａは、p53をノックダウンしていないコントロール細胞（コントロール）とp53をノックダウンした細胞（SiP53）を、各々、核を染めるヘキストで染色後、巨核球マーカーであるCD41aを抗CD41a抗体で染色し、フローサイトメーターで解析した結果である。Ｂは、Ａの結果をグラフ化したものである。 バルプロ酸処理の多核化への影響。巨核球細胞中のMYC／BMI1の発現を抑え、ROCK阻害剤存在（10μM）下、BCL－XLを発現させ、p53遺伝子をノックダウンし、さらに、バルプロ酸（0.5mM）で処理し、39℃で7日間培養した後、CD41a＋細胞の多核化の程度を調べた。Ａは、バルプロ酸処理していない細胞（Si P53）とバルプロ酸処理した細胞（SiP53 VLP）を、各々、核を染めるヘキストで染色後、巨核球マーカーであるCD41aを抗CD41a抗体で染色し、フローサイトメーターで解析した結果である。Ｂは、Ａの結果をグラフ化したものである。 ミオシン重鎖IIA/B ATPase阻害剤（アクトミオシン複合体機能阻害剤）の巨核球細胞の多核化への影響。巨核球細胞中のMYC／BMI1の発現を抑えた後(ドキシサイクリン存在下、エストラジオール非存在下での培養)、ミオシン重鎖IIA/B ATPase阻害剤であるブレビスタチン（10μg/ml）を添加し、7日間培養した後、多核化の程度を調べた。Ａは、ブレビスタチンを添加しなかった細胞（－）とブレビスタチン（10μg/ml）を添加した細胞（＋）を、核を染めるヘキストで染色後、巨核球マーカーであるCD41aを抗CD41a抗体で染色し、フローサイトメーターで解析した結果である。Ｂは、Ａの結果をグラフ化したものである。 ブレビスタチン処理を他の処理と併用した場合の巨核球細胞の多核化への影響。巨核球細胞中のMYC／BMI1の発現を抑え、Y27632（10μM）及びバルプロ酸（0.5mM）存在下、BCL－XLを発現させ、p53遺伝子をノックダウンし、さらに、ブレビスタチン（10μg/ml）を添加し、39℃で７日間培養した後、CD41a＋細胞の多核化の程度を調べた。Ａは、ブレビスタチン処理を行っていない細胞（－）とブレビスタチン処理を行った細胞（＋）を、各々、核を染めるヘキストで染色後、巨核球マーカーであるCD41aを抗CD41a抗体で染色し、フローサイトメーターで解析した結果である。Ｂは、Ａの結果をグラフ化したものである。 ブレビスタチン処理を他の処理と併用した細胞の増殖曲線。巨核球細胞中のMYC／BMI1の発現を抑え、Y27632（10μM）及びバルプロ酸（0.5mM）存在下、BCL－XLを発現させ、p53遺伝子をノックダウンし、ブレビスタチン処理をした細胞（CD41a＋）（▲）とブレビスタチン処理をしていない細胞（CD41a＋）（■）の細胞数の変化を培養日数に対しグラフ化した（Ａ）。また、Ｂにこれらの細胞の顕微鏡写真を示す。 血小板放出期に、BCL－XLの発現を抑制した場合と抑制しない場合において、巨核球と血小板におけるCD41aとCD42bの発現を調べた結果である。 図１４と同一の結果に基づいて、BCL－XL発現のON/OFF時における細胞数を計測した結果を示す。Ａは、CD42b陽性血小板数、Ｂは、CD41a陽性/CD42b陽性巨核球細胞数、Ｃは、CD41a陽性巨核球細胞数を示す。 血小板放出期に、BCL－XLの発現を抑制した場合と抑制しない場合において、培養温度を35℃、37℃、39℃とし、血小板数への影響を調べた結果を示す。 血清、フィーダー細胞、ブレビスタチンの有無が、血小板数に与える影響を調べた結果を示す。 血清、フィーダー細胞、ブレビスタチンの有無が、CD42b血小板の割合に与える影響を調べた結果を示す。 巨核球細胞の多核化工程（MCB expansion）と血小板放出期（Platelet production）の好適な培養条件の一例を示す。 BCL－XLの発現抑制によりCD42b血小板の割合が上昇し、培地から血清及びフィーダー細胞を除き、ブレビスタチンを加えることによりCD42b血小板の割合がさらに上昇したことを示す。 末梢血血小板のリストセチン凝集効果に、CD42bに対する機能的阻害抗体HIP1が与える影響を調べた結果を示す。 in vivoの血栓形成に、CD42bに対する機能的阻害抗体HIP1が与える影響を調べた結果を示す。 ADAM17阻害剤KP-457（S-45457）を加えて産生させることによりGPIba（CD42b）の発現量を高くしたiPS細胞由来血小板と、ADAM17阻害剤を加えないで産生させたiPS細胞由来血小板を、それぞれNOGマウスに輸血し、血栓形成に寄与した血小板の数を測定した結果を示す。 ヒト末梢血血小板をKP-457存在下で血小板傷害剤CCCP 100μMを加えて擬似劣化させたもの、KP-457非存在下でCCCPを加えたもの、新鮮血小板を、それぞれ輸血し、血栓形成に寄与した血小板の数を測定した結果を示す。
（多核化巨核球細胞の製造方法）
　本発明は、巨核球細胞の多核化を促進することにより、多核化した巨核球細胞を調製する方法を提供する。
　本発明に係る多核化巨核球細胞の製造方法の一態様は、多核化前の巨核球細胞において、アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させて、該細胞を培養する工程を含む。
　本発明における「多核化前の巨核球細胞」は、特に限定はなく、臍帯血や骨髄細胞から得られる多核化の進んでいない巨核球細胞であってもよく、また、ES細胞、iPS細胞、臍帯血・骨髄血・末梢血由来の造血幹細胞及び前駆細胞などから分化誘導された多核化の進んでいない巨核球細胞であってもよい。
　また、本発明における「多核化前の巨核球細胞」には、例えば、CD41a陽性／CD42a陽性/CD42b陽性として特徴付けられる細胞も含まれる。
　「多核化巨核球細胞」又は「多核化した巨核球細胞」とは、「多核化前の巨核球細胞」と比較して核の数が相対的に増大した細胞又は細胞群のことをいう。例えば、本発明の方法を適用する巨核球細胞の核が2Nの場合には、4N以上の細胞が「多核化巨核球細胞」あるいは「多核化した巨核球細胞」となる。多核化前の巨核球細胞であっても、核の数は1つとは限らない。また、細胞群において、一定期間経過後にその細胞群に全体における核の数が有意に増加した場合、当該期間経過前の細胞群を多核化前の巨核球細胞と呼び、期間経過後の細胞群を多核化した巨核球細胞ということもある。
　本発明は、多能性幹細胞（ES細胞やiPS細胞など）、臍帯血・骨髄血・末梢血由来の造血幹細胞及び前駆細胞などから分化誘導された多核化前の巨核球細胞に対しても適用することができる。例えば、ES細胞又はiPS細胞から調製されるネット様構造物（ES－sac又はiPS－sacとも称する）から得られる巨核球細胞が好ましい。ここで、ES細胞又はiPS細胞から調製される「ネット様構造物」とは、ES細胞又はiPS細胞由来の立体的な嚢状（内部に空間を伴うもの）構造体で、内皮細胞集団などで形成され、内部に造血前駆細胞を含むもののことである（特許文献１、特許文献２及び非特許文献２を参照のこと）。
　本発明で使用されるES細胞は、特に限定されるものではなく、一般的には、胚盤胞期の受精卵をフィーダー細胞と共に培養し、増殖した内部細胞塊由来の細胞をばらばらにして、さらに、植え継ぐ操作を繰り返し、最終的にES細胞株として樹立されたものを使用することができる。
　また、iPS細胞を使用する場合、体細胞（例えば、線維芽細胞や血液細胞など）へ分化多能性を付与する数種類の転写因子（以下、ここでは「分化多能性因子」と称する）遺伝子を導入することにより、ES細胞と同様の分化多能性を獲得した細胞であれば、如何なる由来の細胞であってもよい。分化多能性因子としては、すでに多くの因子が報告されており、限定はしないが、例えば、Octファミリー（例えば、Oct3/4）、SOXファミリー（例えば、SOX2、SOX1、SOX3、SOX15及びSOX17など）、Klfファミリー（例えば、Klf4、Klf2など）、MYCファミリー（例えば、c-MYC、N-MYC、L-MYCなど）、NANOG、LIN28などを挙げることができる。
　本発明者らは、多能性幹細胞から誘導した多核化前の巨核球細胞（特許文献３中で「巨核前駆細胞」と記載しているものを含む）中でMYC等の癌遺伝子とBMI1などの遺伝子等を強制発現させ、該巨核球細胞の増殖能を高めることについて報告をしている（特許文献３、JEM, 207:2817-2830 2010）。
　この方法により調製された多核化前の巨核球細胞は、本発明の方法に好適に用いることができる。
　したがって、本発明に係る多核化巨核球細胞の製造方法では、多核化前の巨核球細胞として、造血前駆細胞から多核化前の巨核球細胞に至る分化段階のいずれかで、該細胞において、癌遺伝子と以下の(i)～(iii)のいずれかの遺伝子とを強制発現させ、該細胞を培養して増殖させる工程によって得られたものを用いることができる。
(i)p16遺伝子又はp19遺伝子の発現を抑制する遺伝子；
(ii)Ink4a/Arf遺伝子の発現を抑制する遺伝子；及び
(iii)ポリコーム遺伝子。
　癌遺伝子としては、例えば、MYCファミリー遺伝子、Srcファミリー遺伝子、Rasファミリー遺伝子、Rafファミリー遺伝子、c-KitやPDGFR、Ablなどのプロテインキナーゼファミリー遺伝子などを挙げることができる。また、(i)～(iii)の遺伝子としては、例えば、BMI1、Mel18、Ring1a/b、Phc1/2/3、Cbx2/4/6/7/8、Ezh2、Eed、Suz12、HADC、Dnmt1/3a/3bなどを挙げることができるが、BMI1遺伝子が特に好ましい。癌遺伝子及びポリコーム遺伝子の発現制御は、当業者が常法にしたがって行うことができ、例えば特許文献３などに詳細が記載された方法を用いることができる。癌遺伝子及び(i)～(iii)の遺伝子は、造血前駆細胞から多核化前の巨核球細胞に分化するいずれかの段階で、細胞に導入すればよい。いずれにしても、本発明で使用される多核化前の巨核球細胞においてそれらの遺伝子の発現が誘導されればよい。
　本発明で用いられる癌遺伝子及び(i)～(iii)の遺伝子（例えば、BMI1遺伝子）には、既にそのcDNA配列が公開されている遺伝子は勿論のこと、これら公知のcDNA配列の相同性に基づいて従来技術により同定されるホモログも含まれる。
　例えば、MYCファミリー遺伝子のうち、c-MYC遺伝子とは、例えば、配列番号１で示される核酸配列からなる遺伝子である。また、c-MYC遺伝子のホモログとは、そのcDNA配列が、例えば、配列番号１で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなる遺伝子のことである。配列番号１で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるcDNAとは、配列番号１で表される配列からなるDNAと、約60％以上、好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、最も好ましくは約99％の同一性を有する配列からなるDNA、もしくは、配列番号１で表わされる核酸配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAであって、これらのDNAによってコードされるタンパク質が、多核化前の巨核球細胞など、分化段階の細胞の増幅に寄与するもののことである。
　BMI1遺伝子とは、例えば、配列番号２で示される核酸配列からなる遺伝子である。また、BMI1遺伝子のホモログとは、そのcDNA配列が、例えば、配列番号２で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなる遺伝子のことである。配列番号２で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるcDNAとは、配列番号２で表される配列からなるDNAと、約60％以上、好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、最も好ましくは約99％の同一性を有する配列からなるDNA、もしくは、配列番号２で表わされる核酸配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAであって、そのDNAによってコードされるタンパク質が、MYCファミリー遺伝子などの癌遺伝子が発現している細胞内で生じる癌遺伝子誘導性細胞老化を抑制し、該細胞の増幅を促進するもののことである。
　上記癌遺伝子及び(i)～(iii)の遺伝子は、細胞増殖には必要であるが、多核化の促進や血小板放出等を阻害しうるために、多核化工程に入る前にこれら遺伝子の発現を抑制してもよい。細胞内のこれら遺伝子発現を抑制することにより、機能的な血小板がより放出されやすくなる（特許文献３）。
　本明細書において、「アポトーシス抑制遺伝子」とは、アポトーシスを抑制する遺伝子であれば特に限定されず、例えば、BCL2遺伝子、BCL－XL遺伝子、Survivin、MCL1などが挙げられる。
　本発明者らは、上記癌遺伝子及び(i)～(iii)の遺伝子の強制発現を抑制すると、増殖させた多核化前の巨核球細胞の細胞死が誘導されうることを見出した。後述する実施例に示されるとおり、多核化前の巨核球細胞中の癌遺伝子と(i)～(iii)の遺伝子の発現抑制を行うと共に、アポトーシス抑制遺伝子を該細胞中で強制発現させることにより、該巨核球細胞の多核化が促進され、その結果多核化前の巨核球細胞から血小板を効率的に産生させることができる。
　後述する実施例に示されるとおり、アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させることにより、巨核球細胞は長期的に増殖を継続する。
　本発明で用いられるBCL－XL遺伝子、BCL2遺伝子などのアポトーシスを抑制する遺伝子には、すでにそのcDNA配列が公開されている遺伝子は勿論のこと、これら公知のcDNA配列の相同性に基づいて従来技術により同定されるホモログも含まれる。例えば、アポトーシスを抑制する遺伝子の１つであるBCL－XL遺伝子とは、配列番号３で示される核酸配列からなる遺伝子である。また、BCL－XL遺伝子のホモログとは、そのcDNA配列が、例えば、配列番号３で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなる遺伝子のことである。配列番号３で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるcDNAとは、配列番号３で表される配列からなるDNAと、約60％以上、好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、最も好ましくは約99％の同一性を有する配列からなるDNA、もしくは、配列番号３で表わされる核酸配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAであって、そのDNAによってコードされるタンパク質が、アポトーシスを抑制する効果を有するもののことである。
　ここで、ストリンジェントな条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーションの条件のことで、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な実験条件である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点よりやや低い環境における再アニール能力に依存する。
　例えば、低ストリンジェントな条件として、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄段階において、37℃～42℃の温度条件下、0.1×SSC、0.1％SDS溶液中で洗浄することなどが上げられる。また、高ストリンジェントな条件として、例えば、洗浄段階において、65℃、5×SSCおよび0.1％SDS中で洗浄することなどが挙げられる。ストリンジェントな条件をより高くすることにより、相同性の高いポリヌクレオチドを得ることができる。
　癌遺伝子、(i)～(iii)の遺伝子、アポトーシス抑制遺伝子等の遺伝子を細胞内で強制発現させる場合、当業者において周知のいかなる方法により実施してもよいが、例えば、遺伝子を、レンチウイルスやレトロウイルスなどによる遺伝子導入システムを利用して、細胞内に導入し、発現させてもよい。ウイルス遺伝子導入ベクターにより遺伝子発現を行う場合、適当なプロモーターの下流に該遺伝子を作用可能に連結し、これを遺伝子導入ベクターに挿入して、細胞内に導入して目的遺伝子を発現させてもよい。ここで、「作用可能」に連結するとは、該プロモーターによって目的遺伝子がシスに支配され、目的遺伝子の所望の発現が実現されるようにプロモーターと目的遺伝子を連結することを意味する。本発明の実施においては、例えば、CMVプロモーター、EF1プロモーターなどを使用して恒常的に目的遺伝子を発現してもよく、あるいは、テトラサイクリンなどの薬剤応答エレメントなどのトランス因子によって活性制御されるエレメントの支配下に、適当なプロモーター（誘導型のプロモーター）を配置し、例えば、薬剤添加などの制御により目的遺伝子を誘導的に発現させることもできる。このような薬剤による遺伝子発現システムは、癌遺伝子又は(i)～(iii)の遺伝子の所望の発現制御を実現するために、当業者において、適当なシステムを容易に選択することができる。このような発現を行うために、市販のキットなどを使用してもよい。また、発現制御の目的遺伝子である癌遺伝子と(i)～(iii)の遺伝子は、それぞれ別々のベクターに挿入してもよいし、同一のベクターに挿入してもよい。
　また、巨核球細胞内における癌遺伝子や（i)～(iii)の遺伝子の発現の抑制は、例えば、前述の誘導的な発現システムによる発現の誘導を、薬剤等の除去により解除することで達成してもよい。あるいは、導入した癌遺伝子や（i)～(iii)の遺伝子をCre/loxシステムなどを使用して除去し、これらの遺伝子の発現を抑制的に制御してもよい。癌遺伝子又は（i)～(iii)の遺伝子の発現を抑制的に調節するために、市販のキット等を適宜使用することもできる。
　本発明に係る多核化巨核球細胞の製造方法の一態様は、アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させた細胞において、並行してp53遺伝子産物の発現又は機能を阻害する工程を含む。ここで、発現とは、転写及び翻訳を含む概念で用いられ、発現を阻害するという場合、転写レベルで阻害することも翻訳レベルで阻害することも含みうる。
　p53遺伝子産物は、癌抑制遺伝子として、広く知られているもので、種々の動物種における遺伝子配列等も公知である。
　巨核球細胞内のp53遺伝子産物の機能を阻害する方法は、当該技術分野における通常の技術により達成できる。その方法として、例えば、p53遺伝子に突然変異（置換、挿入又は欠失、あるいは、改変又は修飾）を導入することで該遺伝子産物の生産を阻害する方法、該遺伝子産物の機能を直接阻害する方法などを挙げることができる。遺伝子に突然変異（置換、挿入又は欠失、あるいは、改変又は修飾）を導入する方法としては、適切な遺伝子ターゲティングベクターを利用してp53遺伝子全体を相同組換えにより破壊する方法、Cre/loxシステムなどを利用して、該遺伝子産物の活性に重要な領域に変異を導入する方法が挙げられる。
　また、p53遺伝子産物の機能を阻害する方法として、ドミナントネガティブ法を用いてもよい。ドミナントネガティブ法は、変異を導入して活性を低下または喪失させたp53タンパク質を細胞内で大量に発現させ、細胞内の正常p53タンパク質に対する不活性なp53タンパク質の比率を圧倒的に高くして、結果的にp53タンパク質の機能が得られなくなった挙動を示す細胞を得る方法である。
　p53遺伝子産物の発現を抑制する方法としては、アンチセンス法、リボザイム法、RNAi法などを用いてもよい。
　アンチセンス法は、標的遺伝子（基本的には転写産物であるmRNA）に相補的な塩基配列を有し、一般的には10塩基長～100塩基長、好ましくは15塩基長～30塩基長の一本鎖核酸を用いて遺伝子の発現を抑制する方法である。アンチセンス核酸を細胞内に導入し、標的遺伝子にハイブリダイズさせることによって遺伝子の発現が阻害される。アンチセンス核酸は、標的遺伝子の発現阻害効果が得られる限り、標的遺伝子と完全に相補的でなくてもよい。アンチセンス核酸は、公知のソフトウエア等を用いて当業者が適宜設計することができる。アンチセンス核酸は、ＤＮＡ、RNA、DNA－RNAキメラのいずれであっても良く、また修飾されていてもよい。
　リボザイムは、標的RNAを触媒的に加水分解する核酸分子であり、標的RNAと相補的な配列を有するアンチセンス領域と、切断反応を担う触媒中心領域から構成されている。リボザイムは当業者が公知の方法に従って適宜設計することができる。リボザイムは一般的にはRNA分子であるが、DNA－RNAキメラ型分子を用いることもできる。
　RNAi法は、二本鎖核酸によって誘導される配列特異的な遺伝子発現抑制機構である。標的特異性が非常に高く、生体内にもともと存在する遺伝子発現抑制メカニズムを利用する方法なので安全性が高い。
　RNAi効果を有する二本鎖核酸としては、例えば、siRNAが挙げられる。siRNAは、哺乳動物細胞に用いられる場合、通常19～30塩基程度、好ましくは21塩基～25塩基程度の二本鎖RNAである。RNAi効果を有する二本鎖核酸は、一般に、その一方が標的核酸の一部と相補的な塩基配列を有し、他方がこれに相補的な配列を有する。
　RNAi効果を有する二本鎖核酸は、標的遺伝子の塩基配列に基づき、公知の方法に従って設計することができる。また、RNAi効果を有する二本鎖核酸は、二本鎖RNAであっても良いし、DNA－RNAキメラ型二本鎖核酸であってもよく、人工核酸や各種の修飾が施された核酸であってもよい。
　siRNA、アンチセンス核酸、リボザイムは、それぞれをコードする核酸を含むベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を細胞内に導入することによって、細胞内で発現させることができる。siRNAは、二本鎖のそれぞれをコードするDNAを用いてもよいし、二本鎖核酸がループを介して連結されてできる一本鎖核酸をコードするDNAを用いてもよい。後者の場合、細胞内で転写により得られる一本鎖RNAは、その相補的な部分が分子内でハイブリダイズし、ヘアピン型の構造を取る。このRNAはshRNA（short hairpin RNA）と呼ばれる。shRNAは細胞質に移行すると酵素（Dicer）によってループ部分が切断され、二本鎖RNAとなってRNAi効果を発揮する。
　その他、巨核球細胞内のp53遺伝子産物の機能を阻害する方法として、p53遺伝子産物の機能を直接又は間接的に阻害する方法、p53のリン酸化を阻害することで間接的にp53の活性化を阻害する方法などであってもよい。
　後述する実施例に示すとおり、アポトーシス抑制遺伝子の強制発現と、p53遺伝子産物の発現又は機能の阻害を行う前の巨核球細胞は、増殖を続けるが、サイトカイン依存性がSCFであり、放出される血小板もCD42b陽性でないものを含む。アポトーシス抑制遺伝子の強制発現と、p53遺伝子産物の発現又は機能の阻害を行うと、巨核球細胞は、その後も増殖しつつ一部多核化し、CD42b陽性の血小板を多く放出するようになる。この段階では、巨核球細胞のサイトカイン依存性がSCFからTPOに変わり、増殖と成熟化が並行して進む。
　本発明に係る多核化巨核球細胞の製造方法の一態様は、アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させて培養している細胞を、(a)アクトミオシン複合体機能阻害剤で処理する工程、(b)ROCK阻害剤で処理する工程、(c)HDAC阻害剤で処理する工程、の少なくとも１つを含む。これらの処理により、より安定な増殖と多核化が進む。
　ここで、アクトミオシン複合体とは、アクチンとミオシンIIの複合体のことで、例えば、細胞質分裂の際に出現する収縮環などを構成している。アクトミオシン複合体において、ミオシンIIは、アクチンと相互作用をしながら、モーター蛋白質として機能し、収縮環の収縮運動などに関与している。本発明の「アクトミオシン複合体機能阻害剤」は、どのようなメカニズムでその機能を阻害するものであってもよく、例えば、アクトミオシン複合体の形成を阻害することによってアクトミオシン複合体の機能を阻害するもの、ミオシン重鎖（Myosin heavy chain：MHC）IIA/B ATPase阻害に伴ってアクトミオシン複合体の機能を阻害するもの、ミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤（Myosin light chain kinase：MLCK）阻害に伴ってアクトミオシン複合体の機能を阻害するものなどが含まれる。ミオシン重鎖IIA/B ATPaseは、細胞質分裂の際に、収縮環の収縮運動において重要な役割を担う分子であり、ミオシン軽鎖キナーゼは、ミオシン軽鎖のうちL2をリン酸化して、アクチン－ミオシン間の滑り運動を誘導する。
　これまでに、ROCK阻害剤が巨核球細胞の核内分裂を抑制し、多核化を促進することが報告されてはいるが、アクトミオシン複合体の形成又は機能を制御するミオシン重鎖IIA/B ATPaseやミオシン軽鎖キナーゼは、ROCKシグナルの下流において機能しており、アクトミオシン複合体の形成又は機能調節を介して、より直接的に収縮環の収縮運動の制御を行っている。そのため、アクトミオシン複合体機能阻害剤は、ROCK阻害剤よりも効果的に巨核球細胞の核内分裂を抑制し、多核化をより一層促進するものと考えられる。
　本発明で使用可能なアクトミオシン複合体機能阻害剤としては、ミオシン重鎖IIA/B　 ATPase阻害剤である、ブレビスタチン（Blebbistatin；Science, 299:1743-1747 2003）を挙げることができる。また、ミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤である、ML7などを挙げることができる。その他、ミオシン重鎖IIA/B ATPase阻害剤又はミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤として、ミオシン重鎖IIA/B ATPase又はミオシン軽鎖キナーゼの活性を阻害する核酸（例えば、shRNAなど）や抗体なども使用することができる。
　なお、本明細書中において、「処理」とは、阻害剤等の効果が対象細胞において発揮されるようする操作のことで、例えば、細胞の培養液中に適当量の阻害剤等を添加し、細胞内に取りこませるような状態に置くことである。場合によっては、細胞への取り込みを促進するような操作を併用してもよい。
　本発明に係る巨核球細胞の製造方法の一態様は、アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させて培養している細胞を、Rock阻害剤で処理する工程を含む。
　ROCK（Rho-associated coiled－coil forming kinase／Rho結合キナーゼ）阻害剤としては、例えば、〔（R）－（＋）－トランス－N－（4－ピリジル）－4－（1－アミノエチル）-シクロヘキサンカルボキサミド・2HCl・H2O〕（Y27632）などを挙げることができる場合によっては、Rhoキナーゼ活性を阻害するような抗体、あるいは、核酸（例えば、shRNAなど）も、ROCK阻害剤として使用することができる。
　本発明に係る巨核球細胞の製造方法の一態様は、アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させて培養している細胞を、HDAC阻害剤で処理する工程を含む。
　HDAC阻害剤は、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）活性を阻害する作用をもつ。これまでに、HDAC阻害剤は多数知られており、例えば、バルプロ酸、トリコスタチンA、SAHA（スベロイルアニリドヒドロキサム酸）、APHA（アロイルピロリルヒドロキシアミド）などを挙げることができ、特に、バルプロ酸、トリコスタチンAなどを好適に使用することができる。使用薬物が塩の形態を有する場合には、塩の形態で使用してもよい。
　アクトミオシン複合体機能阻害剤、ROCK阻害剤、HDAC阻害剤等で細胞を処理する場合の至適濃度などは、当業者であれば、予備的な実験によって予め決定することができる。また、処理する期間や方法なども、当業者において適宜選択することができる。例えば、ミオシン重鎖II ATPase阻害剤であるブレビスタチン処理の場合、2～15μg/ml、あるいは、5～10μg/ml程度を培養液中に添加し、培養期間としては、例えば、5～10日間程度、特に、6～7日間程度が好ましい。また、ROCK阻害剤であるY27632は、5～15μM、あるいは、8～12μM、好ましくは10μM程度で使用し、HDAC阻害剤であるバルプロ酸は、0.1～1mM、あるいは、0.2～0.7mM、好ましくは0.5mM程度で使用することができる。Y27632、バルプロ酸の処理時間としては、10～21日間、好ましくは14日間程度である。
　本発明に係る多核化巨核球細胞の製造方法の一態様は、アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させて培養している細胞を、37℃以上の温度に置くことを含む。
　また、巨核球細胞を通常の37℃以上の温度で培養することにより、多核化した巨核球細胞の分化を促進することが確認されている。ここで、37℃以上の温度とは、細胞にダメージを与えない程度の温度が適当であることから、例えば、約37℃～約42℃程度、約37～約39℃程度が好ましい。また、37℃以上の温度における培養期間については、多核化した巨核球細胞の数などをモニターしながら、適宜決定することが可能であるが、例えば、10日間～28日間、好ましくは14日間～21日間程度である。
　多核化前の巨核球細胞においてアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させて培養する工程の他の培養条件などは、本発明の効果が好適に得られる限り特に限定されず、公知の培養条件やそれに準ずる条件を使用することができる。例えば、TPO、IL-1、IL-3、IL-4、IL5、IL-6、IL-9、IL-11、EPO、GM-CSF、SCF、G-CSF、Flt3リガンド、Heparinなどのいずれか又はこれらのうちの2つ以上を組合せて培地に添加してもよい。
　また、適宜フィーダー細胞を用いて培養してもよい。
　上述の方法で得られた多核化した巨核球細胞は、CD42b陽性の機能的な血小板を効率よく産生する。実施例に示すとおり、CD42b陽性の血小板は、in vivo及びin vitroにおいて、高い血栓形成能を有している。また、多核化した巨核球細胞は、凍結保存後、融解しても機能的な血小板を産生することができる。
　本発明はまた、多核化巨核球細胞の含有率が高い血液細胞組成物を提供する。ここで、「血液細胞組成物」には、本発明の方法で多核化が促進された「多核化巨核球細胞」を含む他、その他の方法によって調製された巨核球細胞、又は、その他の血液細胞が含まれていてもよい。
　本発明の方法によって多核化前の巨核球細胞を処理すると、4N以上の多核化巨核球細胞への分化を促進することができる。そのため、例えば、多能性幹細胞などから分化させた巨核球細胞集団に対し、本発明の方法を適用することで、4N以上の多核化巨核球細胞の含有率の高い血液細胞組成物を取得することができる。本発明の方法で巨核球細胞集団を処理した場合、4N以上の多核化巨核球細胞の含有率を、少なくとも、20％以上、30％以上、好ましくは、40％以上、50％以上、より好ましくは80％以上（例えば、図１１Ｂ参照）にまで増大させることが可能である。従って、本発明の方法により、多核化巨核球細胞の存在比率の高い巨核球細胞集団、あるいは、血液細胞集団を調製することが可能となる。
　かかる血液細胞組成物も凍結保存が可能である。したがって、凍結保存した状態で流通させ、ユーザにおいて後述する血小板の製造方法を行ってもよい。
　本発明の方法で処理を行い多核化が促進された巨核球細胞等は、適切な方法によって、生体内に移植し、生体内における機能性血小板を産生させるためにも有効である。
　現在、造血幹細胞の移植方法として、骨髄移植や臍帯血移植などが行われており、特に、臍帯血移植は、ドナー数の不足やドナーへの負担の大きさといった骨髄移植における問題を軽減することが可能となることから、近年、臍帯血移植の機会が増えてきている。しかし、臍帯血移植により生体内に産生される巨核球細胞は、多核化の程度が低く、十分な血小板を生体内で産生するまでには、時間を要し、早急に血小板の産生能力を高める必要がある場合には、臍帯血移植では十分な対応ができにくい状況にある。
　本発明の方法によって得られる多核化巨核球細胞等の移植は、骨髄移植におけるドナー数の不足及びドナーの負担の問題、臍帯血移植における生体内での血小板産生能力の問題を解決することが可能で、従来の移植法と比較して、非常に優れた方法ということができる。
（血小板の製造方法）
　一方、本発明に係る血小板の製造方法は、本発明の方法で得られた多核化巨核球細胞等から、in vitroで血小板を産生させるものである。
　本発明に係る血小板の製造方法は、上述の方法で得られた多核化した巨核球細胞を培養し、培養物から血小板を回収する工程を含む。
　培養条件は、限定はしないが、例えば、TPO（10～200ng/mL、好ましくは50～100ng/mL程度）の存在下で、あるいは、TPO（10～200ng/mL、好ましくは50～100ng/mL程度）、SCF（10～200ng/mL、好ましくは50ng/mL程度）及びHeparin（10～100U/mL、好ましくは25U/ml程度)の存在下で、7～15日間程度培養してもよい。
　本発明に係る血小板の製造方法の一態様では、多核化巨核球細胞の培養工程で、上記アポトーシス遺伝子の強制発現を抑制するか、上記アポトーシス抑制遺伝子を多核化巨核球細胞から除去する。
　アポトーシス抑制遺伝子の発現の抑制は、例えば、前述の誘導的な発現システムによる発現の誘導を、薬剤等の除去により解除することで達成してもよい。あるいは、導入したアポトーシス抑制遺伝子をCre/loxシステムなどを使用して除去し、これらの遺伝子の発現を抑制的に制御してもよい。アポトーシス抑制遺伝子の発現を抑制的に調節するために、市販のキット等を適宜使用することもできる。
　後述する実施例に示すとおり、多核化の促進のために強制発現させたアポトーシス抑制遺伝子の発現を抑制すると、CD41a陽性／CD42b陽性の機能的な血小板の産生効率が上昇する。
　アポトーシス抑制遺伝子の発現抑制又は除去は、血小板回収の15日前から、好ましくは10日前から、より好ましくは3日～7日前から、さらに好ましくは約3日前から行う。
　なお、この工程では、外因性のアポトーシス抑制遺伝子のみではなく、内因性のアポトーシス抑制遺伝子の発現も抑制してもよい。また、p53遺伝子産物の発現又は機能阻害を、本工程において引き続き行ってもよい。
　培養温度は、本発明の効果が得られる限り特に限定されず、35℃～40℃で行うことができるが、実施例に示されるとおり、37℃～39℃が好適である。
　本発明に係る製造方法では、多核化巨核球細胞の培養工程を、血清フリー及び／又はフィーダー細胞フリーの条件で行ってもよい。実施例に示されるとおり、本発明に係る方法では、胎仔牛血清を培地に加えた場合と、血清フリー培地で培養した場合とでは、血小板の産生量には大きな差が見られなかったが、血清フリー培地又はフィーダー細胞フリー培地で培養した場合のほうが、CD42b陽性血小板の割合が高かった。血小板産生工程を血清フリー且つフィーダー細胞フリーで行うことができれば、得られた血小板を臨床的に用いる場合に免疫原性の問題が生じにくい。
　また、フィーダー細胞を用いないで血小板を産生させることができれば、フィーダー細胞を接着させる必要がないので、フラスコなどで浮遊培養することができるので、製造コストを抑制できるとともに、大量生産に適している。なお、フィーダー細胞を用いない場合は、conditioned mediumを使用してもよい。conditioned mediumは、特に限定されず、当業者が公知の方法等に従って作製することができるが、例えば、フィーダー細胞を適宜培養し、培養物からフィーダー細胞をフィルターで除去することによって得ることができる。
　本発明に係る血小板の製造方法の一態様では、培地にROCK阻害剤及び／又はアクトミオシン複合体機能阻害剤を加える。ROCK阻害剤及びアクトミオシン複合体機能阻害剤としては、上述した多核化巨核球細胞の製造方法で使用したものと同じものを使用することができる。ROCK阻害剤としては、例えばY27632が挙げられる。アクトミオシン複合体機能阻害剤としては、ミオシン重鎖II ATPase阻害剤である、ブレビスタチンが挙げられる。ROCK阻害剤を単独で加えてもよく、ROCK阻害剤とアクトミオシン複合体機能阻害剤を単独で加えてもよいし、これらを組み合わせて加えてもよい。
　ROCK阻害剤及び／又はアクトミオシン複合体機能阻害剤は、0.1μM～30μMで加えることが好ましく、例えば0.5μM～25μM、5μM～20μM等としてもよい。
　ROCK阻害剤及び／又はアクトミオシン複合体機能阻害剤を加えてからの培養期間は1日～15日とすることができ、3日、5日、7日等としてもよい。ROCK阻害剤及び／又はアクトミオシン複合体機能阻害剤を加えることにより、CD42b陽性血小板の割合をさらに増加させることが可能である。
　本発明の実施形態には、巨核球細胞の多核化を促進し、成熟巨核球細胞及び／又は血小板を製造するためのキットが含まれる。当該キットには、癌遺伝子、上記(i)～(iii)の遺伝子、BCL－XL遺伝子等を細胞内で発現するのに必要な発現ベクター等及び試薬などの他、細胞培養のための培地、血清、増殖因子などのサプリメント（例えば、TPO、EPO、SCF、Heparin、IL-6、IL-11など）、抗生物質などが含まれる。その他、例えば、ES細胞又はiPS細胞由来の細胞を使用する場合、これらの細胞から調製したネット様構造物を同定するためのマーカー確認用の抗体（例えば、Flk1、CD31、CD34、UEA－Iレクチンなどに対する抗体）なども含まれる。キット中に含まれる試薬、抗体等は、構成成分が活性を長期間有効に持続し、容器の材質によって吸着されず、変質を受けないような何れかの種類の容器中に供給される。
　さらに、本発明のキットには、癌遺伝子及び上記(i)～(iii)の遺伝子を強制発現した多核化前の巨核球細胞が含まれていてもよい。
　本明細書中に記載される「細胞」の由来は、ヒト及び非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、トリなど）であり特に限定はされないが。特に好ましくは、ヒト由来の細胞である。
　以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
１．多核化前の巨核球細胞の調製
１－１．ES細胞からの多核化前の巨核球細胞の調製
　巨核球の多核化について検討するために、ES細胞から多核化する前の巨核球細胞の調製を行った（詳細については、特許文献３を参照のこと。）。
　ヒトES細胞株〔KhES-3〕を20ng/ml VEGF存在下で14日間培養してネット様構造物を調製し、このネット様構造物から取り出した造血前駆細胞を回収して、10T1/2細胞上に細胞数1×105/ウェルになるように播いた。
　このように調製した造血前駆細胞に、c-MYC－2A－BMI1を組み込んだpMx tet off c-MYC 2A BMI1レトロウイルスベクターをMOI＝10（Jurkat細胞で確認）で12時間ごとに3回感染させてc-MYCとBMI1の発現誘導を行った（特許文献３）。pMx tet off c-MYC 2A BMI1ベクターは、エストラジオール存在化で、c-MYC遺伝子及びBMI1遺伝子を発現させる一方、ドキシサイクリン（Dox）存在化、エストラジオール非存在化では、c-MYC遺伝子及びBMI1遺伝子の発現を抑制する。
　1回目の感染と同時にエストラジオール2mMを添加し、また、最後の感染から12時間後にウイルスを除去した。この時期は、c-MYC遺伝子やBMI1遺伝子の発現をOffにしても、CD42b陽性血小板の放出が少なく、未成熟な巨核球細胞であるものと考えられた。この細胞を以降、「iMKPC－typeI」と呼ぶこともある。
　iMKPC－typeIのサイトカイン依存性を調べるために、10T1/2フィーダー細胞上に2x105個のiMKPC－typeIを播種し、2uM β-estradiol存在下、37℃でSCF(50ng/ml)、TPO(50ng/ml)、EPO(6U/ml)のサイトカインを用いて、図１Ａに示す条件で14日間培養した。4、11日目に増殖が確認された群は細胞数を測定し2×105個で再播種し、それ以外は培地交換を行なった。8、14日目に細胞数を測定し2×105個で再播種するとともに、8日目には、一部の細胞をCD41抗体、CD42b抗体およびGPA抗体を用いて染色し、フローサイトメーターで解析を行った。
　結果を図１Ｂ及びＣに示す。図１Ｂに示されるとおり、iMKPC－typeIの増殖はSCFに強く依存していた。また、図１Ｃに示されるとおり、いずれの群もほぼCD41陽性であったが、SCFを除いた群では、CD41+/CD42b-の群の増殖が極端に低下していた。CD41+/CD42b-の群が、iMKPC－typeIの中でも増殖の良い集団である。
　SCF依存性であることからも、iMKPC－typeIは未成熟な巨核球細胞であることが示唆された。
１－２．臍帯血由来CD34陽性細胞からの多核化前の巨核球細胞の調製
　臍帯血由来CD34陽性細胞からも、ES細胞やiPS細胞と同様の方法で多核化前の巨核球細胞を調製できることを確認した。
　具体的には、臍帯血由来CD34陽性細胞にpMx-c-MYCとDNsam BMI1ウイルス（いずれもレトロウイルスベクター）をMOI10で三回感染後、14日目と21日目の細胞について、FACSを用いてCD41a(巨核球マーカー)陽性細胞をカウントした。コントロールとして、Mock(Empty vector）を用いた。
　結果を図１Ｄに示す。Mockと比較して、c-MYCとBMI1を強制発現させた群ではCD41陽性巨核球の増殖が観察され、臍帯血由来細胞からも、１－１．と同様の方法で多核化前の巨核球細胞が得られることを確認した。
２．多核化前の巨核球細胞からの多核化巨核球の調製
２－１．BCL－XL発現による多核化への影響
　１－１．において、c-MYC－2A－BMI1を組み込んだpMx tet off c-MYC 2A BMI1レトロウイルスベクター感染後、23日目に、ドキシサイクリン誘導性のLv-BCL-XL-GFP（レンチウイルスベクター）をMOI10で1回感染させた。このベクターは、EcoRI、BamHI処理したAi-Lv tet onベクター（clontech）にPCR増幅したBCL－XLのcDNAを、In-Fusion advance PCR cloning kit（clontech）を用いて導入することにより作製した。感染から24時間後に、ウイルス除去した。エストラジオールを除去し、Doxycylineを加えることで、c-MYCとBMI1の発現を抑制し、同時にBCL－XLの発現を開始した。
２－２．p53遺伝子のノックダウンによる多核化への影響
　ドキシサイクリン誘導性のLv－BCL－XL－GFPレンチウイルスベクターに加えて、FG12-sh p53レンチウイルスベクターを感染させて、p53遺伝子をノックダウンした。以降、この細胞を「iMKPC－typeII」と呼ぶ場合がある。
２－３．iMKPC－typeIIのサイトカイン依存性
　10T1/2フィーダー細胞上に、2×105個のiMKPC－typeIIを播種し、Dox0.5μg/ml存在下、39℃で、SCF(50ng/ml)、TPO(50ng/ml)、EPO(6U/ml)のサイトカイン条件で21日間培養した。結果を図２Ａに示す。iMKPC－typeII株は、サイトカインの非存在下においても増殖するが、TPOの添加によって増殖がより促進されることが確認された。iMKPC－typeIはSCF依存性で、TPOは増殖に無関係であったが、typeIIでは、TPO存在下での増殖が促進され、SCFは増殖に無関係であった。
２－４．iMKPC－typeIIの表面マーカーの解析
　サイトカイン添加後21日目に、細胞をCD41抗体、CD42b抗体、及びGPA抗体を用いて染色し、フローサイトメーターで解析した。結果を図２Ｂに示す。TPOを添加した群では、他の群に比べてCD41a及びCD42bの発現が高かった。より巨核球にコミットした集団であると考えられた。
２－５．形態的変化及びブレビスタチンの影響
　iMKPC－typeI及びtypeIIを顕微鏡で観察した結果を図３に示すc-MYCとBMI1の発現をoffにし、BCL－XLを強制発現させるとともに、p53をノックダウンすることによって、多核化が進むことが観察された。また、ブレビスタチン（5μg/ml）を添加するとさらに多核化が進むことが確認された。
　２－３．～２－５．に示されるとおり、iMKPC－typeIIの段階では、巨核球細胞は増殖しつつ、放出される血小板ではCD42b陽性の割合が高くなり、一部多核化が進んで、サイトカインの依存性がTPOに変わったことから、増殖と成熟化が並行して進んでいるものと考えられた。
２－６．BCL－XL発現抑制の影響
　10T1/2フィーダー細胞上に、2×105個のiMKPC－typeIIを播種し、Dox0.5μg/ml存在下（BCL－XL　ON）または非存在下（BCL－XL　OFF）、39℃で長期培養した。2日～5日に一度細胞数を測定し、2×105個を再播種した。
　結果を図４に示す。Dox OFFによりBCL－LXの発現を抑制すると、iMKPC－typeIIの増殖速度が低下し、長期経過後（100日以降）には増殖能が失われた。BCL－XLは、iMKPC－typeIIの長期増殖に必須であることがわかった。
２－７．その他の処理の多核化への影響の検討
２－７－１．ROCK阻害剤の影響
　MYC及びBMI1遺伝子導入後、ドキシサイクリン非存在下及びエストラジオール存在下において、培養条件、37℃、5％CO2存在下にて、巨核球細胞（105程度）を30日間程度培養して、1011個程度に増殖させた。増殖した巨核球細胞株中のMYC遺伝子及びBMI1遺伝子の発現を抑制するために、ドキシサイクリン存在下、エストラジオール非存在下の条件に変え、ROCK阻害剤（Y27632；和光純薬）の多核化への影響を見るために、Y27632を培養液中へ10μMになるように添加し、さらに培養を続けた。Y27632を添加してから培養7日目にFACSにより多核化の程度を調べた（図５）。ROCK阻害剤を添加した細胞（図５上図（Rocki）、下図白抜き）は、添加していない細胞（図５上図（vehicle）、下図黒塗り）と比較して4N以上の細胞数が増加した。このことから、ES細胞から誘導し、c-MYC遺伝子及びBMI1遺伝子の発現によって増殖能を獲得した多核化前の巨核球細胞に対し、ROCK阻害剤は多核化を促進することが明かとなった。
２－７－２．ROCK阻害剤＋高温条件での培養の影響
　これまでに、未成熟巨核球細胞を39℃のような通常の培養温度よりも高温で培養すると、多核化やproplatlet形成など、巨核球の成熟が促されることが報告されている（非特許文献５）。この点をES細胞から誘導した多核化前の巨核球細胞において確認するため、巨核球の成熟に伴い発現が上昇することが知られている遺伝子（GATA1、PF4、NFE2及びβ－チューブリン）の発現量について定量PCR法により検討を行った。
　多核化前の巨核球細胞の増殖を促した。得られた多核化前の巨核球細胞中のMYC遺伝子及びBMI1遺伝子の発現を抑制するために、ドキシサイクリン存在下、エストラジオール非存在下の条件に変え、培養温度を39℃とし、5日間培養後、定量PCR法により、各種遺伝子の発現量を測定した（図６）。その結果、37℃で培養するときよりも、39℃で培養を行ったときの方が、巨核球の成熟化の指標となる遺伝子の発現が上昇していることが分かった。
２－７－３．ROCK阻害剤＋BCL－XL遺伝子強制発現の影響
　多核化前の巨核球細胞中におけるMYC／BMI1の発現を抑制すると同時にドキシサイクリン存在下で２－１．と同様のBCL－XLを発現させるレンチウイルスベクターを細胞内に導入した。
　BCL－XL遺伝子の発現の有無が、ROCK阻害剤によって誘導される巨核球前駆細胞の多核化へどのような影響を与えるかを調べた（図７）。
　10μMのY27632存在下でMYC／BMI1の発現を抑え、かつ、BCL－XLを発現させ、7日間培養した後、多核化の程度を検討した(ploidy assay）。BCL－XL発現細胞株（図７Ｂ、斜線バー）はBCL－XLを発現させていない細胞株（図７Ｂ、白抜きバー）と比べ、8N以上の多核化細胞が優位に増加していることが確認された。また、BCL－XLを発現させていない細胞の細胞数が減少していくのに対し（図８、▲）、BCL－XLを発現させた細胞の細胞数は、緩やかに増殖していくのが観察された（図８、■）。
　以上のことから、癌遺伝子の強制発現によって高い増殖能を獲得した多核化前の巨核球細胞において、癌遺伝子依存性を回避するためには、BCL－XL遺伝子などのアポトーシスを抑制する遺伝子が効果的であることが示された。
２－７－４．ROCK阻害剤＋BCL－XL遺伝子強制発現＋p53遺伝子抑制の影響
　多核化前の巨核球細胞において、p53の発現抑制が多核化を促進するかどうか検討を行った。
　p53遺伝子の発現抑制は、２－２．と同様に、１プロモーター、ｓｈp53を導入したlenti virus FG12ベクターを用いてMOI10でレンチウイルス感染させて行った。
　MYC／BMI1の発現を抑制し、BCL－XLを強制発現させ、Y27632の存在下、p53の発現抑制を行い、39℃にて、7間培養を行った。培養後、多核化の程度を調べたところ、p53をノックダウンしていないコントロール細胞（図９Ｂ、黒バー）と比較して、p53をノックダウンした細胞（図９Ｂ、白抜きバー）では、8N以上の細胞数が増加し、多核化が促進されていた。
２－７－５．ROCK阻害剤＋BCL－XL遺伝子強制発現＋p53遺伝子抑制＋バルプロ酸の影響
　上記２－７－４の処理に加えて、さらに細胞に対しバルプロ酸の処理を行い、多核化への影響を検討した。MYC／BMI1の発現を抑制、BCL－XLの強制発現、ROCK阻害剤処理（10μM）、p53発現抑制に加え、培地中にバルプロ酸（最終濃度0.5mM）を加え、39℃で7日間培養したところ、バルプロ酸処理を行っていないコントロール細胞（図１０Ｂ、黒バー）と比較して、バルプロ酸で処理した細胞（図１０Ｂ、白抜きバー）では、多核化が促進されていた。
２－７－６．BCL－XL遺伝子強制発現＋ミオシン重鎖IIA/B ATPase阻害剤の影響、及びROCK阻害剤＋BCL－XL遺伝子強制発現＋p53遺伝子抑制＋バルプロ酸＋ミオシン重鎖IIA/B ATPase阻害剤の影響
　多核化の進んでいない巨核球細胞を、ミオシン重鎖IIA/B ATPase阻害剤のブレビスタチンで処理した場合、多核化の程度に影響が出るかどうか検討した。MYC／BMI1の発現を抑制、BCL－XLの強制発現、ブレビスタチン（10μg/ml）処理を行い、39℃で7日間培養した。ブレビスタチン処理を行っていないコントロール細胞（図１１Ｂ、黒バー）と比較して、ブレビスタチン処理を行った細胞（図１１、白抜きバー）では、8N以上の細胞数が増加し、多核化が促進されていた。
　次に、他の処理とブレビスタチン処理を組み合わせた場合の多核化の程度について検討を行った。上記２－７－５．の処理に加え、細胞に対しブレビスタチン処理を行い、多核化への影響を検討した。MYC／BMI1の発現を抑制、BCL－XLの強制発現、ROCK阻害剤（10μM）処理、p53発現抑制、バルプロ酸（0.5mM）処理に加え、ブレビスタチン（10μg/ml）処理を行い、39℃で7日間培養した。ブレビスタチン処理を行っていないコントロール細胞（図１２Ｂ、黒バー）と比較して、ブレビスタチン処理を行った細胞（図１２、白抜きバー）では、8N以上の細胞数が増加し、多核化が促進していた。また、培養7日後、ブレビスタチン処理を行った細胞ではやや増殖能は低下しているものの（図１３、上図）、細胞質の肥大化が観察され、成熟巨核球への誘導が確認された（図１３、下図）。
３．多核化巨核球細胞からの血小板の産生
３－１．BCL－XL発現抑制の血小板産生への影響（１）
　10T1/2フィーダー細胞上に、２－２．で得られた2x105個のiMKPC－typeIIを播種し、Dox 0.5μg/ml存在下（BCL－XL ON）で、またはDoxを培養液中から除去して（BCL－XL OFF）、39℃で培養した。3-4日目に巨核球および培養液中の血小板をCD41抗体およびCD42b抗体を用いて染色し、フローサイトメーターで解析を行った。
　結果を図１４に示す。Dox ONでBCL－XLが発現している巨核球細胞（Ａ）に比較して、Dox OFFによりBclxLの発現を抑えた群ではCD42bを発現している成熟した巨核球細胞が主体となっていた（Ｂ）。また、そこから放出された血小板も、BCL－XL ONの巨核球細胞から放出された血小板（Ｃ）に比較して、機能発現に必要なCD42bを発現しているものの割合が増加していた（Ｄ）。
３－２．BCL－XL発現抑制の血小板産生への影響（２）
　３－１．と同一の結果に基づいて、BCL－XL発現のON/OFF時における細胞数を計測した結果を図１５に示す。BCL－XLの発現を抑えた群では血小板数が著しく増加した。
　Ａは、CD42b陽性血小板数、Ｂは、CD41a陽性/CD42b陽性巨核球細胞数、Ｃは、CD41a陽性巨核球細胞数を示す。
　CD41を発現している巨核球細胞の数においてはBclxLの発現による影響は見られないが（Ｃ）、CD41+中のCD42b発現比率がBclxLの発現抑制により増加し、より成熟した巨核球が増えていたと言える。
３－３．培養温度の血小板産生への影響
　10T1/2フィーダー細胞上に2～3x105個のiMKPC－typeIIを播種し、Dox 0.5μg/mLの添加あるいは非添加条件において、35、37、39℃の培養温度で3日間培養した。上清中に含まれる血小板をCD41抗体およびCD42b抗体を用いて染色し、フローサイトメーターで解析を行った。37℃ Dox+を1として、各群のCD41+CD42b+血小板数の平均値および標準偏差を図１６に示す。
　培養温度は、37℃または39℃が適当であることがわかった。以降の実験では、培養温度を37℃とした。
３－４．フィーダー細胞、培地中の血清、及びブレビスタチンの有無の血小板産生への影響
　フィーダー細胞使用／非使用、Conditioned Medium使用／非使用、血清培地使用／無血清培地使用、ブレビスタチン投与／非投与、の条件を図１７に示すように組合せて血小板産生効率を測定した。
　Conditioned Mediumは、Gelatin coatingした10cm dishにMMC処理した10T1/2を8x105播種し、翌日（細胞が接着後）SCF(50ng/ml)、TPO(50ng/ml)を含む15％血清を含む分化培地(EBM)または血清フリーの分化培地10mlに交換し、24時間後に培地を回収して新たな培地（含SCF、TPO）を10ml添加し、3日間分のConditioned Mediumをプールし、0.22μmのフィルターを通し、10T1/2を除去して調製した。試験に用いる際にはSCF、TPOは新たに添加した。
　フィーダー細胞使用群は、10T1/2フィーダー細胞上に2～3x105個のiMKPC－typeIIを播種し、非使用群は、ゼラチンコートしたディッシュ上に同様に細胞を播種した。血清培地使用群は、15％血清を含む分化培地またはConditioned Mediumを用い、ブレビスタチン投与群は、培地に5μMのブレビスタチンを添加した。培養は、37℃で3日間行った。
　培養上清中に含まれる血小板をCD41抗体およびCD42b抗体を用いて染色し、フローサイトメーターで解析を行った。フィーダー細胞上でブレビスタチン非添加、15%血清添加して培養したものをnormal conditionとし、各群のCD41+CD42b+血小板数のnormal conditionに対する割合の平均値および標準偏差を棒グラフにしたものを図１７に示す。血小板産生量としては、いずれの群においても大きな差は認められなかった。
　また、各群のCD41陽性血小板中のCD42b発現量（各群の平均蛍光強度のnormal conditionの平均蛍光強度に対する割合）の比較を図１８に示す。血清なし、フィーダー細胞なしの条件で、最もCD42bの発現の高い血小板が産生された。ブレビスタチンの影響は見られなかった。
　最適化した条件の一例を図１９に示す。また、この条件で培養したときのCD41陽性、CD42b（GPIbaともいう）陽性血小板の割合を図２０に示す。
　図２０に示されるとおり、本発明によって得られる多核化巨核球細胞から得られる血小板は、約20％がCD41陽性CD42b陽性であり、BCL－XLの発現を抑制することによって、その割合が55％へと上昇し、さらにフィーダー細胞と血清を除いて培養することにより81％まで上昇させることができた。
４．CD42b発現の血小板機能への重要性（参考）
　ヒト末梢血血小板を用いて、リストセチン凝集反応（vWFと血小板上のレセプター〔GPIba、GPIXなどからなるヘテロ5量体〕を介した凝集反応）に対するHIP1抗体の阻害効果を測定した。HIP1抗体は、GPIbaの機能的阻害抗体である。
　1x108個の血小板を５０％血漿中に懸濁し、HIP1抗体を添加して37℃で3分間前培養してGPIbaの効果を阻害した後、リストセチン（最終濃度2mg/ml）を添加して凝集反応を惹起し、7分間光透過度をモニターした。各群の最大光透過度（凝集の強度を示す）を示す棒グラフを図２１に示す。HPI1抗体は10μg/ml以上の濃度でGPIb/alpha-von Willebrand factor (vWF)会合による凝集を完全に阻害した。
　次に、NOGマウス体内に100ugのHIP1抗体またはコントロールIgGを投与し、TAMRA(赤い色素)で染色した血小板を輸血した。血管内皮をレーザー照射により傷害して血栓形成を惹起し、血栓形成に寄与したヒト血小板（赤）数をカウントした。
　血栓中のヒト血小板数を単位血管長で補正した値の平均値および標準誤差を棒グラフで示した（図２２）。HIP1抗体投与群では、ヒト血小板の血栓への寄与が阻害された。
　以上から、GPIba（CD42b）はin vivo及びin vitroにおける血栓形成に重要な役割を果たしている分子であることがわかる。
　本発明は、巨核球前駆細胞の多核化を促し、さらに、血小板の放出を効率よく行わせる方法を提供する。特に、本発明の方法は、各種幹細胞などからインビトロにおいて巨核球や血小板を調製する際に、非常に有効であり、医療分野における治療法や血液製剤の開発に大いに寄与するものである。

Claims (19)

  1. 　多核化巨核球細胞を製造する方法であって、
    　多核化前の巨核球細胞において、アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させて、該細胞を培養する工程を含む、方法。
  2. 　前記アポトーシス抑制遺伝子が、BCL－XL遺伝子である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記培養工程において、p53遺伝子産物の発現又は機能を阻害する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記培養工程において、多核化前の巨核球細胞に対して以下の(a)～(c)の少なくとも1つを行う、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法：
    (a)アクトミオシン複合体機能阻害剤による処理；
    (b)ROCK阻害剤による処理；及び
    (c)HDAC阻害剤による処理。
  5. 　前記ROCK阻害剤がＹ27632であり、前記HDAC阻害剤がバルプロ酸であり、前記アクトミオシン複合体機能阻害剤がブレビスタチンである、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記培養工程を37℃より高い温度で行う、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記多核化前の巨核球細胞は、
    　造血前駆細胞から多核化前の巨核球細胞に至る分化段階のいずれかで、該細胞において、癌遺伝子と以下の(i)～(iii)のいずれかの遺伝子とを強制発現させ、該細胞を培養して増殖させる工程によって得られたものである、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法：
    (i)p16遺伝子又はp19遺伝子の発現を抑制する遺伝子；
    (ii)Ink4a/Arf遺伝子の発現を抑制する遺伝子；及び
    (iii)ポリコーム遺伝子。
  8. 　前記癌遺伝子としてc-MYC遺伝子を、前記(i)～(iii)の遺伝子としてBMI1を用いる、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記造血前駆細胞は、iPS細胞、ES細胞、並びに、臍帯血、骨髄血若しくは末梢血由来の造血幹細胞及び造血幹細胞からなる群より選択される細胞に由来する、請求項７又は８に記載の方法。
  10. 　請求項１から９のいずれか１項に記載の方法で製造された多核化巨核球細胞を含む血液細胞組成物。
  11. 　血小板の製造方法であって、
    　請求項１から９のいずれか１項に記載の方法で多核化巨核球細胞を得て、これを培養する工程と、
    　前記多核化巨核球細胞の培養物から血小板を回収する工程と、を含む方法。
  12. 　前記多核化巨核球細胞の培養工程は、前記アポトーシス抑制遺伝子の強制発現を抑制して、又は、前記アポトーシス抑制遺伝子を細胞から除去して行う、請求項１１に記載の方法。
  13. 　前記多核化巨核球細胞の培養工程は、血清なし、及び／又はフィーダー細胞なしで行う、請求項１１又は１２に記載の方法。
  14. 　前記多核化巨核球細胞の培養工程を、1日から15日間行う、請求項１１から１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　前記多核化巨核球細胞の培養工程は、37℃で行う、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　前記多核化巨核球細胞の培養工程で、培地にROCK阻害剤及び／又はアクトミオシン複合体機能阻害剤を加える、請求項１１から１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 　前記ROCK阻害剤が、Ｙ27632であり、前記アクトミオシン複合体機能阻害剤が、ブレビスタチンである、請求項１６に記載の方法。
  18. 　請求項１１から１７のいずれか１項に記載の方法で製造された血小板。
  19. 　請求項１８に記載の血小板を含む血液製剤。
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