JP2016504339A - 多能性幹細胞から血小板を生産するための方法およびその組成物 - Google Patents

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Abstract

多能性幹細胞、例えばヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からの血小板の生成のための方法が提供される。これらの方法は、胚様体も多能性幹細胞のクラスターも形成することなく実施され得、間質インデューサー細胞の使用を伴わずに実施され得る。さらに、収量および／または純度は、多能性幹細胞から血小板を生成する以前の方法について報告されているよりも高くなり得る。血小板、好ましくは多能性幹細胞から生成された血小板を含む組成物および医薬調製物もまた提供される。

Description

関連出願
本出願は、２０１２年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／７４０，６９９号および２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７８７，４７６号（両方とも「多能性幹細胞から血小板を生産するための方法およびその組成物」と題される）に対する利益を主張し、これら両方の内容全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。
発明の背景
血小板は、血液凝固という重要な高度に特化した機能を果たす小さな血液細胞である。平均的なヒトの血液ではほぼ１兆個の血小板が循環し、そのターンオーバーは、全血小板集団が１０日毎に置き換えられるようなものである。これは、莫大な量の進行中の血小板生成を示す。血小板は、高度に組織化された細胞骨格および３００を超えるタンパク質の細胞内貯蔵を有し、血管傷害の部位においてこれらを分泌する。血小板は、炎症、血管増殖および腫瘍転移においても役割を果たす。
脈管傷害後、血小板は、損傷された血管に迅速に接着し、血栓形成を生じる複雑なカスケードの事象を惹起する。血小板輸血に対する需要は、過去数十年間増加し続けている（５１）。従来の方法を使用すると、血小板は、１週間未満にわたってしか貯蔵できず、ドナー依存的プログラムにとって絶え間ない課題を生んでいる。血小板の供給の不足は、生命を脅かす結果を潜在的に有し得る（特に、複数回の輸血が必要な患者において）。反復される輸血は、免疫媒介性の宿主反応に関連付けられる不応性の応答もまたもたらし得、費用のかかる患者マッチングを必要とし得る（５２；５３）。ｉｎ ｖｉｔｒｏの血小板、特に患者にマッチした血小板を生成する能力は、これらの臨床的シナリオにおいて顕著な利益を提供する。
血小板の供給における制約は、普通でない／稀な血液型を有する、輸血に依存する患者、特に同種免疫された患者、およびがんまたは白血病を有し、しばしば起きることであるが、血小板同種免疫を発達させる患者にとって、生命を脅かす結果を潜在的に有し得る。輸血されたヒト血小板の半減期は４〜５日間であるので、血小板の頻繁な輸血が、これらの患者において臨床的に必要である。さらに、志願者ドナープログラム由来の血小板は、種々の病原体による汚染のリスクが絶えない。血小板は、従来技術を使用しては凍結貯蔵することができず、したがって、血小板をｉｎ ｖｉｔｒｏで生成する能力は、臨床状況における血小板置換療法に顕著な利益を提供する。
１０年より長くにわたって、骨髄（ＢＭ）、臍帯血（ＣＢ）または末梢血（ＰＢ）由来のヒト造血幹細胞（ＨＳＣ、ＣＤ３４＋）が、巨核球（ＭＫ）および血小板の生成について研究されてきた。サイトカイン、増殖因子および／または間質フィーダー細胞の特定の組合せを使用して、機能的血小板が、顕著な成功を収めてＨＳＣから生成されている（１；２）。しかし、ＨＳＣは、なおもドナーから収集され、現行の培養条件下で限定的な拡大増殖能力を有し、それが、大規模生成および将来の臨床的適用を妨げている。
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで無制限に繁殖および拡大増殖され得、ヒト治療のための細胞の、潜在的に無尽蔵のドナーなしの供給源を提供する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｈＥＳＣの造血細胞への分化は、過去１０年間にわたって広範囲に調査されてきた。ｈＥＳＣの方向付けられた造血分化は、２つの異なる型の培養系によってｉｎ ｖｉｔｒｏで首尾よく達成されている。これらのうち１つは、血清含有培地中での、ｈＥＳＣと間質フィーダー細胞との共培養を使用する（３；４）。第２の型の手順は、血清あり／なしのサイトカインの存在下での、超低細胞結合プレートにおける懸濁培養条件を使用する（５〜７）；その終点は、細胞凝集体または胚様体（「ＥＢ」）の形成である。造血先駆体ならびに赤血球、骨髄、マクロファージ、巨核球およびリンパ系の系列を示す成熟した機能的子孫が、上記分化するｈＥＳＣ培養系の両方において同定されている（３〜６：８〜１４）。以前の研究でもまた、血清の存在下で間質細胞と共培養することによって、ｈＥＳＣから巨核球／血小板が生成した（１５；１６）。しかし、上記研究における巨核球／血小板の収量は低かった（１５；１６）。
Ｒｅｅｍｓ ＪＡ， Ｐｉｎｅａｕｌｔ Ｎ， ａｎｄ Ｓｕｎ Ｓ． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ： ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｔ． Ｔｒａｎｓｆｕｓ． Ｍｅｄ．Ｒｅｖ． ２０１０； ２４： ３３−４３． Ｃｈｏｃｋａｌｉｎｇａｍ Ｐ， Ｓａｃｈｅｒ ＲＡ． Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ’ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｔｏ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ． Ｊ．Ｉｎｆｕｓ．Ｎｕｒｓ． ２００７； ３０ ： ２２０−２２５． Ｈｏｄ Ｅ， Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｊ． Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｉｎｅｓｓ． Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ． ２００８； １４２： ３４８−３６０． Ｋａｕｆｍａｎ ＤＳ， Ｈａｎｓｏｎ ＥＴ， Ｌｅｗｉｓ ＲＬ， Ａｕｅｒｂａｃｈ Ｒ， Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡ． Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ２００１；９８．： １０７１６−１０７２１． Ｌｕ Ｓ−Ｊ， Ｌｉ Ｆ， Ｖｉｄａ Ｌ， Ｈｏｎｉｇ ＧＲ． ＣＤ３４＋ＣＤ３８− ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｘｈｉｂｉｔ ａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ． Ｂｌｏｏｄ ２００４；１０３：４１３４−４１４１． Ｃｈａｄｗｉｃｋ Ｋ， Ｗａｎｇ Ｌ， Ｌｉ Ｌ ｅｔ ａｌ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ＢＭＰ−４ ｐｒｏｍｏｔｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｂｌｏｏｄ ２００３ ２００３；１０２：９０６−９１５． Ｃｈａｎｇ ＫＨ， Ｎｅｌｓｏｎ ＡＭ， Ｃａｏ Ｈ ｅｔ ａｌ． Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ−ｌｉｋｅ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｃｏｅｘｐｒｅｓｓ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ ｆｅｔａｌ ｇｌｏｂｉｎｓ ｗｉｔｈ ｌｉｔｔｌｅ ｏｒ ｎｏ ａｄｕｌｔ ｇｌｏｂｉｎ． Ｂｌｏｏｄ ２００６； １０８： １５１５−１５２３． Ｔｉａｎ Ｘ， Ｍｏｒｒｉｓ ＪＫ， Ｌｉｎｅｈａｎ ＪＬ， Ｋａｕｆｍａｎ ＤＳ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｄｉｆｆｅｒ ｆｏｒ ｓｔｒｏｍａ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ． ２００４；３２： １０００−１００９． Ｖｏｄｙａｎｉｋ ＭＡ， Ｂｏｒｋ ＪＡ， Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡ， Ｓｌｕｋｖｉｎ ＩＩ． Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＣＤ３４＋ ｃｅｌｌｓ： ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ＯＰ９ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ． Ｂｌｏｏｄ ２００５；１０５：６１７−６２６． Ｗａｎｇ Ｌ， Ｍｅｎｅｎｄｅｚ Ｐ， Ｓｈｏｊａｅｉ Ｆ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ｅｃｔｏｐｉｃ ＨＯＸＢ４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ２００５；２０１ ： １６０３−１６１４． Ｗｏｌｌ ＰＳ， Ｍａｒｔｉｎ ＣＨ， Ｍｉｌｌｅｒ ＪＳ， Ｋａｕｆｍａｎ ＤＳ． Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ａｃｑｕｉｒｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００５；１７５：５０９５− ５１０３． Ｚａｍｂｉｄｉｓ ＥＴ， Ｐｅａｕｌｔ Ｂ， Ｐａｒｋ ＴＳ， Ｂｕｎｚ Ｆ， Ｃｉｖｉｎ ＣＩ． Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｈｅｍａｔｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ， ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ， ａｎｄ ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｓｔａｇｅｓ ｒｅｓｅｍｂｌｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｙｏｌｋ ｓａｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｂｌｏｏｄ ２００５；１０６：８６０−８７０． Ｑｉｕ Ｃ， Ｈａｎｓｏｎ Ｅ， Ｏｌｉｖｉｅｒ Ｅ ｅｔ ａｌ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ｌｉｖｅｒ ｃｅｌｌｓ ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｇｌｏｂｉｎ ｓｗｉｔｃｈ ｔｈａｔ ｏｃｃｕｒｓ ｅａｒｌｙ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ． ２００５；３３： １４５０−１４５８． Ｚｈａｎ Ｘ， Ｄｒａｖｉｄ Ｇ， Ｙｅ Ｚ ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｌｅｕｃｏｃｙｔｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｌａｎｃｅｔ ２００４；３６４： １６３−１７１． Ｌｅｄｒａｎ ＭＨ， Ｋｒａｓｓｏｗｓｋａ Ａ， Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ Ｌ ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｏｎ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｎｉｃｈｅｓ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２００８；３：８５−９８． Ｇａｕｒ Ｍ， Ｋａｍａｔａ Ｔ， Ｗａｎｇ Ｓ ｅｔ ａｌ． Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ： ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｔｒａｃｔａｂｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ． ２００６；４：４３６−４４２． Ｔａｋａｙａｍａ Ｎ， Ｎｉｓｈｉｋｉｉ Ｈ， Ｕｓｕｉ Ｊ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉａ ＥＳ−ｓａｃｓ， ＶＥＧＦ−ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ． Ｂｌｏｏｄ ２００８； １１１ ：５２９８−５３０６．
発明の概要
本開示は、多能性幹細胞、例えば、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣまたはｉＰＳ細胞）、例えばヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣまたはｈｉＰＳ細胞）からの血小板の生成のための方法を提供する。これらの方法は、胚様体を形成することなく実施され得、間質インデューサー細胞の使用を伴わずに実施され得る。さらに、収量および／または純度は、多能性幹細胞から血小板を生成する以前の方法について報告されているよりも高くなり得る。血小板は、より高い効率およびより大きい規模で生成され得るので、本開示の方法および組成物は、医療上の輸血目的での使用についての大きな可能性を有する。さらに、血小板は、核を有さず、最小の遺伝子材料のみを含むので、本開示の調製物は、任意の汚染する有核細胞、例えば未分化ｈＥＳＣを効果的に排除するために、輸血前に照射され得る。したがって、有核細胞の起こり得る存在は、安全性の問題を示さないはずである。
ドナーから収集された血小板は、非常に限定的な有効期限を有し、患者における予防的輸血にますます必要とされている。ドナー依存的な臍帯血または骨髄ＣＤ３４＋ヒト造血幹細胞とは対照的に、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、制御された条件下での血小板の持続的なｉｎ ｖｉｔｒｏ生成のための有望な代替的供給源であり得る。本明細書にさらに記載するように、本開示は、血清フリーおよび間質フリーの条件下で、多能性幹細胞から巨核球（ＭＫ）を生成するための系および方法を提供する。例示的な実施形態では、多能性幹細胞は、造血性内皮細胞（ＰＶＥ−ＨＥ、これは以下にさらに記載する）の分化を介して巨核球に向けて方向付けられる。ＣＤ３１、ＣＤ１４４およびＣＤ１０５マーカーを発現する一過性の多分化能の細胞集団が、ＰＶＥ−ＨＥ培養の最後に同定されている。フィーダーフリーおよび血清フリーの懸濁培養物中におけるＴＰＯ、ＳＣＦおよび他のサイトカインの存在下で、最大１００倍の拡大増殖が、ｈＥＳＣまたはｈｉＰＳ細胞からＭＫへと、１８〜２０日間で達成され得る。かかる方法は、多能性幹細胞からのＭＫの強いｉｎ ｖｉｔｒｏ生成を提供し得る。フィーダーフリー条件下で培養した場合、多能性幹細胞由来のＭＫは、血小板様粒子（ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴ）またはヒト胚性幹細胞（ＥＳ ＰＬＴ）から生成された血小板または血小板様粒子）を生成するために使用され得る。これらのｈｉＰＳＣ−ＰＬＴおよびＥＳ−ＰＬＴは、トロンビン刺激に対して応答性であり、ミクロ凝集体形成に関与できる。
一実施形態では、本開示は、少なくとも１０８個の血小板を含む、ヒト患者における使用に適切な医薬調製物を提供する。
であって、前記調製物が白血球を実質的に含まず、前記血小板の実質的に全てが機能的である、医薬調製物。
さらに、本開示は、ヒト幹細胞から分化した血小板、例えば、少なくとも１０８個の血小板を含む医薬調製物を提供する。任意選択で、この調製物は白血球を実質的に含まなくてもよい。任意選択で、血小板の実質的に全てが機能的であってもよい。
医薬調製物は、１０９〜１０１４個の血小板、任意選択で、１０９個、１０１０個、１０１１個、１０１２個、１０１３個または１０１４個の血小板を含み得る。
血小板は、以下の属性：９．７〜１２．８ｆＬの平均血小板容量範囲；調製物中のサイズの単峰型分布；および／または１標準偏差が２μｍ３未満（好ましくは１．５μｍ３未満、１μｍ３未満またはさらには０．５μｍ３未満）である対数正規型血小板容量分布のうち１つまたは複数を有し得る。
血小板は、以下のマーカー：ＣＤ４１ａおよびＣＤ４２ｂのうち少なくとも１つについて陽性であり得る。
血小板はヒト血小板であり得る。
血小板の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は機能的であり得、任意選択で、室温での貯蔵後、少なくとも２、３または４日間にわたって機能的であり得る。
別の態様では、本開示は、フィーダー細胞なしで機能的血小板を生成する弱い接着性のまたは非接着性の巨核球を有するバイオリアクターを提供する。
別の態様では、本開示は、少なくとも１０９個の巨核球系列特異的前駆体（ＭＬＰ）を含む組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、ＭＬＰを含む凍結保存組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、凍結保存されたＭＬＰを含むバンクを提供する。
ＭＬＰは、規定されたＨＬＡ型のものであり得る。
凍結保存組成物は、患者にマッチしたＨＬＡであり得る。
別の態様では、本開示は、１０９〜１０１４個のＭＬＰ、任意選択で１０９個、１０１０個、１０１１個、１０１２個、１０１３個または１０１４個のＭＬＰを含む、凍結保存組成物またはバンクを提供する。
別の態様では、本開示は、巨核球またはＭＰＬから血小板を生成するための方法であって、ａ）巨核球の非接着性培養物を提供するステップ；ｂ）この巨核球またはＭＰＬをＴＰＯまたはＴＰＯアゴニストと接触させて、培養において前血小板の形成を引き起こすステップであって、この前血小板が血小板を放出するステップ；およびｃ）この血小板を単離するステップを含む方法を提供する。
別の態様では、本開示は、巨核球またはＭＰＬから血小板を生成するための方法であって、ａ）巨核球またはＭＰＬの非接着性培養物を提供するステップ；ｂ）この巨核球またはＭＰＬを、造血拡大増殖培地ならびに任意選択で（１）ＴＰＯもしくはＴＰＯアゴニスト、ＳＣＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−９または（２）ＴＰＯもしくはＴＰＯアゴニスト、ＳＣＦおよびＩＬ−１１と接触させて、培養において前血小板の形成を引き起こし得るステップであって、この前血小板が血小板を放出するステップ；およびｃ）前記血小板を単離するステップを含む方法を提供する。
前記ＴＰＯアゴニストは、ＡＤＰ、エピネフリン、トロンビン、コラーゲン、ＴＰＯ−Ｒアゴニスト、ＴＰＯ模倣物、第２世代血小板新生剤、ロミプロスチム、エルトロンボパグ（ＳＢ４９７１１５、Ｐｒｏｍａｃｔａ）、組換えヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）、ペグ化組換えヒト巨核球増殖発達因子（ＰＥＧ−ｒＨｕＭＧＤＦ）、Ｆａｂ ５９、ＡＭＧ ５３１、Ｐｅｇ−ＴＰＯｍｐ、ＴＰＯ非ペプチド模倣物、ＡＫＲ−５０１、モノクローナルＴＰＯアゴニスト抗体、ポリクローナルＴＰＯアゴニスト抗体、ＴＰＯミニボディ、ＶＢ２２Ｂ ｓｃ（Ｆｖ）２、ドメインサブクラス変換ＴＰＯアゴニスト抗体、ＭＡ０１Ｇ４Ｇ３４４、組換えヒトトロンボポエチン、組換えＴＰＯ融合タンパク質またはＴＰＯ非ペプチド模倣物のうち１つまたは複数を含む。
任意選択で、実質的に全ての単離された血小板は機能的であり得る。
巨核球またはＭＰＬの非接着性培養物はフィーダーフリー培養物であり得る。
ステップ（ｂ）における培養は、０．５〜１００ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ）、１０〜１００ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン（ＴＰＯ）および１０〜１００ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、少なくとも１種のＲＯＣＫインヒビター、ならびに／または２．５〜２５単位／ｍｌのヘパリンのうち１つまたは複数を含む培地中であり得る。
ステップ（ｂ）における培養は、１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、０．５〜１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、５〜２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、５〜２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−９、少なくとも１種のＲＯＣＫインヒビター、および／または２．５〜２５単位／ｍｌのヘパリンのうち１つまたは複数を含む培地中であり得る。
この少なくとも１種のＲＯＣＫインヒビターはＹ２７６３２を含んでもよく、このＹ２７６３２は、２〜２０μＭ、約３〜１０μＭ、約４〜６μＭまたは約５μＭの濃度であり得る。
この方法は、巨核球を剪断力に供するステップをさらに含み得る。
巨核球１個当たり少なくとも２個、３個、４個または５個の血小板が生成され得る。
巨核球１個当たり少なくとも５０個の血小板が生成され得る。
巨核球１個当たり少なくとも１００個、５００個、１０００個、２０００個、５０００個または１００００個の血小板が生成され得る。
前記血小板の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％は、ＣＤ４１ａ＋および／またはＣＤ４２ｂ＋、例えばＣＤ４１ａ＋およびＣＤ４２ｂ＋であり得る。
血小板は、フィーダー細胞の非存在下で生成されてもよく、そして／または間質フィーダー細胞の非存在下で生成されてもよい。
血小板は、全ての異種細胞の非存在下で生成されてもよい。
血小板はヒトのものであり得る。
巨核球またはＭＰＬは、外因的に添加されたプロテアーゼインヒビターの存在下で培養され得る。 前記巨核球またはＭＰＬは、外因的に添加されたＭＭＰインヒビターの存在下で培養され得る。 前記巨核球またはＭＰＬは、外因的に添加されたＭＭＰ８インヒビターの存在下で培養され得る。前記巨核球またはＭＰＬは、外因的に添加されたＭＭＰ８特異的インヒビターおよび汎ＭＭＰインヒビターの存在下で培養され得る。
巨核球またはＭＰＬは、約３９℃の温度で培養され得る。
巨核球またはＭＰＬは、（ａ）多能性幹細胞を培養して、造血性内皮細胞（ＰＶＥ−ＨＥ）を形成するステップ；（ｂ）前記造血性内皮細胞を培養して、ＭＬＰを形成するステップ；および任意選択で（ｃ）前記ＭＬＰを培養して、巨核球を形成するステップを含むステップによって生成され得る。この多能性幹細胞はヒトのものであり得る。
造血性内皮細胞は、ステップ（ｂ）において、ＢＥＴインヒビターの存在下で培養され得る。このＢＥＴインヒビターはＩＢＥＴ１５１であり得る。
造血性内皮細胞は、胚様体形成なしに誘導され得る。
多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。前記ｉＰＳＣはヒトのものであり得る。
造血性内皮細胞は、胚様体形成なしに誘導され得る。
造血性内皮細胞が、１％〜１０％の酸素、２％〜８％の酸素、３％〜７％の酸素、４％〜６％の酸素または約５％の酸素を含む低酸素条件下で多能性幹細胞から分化させられ得る。
巨核球は、ＭＬＰが、３８〜４０セルシウス度の間の温度、または約３９セルシウス度の温度でＭＬＰから分化させられ得る。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される方法のいずれか、例えば上記方法のいずれかによって生成された血小板を含む医薬調製物を提供する。
この調製物は、ヒト患者における使用に適切であり得る。例えば、この調製物は、ヒト患者における使用に適切であり得、白血球を実質的に含まなくてもよい。この調製物は、少なくとも１０８個の血小板を含み得る。
さらなる一態様では、本開示は、それを必要とする患者あるいは凝固に影響する疾患もしくは障害またはそれによって処置可能な疾患もしくは障害に罹患している患者の処置のための医薬の製造における、血小板を含む組成物（例えば、上述の段落などにおいて本明細書に記載される組成物）または本明細書に記載される方法（例えば、上述の段落に記載された方法）によって生成された血小板を含む組成物の使用を提供する。
この疾患または障害は、血小板減少症、外傷、血液媒介寄生生物またはマラリアを含み得る。
別の態様では、本開示は、血小板輸血を必要とする患者を処置する方法を提供し、この方法は、血小板を含む組成物（例えば、上述の段落などにおいて本明細書に記載される組成物）または本明細書に記載される方法（例えば、上述の段落に記載された方法）によって生成された血小板を含む組成物を、この患者に投与するステップを含む。
この方法は、血小板減少症、外傷、血液媒介寄生生物またはマラリアを含む疾患または障害を処置するために有効であり得る。
別の態様では、本開示は、任意選択で多能性幹細胞から誘導され、任意選択で本明細書に記載される方法に従って生成された単離ＰＶＥ−ＨＥ細胞を含む組成物を提供する。
一態様では、本開示は、任意選択で本明細書に記載される方法に従って生成された単離ｉＰＳ−ＰＶＥ−ＨＥ細胞を含む組成物を提供する。
一態様では、本開示は、任意選択で本明細書に記載される方法に従って生成された単離ｈＥＳ−ＰＶＥ−ＨＥを含む組成物を提供する。
一態様では、本開示は、任意選択で多能性幹細胞から誘導され、任意選択で本明細書に記載される方法に従って生成された単離ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰを含む組成物を提供する。
一態様では、本開示は、任意選択で本明細書に記載される方法に従って生成された単離ｉＰＳ−ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰを含む組成物を提供する。
一態様では、本開示は、任意選択で本明細書に記載される方法に従って生成された単離ｈＥＳ−ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰを含む組成物を提供する。
一態様では、本開示は、任意選択で多能性幹細胞から誘導され、任意選択で本明細書に記載される方法に従って生成された単離ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ−ＭＫを含む組成物を提供する。
一態様では、本開示は、任意選択で本明細書に記載される方法に従って生成された単離ｉＰＳ−ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ−ＭＫを含む組成物を提供する。
一態様では、本開示は、任意選択で本明細書に記載される方法に従って生成された単離ｈＥＳ−ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ−ＭＫを含む組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、少なくとも１０８個の血小板を含む、ヒト患者における使用に適切な医薬調製物を提供し、この調製物は白血球を実質的に含まず、血小板の実質的に全てが機能的である。
種々の実施形態では、この医薬調製物は、有核細胞を除去または不活性化するために照射される。
別の態様では、本開示は、少なくとも１０８個の機能的血小板を含む、ヒト患者における使用に適切な医薬調製物を提供し、この調製物中の機能的血小板の平均血漿半減期は、少なくとも４日間である。
この医薬調製物は、１０９〜１０１４個の血小板、任意選択で１０９個、１０１０個、１０１１個、１０１２個、１０１３個または１０１４個の血小板を含み得る。
この医薬調製物は、以下の属性：９．７〜１２．８ｆＬの平均血小板容量範囲；調製物中のサイズの単峰型分布；および／または１標準偏差が２μｍ３未満（好ましくは１．５μｍ３未満、１μｍ３未満またはさらには０．５μｍ３未満）である対数正規型血小板容量分布のうち１つまたは複数を有する血小板を含み得る。
この医薬調製物は、以下のマーカー：ＣＤ４１ａおよびＣＤ４１ｂのうち少なくとも１つについて陽性である血小板を含み得る。
血小板の少なくとも半分は、室温、例えば（２２〜２５℃）での貯蔵後、少なくとも２、３、４または５日間にわたって機能的であり得る。例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％が、少なくとも２日間にわたって機能的であり得る。血小板は、少なくとも５日間にわたって室温で貯蔵され得る。
別の態様では、本開示は、ＭＬＰの凍結保存されたバンクまたは調製物を提供する。
ＭＬＰは、懸濁物中で浮遊し始めたときに、ＰＶＥ−ＨＥから収集され得る。好ましくは、ＭＬＰはプレート形成して（ｐｌａｔｅｄ）おらず、好ましくは、ＭＬＰは接着されておらず、それによって、他の細胞型への分化を回避し、ＭＫの生成を促進する。
このバンクまたは調製物は、１０９〜１０１４個のＭＬＰ、任意選択で１０９個、１０１０個、１０１１個、１０１２個、１０１３個または１０１４個のＭＬＰを含み得る。
１個のＭＬＰは、少なくとも２個、３個、４個、５個またはそれより多くの血小板を生じ得る。例示的な実施形態では、ＭＬＰ１個当たり５個の血小板の収量で治療的用量の３００〜６００×１０９個の血小板を生成するのに十分な、６×１０１０〜１．２×１０１１個のＭＬＰの組成物が提供される。例示的な実施形態では、ＭＬＰ１個当たり少なくとも１００個の血小板の収量で治療的用量を生成するのに十分な、３〜６×１０９個のＭＬＰの組成物が提供される。
別の態様では、本開示は、フィーダー細胞なしに機能的血小板を生成する弱い接着性のまたは非接着性の巨核球を有するバイオリアクターを提供する。前記巨核球を含む弱い接着性の細胞は、互いからまたは表面から機械的に分離され得る（例えば、血清学的ピペットを使用して穏やかな力で洗浄することによって）。好ましくは、ＭＫは、ＭＫ表現型の維持を促進すると考えられる非接着性条件下で培養される。血小板生成の効率を改善するために、剪断力がＭＫ培養物に加えられ得る。例えば、マイクロ流体チャンバーまたはチップが、剪断応力を制御するために使用され得、ＭＫ１個当たりの血小板収量を増加させ得る。一態様では、ＭＫは、マイクロ流体チップの１つのチャネル中に播種され得、培地は、ほぼ生理学的速度で、ＭＫのそばを通り過ぎて流され得る。
別の態様では、本開示は、少なくとも１０９個のＭＬＰを含む組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、ＭＬＰを含む凍結保存組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、巨核球から血小板を生成するための方法を提供し、この方法は、ａ）巨核球の非接着性培養物を提供するステップ；ｂ）巨核球をＴＰＯまたはＴＰＯアゴニストと接触させて、培養において前血小板の形成を引き起こすステップであって、前血小板が血小板を放出するステップ；およびｃ）血小板を単離するステップを含む。
トロンボポエチン（ＴＰＯ）は、血小板新生および巨核球形成に関与する重要なサイトカインであると考えられ、血小板、巨核球および巨核球先駆体の表面上で発現されるトロンボポエチン受容体に対する内因性リガンドである。ＴＰＯは、２つのドメイン：受容体結合ドメイン（残基１〜１５３）および高度にグリコシル化されており、タンパク質の安定性のために重要である炭化水素リッチドメイン（残基１５４〜３３２）を含む、３３２アミノ酸（９５ｋＤａ）の糖タンパク質である。ＴＰＯ受容体ｃ−Ｍｐｌ（ＣＤ１１０としても公知）は、典型的な造血サイトカイン受容体であり、２つのサイトカイン受容体相同性モジュールを含む。ＴＰＯは、遠位サイトカイン受容体相同性モジュールにのみ結合し、それによって、シグナル伝達を開始させる。この遠位サイトカイン受容体相同性モジュールの非存在下では、ｃ−Ｍｐｌは活性になり、これは、この遠位サイトカイン受容体相同性モジュールが、ＴＰＯによって結合されるまでｃ−Ｍｐｌのインヒビターとして機能することを示唆している。ＴＰＯによる結合は、ヤヌスキナーゼ２（Ｊａｋ２）シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）シグナル伝達経路を活性化して、細胞の増殖および分化を駆動する。巨核球増殖発達因子（ＭＧＤＦ）は、別の血小板新生増殖因子である。ヒト形態およびペグ化形態を含む、ＴＰＯおよびＭＧＤＦの組換え形態が、巨核球および血小板の分化および成熟化を誘発するために使用され得る。ＴＰＯ受容体活性化ペプチドおよび融合タンパク質（即ち、Ｆａｂ ５９、ロミプロスチム／ＡＭＧ ５３１またはペグ化体（Ｐｅｇ−ＴＰＯｍｐ））が、ＴＰＯの代わりに使用され得る。非ペプチド模倣物（エルトロンボパグ（ＳＢ４９７１１５、Ｐｒｏｍａｃｔａ）およびＡＫＲ−５０１）は、ＴＰＯとは異なる機構によってＴＰＯ受容体と結合してそれを活性化し、ＴＰＯに対して相加効果を有し得る。ＴＰＯ受容体を活性化するＴＰＯアゴニスト抗体（即ち、ＭＡ０１Ｇ４Ｇ３４４）またはミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（即ち、ＶＢ２２Ｂ ｓｃ（Ｆｖ）２）もまた、ＴＰＯの効果を模倣するために使用され得る。例示的なＴＰＯアゴニストは、各々その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＳｔａｓｉら、Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２４巻（２０１０年）１７９〜１９０頁およびＫｕｔｅｒ、Ｂｌｏｏｄ． ２００７年；１０９巻：４６０７〜４６１６頁に開示されている。例示的なＴＰＯアゴニストには以下が含まれる：ＡＤＰ、エピネフリン、トロンビンおよびコラーゲン、ならびにＴＰＯ−ＲアゴニストもしくはＴＰＯ模倣物として文献中で同定されている他の化合物、第２世代血小板新生剤、ロミプロスチム、エルトロンボパグ（ＳＢ４９７１１５、Ｐｒｏｍａｃｔａ）、第１世代血小板新生増殖因子、組換えヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）、ペグ化組換えヒト巨核球増殖発達因子（ＰＥＧ−ｒＨｕＭＧＤＦ）、ＴＰＯペプチド模倣物、Ｆａｂの相補性決定領域中に挿入されたＴＰＯ受容体活性化ペプチド（Ｆａｂ ５９）、ＡＭＧ ５３１（２つのジスルフィド結合したヒトＩｇＧ１−ＨＣ定常領域（Ｆｃ断片）（その各々がポリグリシンを介して連結された２つの同一のペプチド配列と残基２２８において共有結合している）から構成される「ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）」）、Ｐｅｇ−ＴＰＯｍｐ（ペグ化ＴＰＯペプチドアゴニスト）、経口投与可能なＴＰＯアゴニスト、ＴＰＯ非ペプチド模倣物、ＡＫＲ−５０１、モノクローナルＴＰＯアゴニスト抗体、ポリクローナルＴＰＯアゴニスト抗体、ＴＰＯミニボディ、例えばＶＢ２２Ｂ ｓｃ（Ｆｖ）２、ドメインサブクラス変換ＴＰＯアゴニスト抗体、例えばＭＡ０１Ｇ４Ｇ３４４、組換えヒトトロンボポエチン、または組換えＴＰＯ融合タンパク質、ＴＰＯ非ペプチド模倣物。ＴＰＯが本発明の一実施形態としてどの場面で使用されても、例示的なＴＰＯアゴニストは本発明のさらなる実施形態においてＴＰＯの代用になり得る。
別の態様では、本開示は、巨核球から血小板を生成するための方法を提供し、この方法は、ａ）巨核球または巨核球前駆体の非接着性培養物を提供するステップ、ｂ）巨核球または巨核球前駆体を、造血拡大増殖培地を含む組成物と接触させて、培養において前血小板の形成を引き起こすステップであって、この前血小板が血小板を放出するステップ、およびｃ）血小板を単離するステップを含む。
例示的な実施形態では、実質的に全ての単離された血小板が機能的である。例示的な実施形態では、巨核球または巨核球前駆体の非接着性培養物は、フィーダーフリーの培養物である、および／または異種細胞を含まない。したがって、本開示は、フィーダー細胞なしに血小板を生成するための方法を提供する。
ステップ（ｂ）における培養は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、ＲＯＣＫインヒビター、例えばＹ２７６３２および／またはヘパリンのうち１つまたは複数を含む培地中で実施され得る。ステップ（ｂ）における培養は、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＲＯＣＫインヒビター、例えばＹ２７６３２、および／またはヘパリンのうち１つまたは複数を含む培地中であり得る。
一実施形態では、造血拡大増殖培地は、ＳｔｅｍＳｐａｍ（商標）ＡＣＦ（ＡＣＦ）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．から入手可能）を含み、ＴＰＯ（トロンボポエチン）またはＴＰＯアゴニスト、ＳＣＦ（幹細胞因子）、ＩＬ−６（インターロイキン６）およびＩＬ−９（インターロイキン９）をさらに含み得、これはＳｔｅｍＳｐａｍ（商標）ＣＣ２２０サイトカインカクテル（ＣＣ２２０）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．から入手可能）として提供され得る。この造血拡大増殖培地は、ＲＯＣＫインヒビターおよび／またはヘパリンを任意選択で含み得る。ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−９およびＩＬ−１１は、公知の巨核球発達因子および成熟化因子である（Ｓｔａｓｉら、Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２４巻（２０１０年）１７９〜１９０頁）。
一実施形態では、造血拡大増殖培地は、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ−ＩＩ造血幹細胞拡大増殖培地（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ−ＩＩ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）を含み、ＴＰＯまたはＴＰＯアゴニスト、ＳＣＦおよびＩＬ−１１をさらに含み得る。この造血拡大増殖培地は、ＲＯＣＫインヒビターおよび／またはヘパリンを任意選択で含み得る。このＲＯＣＫインヒビターは、Ｙ２７６３２であり得るがこれに限定されない。
別の一実施形態では、造血拡大増殖培地は、基本培地としてのイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ヒト血清アルブミン（組換えまたは精製）、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ｂ−メルカプトエタノール、可溶性低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）およびコレステロール（これは、本明細書で限定成分培地と呼ばれ得る）を含み、ＴＰＯまたはＴＰＯアゴニスト、ＳＣＦおよびＩＬ−１１をさらに含み得る。この造血拡大増殖培地は、ＲＯＣＫインヒビターおよび／またはヘパリンを任意選択で含み得る。このＲＯＣＫインヒビターは、Ｙ２７６３２であり得るがこれに限定されない。
別の一実施形態では、この造血拡大増殖培地は、基本培地としてのイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ヒト血清アルブミン（組換えまたは精製）、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ｂ−メルカプトエタノール、可溶性低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）およびコレステロール（これは、本明細書で限定成分培地と呼ばれ得る）を含み、ＴＰＯ（トロンボポエチン）またはＴＰＯアゴニスト、ＳＣＦ（幹細胞因子）、ＩＬ−６（インターロイキン６）およびＩＬ−９（インターロイキン９）をさらに含み得る。この造血拡大増殖培地は、ＲＯＣＫインヒビターおよび／またはヘパリンを任意選択で含み得る。
ステップ（ｂ）における培養は、上述の段落のＡＣＦ、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ−ＩＩまたは限定成分培地、ならびに（１）ＳＣＦ（例えば、０．５〜１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（例えば、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（例えば、５〜２５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−９（例えば、５〜２５ｎｇ／ｍｌ）およびヘパリン（例えば、２．５〜２５単位／ｍｌ）のうち１つまたは複数；（２）ＴＰＯ（例えば、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（例えば、０．５〜１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（例えば、５〜２５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−９（例えば、５〜２５ｎｇ／ｍｌ）、Ｙ２７６３２（例えば、５μＭ、または任意選択で２〜２０μＭ、または任意選択で有効濃度の別のＲＯＣＫインヒビター）およびヘパリン（例えば、０．５〜２５単位／ｍｌ）のうち１つまたは複数；（３）ＴＰＯ（例えば、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（例えば、０．５〜１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１１（例えば、５〜２５ｎｇ／ｍｌ）、Ｙ２７６３２（例えば、５μＭまたは任意選択で２〜２０μＭ、または任意選択で有効濃度の別のＲＯＣＫインヒビター）およびヘパリン（例えば、２．５〜２５単位／ｍｌ）のうち１つまたは複数；あるいは（４）ＴＰＯ（例えば、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（例えば、０．５〜１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（例えば、５〜２５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−９（例えば、５〜２５ｎｇ／ｍｌ）、Ｙ２７６３２（例えば、５μＭまたは任意選択で２〜２０μＭ、または任意選択で有効濃度の別のＲＯＣＫインヒビター）およびヘパリン（例えば、２．５〜２５単位／ｍｌ）のうち１つまたは複数を含む培地中で実施され得る。
この方法は、巨核球を剪断力に供するステップをさらに含み得る。
この方法は、巨核球１個当たり少なくとも２個、３個、４個もしくは５個の血小板、巨核球１個当たり少なくとも２０個、３０個、４０個もしくは５０個の血小板、または巨核球１個当たり少なくとも１００個、５００個、１０００個、２０００個、５０００個もしくは１００００個の血小板を生じ得る。
前記血小板の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、ＣＤ４１ａ＋およびＣＤ４２ｂ＋であり得る。
血小板は、フィーダー細胞または間質フィーダー細胞の非存在下で生成され得る。
血小板は、任意の異種細胞の非存在下で生成され得る。
血小板はヒトのものであり得る。
血小板は、ＣＤ４１ａ＋および／またはＣＤ４２ｂ＋であり得る。
別の態様では、本開示は、（ａ）多能性幹細胞を培養して、造血性内皮細胞（ＰＶＥ−ＨＥ）を形成するステップ；および（ｂ）造血性内皮細胞を培養して、巨核球前駆体（ＭＬＰ）を形成するステップによって生成され得る巨核球前駆体（本明細書でＭＬＰとも呼ばれる）（例えば、血小板を生成する方法においてまたは別の目的のために利用されるもの）を生成する方法を提供する。ステップ（ａ）は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ヒト血清アルブミン、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ｂ−メルカプトエタノール、可溶性低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、コレステロール、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ）から構成される動物成分フリーの培地の存在下で実施され得る。ステップ（ｂ）は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ハムＦ−１２栄養混合物、Ａｌｂｕｃｕｌｔ（ｒｈアルブミン）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、リノール酸、ＳｙｎｔｈｅＣｈｏｌ（合成コレステロール）、モノチオグリセロール（ａ−ＭＴＧ）、ｒｈインスリン−トランスフェリン−セレン−エタノールアミン溶液、タンパク質フリーハイブリドーマ混合物ＩＩ（ＰＦＨＭＩＩ）、アスコルビン酸２ホスフェート、Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉ（Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン）、ペニシリン／ストレプトマイシン、２５ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）（例えば、２５ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬ）（例えば、２５ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）およびヘパリン（例えば、５単位／ｍｌ）中で実施され得る。
別の一態様では、本開示は、実施例１および２に示されるように、（ａ）多能性幹細胞を培養して、造血性内皮細胞（ＰＶＥ−ＨＥ）を形成するステップ；（ｂ）造血性内皮細胞を培養して、ＭＬＰを形成するステップ；および（ｃ）ＭＬＰを培養して、巨核球を形成するステップによって生成され得る巨核球（例えば、血小板を生成する方法においてまたは別の目的のために利用されるもの）を生成する方法を提供する。ステップ（ａ）および（ｂ）は、上述の段落に記載したように実施され得る。ステップ（ｃ）は、基本培地としてのイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ヒト血清アルブミン、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ｂ−メルカプトエタノール、可溶性低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、コレステロール、ＴＰＯ（例えば、３０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（例えば、１ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（例えば、７．５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−９（例えば、１３．５ｎｇ／ｍｌ）、ならびに任意選択でＲＯＣＫインヒビター、例えば、これに限定されずＹ２７６３２（例えば、５μＭ）および／またはヘパリン（例えば、５〜２５単位／ｍｌ）中で実施され得る。
別の一態様では、本開示は、上記方法によって生成された血小板を含む医薬調製物を提供する。この調製物は、ヒト患者における使用に適切であり得、および／または少なくとも１０８個の血小板を含み得、および／または白血球を実質的に含まなくてもよい。
別の一態様では、本開示は、それを必要とする患者または凝固に影響する疾患もしくは障害に罹患している患者の処置のための医薬の製造における、本明細書に記載されるかまたは本明細書に記載される任意の方法によって生成された任意の組成物の血小板の使用を提供する。
別の一態様では、本開示は、血小板輸血を必要とする患者を処置する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるかまたは本明細書に記載される任意の方法によって生成された任意の組成物の血小板をこの患者に投与するステップを含み、これは、凝固および／もしくは他の血小板機能に影響する疾患もしくは障害、ならびに／または血小板減少症もしくは外傷などの、それによって処置され得る別の障害を処置するのに有効な量であり得る。血小板減少症は、血小板の生成、分布または破壊における乱れから生じる。血小板減少症は、肝硬変、ＨＩＶ感染、自己免疫性疾患、特発性血小板減少性紫斑病、化学療法誘発性の骨髄機能抑制および骨髄障害を含む種々の医学的状態において頻繁に見出される。低い血小板計数は、出血のリスクの増加と関連している。それによって処置され得るさらなる例示的な疾患または障害は、マラリアおよび他の寄生生物感染症であり、理論に束縛されることは意図しないが、これは、寄生生物の消化胞を選択的に溶解させることによって赤血球内のマラリア寄生生物を死滅させるヒト血小板因子４の能力によって媒介されると考えられている（その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＬｏｖｅら、Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ １２巻（６号）：８１５〜２３頁を参照のこと）。
別の一態様では、本開示は、薬物送達の方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるかまたは本明細書に記載される任意の方法によって生成された任意の組成物の血小板をこの患者に投与するステップを含み、この血小板が薬物を送達する。例えば、そのｉｎ ｖｉｖｏ寿命、投与後の生着の欠如、およびホーミング特性に起因して、血小板は、薬物担体として有用であり得ると考えられる。ｈＥＳＣ、ｈｉＰＣおよびＭＬＰは遺伝子改変され得、疾患の処置のための所望の薬物を発現する血小板を生成するために使用され得る。一態様では、ｈＥＳＣ、ｈｉＰＣまたはＭＬＰは、抗腫瘍剤を発現するように遺伝子改変され得る。かかる遺伝子改変されたｈＥＳＣ、ｈｉＰＳＣおよびＭＬＰから生成された血小板は、新生物疾患の処置のために腫瘍にかかる抗腫瘍剤を送達するために使用され得る。
本発明の血小板は、受動的様式（経時的な血小板からの拡散）または能動的様式（血小板の活性化および脱顆粒の際に放出される）のいずれかで血小板によって放出される１種または複数の治療剤を含むように操作され得る。広範な薬物が使用され得る。操作された血小板は、シナプスおよび神経効果器接合部位において作用する薬物；中枢神経系に対して作用する薬物；炎症応答をモジュレートする薬物；腎機能および／もしくは心血管機能に影響する薬物；胃腸機能に影響する薬物；抗生物質；抗がん剤；免疫調節剤；血液および／もしくは血液形成性器官に対して作用する薬物；ホルモン；ホルモンアンタゴニスト；石灰化および骨のターンオーバーに影響する薬剤、ビタミン、遺伝子治療剤；または標的化剤などの他の薬剤などからなる群から選択される１種または複数の化合物を含むように調製され得る。
ある特定の実施形態では、血小板は、例えば、血小板の顆粒（例えばα−顆粒）中に貯蔵され得、好ましくは、血小板の活性化の際に放出され得る１種または複数の治療剤、例えば小分子薬物、アプタマーもしくは他の核酸薬剤、または組換えタンパク質を含むように操作されている。
ある特定の実施形態では、血小板は、正常な創傷治癒を促進もしくは加速する外因性薬剤、瘢痕を低減させる外因性薬剤、線維症を低減させる外因性薬剤１種もしくは複数、またはそれらの組合せを含む。
ある特定の実施形態では、血小板は、１種または複数の外因性抗線維症剤を含む。抗血栓剤／抗再狭窄剤を送達するように操作された血小板は、血管形成および血栓溶解手順の間に使用され得る。ある特定の実施形態では、操作された血小板は、アテローム動脈硬化症の重症度を予防または低減するために使用され得る。ある特定の実施形態では、操作された血小板は、再狭窄の重症度を予防または低減するために使用され得る。なお他の実施形態では、操作された血小板は、固形腫瘍の処置の一環として使用され得る。操作された血小板は、１種または複数の免疫刺激剤を含み得る。
本開示のさらなる一態様は、β２ミクログロブリン発現を欠損するように操作された細胞、例えばβ２ミクログロブリンノックアウト多能性細胞から血小板を生成するための本明細書に開示された任意の方法の使用を含む、β２ミクログロブリン欠損血小板、例えば、低減された免疫原性のまたは「ユニバーサル」な血小板を生成する方法を提供する。本開示は、β２ミクログロブリンの発現を欠くβ２ミクログロブリン欠損血小板、巨核球または血小板前駆体もまた提供する。β２ミクログロブリン欠損血小板は一般に、その原形質膜中に存在する、低いかまたは好ましくは検出不能なクラスＩ ＭＨＣ分子を有し、それによって血小板の免疫原性を低減させる。
別の一態様では、巨核球またはＭＬＰから血小板を生成するための方法が提供され、この方法は、プロテアーゼインヒビターの存在下で、剪断力条件下で、ＭＬＰの巨核球の非接着性集団を培養するステップ、およびこの培養物から血小板を回収し、任意選択で単離するステップを含む。
プロテアーゼインヒビターはＭＭＰインヒビターであり得る。
剪断力条件は一定の剪断力条件であり得る。剪断力条件は、１〜４．１ダイン／ｃｍ２の剪断力を含み得る。
巨核球またはＭＬＰは、マイクロ流体デバイス中で培養され得る。
巨核球またはＭＬＰは、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、または天然に存在するＣＤ３４＋細胞、任意選択で骨髄もしくは臍帯血ＣＤ３４＋細胞から誘導され得る。
プロテアーゼインヒビターはＭＭＰインヒビター、例えばＧＭ６００１であり得る。
プロテアーゼインヒビターはＭＭＰ８特異的インヒビター、例えばＭＭＰ８−Ｉ（（３Ｒ）−（＋）−［２−（４−メトキシベンゼンスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−ヒドロキサメート］）であり得る。
プロテアーゼインヒビターは２種またはそれより多くのプロテアーゼインヒビターであり得る。
２種のプロテアーゼインヒビターは、ＭＭＰ一般的（汎）インヒビターおよびＭＭＰ８特異的インヒビターであり得る。
プロテアーゼインヒビターが、培養物内の血小板のピーク生成の時点で添加され得る。
巨核球またはＭＰＬは、ＴＰＯまたはＴＰＯアゴニストの存在下で培養されて、前血小板の形成を引き起こし得、この前血小板は血小板を放出する。巨核球またはＭＰＬは、造血拡大増殖培地、および任意選択で（１）ＴＰＯもしくはＴＰＯアゴニスト、ＳＣＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−９または（２）ＴＰＯもしくはＴＰＯアゴニスト、ＳＣＦおよびＩＬ−１１中で培養されて、培養において前血小板の形成を引き起こし得、この前血小板は血小板を放出する。
巨核球またはＭＰＬは、３７℃よりも高く４０℃と等しいかまたはそれより低い温度で培養され得る。
巨核球またはＭＰＬは約３９℃の温度で培養され得る。
別の態様では、巨核球またはＭＰＬから血小板を生成するための方法であって、３７℃よりも高く４０℃と等しいかまたはそれより低い温度でｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞から誘導された巨核球またはＭＰＬの非接着性集団を培養するステップ、およびこの培養物から血小板を回収し、任意選択で単離するステップを含む方法が提供される。
巨核球またはＭＰＬは約３９℃の温度で培養され得る。
別の態様では、ＰＶＥ−ＨＥ細胞からＭＰＬを生成するための方法であって、ＢＥＴのインヒビターの存在下でｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞から誘導されたＰＶＥ−ＨＥ細胞の集団を培養するステップ、およびこの培養物からＭＰＬを回収し、任意選択で単離するステップを含む方法が提供される。
ＢＥＴのインヒビターはＩ−ＢＥＴ１５１であり得る。
ＢＥＴのインヒビターは、培養の最後の４８時間、最後の３６時間、最後の２４時間、最後の１８時間、最後の１２時間または最後の６時間において、ＰＶＥ−ＨＥ細胞に添加され得る。
別の態様では、ＰＶＥ−ＨＥ細胞からＭＰＬを生成するための方法であって、ｃ−ｍｙｃサプレッサーまたはインヒビターの存在下でｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞から誘導されたＰＶＥ−ＨＥ細胞の集団を培養するステップ、およびこの培養物からＭＰＬを回収し、任意選択で単離するステップを含む方法が提供される。
ｃ−ｍｙｃサプレッサーまたはインヒビターは、培養の最後の４８時間、最後の３６時間、最後の２４時間、最後の１８時間、最後の１２時間または最後の６時間において、ＰＶＥ−ＨＥ細胞に添加され得る。
多能性幹細胞からの血小板の生成を示す段階的プロセス。この図は、多能性幹細胞からの、多能性由来造血性内皮細胞（ＰＶＥ−ＨＥ）を介し、巨核球系列特異的前駆細胞（ＭＬＰ）を介し、巨核球（ＭＫ）を介した、分化の進行を示す。
高度分化形態細胞（ＡＤＭ）を介したｉＰＳ細胞の分化の進行。この図は、ＰＶＥ−ＨＥへ向けたｉＰＳ細胞の進行を示す。図２Ａ、４８時間後、付着した細胞は、フィーダーフリー条件下で典型的な多能性幹細胞形態を示す。図２Ｂ、多能性幹細胞形態から点在する小さい細胞クラスターへのほぼ完全な推移が示される。図２Ｃ、ＰＶＥ−ＨＥ分化開始の９６〜１４６時間後、単層の上で増殖している小さいコンパクトな細胞クラスターを示す、高度分化形態が観察された。
図３。高度分化形態のＰＶＥ−ＨＥの特徴付け。この図は、ＰＶＥ−ＨＥへ分化したＡＤＭ細胞の表現型および形態を示す。ＡＤＭ細胞は、分化のこの段階において、ＰＶＥ−ＨＥ表現型ＣＤ３１＋ＣＤ１４４（ＶＥ−Ｃａｄ）＋ＣＤ１０５＋を示す（図３Ａ）。ＡＤＭ細胞をまた、形態変化についても分析した（図３Ｂ）。 図３。高度分化形態のＰＶＥ−ＨＥの特徴付け。この図は、ＰＶＥ−ＨＥへ分化したＡＤＭ細胞の表現型および形態を示す。ＡＤＭ細胞は、分化のこの段階において、ＰＶＥ−ＨＥ表現型ＣＤ３１＋ＣＤ１４４（ＶＥ−Ｃａｄ）＋ＣＤ１０５＋を示す（図３Ａ）。ＡＤＭ細胞をまた、形態変化についても分析した（図３Ｂ）。
フローサイトメトリーによる、ｉＰＳ−ＰＶＥ−ＨＥ由来巨核球系列特異的前駆体（ＭＬＰ）の特徴付け。この図は、ヒトｉＰＳ−ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ細胞の表現型をＣＤ３４＋ＣＤ３１＋ＣＤ４１ａ＋ＣＤ４３＋ＣＤ１３＋ＣＤ１４−ＣＤ４２ｂ−／＋として示す。
ヒトｉＰＳ−ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ由来の成熟中のＭＫ細胞の形態分析。この図は、ＭＫ細胞の内側の核（「Ｎ」によって示される）、および容易に観察可能な、伸長した仮足を有する前血小板形成性細胞（矢印によって示される）を示す。血小板分化の開始の７２時間後、非常に大きい倍数性ＭＫ（５０μＭ）は、成熟化の進行を伴って豊富になった（図５ＡおよびＢ。５Ａ中のスケールバーは１００μＭであり、５Ｂ中のＮはＭＫの内側の核を示す）。７２〜９６時間から、伸長した仮足を有する前血小板形成性細胞が、顕微鏡により容易に観察された（図５Ａおよび５Ｃ、矢印によって示される）。
図６Ａ〜Ｅ。異なる供給源由来の血小板調製物の表現型および純度の比較。この図は、形態ならびに末梢血由来ヒト血小板およびｉＰＳ−ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ−ＭＫ由来血小板上のＣＤ４１ａおよびＣＤ４２ｂの細胞表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。開始後７２〜９６時間の間、ＣＤ４１ａ＋ＣＤ４２ｂ＋血小板の量は劇的に増加し、約７０％もの高いレベルに達した（図６Ｄ）。図６Ａ〜６Ｂは、ドナー由来ヒト血小板（６Ａ）および実施例３に記載したように生成したｈＥＳ由来血小板（ｈＥＳ−ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ）（６Ｂ）についての、前方散乱（「ＦＳＣ−Ａ」）および側方散乱（「ＳＳＣ−Ａ」）を示す。図６Ｃ〜Ｅは、ドナー由来ヒト血小板（６Ｃ）、ｉＰＳ由来血小板（ｉＰＳ−ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ）（６Ｄ）およびｈＥＳ由来血小板（ｈＥＳ−ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ）（６Ｅ）によるＣＤ４１ａおよびＣＤ４２Ｂの発現を示し、後者の２つの試料は、実施例３に記載したように生成した。
透過型走査顕微鏡による、末梢血由来ヒト血小板およびヒト人工多能性細胞の分化によって生成された血小板（ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴ）の超微細構造的比較。この図は、末梢血由来ヒト血小板および本開示のｈｉＰＳＣ−ＰＬＴの細胞特徴における類似性を示す。ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴは円盤状である。
末梢血由来ヒト血小板（ｈＰＲＰ）およびｈｉＰＳＣ−ＰＬＴの比較。この図は、血小板直径（左パネル）、ならびに活性化で誘発された血小板形状変化に関与する細胞構造タンパク質ベータ１−チューブリンおよびＦ−アクチンの発現（ＦＩＴＣ−ファロイジン結合を介する）（右パネル）における、２つの細胞調製物間の類似性を示す。陰性Ｈｏｅｃｈｓｔ染色（右上）により、ｉＰＳＣ−ＰＬＴおよびドナー由来ＰＬＴにおける核ＤＮＡの非存在が確認された。
末梢血由来ヒト血小板およびｈｉＰＳＣ−ＰＬＴの比較。この図は、微分干渉（ＤＩＣ）生細胞顕微鏡を使用して、末梢血由来ヒト血小板および本開示のｈｉＰＳＣ−ＰＬＴの形態的特徴における類似性を示す。末梢血由来ヒト血小板およびｈｉＰＳＣ−ＰＬＴの両方が、負に荷電したガラス表面に結合したときの活性化を示す仮足放出を示す。
末梢血由来ヒト血小板およびｈｉＰＳＣ−ＰＬＴの比較。この図は、トロンボスポンジン４（ＴＳＰ４）および血小板因子４（ＰＦ４）標識化によって実証されるように、アルファ−顆粒発現の類似性を示す。ＴＳＰ４およびＰＦ４は、活性化された血小板のアルファ−顆粒から放出されるケモカインである。ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴ（図１０Ｂ）は、ＴＳＰ４およびＰＦ４の標識化によって実証されるように、正常なヒト血小板（図１０Ａ）と比較して、正常なアルファ−顆粒発現を有することがわかった。
ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴの機能的評価。この図は、２種の接着分子ＣＤ６２ｐおよびαＩＩｂβＩＩＩの上方調節によって測定されるように（ＰＡＣ−１ Ａｂによって測定されるように）、トロンビンによるｈｉＰＳＣ−ＰＬＴのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化を示す。
循環ヒト血小板ならびにヒトｉＰＳＣおよびＥＳＣから誘導された血小板の機能的比較。この図は、循環ヒト血小板、ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴおよびｈＥＳＣ−ＰＬＴのｉｎ ｖｉｖｏ血餅形成潜在力を示す。実験は、天然ヒト血小板（「ｈＰＬＴ」）、ｉＰＳＣ−ＰＬＴおよびｈＥＳ細胞由来血小板（「ｈＥＳＣ−ＰＬＴ」）を用いて実施した。図１２Ａは、マウス血管壁傷害モデルにおいて形成された血栓の代表的画像を示す。図１２Ｂは、各実験において血栓に結合した血小板の平均数をグラフにより示す。血小板結合は、抗αＩＩｂβＩＩＩ抗体断片ＲｅｏＰｒｏによる処理によって阻害された。これは、結合が予測されたようにαＩＩｂβＩＩＩに依存したことを示している（図１２Ｂ）。
注入後のマクロファージ除去ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＰＬＴの動態。この図は、８時間のｈｉＰＳＣ−ＰＬＴおよびｈＥＳＣ−ＰＬＴの検出可能な循環を示す。
多能性幹細胞からの血小板の生成のための例示的なプロセスフローダイヤグラム。 多能性幹細胞からの血小板の生成のための例示的なプロセスフローダイヤグラム。 多能性幹細胞からの血小板の生成のための例示的なプロセスフローダイヤグラム。 多能性幹細胞からの血小板の生成のための例示的なプロセスフローダイヤグラム。 多能性幹細胞からの血小板の生成のための例示的なプロセスフローダイヤグラム。
ＦＡＣＳ分析（ＣＤ４１ａ、ＣＤ４２ｂ）−ｈｉＰＳＣから誘導されたＭＬＰ。
ｈｉＰＳＣから誘導された代表的ＭＬＰ。
ＦＡＣＳ分析（ＣＤ３１＋、ＣＤ４３＋）−ｈｉＰＳＣから誘導されたＭＬＰ。
ｈＥＳＣから誘導された代表的ＭＫ。
ＭＫからの前血小板形成。
ＦＡＣＳ分析（ＣＤ４１ａ、ＣＤ４２ｂ）。
β１−チューブリン染色と共にＤＩＣ顕微鏡法、ヒトドナーＰＬＴ（上）ｈＥＳＣ−ＰＬＴ（下）。
一定の剪断力培養条件下で、ＤＭＳＯ（菱形）、ＭＭＰインヒビターＧＭ６００１（四角）、ならびにＧＭ６００１および８％デキストラン（「粘度」と称する）（三角）の存在下での、時間の関数として血小板純度。ｘ軸は試料番号に対応し、試料は、６＋時間の培養にわたって、３０分毎に取り出した。
一定の剪断力培養条件下で、ＤＭＳＯ（菱形）、ＭＭＰインヒビターＧＭ６００１（四角）、ならびにＧＭ６００１および８％デキストラン（「粘度」と称する）（三角）の存在下での、時間の関数としての血小板数。ＧＭ６００１は０日目に培養物に添加した。
一定の剪断力培養条件下でのＤＭＳＯ（左の棒）およびＭＭＰインヒビターＧＭ６００１（中央の棒）の存在下、ならびに静置培養条件下（ＭＭＰインヒビターＧＭ６００１の非存在下）（右の棒）での、血小板数。
１２マイクロリットル／分の流速（四角）および１６マイクロリットル／分の流速（三角）で、マイクロ流体デバイス中におけるＭＭＰインヒビターＧＭ６００１の存在下での時間の関数としての血小板純度。ＭＭＰインヒビターはＤＭＳＯ中に溶解されるので、対照（菱形）はＤＭＳＯの存在下である。
流速の関数としての血小板数。左の棒：１２マイクロリットル／分、右の棒：１６マイクロリットル／分。
ＭＭＰ８特異的インヒビターＭＭＰ８−Ｉ（第２の棒）、汎ＭＭＰインヒビターＧＭ６００１（第３の棒）、またはＭＭＰ８−ＩおよびＧＭ６００１の組合せ（第４の棒）の存在下での静置培養の結果としての血小板純度。ＭＭＰ８−Ｉは、（３Ｒ）−（＋）−［２−（４−メトキシベンゼンスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−ヒドロキサメート］であり、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社から市販されている。第１の棒は対照である。
ＭＭＰ８特異的インヒビターＭＭＰ８−Ｉ（第２の棒）、汎ＭＭＰインヒビターＧＭ６００１（第３の棒）、またはＭＭＰ８−ＩおよびＧＭ６００１の組合せ（第４の棒）の存在下での静置培養の結果としての血小板数。第１の棒は対照である。
３７℃（対の左の棒）および３９℃（対の右の棒）での培養における、時間の関数としての血小板純度。温度は、培養の開始時に設定し、培養を通じて維持した。
３７℃（対の左の棒）および３９℃（対の右の棒）での培養における、時間の関数としての血小板数。
６＋４日目（即ち、分化の１０日目）において回収した、漸増用量のｉＢＥＴ−１５１（μＭ）の関数としての巨核球前駆体（ＭＬＰ）数。ｉＢＥＴを、６＋３日の時間枠において培養物に添加し、ＭＬＰを、その回収の前に約２４時間の期間にわたってｉＢＥＴに曝露させる。ｉＢＥＴ濃度：０（左の棒）、０．１マイクロＭ（中央の棒）、０．２５マイクロＭ（右の棒）。
漸増用量のｉＢＥＴ−１５１の関数としての、６＋４日目のｃ−ｍｙｃおよびＧＡＴＡ−１のｍＲＮＡの相対的定量分析。ｉＢＥＴ濃度：各三つ組について、０（左の棒）、０．１マイクロＭ（中央の棒）、０．２５マイクロＭ（右の棒）。
漸増用量のｉＢＥＴ−１５１の関数としての、６＋４日目に回収された細胞集団におけるＣＤ１４＋細胞の純度。ｉＢＥＴ濃度：０（左の棒）、０．１マイクロＭ（中央の棒）、０．２５マイクロＭ（右の棒）。
発明の詳細な説明
本開示において使用する定義および略号のリストは、詳細な説明の最後に提供する。
上述のように、血小板の供給における制約は、輸血に依存する患者にとって、生命を脅かす結果を潜在的に有し得る。多能性細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで無制限に繁殖され得、ヒト治療のための血小板の、潜在的に無尽蔵のドナーなしの供給源を提示する。マッチしたまたは低減された不適合性を有するｈＥＳＣ株のバンクを創出する能力は、免疫抑制薬および／または免疫調節プロトコールの必要性を、潜在的に減少させるまたは排除することができた。例示的な実施形態は、患者特異的ｉＰＳ細胞を（例えば、本明細書に記載される方法または当技術分野で公知の任意の他の方法を使用して）生成するステップ、およびこの患者特異的ｉＰＳ細胞から患者特異的血小板を生成するステップを含む方法を提供し、この血小板は、血小板同種免疫を発達させた患者またはそれを発達させるリスクがある患者などの患者の処置のために使用され得る。
例示的な実施形態は、血清フリーおよびフィーダーフリー条件下で多能性幹細胞から巨核球（ＭＫ）を生成するための効率的な方法を提供する。好ましくは、ＭＫは、巨核球系列特異的前駆細胞（ＭＬＰ、これは、本明細書にさらに記載される）から生成される。好ましくは、ＭＫは、米国特許第８０１７３９３号に開示されているもののような血管芽細胞または血管コロニー形成細胞（ｈｅｍａｎｇｉｏ−ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌ）からは生成されない。本明細書に開示される方法を使用して、多能性幹細胞（ｉＰＳＣおよびＥＳＣ）を、ＭＫ分化に向けて方向付けた。ＭＬＰからの巨核球の分化の効率は、非常に高くなっていた（最大９０％）。さらなる精製なしに、ＭＫ懸濁培養物由来の生細胞の８５％は、ＣＤ４１ａ＋ＣＤ４２ｂ＋であり、成熟ＭＫは、ＣＤ２９＋およびＣＤ６１＋でもあった。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導されたＭＫ細胞は、核内分裂を起こすことができ、成熟した倍数体ＭＫになることができる。重要なことに、伸長した仮足を有する前血小板形成性細胞は、ＭＫ培養の後期段階で観察された。これは、この系において生成されたＭＫは、フィーダーフリー条件下で最終分化を起こすことができ、機能的血小板を生成できることを示している。
制御された条件下で、ｉＰＳＣまたは他の多能性幹細胞を供給源細胞として使用した、大規模かつ効率的なｉｎ ｖｉｔｒｏ巨核球生成に適合可能な効率的な系が、本明細書に記載される。さらに、血小板は、ドナー由来血小板に対する必要性を補完するまたはそれに取って代わるのに十分な量で、生成され得る。さらに、開示される方法は、予測可能な様式で血小板および血小板前駆細胞を生成するために利用され得、その結果、この細胞は、「オンデマンド」で、または予想された必要性を満たすのに望ましい量で、生成され得る。この細胞は、ＣＤ４１ａおよびＣＤ４２ｂを発現し、核内分裂を起こして、成熟倍数体ＭＫを形成した。さらなる成熟化の際に、これらは、トロンビンによって刺激されて細胞接着分子ＣＤ６２ｐおよびαＩＩｂβＩＩＩについて陽性になった（活性化の際のαＩＩｂβＩＩＩのコンフォメーション変化後のＰＡＣ−１結合部位の露出によって生じると考えられるが、ＣＤ６２ｐは顆粒放出に起因して外側膜上に露出されると考えられる）、機能的または活性化された血小板を生成した。これらのマーカーは両方とも、活性化された血小板の表面上に発現されることが公知であり、ＰＡＣ−１およびＣＤ６２ｐ（ｐ−セレクチン）結合アッセイを使用して、ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴ上で検出された。間質インデューサー細胞は巨核球生成に必要とされないので、本明細書に記載される方法は、フィーダーフリーの血小板生成、例えば、異種細胞のいずれの使用も伴わない血小板生成を提供し得る。
例示的な実施形態では、エストラジオール、ビタミンＢ３、マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター（ＭＭＰ）、ｃ−ｍｙｃ発現のインヒビター、および細胞外マトリックスタンパク質を含むさらなる因子もまた、血小板生成を増強するために使用され得（例えば、巨核球成熟化を刺激することおよび／または血小板生成を刺激することによって）、これは間質細胞の非存在下で実施され得る。
血清フリーおよび間質フリー条件下での巨核球の生成は、十分に規定された条件下で巨核球形成および血小板新生を調節することにおいて重要な因子についてのスクリーニングを可能にし得る。そうして同定された因子は、臨床適用に寄与し得る。この分野での進歩は、系列の傾倒、拡大増殖および成熟化を含む、巨核球形成の異なる態様を調節する細胞機構および分子機構に関する洞察を提供する可能性もまたあり得る。
例示的な実施形態は、多能性幹細胞からの巨核球分化の段階的誘発を統合する。進行中の制御のさらなる最適化および確立が、臨床適用のためにこの系の一貫性および効率を改善するために実施され得る。巨核球成熟化を調節する、根底の細胞機構または細胞外機構は、これらの方法を実施するために完全に規定される必要はない。倍数体化および細胞質成熟化を促進する他の因子が同定され、ｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導された巨核球の最終分化を促進するために含まれ得る。例えば、少なくとも１種のＲＯＣＫキナーゼインヒビターが、初期段階で巨核球の核内分裂を誘発するために使用され得る。しかし、この効果は、分化している巨核球の組織化された細胞および核の成熟化ではなく、染色体分配および細胞質分裂の人工的遮断に起因する可能性が高いと考えられる。規定された条件下での最も高いｉｎ ｖｉｔｒｏ巨核球収量、最終分化状況、および機能的血小板の下流の生成を達成するために拡大増殖と核内分裂と細胞質成熟化との間のバランスに達することが有利であり得る。
これらの現在の結果は、多能性幹細胞から誘導された血小板が、正常な血液血小板の形態的特性および機能的特性を共有することを実証した。これらの多能性幹細胞由来ヒト血小板は、ｉｎ ｖｉｖｏでも機能できる。
さらなる血行力学的事象が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系によって完全には模倣することができない生きた生物における血小板血栓の生成および繁殖の間に生じ得る。生体内画像化技術の利用可能性は、複雑なｉｎ ｖｉｖｏ系において脈管傷害後に生じる血小板依存的な血栓性プロセスを直接的に試験および定量するための手段を提供する。生体内高速広視野顕微鏡を使用して、本発明者らは、多能性幹細胞由来血小板は、正常なヒト血液血小板と同様に、生きたマウス中のレーザー誘発性の細動脈壁傷害の部位において発達しているマウス血小板血栓中に取り込まれることを実証した。ＲｅｏＰｒｏによる多能性細胞由来血小板および対照血小板の事前処理は、血栓中に取り込まれている供与された血小板および多能性幹細胞由来血小板の両方の数を顕著に低減させ、この結合がαＩＩｂβＩＩＩインテグリンによって媒介されることが確認された。これらの結果は、多能性幹細胞由来血小板が、生きた動物における脈管傷害の部位において機能的であることを示す。
血小板は、脈管傷害に応答して組織にかつ互いに接着する無核細胞である。このプロセスは、いくつかの接着性基質、例えば、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）およびフィブリノーゲンに結合して、成長中の血栓において血小板を架橋しさらに活性化する、血小板インテグリンαＩＩｂβＩＩＩによって主に媒介される（３６）。本明細書の結果は、多能性幹細胞から生成された血小板が、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび生きた動物の両方において、正常な血液血小板と機能的に類似していることを実証する。多能性幹細胞由来血小板は、生理学的アゴニストで刺激された時に凝集する能力を含む、止血に関与する重要な機能を有することが示された。さらに、免疫蛍光および透過型電子顕微鏡の結果は、多能性幹細胞から生成された血小板が、正常な血液血小板と類似していることをさらに実証している。
以下の例にさらに記載するように、多能性細胞由来血小板と精製された正常ヒト血小板との間の多数の類似性が観察された。これらの類似性には以下が含まれる。
ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴは円盤状である（透過型電子顕微鏡によって実証されるように）。
ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴは、循環ヒトＰＬＴと大部分は超微細構造的に同一である（透過型電子顕微鏡によって実証されるように）。
ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴのサイズは、ＤＩＣおよびβ１−チューブリンＩＦ顕微鏡によって実証されるように、循環ヒトＰＬＴのサイズに匹敵する（２．３８μｍ±０．８５μｍ対２．２７μｍ±０．４９μｍ）
ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴは、ＤＩＣ生細胞顕微鏡画像によって実証されるように、ガラス上に伸展することができ、糸状仮足および葉状仮足の両方を形成することができた。
ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴは無核である−循環ヒトＰＬＴと同等である（Ｈｏｅｃｈｓｔ標識化によって実証されるように）。
ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴは、循環ヒトＰＬＴと比較して、正常なチューブリン細胞骨格を有する（β１−チューブリン標識化によって実証されるように）。
ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴは、循環ヒトＰＬＴと比較して、正常な線維状アクチンを有する（ファロイジン標識化によって実証されるように）。
ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴは、循環ヒトＰＬＴと比較して、正常なアルファ−顆粒発現を有する（ＴＳＰ４およびＰＦ４の標識化によって実証されるように）。
別の科学的および臨床的な問題は、多能性幹細胞由来血小板が複雑なｉｎ ｖｉｖｏ環境において機能的であるかどうかである。いくつかのグループによって近年使用されているレーザー傷害血栓症モデルを含む多数の実験モデルが、マウスにおいて血栓形成を調査するために過去１０年間に確立された（３７：３８：３９）。レーザー誘発性の血栓症モデルは、傷害の５〜３０秒後に早くも血小板血栓形成を開始する。したがって、このモデルは、迅速に排除されるヒト血小板およびｈＥＳＣ−ＰＬＴの、発達中のマウス血小板血栓中へのリアルタイム取り込みのモニタリングを可能にし、これは、多数のシグナル伝達経路、酵素カスケード、ならびに無数の細胞成分およびタンパク質成分の相互作用を含む。このモデルは、トロンビン誘発性血栓症と関連する炎症反応もまた反映する。
レーザー誘発性脈管傷害モデルを使用して、生体内顕微鏡分析により、ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴおよびｈＥＳＣ−ＰＬＴが、血液血小板と同様、脈管傷害後にαＩＩｂβＩＩＩインテグリンを介して発達中のマウス血小板血栓中に取り込まれることが実証されている（図１２Ａ）。ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴおよびｈＥＳＣ−ＰＬＴの機能的能力は、αＩＩｂβＩＩＩに特異的に結合して血小板機能を阻害するヒト−マウスキメラモノクローナル抗体のＦａｂ断片ＲｅｏＰｒｏによる事前処理によって、αＩＩｂβＩＩＩによって媒介されることが決定された（図１２Ｂ）。これらの結果は、ｈＥＳＣ−ＰＬＴが脈管傷害の部位においてｉｎ ｖｉｖｏで機能的であるという証拠を提供する。重要なことに、血清フリー条件およびフィーダーフリー条件下で多能性幹細胞から誘導された血小板は、凝血および血栓形成をｉｎ ｖｉｖｏで促進することができることが最初に示された。
２つの以前の研究が、ｈＥＳＣからのＭＫの生成を報告している。これらの系における収量は非常に低く、本発明の系とは異なり、血清を補充した動物間質細胞との共培養に依存する（１５、１６）。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでの機能性は報告しなかった（１５、１６）。多能性幹細胞分化におけるこれら２つの変数の排除は、動物生成物への曝露なしでの血小板の生成を可能にする。さらに、本開示は、本明細書に記載されるフィーダーフリーの系が高い効率でＭＫを生成できること、および機能的な血小板がフィーダーフリー条件下で効率的に生成され得ることを実証している。
血小板新生は、膜および微小管の洗練された再編成ならびに顆粒およびオルガネラの正確な分布を伴う、高度に複雑なプロセスである（４０）。血小板生合成の理解における最近の進歩にもかかわらず、膜再編成、前血小板の開始、血小板オルガネラおよび分泌顆粒の輸送ならびに血小板サイズの制御の根底にある機構的詳細は、未だ解明されていない。血清およびフィーダーフリー条件下でＭＫを生成する能力は、十分規定された条件下で、系列の傾倒、拡大増殖および成熟化を含む巨核球形成の異なる態様を調節することにおいて重要な因子のスクリーニングを助けるはずである。
本開示は、ｉＰＳ由来またはＥＳＣ由来であるＰＶＥ−ＨＥ細胞、ＭＬＰ、ＭＫ、前血小板および血小板をｉｎ ｖｉｔｒｏ（またはｅｘ ｖｉｖｏ）で生成するための種々の方法を提供する。
本開示は、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞からＰＶＥ−ＨＥ細胞へ、またはＭＬＰへ、またはＭＫへ、または血小板へと推移させるための方法を提供する。本開示は、ＰＶＥ−ＨＥ細胞からＭＬＰへ、またはＭＫへ、または血小板へと推移させるための方法を提供する。本開示は、ＭＬＰからＭＫへ、または血小板へと推移させるための方法を提供する。本開示は、ＭＫから血小板へと推移させるための方法を提供する。これらの種々の培養は、以下に簡潔に記載される。
ＰＶＥ−ＨＥ細胞は、基本培地としてのイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ヒト血清アルブミン、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ｂ−メルカプトエタノール、可溶性低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、コレステロールを含み、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ）をさらに含む培養培地中でｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞を培養するステップを含む方法を介して、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞から生成され得る。この培養期間は、平均して６日間持続し得る。
ＭＬＰは、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ハムＦ−１２栄養混合物、Ａｌｂｕｃｕｌｔ（ｒｈアルブミン）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、リノール酸、ＳｙｎｔｈｅＣｈｏｌ（合成コレステロール）、モノチオグリセロール（ａ−ＭＴＧ）、ｒｈインスリン−トランスフェリン−セレン−エタノールアミン溶液、タンパク質フリーハイブリドーマ混合物ＩＩ（ＰＦＨＭＩＩ）、アスコルビン酸２ホスフェート、Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉ（Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン）、ペニシリン／ストレプトマイシンを含み、幹細胞因子（ＳＣＦ）（例えば、２５ｎｇ／ｍｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）（例えば、２５ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬ）（例えば、２５ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）および任意選択でヘパリン（例えば、５単位／ｍｌ）をさらに含む培養培地中でＰＶＥ−ＨＥ細胞を培養するステップを含む方法を介して、ＰＶＥ−ＨＥ細胞から生成され得る。この培養期間は、平均して３〜４日間持続し得る。最後の４８時間、最後の３６時間、最後の２４時間、最後の１８時間、最後の１２時間または最後の６時間を含む培養の後半で、ＢＥＴのインヒビターが、培養物に、好ましくは細胞毒性未満のレベルで添加され得る。これらの培養物から回収されたＭＬＰは、血小板生成またはその他分析のために凍結保存されてもよいし、または直ぐに使用されてもよい。
巨核球は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ヒト血清アルブミン、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ｂ−メルカプトエタノール、可溶性低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、コレステロールを含み、ＴＰＯ（例えば、３０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（例えば、１ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（例えば、７．５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−９（例えば、１３．５ｎｇ／ｍｌ）ならびに任意選択で、ＲＯＣＫインヒビター、例えばＹ２７６３２（例えば、５μＭ）および／またはヘパリン（例えば、５〜２５単位／ｍｌ）をさらに含む培地中でＭＬＰを培養するステップを含む方法を介して、ＭＬＰから生成され得る。
巨核球は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ヒト血清アルブミン、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ｂ−メルカプトエタノール、可溶性低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、コレステロールを含み、ＴＰＯ（例えば、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（例えば、０．５〜１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１１（例えば、５〜２５ｎｇ／ｍｌ）ならびに任意選択で、ＲＯＣＫインヒビター、例えばＹ２７６３２（例えば、５μＭ）および／またはヘパリン（例えば、２．５〜２５単位／ｍｌ）のうち１種または複数をさらに含む培地中でＭＬＰを培養するステップを含む方法を介して、ＭＬＰから生成され得る。
この後者の培養は、培養の長さに依存して、ＭＫおよび血小板を生成する。血小板は、典型的には、培養の約３〜４日目までに観察される。この培養期間の間、ＭＬＰはＭＫへと成熟化しており、ＭＫは前血小板へと成熟化しており、前血小板は血小板へと成熟化していると理解される。
したがって、血小板は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ヒト血清アルブミン、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ｂ−メルカプトエタノール、可溶性低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、コレステロールを含み、ＴＰＯ（例えば、３０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（例えば、１ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（例えば、７．５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−９（例えば、１３．５ｎｇ／ｍｌ）ならびに任意選択で、ＲＯＣＫインヒビター、例えばＹ２７６３２（例えば、５μＭ）および／またはヘパリン（例えば、５〜２５単位／ｍｌ）をさらに含む培地中でＭＬＰまたはＭＫを培養するステップを含む方法を介して、ＭＬＰまたはＭＫから生成され得る。これらの培養期間は、４〜８日間の長さまたはそれより長くであり得る。
血小板は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ヒト血清アルブミン、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ｂ−メルカプトエタノール、可溶性低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、コレステロールを含み、ＴＰＯ（例えば、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（例えば、０．５〜１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１１（例えば、５〜２５ｎｇ／ｍｌ）ならびに任意選択で、ＲＯＣＫインヒビター、例えばＹ２７６３２（例えば、５μＭ）および／またはヘパリン（例えば、２．５〜２５単位／ｍｌ）のうち１種または複数をさらに含む培地中でＭＬＰまたはＭＫを培養するステップを含む方法を介して、ＭＬＰまたはＭＫから生成され得る。
これらの血小板生成法は、静置培養条件または剪断力培養条件下でのＭＬＰまたはＭＫの培養を含む。静置培養条件は、培養されている細胞と接触する培養培地が、比較的静的である培養条件である。剪断力培養条件は、培養されている細胞と接触する培養培地の意図的な一定の動きを含む培養条件である。剪断力はダイン／ｃｍ２で測定される。一部の例では、この剪断力は、骨髄の造血環境において生じる剪断力に近い。ＢＭ類洞における剪断力は、約１．３〜４．１ダイン／ｃｍ２であると報告されている。本開示は、剪断力培養が、約１〜約４．５ダイン／ｃｍ２、または約１．３〜約４．１ダイン／ｃｍ２の範囲の剪断力、例えば、その間の任意の力または任意の範囲の力、例えば、約１．５、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０および約４．１ダイン／ｃｍ２で実施され得ることを企図する。
培養は、かかる剪断力を生じる流速で実施され得ることが理解される。所与の培養について、剪断力は、流速（容量／時間）と関連する。剪断力は、当技術分野の知識を使用して、任意の所与の培養物または培養デバイスについて、流速の知識を用いて決定され得る。本明細書に提供される実験結果の一部は、１２マイクロリットル／分および１６マイクロリットル／分の流速での、所与のマイクロ流体デバイスにおける血小板生成を比較している。一部の例では、流速は、５〜２５マイクロリットル／分の範囲内、または１０〜２０マイクロリットル／分以内であり得る。一部の例では、流速は、１０〜１５マイクロリットル／分の範囲内であり得、他の例では、１６〜２０マイクロリットル／分の範囲内であり得る。
剪断力培養が使用される場合、この血小板生成法は、３〜４日間または血小板が観察されるまでの静置培養での第１の培養期間と、その後の、マイクロ流体デバイスまたは剪断力を誘発することが可能な他のデバイスなどの剪断力環境中での第２の培養とを含み得る。
一定分量がかかる培養物から回収され、血小板計数について測定され得ることを理解すべきである（例えばＦＡＣＳを使用して）。これにより、ピーク血小板生成の期間が同定される。
血小板生成法は、ＭＬＰおよびＭＫの混合物を出発材料として有するか、またはＭＬＰおよびＭＫの混合物を、培養期間の間のいくつかの時点においてその培養培地中に含む場合が多いこともまた、理解すべきである。
本開示は、マイクロ流体デバイスまたは剪断力条件が達成され得る他の培養デバイス中でＭＬＰまたはＭＫが培養されることを企図する。一部の例では、このデバイスは、ＭＬＰまたはＭＫが、このデバイス内で固定化されるがこのデバイスに付着しないように設計される。一部の例では、このデバイスは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはジメチコンなどの合成樹脂で製造される。これらは、マイクロ流体デバイスおよびチップにおいて一般に使用される。
本開示は、血小板が剪断力培養条件を使用して生成される場合に、特定のプロテアーゼインヒビターが培養物に添加されるとき、より良い血小板の収量および機能性が得られることをさらに企図する。本開示によって、血小板が剪断力下に置かれた場合、細胞表面ＣＤ４２ｂが血小板表面から喪失され得、血小板の活性を低くすることが見出された。これを回避し、剪断培養の利益をなおも得るために、本開示は、ＣＤ４２ｂの剪断または喪失を防止するプロテアーゼインヒビターを使用することを企図する。かかるインヒビターの例には、メタロプロテアーゼインヒビターおよびより具体的にはマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）インヒビターが含まれる。剪断培養において使用され得るインヒビターの別の例は、プラスミノーゲン活性化因子インヒビターである。これらのインヒビターは、汎インヒビターであり得、これは、単一のインヒビターが、そのクラス内の１種よりも多くのおよび場合によっては全てのプロテアーゼを阻害し得ることを意図する。あるいは、これらは特異的インヒビターであり得、これは、単一のインヒビターが、そのクラス内の１種のプロテアーゼを完全にまたは大部分阻害することを意図する。
一部の例では、培養は、ＭＭＰインヒビターの存在下で実施される。インヒビターは、例えば、有機小分子、抗体または抗体断片、アンチセンスまたはＲＮＡｉ核酸などの小分子であり得る。
ＭＭＰインヒビターの例としては、以下が含まれるがこれらに限定されない：ＧＭ６００１（汎インヒビター）、Ｎ−ダンシル−Ｄ−フェニルアラニン、４−エピ−クロルテトラサイクリン、ピリドキサチン塩酸塩（Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ Ｐｙｒｉｄｏｘａｔｉｎ）、ＡＲＰ１００、ＡＲＰ １０１、バチマスタット、クロルヘキシジン，二塩酸塩、シス−ＡＣＣＰ、ＣＬ８２１９８塩酸塩、ミノサイクリン，塩酸塩、アレンドロネート，ナトリウム塩、ＧＭ １４８９、ＴＡＰＩ−１、ＴＡＰＩ−２、ＧＭ ６００１、マリマスタット、ＭＭＰインヒビターＩＩ、ＭＭＰインヒビターＩＩＩ、ＥＧＴＡ、ＭＭＰインヒビターＶ、ＭＭＰ−１３インヒビター、ＭＭＰ−２インヒビターＩ、ＭＭＰ−２インヒビターＩＩ、ＣＰ ４７１４７４、ＭＭＰ−２／ＭＭＰ−３インヒビターＩ、ＭＭＰ−２／ＭＭＰ−３インヒビターＩＩ、ＭＭＰ−２／ＭＭＰ−９インヒビターＩ、ＭＭＰ−２／ＭＭＰ−９インヒビターＩＩ、ＭＭＰ−２／ＭＭＰ−９インヒビターＶ．エコチン、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＭＭＰ−３インヒビター、ＭＭＰ−３インヒビターＩＩＩ、ＭＭＰ−３インヒビターＩＶ、アクチノニン、ＭＭＰ−３インヒビターＶ、ＭＭＰ−３インヒビターＶＩＩＩ、ＭＭＰ−７アンチセンスオリゴヌクレオチド、ナトリウム塩、ＭＭＰ−８インヒビターＩ、ＭＭＰ−９インヒビターＩ、ＭＭＰ−９／ＭＭＰ−１３インヒビターＩ、ＭＭＰ−９／ＭＭＰ−１３インヒビターＩＩ、ＮＮＧＨ、ＮＳＣ ２３７６６、ＰＤ１６６７９３、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙヒドロキサメート塩酸塩、Ｒｏ ３２−３５５５、ＰＦ−３５６２３１、ＳＢ−３ＣＴ、ホスホラミドン、ＷＡＹ １７０５２３、ＵＫ ３７０１０６、ＵＫ ３５６６１８、塩化バリウム二水和物（ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、ルテオリン、イソババカルコン（Ｉｓｏｂａｖａｃｈａｌｃｏｎｅ）、ドキシサイクリンヒクレート、コラゲナーゼインヒビターＩ、ｏ−フェナントロリンおよびＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．のＴＡＰＩ−０。これらには、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、ＴＩＭＰ−４、ＧＭ６００１、メチルプレドニゾロン、バチマスタット、マリマスタット、プリノマスタット、ＢＡＹ １２−９５６６、ＭＭＩ２７０（Ｂ）、ＢＭＳ−２７５２９１、メタスタット（ｍｅｔａｓｔａｔ）およびＭＭＰ−１〜ＭＭＰ−２６の他のインヒビターもまた含まれる。ＭＭＰインヒビターは、１種のＭＭＰファミリーメンバーのみを阻害してもよいし、または１種よりも多いもしくは全てのＭＭＰファミリーメンバーを阻害してもよいことを理解すべきである。
特定の合成ＭＭＰインヒビターは一般に、ＭＭＰ活性部位における触媒的亜鉛原子に緊密に結合するキレート基を含む。一般的なキレート基には、ヒドロキサメート、カルボキシレート、チオールおよびホスフィニルが含まれる。
他のＭＭＰインヒビターには、ＢＢ−９４、Ｒｏ ３２−３５５５、ＢＢ−１１０１、ＢＢ−２５１６、ＳＥ２０５、ＣＴ１７４６、ＣＧＳ ２７０２３Ａ、ＡＧ３３４０、ＢＡＹ １２−９５６６、Ｄ２１６３、Ｄ１９２７、ＰＮＵ−１４２３７２、ＣＭＴ−１およびアクチノニンが含まれる。
多くのＭＭＰインヒビターが市販されている。
当技術分野では、ＭＭＰインヒビターが熟知されており、さらなる例は、その各々が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８７７，８０５号；第５，８３７，２２４号；第６，３６５，６３０号；第６，６３０，５１６号；第６，６８３，０６９号；第６，９１９，０７２号；第６，９４２，８７０号；第７，０９４，７５２号；第７，０２９，７１３号；第６，９４２，８７０号；第６，９１９，０７２号；第６，９０６，０３６号；第６，８９０，９３７号；第６，８８４，４２５号；第６，８５８，５９８号；第６，７５９，４３２号；第６，７５０，２３３号；第６，７５０，２２８号；第６，７１３，０７４号；第６，６９９，４８６号；第６，６４５，４７７号；第６，６３０，５１６号；第６，５４８，６６７号；第６，５４１，４８９号；第６，３７９，６６７号；第６，３６５，６３０号；第６，１３０，２５４号；第６，０９３，３９８号；第５，９６２，４６６号；第５，８３７，２２４号；第７，７０５，１６４号；第７，７８６，３１６号；第８，００８，５１０号；第７，５７９，４８６号；第８，３１８，９４５号；および第７，１７６，２１７号；公開米国特許出願第２００７００３７２５３号；第２００６０２９３３４５号；第２００６０１７３１８３号；第２００６００８４６８８号；第２００５００５８７０９号；第２００５００２０６０７号；第２００５０００４１７７号；第２００４０２３５８１８号；第２００４０１８５１２７号；第２００４０１７６３９３号；第２００４００６７８８３号；第２００４００４８８５２号；第２００４００３４０９８号；第２００４００３４０８６号；第２００４００３４０８５号；第２００４００２３９６９号；第２００４００１９０５５号；第２００４００１９０５４号；第２００４００１９０５３号；第２００４０００６１３７号；第２００４０００６０７７号；第２００３０２１２０４８号；第２００３０００４１６５号；第２００２０１９８１７６号；第２００２０１７７５８８号；第２００２０１６９３１４号；第２００２０１６４３１９号；第２００２０１０６３３９号；第２００２００６１８６６号；第２００２００５４９２２号；第２００２００４９２３７号；第２００２００１０１６２号；第２００１００３９２８７号；および第２００１００１４６８８号；ならびに公開されたＰＣＴ出願ＷＯ ０２／０６４５５２、ＷＯ ０５／１１０３３９９、ＷＯ ０６／０２８５２３、ＷＯ２００８／０２４７８４、ＷＯ ０２／０６４５５２、ＷＯ ０５／１１０３９９、ＷＯ ０６／０２８５２３、ＷＯ０１／６２２６１およびＷＯ２００８／０２４７８４において提供される。
ＭＭＰインヒビターは、科学文献中にも記載されており、例えば、ＷｈｉｔｔａｋｅｒらＣｈｅｍ Ｒｅｖ． ９９巻：２７３５〜２７７６頁、１９９９年；ＷｈｉｔｔａｋｅらＣｅｌｌｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｓ １７巻（１号）：３〜１４頁（表ＡＢ）およびＨａｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ６巻：４２６〜４２７頁、２００７年（表ＡＣ）を参照されたいが、その具体的な教示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかのＭＭＰインヒビターは以下であり得る。
一部の例では、ＭＭＰ８インヒビター、例えば特異的ＭＭＰ８インヒビターが、静置培養または剪断力培養において使用され得る。一部の例では、このＭＭＰ８インヒビターは、天然に存在するＭＬＰおよびＭＫ、例えば、骨髄または臍帯血由来のＭＬＰ（例えば、ＣＤ３４＋前駆細胞）またはＭＫの培養において使用され得る。
ＭＭＰ８特異的インヒビターの一例は、化学名（３Ｒ）−（＋）−［２−（４−メトキシベンゼンスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−ヒドロキサメート］を有するＭＭＰ８−Ｉであり、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから市販されている。
一部の例では、このプロテアーゼインヒビターは、プラスミノーゲン活性化因子インヒビターであり得る。プラスミノーゲン活性化因子インヒビターの例には、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター１（ＰＡＩ−１）、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター２（ＰＡＩ−２）および組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）インヒビターが含まれるがこれらに限定されない。他のプラスミノーゲン活性化因子インヒビターには、その各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９２３、８０７号；国際ＰＣＴ出願ＷＯ／１３０６３３３１；ＷＯ／１３１６９７４；および参考文献Ｆｏｒｔｅｎｂｅｒｒｙ ＹＭ． Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ： ａ ｐａｔｅｎｔ ｒｅｖｉｅｗ （２００６−ｐｒｅｓｅｎｔ）． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｐａｔ． ２０１３年７月；２３巻（７号）：８０１〜１５頁；およびＰａｎｎｅｋｏｅｋら、ＥＭＢＯ Ｊ． １９８６年；５巻（１０号）：２５３９〜４４頁に記載されるものが含まれる。
一部の例では、２種以上のプロテアーゼインヒビターが、培養物中で一緒に使用され得る。一例として、ＭＭＰインヒビターＧＭ６００１は、ＭＭＰ８特異的インヒビターＭＭＰ８−Ｉと一緒に使用され得る。
一部の例では、培養は、３７℃を上回る温度で実施され得る。培養温度は、３７℃〜４５℃の範囲内、または３７℃〜４２℃の範囲内、または３８℃〜４１℃の範囲内、または３９℃〜４０℃の範囲内、または約３９℃もしくは約４０℃であり得る。培養は、設定された温度で実施される。３７℃を上回る温度での培養は、本明細書で昇温培養と呼ぶ。
一部の例では、ＰＶＥ−ＨＥ細胞からＭＬＰを生成する方法は、ＢＥＴファミリーのブロモドメイン含有タンパク質のインヒビターの存在下で実施される。ＢＥＴインヒビターは、ＢＥＴファミリーメンバーを阻害する任意の分子または化合物であり得、核酸、例えばＤＮＡおよびＲＮＡアプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ、小ペプチド、抗体または抗体断片、ならびに小分子、例えば、小さい化学物質化合物であり得る。ＢＥＴインヒビターは、少なくとも１つのＢＥＴファミリーメンバーのブロモドメインの、タンパク質のアセチル−リシン残基への結合を防止または低減させ得る。ＢＥＴインヒビターは、１種のＢＥＴファミリーメンバーのみを阻害してもよいし、または１種よりも多くのもしくは全てのＢＥＴファミリーメンバーを阻害してもよいことを理解すべきである。
ＢＥＴインヒビターの例は、参照によって本明細書に組み込まれる、ＵＳ ２０１１１４３６５１、ＷＯ２００９／０８４６９３Ａ１、ＷＯ ２０１１１４３６６９、ＷＯ ２０１１１４３６６０、ＷＯ ２０１１０５４８５１およびＪＰ ２００８１５６３１１に記載されている。
当技術分野で公知のＢＥＴインヒビターの例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：ＲＶＸ−２０８（Ｒｅｓｖｅｒｌｏｇｉｘ）、ＰＦＩ−１（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）、ＯＴＸ０１５（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｔａｎａｂｅ Ｐｈａｒｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＢｚＴ−７、ＧＳＫ５２５７６２Ａ（ｉＢＥＴ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＪＱ１（Ｃｅｌｌ ２０１１年１４６巻（６号）：９０４〜１７頁）および以下の化合物（ＷＯ ２０１１０５４８５１、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）：
一部の実施形態では、ＢＥＴインヒビターは、ＢＥＴファミリーメンバー（例えば、ＢＲＤ１、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤ７、ＢＲＤＴ；ＷＯ２０１１１４３６６９を参照のこと）の第１のブロモドメインの結合ポケットに結合する小分子化合物（例えば、ＪＱ１またはその誘導体）である。他のＢＥＴインヒビターには、ＪＱ１Ｓ、ＪＱ１Ｒ、ＪＱ２０、ＪＱ８、ＪＱ６、ＪＱ１３、ＪＱ１９、ＪＱ１８、ＪＱ１１、ＪＱ２１、ＪＱ２４ＢおよびＫＳ１が含まれる。
ＢＥＴインヒビター（本明細書でｉＢＥＴと呼ぶ）の別の例は、ＧＳＫ１２１０１５１Ａ（本明細書でＩ−ＢＥＴ−１５１と呼ぶ）である。他のＢＥＴインヒビターには、ＩＢＥＴ１５１およびＩＢＥＴ７６２が含まれる。
多くのＢＥＴインヒビターは、抗白血病剤として有用である。本開示の方法において使用する場合、これらは、典型的には低濃度（即ち、その細胞毒性効果が観察されるレベル未満）で使用される。
本開示は、ＢＥＴインヒビターが、ＰＶＥ−ＨＥ細胞をＭＬＰに分化（または成熟化）させる培養期間の間に使用されることを企図する。この培養期間は、通常は約４日間持続する。ＢＥＴインヒビターは、典型的には、培養の最後の４８時間、最後の３６時間、最後の２４時間、最後の１２時間または最後の６時間を含む、培養の後半に添加される。
Ｍｙｃインヒビターには、１００５８−Ｆ４およびＣＸ−３５４３が含まれる。
巨核球系列前駆体
本開示の種々の実施形態は、多能性幹細胞（ヒトｉＰＳおよびヒトＥＳを含む）から巨核球系列前駆体（ＭＬＰ）を生成する方法、ならびにＭＬＰの組成物を提供する。
初期系列造血性内皮細胞はＣＤ４１ａ陰性であり、造血前駆体への後期段階造血性分化の間にＣＤ４１ａを発現する。ＣＤ４２ｂは、成熟巨核球において排他的に発現される。ＭＬＰ培養物は、高い割合のＣＤ４１＋細胞および低い割合のＣＤ４２＋細胞を伴って、不均一であり得る。
ＭＬＰは、ＦＡＣＳ分析によって、ＣＤ４１ａおよびＣＤ４２ｂ二重陽性細胞の百分率について評価され得る。ＣＤ４１ａは、フィブリノーゲン受容体（αＩＩｂβＩＩＩ）のサブユニットであり、ＣＤ４２ｂは、フォン・ヴィルブランド因子受容体（ＧＰＩｂ−Ｖ−ＩＸ）上のサブユニットである。両方の受容体の発現は、巨核球系列に特異的であり、両方とも、血小板機能に必要とされると考えられる。
凍結保存のための回収前に、ＭＬＰは、付着細胞のおよその百分率および低い核対細胞質比を有する分化した大きい細胞の程度について評価され得る。付着細胞は、明確なコロニー境界を有さない拡散コロニーとして表れ得る。付着細胞集団の上に静止している豊富な浮遊ＭＬＰが存在し得る。生存浮遊ＭＬＰは、最小の複屈折で、平滑な細胞膜によって境界が定められて、明確に見え得る。
ＭＬＰおよびその組成物は、任意選択で、凍結保存組成物として提供され得る。
別の一実施形態では、本開示は、細胞分化のモジュレーターについてスクリーニングする方法を提供し、この方法は、ある量のＰＶＥ−ＨＥ細胞または巨核球前駆体（ＭＬＰ）を提供するステップ；このＰＶＥ−ＨＥ細胞またはＭＬＰを試験化合物と接触させるステップ；このＰＶＥ−ＨＥ細胞またはＭＬＰとこの試験化合物との間の接触からの機能的影響の存在または非存在を決定するステップを含み、機能的影響の存在は、この試験化合物が細胞分化をモジュレートする巨核球形成因子、血小板新生因子および／または造血因子であることを示し、機能的影響の非存在は、この試験化合物が細胞分化をモジュレートする巨核球形成因子、血小板新生因子および／または造血因子ではないことを示す。他の実施形態では、巨核球形成因子、血小板新生因子および／または造血因子は、機能的血小板の拡大増殖、核内分裂、細胞質成熟化および最終分化に関連する。
巨核球
本開示の種々の実施形態は、間質フリー条件下および／または血清フリー条件下で多能性幹細胞（ヒトｉＰＳおよびヒトＥＳを含む）から巨核球を生成する方法を提供する。これらの実施形態は、巨核球を生成するステップを含む。さらなる実施形態は、多能性由来造血性内皮細胞から巨核球を生成する方法を提供する。前記巨核球は、好ましくは、血小板を生成できる（例えば、本明細書に記載される条件下で培養した場合）。
一実施形態では、この方法は、多能性幹細胞を提供するステップ；および多能性幹細胞を巨核球に分化させるステップを含む。一実施形態では、多能性幹細胞はヒト細胞である。別の一実施形態では、多能性幹細胞は、ＮＥＤ７株などの、胚の破壊なしに任意選択で生成されたｈＥＳＣである。別の一実施形態では、多能性細胞はヒトＥＳ細胞である。別の一実施形態では、巨核球は、人工多能性幹細胞から誘導される。別の一実施形態では、多能性幹細胞は、体細胞を再プログラミングすることから誘導されたヒトｉＰＳ細胞である。一実施形態では、体細胞は、胎仔組織由来である。別の一実施形態では、体細胞は、成体組織由来である。
別の一実施形態では、本開示は、細胞分化のモジュレーターについてスクリーニングする方法を提供し、この方法は、ある量の巨核球（ＭＫ）を提供するステップ；このＭＫを試験化合物と接触させるステップ；およびこのＭＫとこの試験化合物との間の接触からの機能的影響の存在または非存在を決定するステップを含み、機能的影響の存在は、この試験化合物が細胞分化をモジュレートする巨核球形成因子、血小板新生因子および／または造血因子であることを示し、機能的影響の非存在は、この試験化合物が細胞分化をモジュレートする巨核球形成因子、血小板新生因子および／または造血因子ではないことを示す。他の実施形態では、巨核球形成因子、血小板新生因子および／または造血因子は、機能的血小板の拡大増殖、核内分裂、細胞質成熟化および最終分化に関連する。
血小板
本開示の他の実施形態は、ヒト胚性幹細胞および多能性幹細胞（ｉＰＳＣおよびヒトｉＰＳＣを含む）から血小板を生成する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を提供するステップ；ＰＶＥ−ＨＥ細胞を巨核球に分化させるＰＶＥ−ＨＥ細胞を形成するステップ；および巨核球を血小板に分化させるステップを含む。
別の一実施形態では、血小板を生成する方法は、ＰＶＥ−ＨＥ細胞を提供するステップ；ＰＶＥ−ＨＥ細胞をＭＬＰまたは巨核球に分化させるステップ；および任意選択で、ＭＬＰを巨核球に分化させるステップ；ならびに次いで、典型的には前血小板ステップを介して、巨核球を血小板に分化（または成熟化）させるステップを含む。ＰＶＥ−ＨＥ細胞を巨核球に分化させるプロセスは、上記のように実施され得る。一実施形態では、ＰＶＥ−ＨＥ細胞は、ヒトＥＳ細胞から誘導される。別の一実施形態では、ＰＶＥ−ＨＥ細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から誘導される。一実施形態では、ｉＰＳ細胞は、体細胞を再プログラミングすることから誘導されたヒトｉＰＳ細胞である。一実施形態では、体細胞は、胎仔組織由来である。別の一実施形態では、体細胞は、成体組織由来である。種々の実施形態では、巨核球を血小板に分化させるプロセスは、巨核球を血小板に分化させるために、巨核球を培養し続けるステップを含む。種々の実施形態では、巨核球を血小板に分化させるプロセスは、フィーダーフリー条件下であり、巨核球系列特異的前駆細胞から分化した巨核球を収集するステップを含む。
さらなる実施形態では、血小板は、ＭＫ−Ｍ培地中、または基本培地としてのイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ヒト血清アルブミン、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ｂ−メルカプトエタノール、可溶性低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、コレステロール、ＴＰＯ（例えば、３０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（例えば、１ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（例えば、７．５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−９（例えば、１３．５ｎｇ／ｍｌ）、ならびに任意選択で、ＲＯＣＫインヒビター、例えばＹ２７６３２（例えば、５μＭ）および／もしくはヘパリン（例えば、５〜２５単位／ｍｌ）を含む他の培地中における巨核球培養の４日目〜１０日目に収集される。好ましい一実施形態では、血小板は、ＭＫ−Ｍ培地中の巨核球培養物中における前血小板形成性細胞の最初の出現の３〜５日後から収集される。ある特定の実施形態では、血小板は、密度勾配遠心分離を使用して精製される。さらなる実施形態では、この密度勾配遠心分離はＰｅｒｃｏｌｌ媒体を使用する。さらなる実施形態では、この密度勾配遠心分離はＢＳＡ／ＨＳＡ媒体を使用する。別の一実施形態では、この血小板精製法は、ＣＤ４１ａ陰性である粒子を分離する。別の一実施形態では、この血小板精製法は、ＣＤ４２ｂ陰性である粒子を分離する。別の一実施形態では、この血小板精製法は、細胞の生存度および形態学的完全性を保持する。他の実施形態では、血小板は、ＣＤ４１ａおよびＣＤ４２ｂを発現する。他の実施形態では、血小板は、トロンビン刺激に対して応答性である。別の一実施形態では、血小板は、フィブリノーゲンおよびフォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）表面上に伸展することができる。さらなる実施形態では、血小板は、ＰＡＣ−１結合およびインテグリン活性化の能力を有する。別の一実施形態では、血小板は、ミクロ凝集体を形成し、血餅の形成および退縮を促進する。別の一実施形態では、血小板は、アピラーゼおよび／またはＥＤＴＡの存在下では活性化されない。
本開示の種々の実施形態は、多能性幹細胞由来血小板を使用する方法を提供する。ある特定の実施形態では、多能性幹細胞由来血小板は、血小板輸血において使用される。この方法は、ある量の多能性幹細胞由来血小板を提供するステップ；およびこの量の多能性幹細胞由来血小板を、それを必要とする対象に投与するステップを含み得る。種々の実施形態では、多能性幹細胞由来血小板は、患者にマッチした血小板であり得る。別の一実施形態では、血小板は、ｉＰＳＣから誘導される。ある特定の一実施形態では、血小板は、ヒトｉＰＳ細胞から誘導される。他の実施形態では、血小板は、対象への血小板の投与の際に対象においてＨＬＡ同種免疫原性応答に寄与しない溶液中に貯蔵される。さらなる例示的な実施形態では、多能性幹細胞由来血小板は、白血球を実質的に含まなくてもよく、例えば、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満の白血球、好ましくは０．１％未満、０．００１％未満またはさらには０．０００１％未満を含む。さらなる例示的な実施形態は、調製物中に１０６個未満の白血球、より好ましくは、１０５個未満、１０４個未満またはさらには１０３個未満の白血球を含む、多能性幹細胞由来血小板の調製物を提供する。
さらなる例示的な実施形態は、少なくとも１０８個の血小板、より好ましくは少なくとも１０９個、少なくとも１０１０個または少なくとも１０１１個の血小板を含む組成物を提供する。
２２〜２４℃における本発明の血液バンク貯蔵条件を使用すると、ヒト血小板（アフェレシスによって収集した）の生存度および機能は、５日間のみにわたって維持され得る−限定的な貯蔵時間は、血小板の加齢および細菌増殖のリスクの増加に起因すると考えられる。本発明の方法によって生成された血小板は、バンクに保存された血小板よりも長い有効期限を有し、例えば、２２〜２４℃で少なくとも６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間またはさらには１５日間にわたって維持され得、ヒト患者において使用されるための適切な生存度を維持することが予測される。
ある特定の実施形態では、血小板は、単離後にまたは血小板生成をもたらす培養ステップの１つもしくは複数の間に、２２〜２４℃における、冷蔵下における（例えば、４℃）および／または凍結下における血小板貯蔵を延長させる１つまたは複数の薬剤で処理され得る。
例えば、本発明は、シアリダーゼ活性を低減させ、血小板生成物調製物における１種もしくは複数の細菌の増殖を（任意選択で）阻害する薬剤で血小板を処理すること、またはシアリダーゼ活性を低減させ、血小板生成物調製物における１種もしくは複数の細菌の増殖を（任意選択で）阻害する条件下で血小板を誘導することを企図する。この方法は、血小板生成物調製物をある量のシアリダーゼインヒビターと接触させ、それによって、シアリダーゼ処理された血小板生成物調製物を取得するステップを含み得る；ここで、シアリダーゼインヒビターに供されていない血小板生成物調製物と比較して、シアリダーゼ活性は低減され、１種または複数の細菌の増殖は阻害される。
阻害される細菌の型には、血小板生成物調製物中に一般に見出されるものが含まれる。かかる細菌の例には以下が含まれる：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｅｇｇｅｒｔｈｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ、Ｄｉｐｈｔｈｅｒｏｉｄ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍｎｉｇｅｎｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｖｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ ａｄｉａｃｅｎｓ、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ、（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ、Ｐｓｅｕｄｏｍｙｓ ｏｘａｌｉｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ（コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ、（Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｂｏｖｉｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｖｉｒｉｄａｎｓ）およびＹｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ。
本発明で使用され得るシアリダーゼインヒビターには、例えば以下が含まれる：フェチュイン、２，３−デヒドロ−２−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＤＡＮＡ）もしくはその薬学的に許容される塩；エチル（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−５−アミノ−４−アセトアミド−３−（ペンタン−３−イルオキシ）−シクロヘキサ−１−エン−１−カルボキシレート）；（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−４−グアニジノ−３−（プロパ−１−エン−２−イルアミノ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２，３−トリヒドロキシプロピル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−６−カルボン酸；（４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−５−アセトアミド−４−カルバミミダミド（ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏ）−６−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−メトキシプロピル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピラン−２−カルボン酸；および（１Ｓ，２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３−［（１Ｓ）−１−アセトアミド−２−エチル−ブチル］−４−（ジアミノメチリデンアミノ）−２−ヒドロキシ−シクロペンタン−１−カルボン酸、またはそれらの薬学的に許容される塩。
１種またはそれ以上のグリカン改変剤が、血小板に添加され得る。かかるグリカン改変剤には、例えば、ＣＭＰ−シアル酸、ＣＭＰ−シアル酸先駆体、ＵＤＰガラクトースまたはそれらの組合せが含まれる。一態様では、ＣＭＰ−シアル酸先駆体をＣＭＰ−シアル酸に変換する酵素もまた、血小板に添加され得る。
ある特定の実施形態では、血小板は、血小板の集団のクリアランスを低減させるのに有効な量の少なくとも１種のグリカン改変剤で処理され得る。一部の実施形態では、このグリカン改変剤は、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＵＤＰ−ガラクトース先駆体からなる群から選択される。一部の好ましい実施形態では、このグリカン改変剤はＵＤＰ−ガラクトースである。
ある特定の実施形態では、血小板は、ＧＰ１ｂ上に露出されたＧｌｃＮＡｃ残基の糖化をもたらす特定の糖分子で処理され得、それによって、血小板クリアランスを低減させ、血小板食作用を遮断し、血小板循環時間を増加させ、かつ／または血小板貯蔵時間を増加させる。
ある特定の実施形態では、血小板は、トレハロースまたは他の低分子量多糖で処理され得る。
ある特定の実施形態では、血小板は、プロテアーゼインヒビター、例えばマトリックスメタロプロテアーゼインヒビターで処理され得る。
一部の実施形態では、血小板のｉｎ ｖｉｖｏ循環時間は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１５０％、２００％またはそれより多く、増加させられる。
本発明の血小板は、少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約７日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間または少なくとも約２８日間にわたって、冷却貯蔵され得る。
さらに、培養物中の幹細胞から血小板を誘導することは、血小板および巨核球を事前順化する機会、ならびにさらには、血小板の有効期限を延長させ、冷蔵および／または凍結保存貯蔵後の収量および生存度を増強する様式で、幹細胞または巨核球などの前駆細胞を遺伝子改変する機会を提供する。例えば、ＭＫは、膜脂質比率、タンパク質グリコシル化パターン、ストレス誘発性タンパク質、１４−３−３ζ移行などに関与する遺伝子の発現のレベルの変更を有するように操作され得る。
さらなる一実施形態では、血小板は、機能的血小板である。さらなる一実施形態では、機能的血小板の百分率は、少なくとも約６０％であり、少なくとも約７０％であり、少なくとも約８０％であり、または少なくとも約９０％である。なおさらなる一実施形態では、機能的血小板は、２２〜３７℃で貯蔵した場合、少なくとも２日間にわたって活性である。
本開示は、本明細書に提供される方法に従って生成された血小板が、受動的様式（例えば、経時的に血小板から拡散し得る）または能動的様式（例えば、血小板の活性化および脱顆粒の際に放出される）のいずれかで血小板によって放出される１種または複数の治療剤を含むように操作され得ることを、さらに企図する。広範な薬物が使用され得、これらには、抗生物質、抗ウイルス剤、麻酔薬、ステロイド性薬剤、抗炎症剤、抗新生物剤、抗原、ワクチン、抗体、鬱血除去薬、降圧薬、鎮静薬、受胎調節剤、プロゲステロン剤、抗コリン薬、鎮痛薬、抗うつ薬、抗精神病薬、β−アドレナリン受容体遮断剤、利尿薬、心血管活性剤、血管作動性剤、非ステロイド性抗炎症剤、栄養剤などが含まれ得る。
例えば、操作された血小板は、以下からなる群から選択される１種または複数の化合物を含むように調製され得る：シナプスおよび神経効果器接合部位において作用する薬物（例えば、アセチルコリン、メタコリン、ピロカルピン、アトロピン、スコポラミン、フィゾスチグミン、サクシニルコリン、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、ドブタミン、イソプロテレノール、アルブテロール、プロプラノロール、セロトニン）；中枢神経系に対して作用する薬物（例えば、クロナゼパム、ジアゼパム、ロラゼパム、ベンゾカイン、ブピバカイン、リドカイン、テトラカイン、ロピバカイン、アミトリプチリン、フルオキセチン、パロキセチン、バルプロ酸、カルバマゼピン、ブロモクリプチン、モルヒネ、フェンタニル、ナルトレキソン、ナロキソン）；炎症応答をモジュレートする薬物（例えば、アスピリン、インドメタシン、イブプロフェン、ナプロキセン、ステロイド、クロモリンナトリウム、テオフィリン）；腎機能および／または心血管機能に影響する薬物（例えば、フロセミド、チアジド、アミロライド、スピロノラクトン、カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、ジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル、ジゴキシン、イソルジル（ｉｓｏｒｄｉｌ）、ドブタミン、リドカイン、キニジン、アデノシン、ジギタリス、メバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、メバロネート）；胃腸機能に影響する薬物（例えば、オメプラゾール、スクラルファート）；抗生物質（例えば、テトラサイクリン、クリンダマイシン、アンホテリシンＢ、キニーネ、メチシリン、バンコマイシン、ペニシリンＧ、アモキシシリン、ゲンタマイシン、エリスロマイシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、アシクロビル、ジドブジン（ＡＺＴ）、ｄｄＣ、ｄｄＩ、リバビリン、セファクロル、セファレキシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、クロラムフェニコール、イソニアジド、フルコナゾール、アマンタジン、インターフェロン）；抗がん剤（例えば、シクロホスファミド、メトトレキセート、フルオロウラシル、シタラビン、メルカプトプリン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ヒドロキシウレア、プレドニゾン、タモキシフェン、シスプラチン、ダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））；免疫調節剤（例えば、インターロイキン、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、シクロスポリン、ＦＫ５０６、アザチオプリン、ステロイド）；血液および／または血液形成性器官に対して作用する薬物（例えば、インターロイキン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、ビタミン、鉄、銅、ビタミンＢ１２、葉酸、ヘパリン、ワルファリン、クマリン）；ホルモン（例えば、成長ホルモン（ＧＨ）、プロラクチン、黄体形成ホルモン、ＴＳＨ、ＡＣＴＨ、インスリン、ＦＳＨ、ＣＧ、ソマトスタチン、エストロゲン、アンドロゲン、プロゲステロン、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、チロキシン、トリヨードサイロニン）；ホルモンアンタゴニスト；石灰化および骨のターンオーバーに影響する薬剤（例えば、カルシウム、ホスフェート、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ビタミンＤ、ビスホスホネート、カルシトニン、フッ化物）、ビタミン（例えば、リボフラビン、ニコチン酸、ピリドキシン、パントテン酸、ビオチン、コリン、イノシトール、カルニチン（ｃａｍｉｔｉｎｅ）、ビタミンＣ、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ）、遺伝子治療剤（例えば、ウイルスベクター、核酸保有リポソーム、ＤＮＡ−タンパク質コンジュゲート、アンチセンス剤）；または標的化剤などの他の薬剤。
ある特定の実施形態では、血小板は、１種または複数の治療剤、例えば小分子薬物、アプタマー（ａｐａｔａｍｅｒ）もしくは他の核酸薬剤、または組換えタンパク質を含むように操作されており、即ち、これらは、血小板の顆粒（例えばα−顆粒）中に貯蔵され得、好ましくは、血小板の活性化の際に、例えば、脈管傷害もしくは他の創傷、アテローム動脈硬化性プラークもしくは内皮細胞びらん、感染、または血小板活性化が可能な血栓形成促進性環境、例えば固形腫瘍の血管系、の部位において放出され得る。他の実施形態では、操作された血小板は、線維症の重症度を低減させるまたは線維症を予防するために、例えば、肺の線維症（即ち、肺線維症、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息および嚢胞性線維症からなる群から選択され得るもの）の処置などにおいて、使用され得る。
ある特定の実施形態では、血小板は、正常な創傷治癒を促進もしくは加速する外因性薬剤、瘢痕を低減させる外因性薬剤、線維症を低減させる外因性薬剤１種もしくは複数、またはそれらの組合せを含む。巨核球において発現され、その巨核球から生成された血小板の顆粒中に詰め入れられ得る例示的な組換えタンパク質には、エリスロポエチンが含まれる。エリスロポエチンの局在化送達は、フィブリン誘発性の創傷治癒応答を加速させ、組換えＥＰＯ積載血小板は、糖尿病性潰瘍、熱傷などを含む開放創傷および痛み、ならびに外科的手順（椎弓切除術、椎間板切除術、関節手術、腹部手術または胸部手術から生じるものなどの外科的病変）を含む閉鎖（内部）創傷の処置において使用され得る。ＭＫ細胞における発現および血小板顆粒における貯蔵が本発明に従って達成され得る他の創傷治癒性タンパク質、特に、非線維性増殖因子には、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）；塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）；トランスフォーミング増殖因子β−３（ＴＧＦβ−３）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、フィブロネクチン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、ラミニン、テネイシン（ｔｅｎａｓｉｎ）が含まれる。
ある特定の実施形態では、血小板は、ＴＧＦβ−１、ＴＧＦβ−２および／もしくはＰＤＧＦに対する抗体（特に単鎖抗体）；増殖因子自体への結合あるいは受容体（例えば、受容体結合部位配列を含むペプチド）または可溶性形態の増殖因子受容体もしくはこれらの受容体の増殖因子結合ドメインへの結合のいずれかによって、ＴＧＦβ−１、ＴＧＦβ−２および／もしくはＰＤＧＦがそれらの受容体に結合することを防止する結合タンパク質；あるいは受容体−リガンド相互作用を阻害するアプタマーなどが含まれるがこれらに限定されない、１種または複数の外因性抗線維症剤を含む。
ある特定の実施形態では、血小板は、創傷治癒をモジュレートする１種もしくは複数の外因性薬剤、例えば、プロテアーゼ；血管作動性物質、例えばセロトニンおよび／またはヒスタミン；フィブロネクチン；コラゲナーゼ；プラスミノーゲン活性化因子；中性プロテアーゼ；エラスチン；コラーゲン；プロテオグリカン（ｐｒｏｔｅｏｇｙｃａｎ）；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；ホルモン、例えば、エストラジオール、テストステロンまたはプロゲステロン；マクロファージ由来増殖因子（ＭＤＧＦ）；アドレノメデュリン；アンジオゲニン；アンジオポエチン−１；アンジオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｔｉｎ）関連増殖因子；脳由来神経栄養因子；コルチコトロピン放出ホルモン；Ｃｙｒ１６；フォリスタチン；肝細胞増殖因子；インターロイキン；ミッドカイン；ニューロキニンＡ；ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）；プレイオトロフィン；プログラニュリン、プロリフェリン（ｐｒｏｌｉｆｅｒｎ）；セクレトニューリン（ｓｅｃｒｅｔｏｎｅｕｒｉｎ）；サブスタンスＰ；ＶＧ５Ｑ；および周皮細胞をリクルートする因子；ならびにベカプレルミンを含む。
ある特定の実施形態では、血小板は、創傷治癒を促進しかつ／または創傷の部位において線維症および瘢痕を低減させ得る、１種または複数の核アプタマーを含む。瘢痕は、持続性の炎症および過剰に豊富な線維芽細胞活性化の両方によって引き起こされると考えられている。オステオポンチン（ＯＰＮ）は、細胞活性化を促進するサイトカインである。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＯＰＮの非存在は、皮膚の瘢痕を低減させる。ＲＮＡアプタマーは、高い親和性で標的タンパク質に結合する短いＲＮＡ分子である。アプタマーＯＰＮ−Ｒ３（Ｒ３）は、ＯＰＮのシグナル伝達を遮断する。ある特定の実施形態では、血小板には、血小板活性化のための部位において、能動的にまたは受動的に、好ましくは能動的に放出されるＯＰＮ−Ｒ３が積載され得る。例示的なＯＰＮ阻害アプタマーは、ＵＳ２０１１０１９０３８６に記載されている。
ある特定の実施形態では、血小板は、創傷治癒を促進しかつ／または創傷の部位において線維症および瘢痕を低減させ得る、１種または複数の小さい（有機）薬剤を含む。例えば、切除術の創傷閉鎖は、Ａ２Ａ受容体アゴニスト、例えばＣＧＳ−２１６８０によって顕著に加速され得る（Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏｓら ＪＥＭ １９９７年、１８６巻（９号）１６１５〜１６２０頁）。したがって、単なる例示として、血小板には、能動的にまたは受動的に（好ましくは、血小板活性化のための部位において能動的に）放出されるＡ２Ａ受容体アゴニストが積載され得る。他の小分子薬剤には、ステロイド、非ステロイド性抗炎症化合物（ＮＳＡＩＤ）、５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）インヒビター、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）受容体アンタゴニスト、ロイコトリエンＡ４（ＬＴＡ４）ヒドロラーゼインヒビター、５−ＨＴアゴニスト、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）インヒビター、Ｈ２アンタゴニスト、抗新生物剤およびシクロオキシゲナーゼ−２インヒビターが含まれる。
ある特定の実施形態では、血小板は、１種または複数の外因性抗生剤を含む。例示的な抗生物質には、クロラムフェニコール、クロルテトラサイクリン、クリンダマイシン（ｃｌｙｎｄａｍｙｃｉｎ）、クリオキノール、エリスロマイシン、フラマイセチン、グラミシジン、フシジン酸、ゲンタマイシン、マフェニド、ムピロシン（ｍｕｐｉｒｏｉｃｉｎ）、ネオマイシン、ポリミキシンＢ、バシトラシン、スルファジアジン銀、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、トブラマイシン、アミカシン、バンコマイシン、ラモプラニン、レボフロキサシン、オフロキサシン、モキシフロキサシン、クリンダマイシンまたはそれらの組合せが含まれる。
ある特定の実施形態では、血小板は、１種または複数の外因性鎮痛剤もしくは麻酔剤および／または抗炎症剤を含む。例示的な抗炎症剤は、アセトアミノフェン、アスピリン、イブプロフェン、ジクロフェナク、インドメタシン、ピロキシカム、フェノプロフェン、フルルビプロフェン（ｆｌｕｂｉｐｒｏｆｅｎ）、ケトプロフェン、ナプロキセン、スプロフェン、ロキソプロフェン、シンノキシカム（ｃｉｎｎｏｘｉｃａｍ）、テノキシカムおよびそれらの組合せから選択され得る。
抗血栓剤／抗再狭窄剤を送達するように操作された血小板は、血管形成手順および血栓溶解手順の間に使用され得る。
ある特定の実施形態では、操作された血小板は、アテローム動脈硬化症の重症度を予防するまたは低減させるために使用され得、１種または複数の外因性抗アテローム動脈硬化症剤（即ち、アテローム動脈硬化性病変を低減させるまたは形成を予防する薬剤）を含み得、以下を含み得る：天然生成物を含む抗増殖／抗有糸分裂剤、例えばビンカアルカロイド（即ち、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビン）、パクリタキセル、エピポドフィロトキシン（ｅｐｉｄｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）（即ち、エトポシド、テニポシド）、抗生物質（ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）ダウノルビシン、ドキソルビシンおよびイダルビシン）、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミスラマイシン）およびマイトマイシン、酵素（Ｌ−アスパラギンを全身的に代謝し、それ自身のアスパラギンを合成する能力を有さない細胞を取り除く、Ｌ−アスパラギナーゼ）；抗増殖／抗有糸分裂アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミドおよびアナログ、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、スルホン酸アルキル−ブスルファン、ニトロソウレア（ｎｉｒｔｏｓｏｕｒｅａ）（カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびアナログ、ストレプトゾシン）、トラゼン（ｔｒａｚｅｎｅ）−ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｉｎｅ）（ＤＴＩＣ）；抗増殖／抗有糸分裂代謝拮抗薬、例えば葉酸アナログ（メトトレキサート）、ピリミジンアナログ（フルオロウラシル、フロクスウリジンおよびシタラビン）、プリンアナログおよび関連のインヒビター（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチンおよび２−クロロデオキシアデノシン｛クラドリビン｝）；白金配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン（即ち、エストロゲン）；血栓溶解剤（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼ）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走薬（ａｎｔｉｍｉｇｒａｔｏｒｙ）；抗分泌薬（ａｎｔｉｓｅｃｒｅｔｏｒｙ）（ブレフェルジン（ｂｒｅｖｅｌｄｉｎ））；抗炎症薬：例えば副腎皮質ステロイド（コルチゾール、コルチゾン、フルドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、６ａ−メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、ベタメタゾンおよびデキサメタゾン）、非ステロイド性薬剤（サリチル酸誘導体、即ちアスピリン；パラ−アミノフェノール誘導体、即ちアセトアミノフェン；インドールおよびインデン酢酸（インドメタシン、スリンダクおよびエトドラク（ｅｔｏｄａｌａｃ））、ヘテロアリール酢酸（トルメチン、ジクロフェナクおよびケトロラク）、アリールプロピオン酸（イブプロフェンおよび誘導体）、アントラニル酸（メフェナム酸およびメクロフェナム酸）、エノール酸（ピロキシカム、テノキシカム、フェニルブタゾンおよびオキシフェンタトラゾン（ｏｘｙｐｈｅｎｔｈａｔｒａｚｏｎｅ））、ナブメトン、金化合物（オーラノフィン、オーロチオグルコース、金チオリンゴ酸ナトリウム）；免疫抑制薬：（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；血管新生剤：血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）；アンジオテンシン受容体ブロッカー；一酸化窒素供与体；アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそれらの組合せ；細胞周期インヒビター、ｍＴＯＲインヒビターおよび増殖因子受容体シグナル伝達キナーゼインヒビター；レチノイド（ｒｅｔｅｎｏｉｄ）；サイクリン／ＣＤＫインヒビター；ＨＭＧ補酵素レダクターゼインヒビター（スタチン）；ならびにプロテアーゼインヒビター。
ある特定の実施形態では、操作された血小板は、再狭窄の重症度を予防するまたは低減させるために使用され得、活性剤として使用される、１種または複数の外因性抗増殖物質、消炎薬ならびに抗血栓化合物を含み得る。再狭窄に対する例示的な活性な活性剤には、以下が含まれる：シロリムス、エベロリムス、ソマトスタチン、タクロリムス、ロキシスロマイシン、ズナイマイシン（ｄｕｎａｉｍｙｃｉｎ）、アスコマイシン、バフィロマイシン、エリスロマイシン、ミデカマイシン、ジョサマイシン、コンカナマイシン、クラリスロマイシン、トロレアンドマイシン、フォリマイシン（ｆｏｌｉｍｙｃｉｎ）、セリバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン、フルバスタチン、ロスバスタチン、アトルバスタチン、プラバスタチン、ピタバスタチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、エトポシド（ｅｔｏｂｏｓｉｄｅ）、テニポシド、ニムスチン、カルムスチン、ロムスチン、シクロホスファミド、４−ヒドロキシオキシシクロホスファミド、エストラムスチン、メルファラン、イホスファミド、トロホスファミド（ｔｒｏｐｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、クロラムブシル、ベンダムスチン、ダカルバジン、ブスルファン、プロカルバジン、トレオスルファン、テモゾロミド（ｔｒｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、チオテパ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アクラルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ダクチノマイシン、メトトレキサート、フルダラビン、フルダラビン−５’−ジヒドロゲンホスフェート、クラドリビン、メルカプトプリン、チオグアニン、シタラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、カペシタビン、ドセタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、アムサクリン、イリノテカン、トポテカン、ヒドロキシカルバミド、ミルテホシン、ペントスタチン、アルデスロイキン、トレチノイン、アスパラギナーゼ、ペグアスパラーゼ（ｐｅｇａｓｐａｒａｓｅ）、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ホルメスタン、アミノグルテチミド（ａｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｅｍｉｄｅ）、アドリアマイシン、アジスロマイシン、スピラマイシン、セファランチン（ｃｅｐｈａｒａｎｔｉｎ）、ｓｍｃ増殖インヒビター−２ｗ、エポチロンＡおよびＢ、ミトキサントロン、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｍｏｆｅｔｉｌ）、ｃ−ｍｙｃ−アンチセンス、ｂ−ｍｙｃ−アンチセンス、ベツリン酸、カンプトテシン、ラパコール、β−ラパコン、ポドフィロトキシン、ベツリン、ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｃ ａｃｉｄ）２−エチルヒドラジド、モルグラモスチム、ペグインターフェロンα−２ｂ、レノグラスチム；フィルグラスチム、マクロゴール、ダカルバジン、バシリキシマブ、ダクリズマブ、セレクチン、サイトカインアンタゴニスト、ＣＥＴＰインヒビター、カドヘリン、サイトカイニンインヒビター、ＣＯＸ−２インヒビター、ＮＦκ．Ｂ、アンジオペプチン（ａｎｇｉｏｐｅｐｔｉｎ）、シプロフロキサシン、カンプトテシン、フルロブラスチン（ｆｌｕｒｏｂｌａｓｔｉｎ）、筋肉細胞の増殖を阻害するモノクローナル抗体、ｂＦＧＦアンタゴニスト、プロブコール、プロスタグランジン、１，１１−ジメトキシカンチン−６−オン、１−ヒドロキシ−１１−メトキシカンチン−６−オン、スコポレクチン（ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎ）、コルヒチン、ＮＯ供与体、四硝酸ペンタエリスリトール、シンドノエイミン（ｓｙｎｄｎｏｅｉｍｉｎｅ）、Ｓ−ニトロソ誘導体、タモキシフェン、スタウロスポリン、β−エストラジオール、α−エストラジオール、エストリオール、エストロン、エチニルエストラジオール、ホスフェストロール、メドロキシプロゲステロン、シピオン酸エストラジオール、安息香酸エストラジオール、トラニラスト、カメバカウリン（ｋａｍｅｂａｋａｕｒｉｎ）および他のテルペノイド、これはがんの治療に適用される、ベラパミル、チロシンキナーゼインヒビター、チルホスチン、シクロスポリンＡ、パクリタキセルおよびその誘導体、バッカチン、タキソテール、ならびに他の合成により取得されたおよびネイティブ供給源から取得された亜酸化炭素（ＭＣＳ）の大環状オリゴマーならびにそれらの誘導体、モフェブタゾン、アセメタシン、ジクロフェナク、ロナゾラク、ダプソン、ｏ−カルバモイルフェノキシ酢酸、リドカイン、ケトプロフェン、メフェナム酸、ピロキシカム、メロキシカム、リン酸クロロキン、ペニシラミン、ヒドロキシクロロキン、オーラノフィン、金チオリンゴ酸ナトリウム、オキサセプロール、セレコキシブ、β−シトステリン（β−ｓｉｔｏｓｔｅｒｉｎ）、アデメチオニン、ミルテカイン（ｍｙｒｔｅｃａｉｎｅ）、ポリドカノール、ノニバミド（ｎｏｎｉｖａｍｉｄｅ）、レボメントール、ベンゾカイン、エスチン、エリプチシン、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｄ−２４８５１、コルセミド、サイトカラシンＡ〜Ｅ、インダノシン（ｉｎｄａｎｏｃｉｎｅ）、ノコダゾール（ｎｏｃａｄａｚｏｌｅ）、Ｓ １００タンパク質、バシトラシン、ビトロネクチン受容体アンタゴニスト、アゼラスチン、グアニリル（ｇｕａｎｉｄｙｌ）シクラーゼ刺激因子 金属プロテイナーゼ−１および−２の組織インヒビター、遊離核酸、ウイルストランスミッター中に組み込まれた核酸、ＤＮＡおよびＲＮＡ断片、プラスミノーゲン（ｐｌａｍｉｎｏｇｅｎ）活性化因子インヒビター−１、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター−２、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＶＥＧＦインヒビター、ＩＧＦ−１、抗生物質、抗血栓薬、アルガトロバン、アスピリン、アブシキシマブ、合成アンチトロンビン、ビバリルジン、クマジン、エノキサパリン（ｅｎｏｘｏｐａｒｉｎ）、脱硫酸化およびＮ−再アセチル化ヘパリン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ血小板膜受容体、第Ｘａ因子インヒビター抗体、ヒルジン、ｒ−ヒルジン、ＰＰＡＣＫ、プロタミン、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ワルファリン、ウロキナーゼ、血管拡張薬、ジピラミドール（ｄｉｐｙｒａｍｉｄｏｌｅ）、トラピジル、ニトロプルシド、ＰＤＧＦアンタゴニスト、トリアゾロピリミジンおよびセラミン（ｓｅｒａｍｉｎ）、ＡＣＥインヒビター、カプトプリル、シラザプリル、リシノプリル、エナラプリル、ロサルタン、チオプロテアーゼインヒビター、プロスタサイクリン、バピプロスト、インターフェロンα、βおよびγ、ヒスタミンアンタゴニスト、セロトニンブロッカー、アポトーシスインヒビター、アポトーシス調節因子、ｐ６５ ＮＦ−κ．ＢおよびＢｃｌ−ｘＬアンチセンスオリゴヌクレオチド、ハロフジノン、ニフェジピン、トコフェロール、トラニラスト（ｔｒａｎｉｒａｓｔ）、モルシドミン、茶ポリフェノール、没食子酸エピカテキン、没食子酸エピガロカテキン、ボスウェル酸およびその誘導体、レフルノミド、アナキンラ、エタネルセプト、スルファサラジン、エトポシド、ジクロキサシリン、テトラサイクリン、トリアムシノロン、ムタマイシン（ｍｕｔａｍｙｃｉｎ）、プロカインイミド（ｐｒｏｃａｉｎｉｍｉｄ）、レチノイン酸、キニジン、ジソピリミド（ｄｉｓｏｐｙｒｉｍｉｄｅ）、フレカイニド、プロパフェノン、ソタロール（ｓｏｔｏｌｏｌ）、アミドロン（ａｍｉｄｏｒｏｎｅ）、天然および合成により取得されたステロイド、ブリオフィリン（ｂｒｙｏｐｈｙｌｌｉｎ）Ａ、イノトジオール（ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）、マキロシド（ｍａｑｕｉｒｏｓｉｄｅ）Ａ、ガラキノシド（ｇｈａｌａｋｉｎｏｓｉｄｅ）、マンソニン（ｍａｎｓｏｎｉｎｅ）、ストレブロシド（ｓｔｒｅｂｌｏｓｉｄｅ）、ヒドロコルチゾン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、フェノプロフェン（ｆｅｎｏｐｏｒｆｅｎ）、イブプロフェン、インドメタシン、ナプロキセン、フェニルブタゾン、抗ウイルス剤、抗真菌薬、抗原虫剤、天然テルペノイド、ヒポカエスクリン（ｈｉｐｐｏｃａｅｓｃｕｌｉｎ）、バリントゲノール−Ｃ２１−アンゲレート（ｂａｒｒｉｎｇｔｏｇｅｎｏｌ−Ｃ２１−ａｎｇｅｌａｔｅ）、１４−デヒドロアグロスチスタチン（１４−ｄｅｈｙｄｒｏａｇｒｏｓｔｉｓｔａｃｈｉｎ）、アグロスケリン（ａｇｒｏｓｋｅｒｉｎ）、アグロスチスタチン（ａｇｒｏｓｔｉｓｔａｃｈｉｎ）、１７−ヒドロキシアグロスチスタチン、オバトジオリド（ｏｖａｔｏｄｉｏｌｉｄ）、４，７−オキシシクロアニソメリック酸（４，７−ｏｘｙｃｙｃｌｏａｎｉｓｏｍｅｌｉｃ ａｃｉｄ）、バッカリノイド（ｂａｃｃｈａｒｉｎｏｉｄ）Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ７、ツベイモシド（ｔｕｂｅｉｍｏｓｉｄｅ）、ブルセアノール（ｂｒｕｃｅａｎｏｌ）Ａ、ＢおよびＣ、ブルセアンチノシド（ｂｒｕｃｅａｎｔｉｎｏｓｉｄｅ）Ｃ、ヤダンジオシド（ｙａｄａｎｚｉｏｓｉｄｅ）ＮおよびＰ、イソデオキシエレファントピン（ｉｓｏｄｅｏｘｙｅｌｅｐｈａｎｔｏｐｉｎ）、トメンファントピン（ｔｏｍｅｎｐｈａｎｔｏｐｉｎ）ＡおよびＢ、コロナリン（ｃｏｒｏｎａｒｉｎ）Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ、ウルソール酸、ヒプタチン酸（ｈｙｐｔａｔｉｃ ａｃｉｄ）Ａ、ゼオリン（ｚｅｏｒｉｎ）、イソイリドゲルマナール（ｉｓｏ−ｉｒｉｄｏｇｅｒｍａｎａｌ）、メイテンフォリオール（ｍａｙｔｅｎｆｏｌｉｏｌ）、エフサンチン（ｅｆｆｕｓａｎｔｉｎ）Ａ、エクシサニン（ｅｘｃｉｓａｎｉｎ）ＡおよびＢ、ロンギカウリン（ｌｏｎｇｉｋａｕｒｉｎ）Ｂ、スカルポネアチン（ｓｃｕｌｐｏｎｅａｔｉｎ）Ｃ、カメバウニン（ｋａｍｅｂａｕｎｉｎ）、ロイカメニン（ｌｅｕｋａｍｅｎｉｎ）ＡおよびＢ、１３，１８−デヒドロ−６−α−セネシオイルオキシカパリン（１３，１８−ｄｅｈｙｄｒｏ−６−α−ｓｅｎｅｃｉｏｙｌｏｘｙｃｈａｐａｒｒｉｎ）、タキサマイリン（ｔａｘａｍａｉｒｉｎ）ＡおよびＢ、レジェニロール（ｒｅｇｅｎｉｌｏｌ）、トリプトライド、シマリン、アポシマリン、アリストロキア酸、アノプテリン（ａｎｏｐｔｅｒｉｎ）、ヒドロキシアノプテリン、アネモニン、プロトアネモニン、ベルベリン、塩化ケリブリン（ｃｈｅｌｉｂｕｒｉｎ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、シクトキシン（ｃｉｃｔｏｘｉｎ）、シノコクリン（ｓｉｎｏｃｏｃｕｌｉｎｅ）、ボンブレスタチン（ｂｏｍｂｒｅｓｔａｔｉｎ）ＡおよびＢ、クドライソフラボン（ｃｕｄｒａｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ）Ａ、クルクミン、ジヒドロニチジン（ｄｉｈｙｄｒｏｎｉｔｉｄｉｎｅ）、塩化ニチジン（ｎｉｔｉｄｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、１２−β−ヒドロキシプレグナジエン−３，２０−ジオン、ビロボール、ギンコール、ギンコール酸、ヘレナリン、インジシン、インジシン−Ｎ−オキシド、ラシオカルピン（ｌａｓｉｏｃａｒｐｉｎｅ）、イノトジオール、グリコシドｌａ、ポドフィロトキシン、ジュスチシジン（ｊｕｓｔｉｃｉｄｉｎ）ＡおよびＢ、ラレアチン（ｌａｒｒｅａｔｉｎ）、マロテリン（ｍａｌｌｏｔｅｒｉｎ）、マロトクロマノール（ｍａｌｌｏｔｏｃｈｒｏｍａｎｏｌ）、イソブチリルマロトクロマノール、マキロシドＡ、マルカンチンＡ、メイタンシン、リコリジシン（ｌｙｃｏｒｉｄｉｃｉｎ）、マルゲチン（ｍａｒｇｅｔｉｎｅ）、パンクラチスタチン、リリオデニン、ビスパルテノリジン（ｂｉｓｐａｒｔｈｅｎｏｌｉｄｉｎｅ）、オキソウシンスニン（ｏｘｏｕｓｈｉｎｓｕｎｉｎｅ）、アリストラクタム（ａｒｉｓｔｏｌａｃｔａｍ）−ＡＩＩ、ビスパルテノリジン、ペリプロコシド（ｐｅｒｉｐｌｏｃｏｓｉｄｅ）Ａ、ガラキノシド、ウルソール酸、デオキシプソロスペルミン（ｄｅｏｘｙｐｓｏｒｏｓｐｅｒｍｉｎ）、サイコルビン（ｐｓｙｃｏｒｕｂｉｎ）、リシンＡ、サンギナリン、マヌーコムギ酸（ｍａｎｗｕ ｗｈｅａｔ ａｃｉｄ）、メチルソルビフォリン（ｍｅｔｈｙｌｓｏｒｂｉｆｏｌｉｎ）、スファテリアクロメン（ｓｐｈａｔｈｅｌｉａｃｈｒｏｍｅｎ）、
スチゾフィリン（ｓｔｉｚｏｐｈｙｌｌｉｎ）、マンソニン、ストレブロシド、アカゲリン（ａｋａｇｅｒｉｎｅ）、ジヒドロウサンバレンシン（ｄｉｈｙｄｒｏｕｓａｍｂａｒａｅｎｓｉｎｅ）、ヒドロキシウサンバリン（ｈｙｄｒｏｘｙｕｓａｍｂａｒｉｎｅ）、ストリクノペンタミン（ｓｔｒｙｃｈｎｏｐｅｎｔａｍｉｎｅ）、ストリクノフィリン（ｓｔｒｙｃｈｎｏｐｈｙｌｌｉｎｅ）、ウサンバリン（ｕｓａｍｂａｒｉｎｅ）、ウサンバレンシン（ｕｓａｍｂａｒｅｎｓｉｎｅ）、ベルベリン、リリオデニン、オキソウシンスニン、ダフノレチン（ｄａｐｈｎｏｒｅｔｉｎ）、ラリシレシノール、メトキシラリシレシノール、シリンガレシノール、ウンベリフェロン、アフロモソン（ａｆｒｏｍｏｓｏｎ）、アセチルビスミオン（ａｃｅｔｙｌｖｉｓｍｉｏｎｅ）Ｂ、デスアセチルビスミオン（ｄｅｓａｃｅｔｙｌｖｉｓｍｉｏｎｅ）Ａ、またはビスミオン（ｖｉｓｍｉｏｎｅ）ＡおよびＢ。
なお他の実施形態では、操作された血小板は、固形腫瘍の処置の一環として使用され得る。固形腫瘍は、血小板活性化が可能な血栓形成促進性環境を生成する。最近の知見は、活性化された血小板が、腫瘍出血を予防するという点において、腫瘍脈管恒常性の重要な調節因子であることを示している。驚くべきことに、この効果は、血栓を形成する血小板の能力からは独立しており、その代り、その顆粒内容物の分泌に依存する。したがって、抗腫瘍剤および／または抗血管新生剤の放出を標的化する血小板分泌活性を使用することは、腫瘍細胞を特異的に死滅させるおよび／または腫瘍血管系を不安定化させるためのアプローチの代表となる。ある特定の好ましい実施形態では、操作された血小板には、抗血管新生剤および／または腫瘍脈管構造の破壊を引き起こす薬剤が充填され得る。
さらに例示するために、操作された血小板には、（ａ）アルキル化剤、例えばメクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン（ｍｅｌｐｈａａｎ）、クロラムブシル、ヘキサメチルメラミン、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジンなど；（ｂ）代謝拮抗薬、例えばメトトレキサート、５−ＦＵ、ＦｕｄＲ、シタラビン、６ＭＰ、チオグアニン、ペントスタチンなど；（ｃ）天然生成物、例えばタキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、エトポシド、テニポシドなど；（ｄ）抗生物質、例えばダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシンｃなど；（ｅ）酵素、例えばＬ−アスパラギナーゼ、ヘパリナーゼ、コンドロイチナーゼなど；（ｆ）インターフェロンおよびインターロイキン、例えばインターフェロン−α、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子など；（ｇ）白金配位錯体、例えばシスプラチン、カルボプラチンまたはそれらの誘導体；ならびに（ｈ）その他種々の薬剤、例えばミトキサントロン、ビスクロロエチルニトロソウレア、ヒドロキシウレア、クロロエチル−シクロヘキシルニトロソウレア、プレドニゾン、ジエチルスチルベストロール、メドロキシプロゲステロン、タモキシフェン、ミトタン、プロカルバジン、アミノグルテチミド、プロゲスチン、アンドロゲン、抗アンドロゲン薬（ａｎｔｉａｄｒｏｇｅｎ）、リュープロリドなどが含まれ得る、抗新生物または化学療法剤などの抗がん剤が充填され得る。
例示的な一実施形態では、操作された血小板は、ＶＥＧＦのインヒビター（即ち、ＶＥＧＦアンタゴニスト）として作用する組換えタンパク質を含む。かかるタンパク質には、抗体および抗体アナログ（例えば、単鎖抗体、モノボディ（ｍｏｎｏｂｏｄｙ）、抗原結合部位など）、例えば、ラニビズマブ、ＶＥＧＦ受容体由来のリガンド結合ドメインを含む可溶性タンパク質であるＶＥＧＦ−トラップ、例えばアフリベルセプト（これらは、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体のいずれかに結合し、受容体活性化を遮断する）が含まれる。好ましい実施形態では、ポリペプチドＶＥＧＦアンタゴニストは、血小板の顆粒、特にα−顆粒中に取り込まれ血小板の活性化の際に放出される様式で、ＭＫ細胞中で発現される。
しかし、操作された血小板組成物の好ましい使用は固形および骨髄の両方の腫瘍治療における使用であり、同じ原理が他の異常な血管形成ベースの病理の処置において具体化される。他の病理には、関節炎、網膜症、乾癬、固形腫瘍、良性腫瘍、カポジ肉腫および血液学的悪性疾患が含まれ得る。これは、上に記載した薬物を含み得；または例えば関節炎の場合、疾患改変薬物（ＤＭＡＲＤ）、非ステロイド性抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤＳ）、コルヒチン、メトトレキサートなどから構成され得る。
例示的な実施形態では、操作された血小板には、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール（ａｃｏｄａｚｏｌｅ）、アクロニシン（ａｃｒｏｎｙｃｉｎｅ）、アドゼレシン、アラノシン、アルデスロイキン、アロプリノールナトリウム、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アモナフィド、アンプリジェン、アムサクリン、アンドロゲン、アングイジン、アフィジコリングリシネート、アサレイ（ａｓａｌｅｙ）、アスパラギナーゼ、５−アザシチジン、アザチオプリン、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、ベーカーズアンチフォール（Ｂａｋｅｒ’ｓ Ａｎｔｉｆｏｌ）（可溶性）、ベータ−２’−デオキシチオグアノシン、ビサントレンＨＣｌ、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、ＢＷＡ ７７３Ｕ８２、ＢＷ ５０２Ｕ８３．ＨＣｌ、ＢＷ ７Ｕ８５メシレート、セラセミド（ｃｅｒａｃｅｍｉｄｅ）、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、クロロキノキサリン−スルホンアミド、クロロゾトシン、クロモマイシンＡ３、シスプラチン、クラドリビン、コルチコステロイド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、ＣＰＴ−１１、クリスナトール、シクロシチジン、シクロホスファミド、シタラビン、シテンベナ（ｃｙｔｅｍｂｅｎａ）、ダビスマレアート（ｄａｂｉｓ ｍａｌｅａｔｅ）、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、デアザウリジン、デクスラゾキサン、ジアンヒドロガラクチトール、ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、ジブロモダルシトール、ジデムニンＢ、ジエチルジチオカルバメート、ジグリコアルデヒド、ジヒドロ−５−アザシチジン、ドキソルビシン、エキノマイシン、エダトレキセート、エデルフォシン（ｅｄｅｌｆｏｓｉｎｅ）、エフロルニチン、Ｅｌｌｉｏｔｔ溶液、エルサミトルシン（ｅｌｓａｍｉｔｒｕｃｉｎ）、エピルビシン、エソルビシン、リン酸エストラムスチン、エストロゲン、エタニダゾール、エチオフォス（ｅｔｈｉｏｆｏｓ）、エトポシド、ファドラゾール（ｆａｄｒａｚｏｌｅ）、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、フラボン酢酸、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、５−フルオロウラシル、フルオゾール（Ｆｌｕｏｓｏｌ．）、フルタミド、硝酸ガリウム、ゲムシタビン、酢酸ゴセレリン、ヘプスルファム（ｈｅｐｓｕｌｆａｍ）、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ホモハリントニン、硫酸ヒドラジン、４−ヒドロキシアンドロステンジオン、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｚｙｕｒｅａ）、イダルビシンＨＣｌ、イホスファミド、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターロイキン−１アルファおよびベータ、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、４−イポメアノール（４−ｉｐｏｍｅａｎｏｌ）、イプロプラチン、イソトレチノイン、ロイコボリンカルシウム、酢酸リュープロリド、レバミゾール、リポソームダウノルビシン、リポソーム封入ドキソルビシン、ロムスチン、ロニダミン、メイタンシン、メクロレタミン塩酸塩、メルファラン、メノガリル、メルバロン（ｍｅｒｂａｒｏｎｅ）、６−メルカプトプリン、メスナ、カルメット・ゲラン桿菌のメタノール抽出残渣、メトトレキサート、Ｎ−メチルホルムアミド、ミフェプリストン、ミトグアゾン、マイトマイシン−Ｃ、ミトタン、ミトキサントロン塩酸塩、単球／マクロファージコロニー刺激因子、ナビロン、ナフォキシジン、ネオカルチノスタチン、酢酸オクトレオチド、オルマプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パラ（ｐａｌａ）、ペントスタチン、ピペラジンジオン、ピポブロマン、ピラルビシン、ピリトレキシム、ピロキサントロン塩酸塩、ＰＩＸＹ−３２１、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、プレドニムスチン、プロカルバジン、プロゲスチン、ピラゾフリン（ｐｙｒａｚｏｆｕｒｉｎ）、ラゾキサン、サルグラモスチム、セムスチン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、スラミンナトリウム、タモキシフェン、タキソテール、テガフール、テニポシド、テレフタルアミジン、テロキシロン（ｔｅｒｏｘｉｒｏｎｅ）、チオグアニン、チオテパ、チミジン注射、チアゾフリン、トポテカン、トレミフェン、トレチノイン、トリフロペラジン塩酸塩、トリフルリジン、トリメトレキサート、腫瘍壊死因子、ウラシルマスタード、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンゾリジン（ｖｉｎｚｏｌｉｄｉｎｅ）、Ｙｏｓｈｉ ８６４、ゾルビシン、およびそれらの混合物から選択され得る抗がん薬などが充填され得る。
操作された血小板は、腫瘍細胞に対する免疫活性化を促進するために、１種または複数の免疫刺激剤を含み得、したがって、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニン−Ｄ−イソグルタミン（ＭＤＰ）、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）、遺伝子改変および／または分解されたＬＰＳ、ミョウバン、グルカン、コロニー刺激因子、ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ペグ化Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＬ６、ＰＩＸＹ ３２１、インターフェロン、γ−インターフェロン、α−インターフェロン、インターロイキン、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＭＨＣクラスＩＩ結合性ペプチド、サポニン、ＱＳ２Ｉ、非メチル化ＣｐＧ配列、Ｉ−メチルトリプトファン、アルギナーゼインヒビター、シクロホスファミド、もしくは免疫抑制機能を遮断する抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、またはそれらの２つ以上の混合物などの薬剤を含み得る。
特定の例では、特に、小分子薬物および／または核酸を含む操作された血小板を創出するために、活性剤（複数可）は、分化経路に沿って巨核球、前血小板もしくは他の細胞のための培養培地に添加することによって、血小板中に導入され得るか、または血小板がインキュベートされる培地／溶液中に提供され得る。
他の例では、特に、タンパク質治療薬を含む操作された血小板を創出するために、活性剤（複数可）は、分化経路に沿って巨核球、前血小板または他の細胞によって組換え発現され得、したがって、得られる血小板中に存在し得る。好ましい実施形態では、この組換えタンパク質は、血小板顆粒（特にα−顆粒）中に詰め入れられる。第ＶＩＩＩ因子などの特定の組換えタンパク質は、顆粒中に自動的に輸送され、さもなければ、その融合タンパク質を血小板顆粒に輸送する顆粒標的化部分を含む融合タンパク質の使用を必要とし得る。例示的な顆粒標的化部分は、血小板因子４（ＰＦ４）、または得られた融合タンパク質を血小板顆粒に輸送するのに十分なその一部分である。例えば、Ｂｒｉｇｕｅｔ−Ｌａｕｇｉｅｒら、Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ． ２００４年２巻（１２号）：２２３１〜４０頁；Ｅｌ Ｇｏｌｉら Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００５年２８０巻（３４号）：３０３２９〜３５頁を参照のこと。
さらなる顆粒輸送部分を必要としない組換えタンパク質の例示的な一実施形態は、第ＶＩＩＩ因子である。本発明は、そのａ−顆粒中に貯蔵された第ＶＩＩＩ因子を有するように操作されており、創傷の部位などにおいて活性化の際にその組換えタンパク質を放出する血小板を企図する。血友病Ａは、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子における欠損によって引き起こされ、およそ１：５０００の雄性個体が罹患する、Ｘ染色体連鎖した出血障害である。現行の処置は、プールされたＦＶＩＩＩ濃縮物または組換え生成物を使用することによる因子置換からなる。これらの生成物の制限には、その高価さ、および厳密な予防レジメンにおいて使用される場合を除きこれらの生成物が長期後遺症を予防する限定的な能力が含まれる。血友病Ａを有する集団の約１０％は、注入生成物に対するインヒビターを発達させ、代替的な、さらに高価で有効性が低い形態の治療を必要とする。血液由来置換生成物からの感染性合併症に関する懸念は、新たな調製技術を用いても、問題であり続けている。処置の高い費用、治療の感染性合併症および免疫性合併症、ならびに血友病Ａの長期合併症を予防する際の制限は、血友病Ａの処置のための血小板送達戦略を、治療の魅力的な代替的形態にしている。
さらに例示するために、Ｙａｒｏｖｏｉら Ｂｌｏｏｄ、２００３年１０２巻（１２号）：４００７頁は、本発明の第ＶＩＩＩ因子操作された血小板を生成するために使用され得る発現構築物を記載している。特に、（ヒト）第ＶＩＩＩ因子のコード配列は、巨核球特異的糖タンパク質Ｉｂ（ＧＰＩｂα）近位プロモーター領域の調節的制御下に配置され得る。Ｆｕｊｉｔａら Ｂｌｏｏｄ． １９９８年；９２巻：４８８〜４９５頁を参照のこと。発生中の巨核球において異所的に発現された第ＶＩＩＩ因子はα−顆粒中に貯蔵され、これはＭＫによって生成される血小板内に含まれ、次いで活性化の際に循環血小板から放出される。
医薬調製物
本開示の例示的な組成物は、発熱物質を含まない、または発熱物質を本質的に含まない、および病原体を含まないなどの、ヒト患者を処置する際の使用に適した製剤であり得る。投与されるとき、本開示における使用のための医薬調製物は、発熱物質を含まず、病原体を含まず、生理学的に許容される形態であり得る。
本開示のさらなる例示的な組成物は照射され得る（例えば、投与の前に）。例えば、この細胞は、ガンマ線照射で照射され得る（例えばおよそ２５ｇｙの線量で）。例えば、この組成物は、組成物中に含まれる任意の有核真核生物細胞および／または病原体を有糸分裂的に不活性化するのに十分な線量で、例えば、この組成物の中に含まれ得る任意の多能性幹細胞、ＭＫ、白血球および／またはＰＶＥ−ＨＥを有糸分裂的に不活性化するのに十分な線量で、照射され得る。
血小板の送達
それらの製造のための種々のメンブレン、デバイスおよび方法が、細胞およびそれらの分泌された生成物をヒト身体中に移植する手段として提案および評価されてきており、特許文献中でバイオ人工移植片として集合的に言及される。典型的には、これらは、操作の一般的原則を共有する、即ち、細胞は、半透膜によって仕切られたチャンバーの内側に隔離される。長期細胞生存度は、隣接する脈管化した組織との、栄養素および廃棄生成物の持続的な拡散性の交換に依存すると考えられる（米国特許第６，３７２，２４４号、米国特許第６，１１３，９３８号、米国特許第６，３２２，８０４号、米国特許第４，９１１，７１７号、米国特許第５，８５５，６１３号、米国特許第６，０８３，５２３号、米国特許第５，９１６，５５４号、米国特許第６，５１１，４７３号、米国特許第６，４８５，７２３号）。種々の組織区画中への細胞の移植について科学文献および特許文献中に記載されるデバイスには、以下を含む３つの主要な型が存在する：平面ディスク設計、中空繊維ベースの設計および幾何学的立体ベースの設計。これらのデバイスは、典型的には、体腔中に配置されるように設計される。
定義
「胚様体」とは、非付着条件下で、例えば、低接着性基材上または「懸滴」中で多能性細胞を培養することによって形成され得る、多能性細胞（例えば、ｉＰＳＣまたはＥＳＣ）の凝集塊またはクラスターを指す。これらの培養において、多能性細胞は、胚様体と命名された細胞の凝集塊またはクラスターを形成し得る。その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒら、Ｍｏｌ Ｍｅｄ． ２０００年２月；６巻（２号）：８８〜９５頁を参照のこと。典型的には、胚様体は、多能性細胞の固体凝集塊またはクラスターとして最初に形成し、時間と共に、胚様体のうちいくつかは、流体で満たされた腔を含むようになり、文献中で、後者の前者は「単純な」ＥＢとして言及され、後者は「嚢胞性」胚様体として言及される。
用語「胚性幹細胞」（ＥＳ細胞）は、当技術分野で使用されるように本明細書中で使用される。この用語は、ヒト胚盤胞または桑実胚の内部細胞塊から誘導された細胞を含み、細胞株として連続的に継代されたものを含む。ＥＳ細胞は、卵細胞と精子との受精から、ならびにＤＮＡ、核移植、単為生殖を使用して、またはＨＬＡ領域中にホモ接合性を有するＥＳ細胞を生成するための手段によって、誘導され得る。ＥＳ細胞はまた、細胞を生成するための、精子および卵細胞の融合、核移植、単為生殖、雄性発生、またはクロマチンの再プログラミングおよび再プログラミングされたクロマチンの原形質膜中への引き続く取り込みによって生成された、接合体、卵割球または胚盤胞段階の哺乳動物胚から誘導された細胞である。胚性幹細胞は、その供給源またはそれらを生成するために使用される特定の方法に関わらず、（ｉ）３種全ての胚葉の細胞へと分化する能力、（ｉｉ）少なくともＯｃｔ４およびアルカリホスファターゼの発現、ならびに（ｉｉｉ）免疫不全動物中に移植した場合に奇形腫を生成する能力、に基づいて同定され得る。本発明の実施形態において使用され得る胚性幹細胞には、ヒトＥＳ細胞（「ＥＳＣ」または「ｈＥＳ細胞」）、例えばＭＡ０１、ＭＡ０９、ＡＣＴ−４、Ｎｏ．３、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１４およびＡＣＴ３０胚性幹細胞が含まれるがこれらに限定されない。さらなる例示的な細胞株には、ＮＥＤ１、ＮＥＤ２、ＮＥＤ３、ＮＥＤ４、ＮＥＤ５およびＮＥＤ７が含まれる。ＮＩＨ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙもまた参照のこと。使用され得る例示的なヒト胚性幹細胞株は、ＭＡ０９細胞である。ＭＡ０９細胞の単離および調製は、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａら（２００６年）「Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ」Ｎａｔｕｒｅ ４４４巻：４８１〜４８５頁中に以前に記載された。本開示に従って使用され得る他のＥＳ細胞の単離および調製もまた、Ｃｈｕｎｇら（２００８年）「Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｅｍｂｒｙｏ Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、２巻：１１３〜１１７頁中に以前に記載されている。本発明の例示的な実施形態に従って使用されるヒトＥＳ細胞は、ＧＭＰ標準に従って誘導および維持され得る。
本明細書で使用する場合、用語「多能性幹細胞」は、その多能性幹細胞が誘導される方法に関わらず、胚性幹細胞、胚由来幹細胞および人工多能性幹細胞を含む。多能性幹細胞は、以下である幹細胞として機能的に定義される：（ａ）免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス中に移植した場合に奇形腫を誘発することが可能である；（ｂ）３種全ての胚葉の細胞型へと分化することが可能である（例えば、外胚葉、中胚葉および内胚葉の細胞型に分化することができる）；および（ｃ）胚性幹細胞の１つまたは複数のマーカーを発現する（例えば、Ｏｃｔ４、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ−３表面抗原、ＳＳＥＡ−４表面抗原、ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＯＸ２、ＲＥＸ１などを発現する）。ある特定の実施形態では、多能性幹細胞は、ＯＣＴ−４、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを発現する。例示的な多能性幹細胞は、例えば当技術分野で公知の方法を使用して生成され得る。例示的な多能性幹細胞には、胚盤胞段階の胚のＩＣＭから誘導された胚性幹細胞、ならびに卵割段階または桑実胚段階の胚の１つまたは複数の卵割球から（任意選択で胚の残部を破壊することなく）誘導された胚性幹細胞が含まれる。かかる胚性幹細胞は、受精によって、または体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、単為生殖および雄性発生を含む無性生殖的手段によって生成された胚性材料から生成され得る。さらなる例示的な多能性幹細胞には、因子（本明細書で再プログラミング因子と称される）の組合せを発現させることによって体細胞を再プログラミングすることによって生成された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が含まれる。ｉＰＳＣは、胎仔、出生後、新生仔、若年または成体の体細胞を使用して生成され得る。
ある特定の実施形態では、体細胞を多能性幹細胞へと再プログラミングするために使用され得る因子には、例えば、Ｏｃｔ４（時にＯｃｔ３／４と呼ばれる）、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４の組合せが含まれる。他の実施形態では、体細胞を多能性幹細胞へと再プログラミングするために使用され得る因子には、例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の組合せが含まれる。ある特定の実施形態では、少なくとも２種の再プログラミング因子が、体細胞を首尾よく再プログラミングするために、体細胞において発現される。他の実施形態では、少なくとも３種の再プログラミング因子が、体細胞を首尾よく再プログラミングするために、体細胞において発現される。他の実施形態では、少なくとも４種の再プログラミング因子が、体細胞を首尾よく再プログラミングするために、体細胞において発現される。他の実施形態では、さらなる再プログラミング因子が同定され、体細胞を多能性幹細胞へと再プログラミングするために、単独で、または１種もしくは複数の公知の再プログラミング因子と組み合わせて使用される。人工多能性幹細胞は、機能的に定義され、これには、種々の方法（組込みベクター、非組込みベクター、化学的手段など）のいずれかを使用して再プログラミングされた細胞が含まれる。多能性幹細胞は、寿命、有効性、ホーミングを増加させるため、同種免疫応答を予防もしくは低減させるため、またはかかる多能性細胞から分化した細胞（例えば、血小板）中に所望の因子を送達するために、遺伝子改変または他の方法で改変され得る。
「人工多能性幹細胞」（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣ）は、体細胞中への再プログラミング因子のタンパク質形質導入によって生成され得る。ある特定の実施形態では、少なくとも２種の再プログラミングタンパク質が、体細胞を首尾よく再プログラミングするために、体細胞中に形質導入される。他の実施形態では、少なくとも３種の再プログラミングタンパク質が、体細胞を首尾よく再プログラミングするために、体細胞中に形質導入される。他の実施形態では、少なくとも４種の再プログラミングタンパク質が、体細胞を首尾よく再プログラミングするために、体細胞中に形質導入される。
多能性幹細胞は、任意の種由来であり得る。胚性幹細胞は、例えば、マウス、複数の種の非ヒト霊長類、およびヒトにおいて首尾よく誘導されており、胚性幹様細胞は、多数のさらなる種から生成されている。したがって、当業者は、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット）、有蹄動物（ウシ、ヒツジなど）、イヌ（飼いイヌおよび野生のイヌ）、ネコ（飼いネコおよび野生のネコ、例えば、ライオン、トラ、チーター）、ウサギ、ハムスター、スナネズミ、リス、モルモット、ヤギ、ゾウ、パンダ（ジャイアントパンダを含む）、ブタ、アライグマ、ウマ、シマウマ、海洋哺乳動物（イルカ、クジラなど）などが含まれるがこれらに限定されない任意の種から、胚性幹細胞および胚由来幹細胞を生成できる。ある特定の実施形態では、この種は、絶滅危惧種である。ある特定の実施形態では、この種は、現在絶滅した種である。
同様に、ｉＰＳ細胞は、任意の種由来であり得る。これらのｉＰＳ細胞は、マウスおよびヒトの細胞を使用して首尾よく生成されている。さらに、ｉＰＳ細胞は、胚性、胎仔、新生仔および成体の組織を使用して首尾よく生成されている。従って、任意の種由来のドナー細胞を使用して、ｉＰＳ細胞を容易に生成することができる。したがって、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット）、有蹄動物（ウシ、ヒツジなど）、イヌ（飼いイヌおよび野生のイヌ）、ネコ（飼いネコおよび野生のネコ、例えば、ライオン、トラ、チーター）、ウサギ、ハムスター、ヤギ、ゾウ、パンダ（ジャイアントパンダを含む）、ブタ、アライグマ、ウマ、シマウマ、海洋哺乳動物（イルカ、クジラなど）などが含まれるがこれらに限定されない任意の種から、ｉＰＳ細胞を生成することができる。ある特定の実施形態では、この種は、絶滅危惧種である。ある特定の実施形態では、この種は、現在絶滅した種である。
人工多能性幹細胞は、任意の発生段階の事実上任意の体細胞を出発点として使用して生成され得る。例えば、この細胞は、胚、胎仔、新生仔、若年性または成体のドナー由来であり得る。使用され得る例示的な体細胞には、線維芽細胞、例えば、皮膚試料もしくは生検によって取得される皮膚線維芽細胞、滑膜組織由来の滑膜細胞、包皮細胞、頬細胞または肺線維芽細胞が含まれる。皮膚および頬は、適切な細胞の容易に入手可能で容易に取得可能な供給源を提供するが、事実上任意の細胞が使用され得る。ある特定の実施形態では、体細胞は、線維芽細胞ではない。
人工多能性幹細胞は、体細胞において１種もしくは複数の再プログラミング因子を発現させるまたはかかる１種もしくは複数の再プログラミング因子の発現を誘発することによって生成され得る。この体細胞は、線維芽細胞、例えば、皮膚線維芽細胞、滑膜線維芽細胞もしくは肺線維芽細胞、または非線維芽細胞性体細胞であり得る。この体細胞は、少なくとも１、２、３、４、５種の再プログラミング因子の発現を（例えば、ウイルス形質導入ベクター、組込みベクターまたは非組込みベクターなどを介して）引き起こすこと、および／または少なくとも１、２、３、４、５種の再プログラミング因子との接触を（例えば、タンパク質形質導入ドメイン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、カチオン性両親媒性物質、脂質二重層含有との融合、界面活性剤透過処理などを使用して）引き起こすことによって、再プログラミングされ得る。再プログラミング因子は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮＡＮＯＧ、Ｌｉｎ２８、ｃ ＭｙｃおよびＫｌｆ４から選択され得る。再プログラミング因子の発現は、体細胞を、再プログラミング因子の発現を誘発する少なくとも１種の薬剤、例えば有機小分子薬剤と接触させることによって誘発され得る。
さらなる例示的な多能性幹細胞には、因子（「再プログラミング因子」）の組合せを発現させることまたはかかる因子の組合せの発現を誘発することによって体細胞を再プログラミングすることによって生成された人工多能性幹細胞が含まれる。ｉＰＳ細胞は、細胞バンクから取得され得る。ｉＰＳ細胞の作製は、分化した細胞の生成における最初期ステップであり得る。ｉＰＳ細胞は、組織にマッチした巨核球および血小板を生成することを目的として、特定の患者またはマッチしたドナー由来の材料を使用して特異的に生成され得る。ｉＰＳＣは、意図したレシピエントにおいて実質的に免疫原性でない細胞から生成され得、例えば、自家細胞からまたは意図したレシピエントに対して組織適合性の細胞から生成され得る。
体細胞は、再プログラミング因子が（例えば、ウイルスベクター、プラスミドなどを使用して）発現され、その再プログラミング因子の発現が（例えば、有機小分子を使用して）誘発される組み合わせのアプローチを使用しても、再プログラミングされ得る。例えば、再プログラミング因子は、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを使用する感染によって、体細胞において発現され得る。また、再プログラミング因子は、非組込みベクター、例えばエピソームプラスミドを使用して、体細胞において発現され得る。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００９年５月８日；３２４巻（５９２８号）：７９７〜８０１頁を参照のこと。再プログラミング因子が非組込みベクターを使用して発現される場合、この因子は、ベクターを用いた体細胞のエレクトロポレーション、トランスフェクションまたは形質転換を使用して、この細胞において発現され得る。例えば、マウス細胞では、組換えウイルスベクターを使用した４種の因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ ｍｙｃおよびＫｌｆ４）の発現が、体細胞を再プログラミングするために十分である。ヒト細胞では、組換えウイルスベクターを使用した４種の因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮＡＮＯＧおよびＬｉｎ２８）の発現が、体細胞を再プログラミングするために十分である。
再プログラミング因子が細胞において発現されると、この細胞は培養され得る。時間と共に、ＥＳ特徴を有する細胞が培養皿中に出現する。この細胞は、例えば、ＥＳ形態に基づいて、または選択可能もしくは検出可能なマーカーの発現に基づいて、選択および継代培養され得る。この細胞は、ＥＳ細胞と似た細胞の培養物を生成するために培養され得る−これらは、推定ｉＰＳ細胞である。
ｉＰＳ細胞の多能性を確認するために、この細胞は、多能性の１つまたは複数のアッセイにおいて試験され得る。例えば、この細胞は、ＥＳ細胞マーカーの発現について試験され得る；この細胞は、ＳＣＩＤマウス中に移植した場合に奇形腫を生成する能力について評価され得る；この細胞は、３種全ての胚葉の細胞型を生成するように分化する能力について評価され得る。多能性ｉＰＳＣが取得されると、これは、巨核球細胞および血小板を生成するために使用され得る。
用語「造血性内皮細胞」（ＰＶＥ−ＨＥ）は、本明細書で使用する場合、ＰＥＣＡＭ１、ＶＥ−カドヘリンおよび／またはエンドグリンを発現し得（例えば、ＰＥＣＡＭ１＋ＶＥ−Ｃａｄ＋エンドグリン＋造血性ＰＶＥ−ＨＥ）、任意選択で、多能性幹細胞から誘導され得る、造血細胞型または内皮細胞型を生じるように分化することが可能な細胞を指す。これらの細胞は、１つまたは複数のマーカーの発現（ＲＮＡまたはタンパク質）または発現（ＲＮＡまたはタンパク質）の欠如が含まれるがこれらに限定されない多数の構造的および機能的特性に基づいて記述され得る。ＰＶＥ−ＨＥ細胞は、マーカーＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ１）の発現を特徴とする。例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９付加、免疫蛍光顕微鏡および透過型電子顕微鏡の結果は、集団中のＰＶＥ−ＨＥ細胞の９％がＣＤ３１＋であり得ることをさらに実証する。ＰＶＥ−ＨＥ細胞は、マーカーＣＤ１０５（エンドグリン）およびＣＤ１４４（ＶＥ−カドヘリン）もまた発現し得る。例えば、集団中のＰＶＥ−ＨＥ細胞の少なくとも約７０％、約少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％は、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１４４＋およびＣＤ３１＋であり得る。ある特定の実施形態では、ＰＶＥ−ＨＥ細胞は、互いに緩く接着性である。ＣＤ３１、血小板内皮細胞接着分子−１（ＰＥＣＡＭ−１）は、内皮細胞前駆体の発生、脈管形成および血管形成についてのマーカーとして使用されてきた。ＣＤ３１は、成体および胚性の内皮細胞の表面上で恒常的に発現され、内皮細胞細胞間接着部（ここには、最大１０６個のＰＥＣＡＭ−１分子が濃縮される）の主要な構成要素であり、多くの末梢白血球および血小板上で弱く発現される。
例示的な実施形態では、ＰＶＥ−ＨＥは、以下の特徴のうち１つまたは複数、好ましくは全てを示し得る：（１）顕著な量のＣＤ３１＋ＰＶＥ−ＨＥ細胞が、ＰＶＥ−ＨＥ分化の開始の７２時間後に早くも検出され得る。（２）これは、ＰＶＥ−ＨＥ分化の開始のほぼ１２０〜１４６時間後において、ピークレベルに達する。（３）ＣＤ３１＋ＰＶＥ−ＨＥ細胞集団は、単離および凍結保存され得る。（３）これらは、ほぼ全ての内皮前駆細胞表面マーカー、例えばＣＤ３１、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＣＤ１４４（ＶＥ−カドヘリン）を発現する。これらは、ＣＤ３４、ＣＤ３０９（ＫＤＲ）およびＣＤ１４６もまた発現し得る。（４）ＣＤ３１＋ＰＶＥ−ＨＥ細胞の分集団はＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）もまた発現する。（５）内皮系列の潜在能力が、内皮細胞（ＥＣ）特異的培地（例えば、ＥＧＭ−２またはＥｎｄｏＧｒｏ）中でフィブロネクチン上でＣＤ３１＋ＰＶＥ−ＨＥ細胞を培養して、典型的な内皮形態を有する細胞の単層を得ることによって確認され得る。（６）ＰＶＥ−ＨＥ由来内皮細胞（ＰＶＥ−ＨＥ−ＥＣ）は、ＣＤ３１（細胞−細胞接合部において局在化）を発現するだけでなく、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）もまた発現し、ＬＤＬ取り込みが可能である。（７）ＰＶＥ−ＨＥ−ＥＣは、Ｍａｔｒｉｇｅｌの上で培養した場合、３Ｄネットワーク構造を形成することが可能である。（８）ＥＣ特異的培地中でフィブロネクチン上に非常に低密度でプレート形成させた（ｐｌａｔｉｎｇ）場合、ＣＤ３１＋ＰＶＥ−ＨＥ細胞は、それらのクローン原性能を裏付ける典型的な内皮形態を有するコロニーを形成することが可能である。（９）芽細胞−コロニー増殖のためのメチルセルロース培地中でプレート形成させた場合、芽細胞コロニーは、ＣＤ３１＋画分からのみ生成され得る。ＣＤ３１−細胞とは異なり、ＣＤ３４−およびＣＤ１０５−は共に、芽細胞コロニーを生成することが可能であり、これは、造血性の能力がＣＤ３１画分のみにおいて排他的に維持されることを示唆している。（１０）新たに誘導されたＰＶＥ−ＨＥ−ＥＣは、造血性の潜在能力を維持し、造血系列に有利な条件下で培養した場合、造血性細胞を生じる。
用語「巨核球系列特異的前駆細胞」（「ＭＬＰ」）とは、本明細書で使用する場合、少なくとも巨核球系列に傾倒した単核造血幹細胞を指し、これには、臍帯血、骨髄および末梢血中の細胞、ならびに造血幹細胞、ヒト胚性幹細胞から誘導された細胞、および人工多能性幹細胞から誘導された細胞が含まれるがこれらに限定されない。これらの細胞は、１つまたは複数のマーカーの発現（ＲＮＡまたはタンパク質）または発現（ＲＮＡまたはタンパク質）の欠如が含まれるがこれらに限定されない多数の構造的および機能的特性に基づいて記述され得る。本開示のＭＬＰは、未成熟細胞および成熟細胞の混合物であり得る。成熟ＭＬＰ対未成熟ＭＬＰの百分率は、ＭＬＰ−誘導および拡大増殖培地（ＭＬＰ−ＤＥＭ、本明細書でＡＰＥＬとも呼ぶ）（実施例２に記載される）中での培養における時間の長さに基づいて変動し得る。未成熟ＭＬＰは、マーカーＣＤ４１ａ、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ１３の発現、ならびにＣＤ１４およびＣＤ４２ｂマーカー発現の欠如を特徴とする。本開示の例示的な方法は、ＣＤ１３の発現を検出するステップおよび／またはＣＤ１３陽性細胞を濃縮もしくは精製するステップを含む方法による、ＭＬＰの検出および／または精製を提供する。任意選択で、これらの方法では、ＣＤ１３の発現は、本明細書に記載される未成熟ＭＬＰまたは成熟ＭＬＰの１種または複数のさらなるマーカーの発現と組み合わせて、検出され得るおよび／または細胞精製のための基礎として使用され得る。成熟ＭＬＰは、マーカーＣＤ４１ａ、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ１３、ＣＤ４２ｂの発現およびＣＤ１４発現の欠如を特徴とする。ある特定の実施形態では、フィーダーフリーの培養において生成されたＭＬＰは、半剥離または完全に剥離されていてもよく、培養培地中に浮遊していてもよい。例えば、ＭＬＰは、懸濁物中で浮遊し始めたときに、ＰＶＥ−ＨＥから収集され得る。好ましくは、ＭＬＰは、プレート形成しておらず接着されておらず、ＭＫ系列以外の系列または非ＭＫ系列（例えば、内皮細胞）への分化を容認し得る。ＭＬＰは、好ましくは、ＭＫを生成するために、懸濁物中で増殖させられる。任意選択で、ＭＬＰは凍結保存され得る。
用語「巨核球」（ＭＫ）とは、本明細書で使用する場合、血小板を生じる大きい倍数体の造血細胞、ならびに二倍体であるが血小板を生成することが完全に可能であり得るより小さいＭＫ（これは、主題の方法によって生成され得る）を指す。成熟ＭＫの１つの主要な形態学的特徴は、大きな倍数体核の発達である。成熟ＭＫは、増殖を停止しているが、核内分裂を介してそのＤＮＡ含量を増加させ続ける；細胞サイズが並行して増加する。ＭＫの大きな倍数体核、大きな細胞容量および豊富な細胞質は、細胞１個当たり何千もの血小板の生成を可能にする。ＭＫは、１つまたは複数のマーカーの発現（ＲＮＡまたはタンパク質）または発現（ＲＮＡまたはタンパク質）の欠如が含まれるがこれらに限定されないこれらおよび多数の他の構造的および機能的特性に基づいて記述され得る。成熟ＭＫは、マーカーＣＤ４１ａおよびＣＤ４２ｂを発現する。成熟ＭＫは、ＣＤ６１およびＣＤ２９もまた発現し得る。例えば、本開示のＭＫは、好ましくは、血小板を生成することができるという意味において機能的である（例えば、本明細書に記載される条件下で培養した場合に）。例示的な実施形態は、ＣＤ２９の発現を検出するステップおよびＣＤ２９陽性細胞を成熟ＭＫと同定するステップを含む、成熟ＭＫを検出する方法を提供する。さらなる例示的な実施形態は、集団からのＣＤ２９陽性細胞の精製を含むＭＫを精製する方法を提供する（例えば、磁気ビーズサブトラクション、ＦＡＣＳ、他の免疫親和性ベースの方法などを使用して）。任意選択で、これらの方法では、ＣＤ２９の発現は、表１（成熟ＭＫのさらなる例示的な細胞表面マーカー発現を提供する）中に示されたマーカーなどの、成熟ＭＫの１種または複数のさらなるマーカーの発現と組み合わせて、検出され得るおよび／または細胞精製のための基礎として使用され得る。
ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＭＫは、骨髄中の造血幹細胞先駆細胞から誘導される。これらの多分化能幹細胞は、骨髄類洞中に存在し、それらが受容するシグナルに依存して全ての型の血液細胞を生成することが可能である。ＭＫ生成のための主要なシグナルはＴＰＯである。ＴＰＯは、骨髄中で最終的なＭＫ表現型に向かう前駆細胞の分化を誘発する。ＭＫは、以下の系列を介して発生する：ＣＦＵ−ＭＥ（多能性造血幹細胞または血球芽細胞）、巨核芽球、前巨核球、巨核球。この細胞は、最終的に巨核芽球段階に達し、分裂する能力を喪失する。しかし、この細胞は、そのＤＮＡを依然として複製でき、発生を続けて、倍数性になる。細胞質は、拡大し続け、ＤＮＡ相補体は、６４Ｎよりも大きくなるまで増加し得る。
この細胞は、分化を完了して成熟巨核球になると、血小板を生成するプロセスを開始する。ＴＰＯは、小さい前血小板突起を形成するようにＭＫを誘発することにおいて役割を果たす。血小板は、ＭＫの細胞質内のこれらの内部膜内に保持される。血小板放出に関して２つの機構が提案されている。１つのシナリオでは、これらの前血小板突起は、爆発的に崩壊して血小板になる。あるいは、この細胞は、血管中に血小板リボンを形成し得る。リボンは、仮足を介して形成され、循環中に血小板を持続的に排出することができる。いずれのシナリオでも、これらの前血小板突起の各々は、崩壊の際に２０００〜５０００個の新たな血小板を生じ得る。全体として、これらの新たに生成された血小板の７５％よりも多くが循環中に残留するが、残りは脾臓によって捕捉される。
用語「血小板」とは、本明細書で使用する場合、血餅の形成をもたらす一次止血の細胞機構に関与する、細胞から誘導された無核の細胞質体を指す。血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔｓ（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅｓ））は、直径が２〜３ｐｍの小さい不規則な形状の透明な細胞断片であり、これはｉｎ ｖｉｖｏでは先駆巨核球（ＭＫ）の断片化から誘導される。血小板は、１つまたは複数のマーカーの発現（ＲＮＡまたはタンパク質）または発現（ＲＮＡまたはタンパク質）の欠如が含まれるがこれらに限定されない多数の構造的および機能的特性に基づいて同定され得る。血小板は、マーカーＣＤ４１ａおよびＣＤ４２ｂを発現する。血小板は、脈管傷害に応答して組織にかつ互いに接着する。
用語「機能的血小板」または「機能的である血小板」とは、本明細書で使用する場合、トロンビンによって活性化され、血餅退縮に関与し得る血小板を指す。例示的な実施形態では、血小板が機能的血小板であるかどうかは、動物モデルを使用して決定され得る（例えば実施例４（図１２）に記載されるように、例えば、同じ種のものであり得る天然に誘導された血小板との比較によって）。さらに、活性化された血小板は、ＣＤ６２ｐおよびαＩＩｂβＩＩＩの発現によって同定され得、機能的血小板は、トロンビンによる活性化の際などの活性化の際のこれらのマーカーの発現によって（任意選択で定量的に）同定され得る。語句「実質的に全ての血小板が機能的である」とは、例えば、血小板の少なくとも６０％が機能的血小板である、または血小板の少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％が機能的血小板である、血小板を含む組成物または調製物を指す。機能的血小板は、２２〜３７℃で貯蔵した場合、少なくとも５日間にわたって活性であり得る。
ＰＥＣＡＭ１（ＣＤ３１）は、循環血小板、単球、好中球および特定のＴ細胞サブセットの表面上に発現される免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである。これは、内皮細胞細胞間接着部の主要な構成要素でもあり、ここでは最大で推定百万個の分子が濃縮されている。この細胞発現パターンに起因して、ＰＥＣＡＭ１は、白血球の経内皮遊走、血管形成およびインテグリン活性化を含むいくつかの機能に関与する。Ｉｇスーパーファミリーは、細胞接着（例えば、ＮＣＡＭ１、ＩＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１）または抗原認識（例えば、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体およびＭＨＣ分子）を媒介する。さらに、その細胞質ドメイン内における１つまたは複数の免疫受容体チロシン抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）の存在を特徴とする３０のメンバーを含む部分群もまた、認識されている。その細胞質ドメイン内に６つのＩＴＩＭを有するＰＥＣＡＭ１は、このサブファミリーのメンバーである。
エンドグリン（ＥＮＧ）は、ＣＤ１０５とも呼ばれ、ヒト脈管内皮と主に関連するホモダイマー膜糖タンパク質である。これは、骨髄前赤芽球、活性化単球、線維芽細胞、平滑筋細胞および小児白血病におけるリンパ芽球上にも見出される。エンドグリンは、トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦＢ）受容体複合体の成分であり、高い親和性でＴＧＦＢ１に結合する。エンドグリンは、心血管系の発生などのプロセスおよび脈管リモデリングにおいて、細胞の形態および遊走に影響する細胞骨格組織化に関与する。その発現は、心臓の発生の間に調節される。エンドグリン遺伝子を有さない実験マウスは、心血管異常に起因して死亡する。
ＶＥ−カドヘリン（ＣＤ１４４）は、カドヘリンスーパーファミリーからの古典的カドヘリンである。ＶＥ−カドヘリンは、接着の制御および細胞間接着部の組織化を介して内皮細胞の生物学において重要な役割を果たし、したがって、内皮の完全性を維持する。ＶＥ−カドヘリンは、適切な脈管発生にとって不可欠である。トランスジェニックマウスモデル研究により、ＶＥ−カドヘリン欠乏が、脈管の欠陥に起因して、胎生致死であることが確認された。ＶＥ−カドヘリンは、新たに形成された血管を維持する目的を果たす。
用語「ＲＯＣＫインヒビター」とは、本明細書で使用する場合、細胞においてＲｈｏ関連キナーゼまたはそのシグナル伝達経路の機能を阻害するまたは低減させる任意の物質、例えば、小分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを指す。「ＲＯＣＫシグナル伝達経路」は、本明細書で使用する場合、ＲＯＣＫ関連シグナル伝達経路、例えば、細胞中のＲｈｏ−ＲＯＣＫ−ミオシンＩＩシグナル伝達経路、その上流のシグナル伝達経路、またはその下流のシグナル伝達経路に関与する任意のシグナルプロセッサーを含み得る。使用され得る例示的なＲＯＣＫインヒビターは、ＳｔｅｍｇｅｎｔのＳｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｙ２７６３２、ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビターである（Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００７年６月；２５巻（６号）：６８１〜６頁を参照のこと）。他のＲＯＣＫインヒビターには、例えば、Ｈ−１１５２、Ｙ−３０１４１、Ｗｆ−５３６、ＨＡ−１０７７、ヒドロキシル−ＨＡ−１０７７、ＧＳＫ２６９９６２ＡおよびＳＢ−７７２０７７−Ｂが含まれる。その全体が示されるかのようにその各々が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｄｏｅら、Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．、３２巻：８９〜９８頁、２００７年；Ｉｓｈｉｚａｋｉら、Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５７巻：９７６〜９８３頁、２０００年；Ｎａｋａｊｉｍａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５２巻：３１９〜３２４頁、２００３年；およびＳａｓａｋｉら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ．、９３巻：２２５〜２３２頁、２００２年。ＲＯＣＫインヒビターは、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開２０１２／０２７６０６３号に記載されるように、当技術分野で公知の濃度および／または培養条件で利用され得る。例えば、ＲＯＣＫインヒビターは、約０．０５〜約５０マイクロＭ、例えば、少なくともまたは約０．０５、０．１、０．２、０．５、０．８、１、１．５、２、２．５、５、７．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０マイクロＭの濃度を有し得、その中の誘導可能な任意の範囲または細胞の増殖もしくは生存を促進するのに有効な任意の濃度を含む、。
例えば、多能性幹細胞の生存度は、ＲＯＣＫインヒビターを含めることによって改善され得る。例示的な一実施形態では、多能性幹細胞は、フィーダーフリー条件下で維持され得る。別の一例では、巨核球系列特異的前駆細胞の生存度は、ＲＯＣＫインヒビターを含めることによって改善され得る。別の一例では、巨核球の生存度は、ＲＯＣＫインヒビターを含めることによって改善され得る。別の例示的な一実施形態では、この巨核球系列特異的前駆細胞は、フィーダーフリー条件下で維持され得る。
略号
ｉＰＳ：人工多能性幹
ｉＰＳＣ：人工多能性幹細胞
ｈｉＰＳＣ：ヒト人工多能性幹細胞
ｈＥＳ：ヒト胚性幹
ｈＥＳＣ：ヒト胚性幹細胞
ＭＫ：巨核球
ＭＬＰ：巨核球系列特異的前駆体、巨核球前駆体（ＭＫＰ）とも呼ばれる
ＰＶＥ−ＨＥ：造血性内皮細胞、任意選択でＰＥＣＡＭ１＋ＶＥ−カドヘリン＋エンドグリン＋であり、任意選択で多能性幹細胞から誘導されている
ｉＰＳ−ＰＶＥ−ＨＥ：ｉＰＳ細胞由来造血性内皮細胞（例えば、ＰＥＣＡＭ１＋ＶＥ−カドヘリン＋エンドグリン＋細胞）
ｈＥＳ−ＰＶＥ−ＨＥ：ｈＥＳ細胞由来造血性内皮細胞（例えば、ＰＥＣＡＭ１＋ＶＥ−カドヘリン＋エンドグリン＋細胞）
ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ：造血性内皮細胞から生成された巨核球系列特異的前駆体
ｉＰＳ−ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ：ｉＰＳ細胞から生成されたＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ
ｈＥＳ−ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ：ｈＥＳ細胞から生成されたＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ
ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ−ＭＫ：造血性内皮細胞から生成された巨核球系列特異的前駆体から生成された巨核球
ｉＰＳ−ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ−ＭＫ：ｉＰＳ細胞から生成されたＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ−ＭＫ
ｈＥＳ−ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ−ＭＫ：ｈＥＳ細胞から生成されたＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ−ＭＫ
ＰＬＴ：血小板
ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴ：ヒト人工多能性幹細胞から生成された血小板または血小板様粒子
ｈＥＳＣ−ＰＬＴ：ヒト胚性幹細胞から生成された血小板または血小板様粒子
ＡＤＭ：高度分化形態。
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本明細書中の全ての刊行物は、各個々の刊行物または特許出願が参照によって組み込まれると具体的かつ個々に示されるのと同程度まで、参照によって組み込まれる。以下の説明は、本発明を理解する際に有用であり得る情報を含む。これは、本明細書に提供されるいずれかの情報が先行技術であるか、もしくは特許請求された本発明と関連すること、または具体的もしくは暗示的に参照されたいずれかの刊行物が先行技術であることを自認するものではない。
以下の実施例は、特許請求された発明をより良く例示するために提供されているのであって、本発明の範囲の限定として解釈すべきではない。具体的な材料が言及される程度まで、これは、例示のみを目的としており、本発明を限定することは意図しない。当業者は、発明能力の行使なしに、本発明の範囲から逸脱することなく、等価な手段または反応物を開発し得る。
（実施例１）
多能性由来造血性内皮細胞（ＰＶＥ−ＨＥ）の生成。
多能性由来造血性内皮細胞（ＰＶＥ−ＨＥ）を、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から生成した。
第１に、ｉＰＳ細胞を、フィーダーフリー多能性幹細胞培養培地ｍＴｅＳＲ１中においてＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞由来の可溶性調製物）上で培養することによって拡大増殖させた。簡潔に述べると、ヒトｉＰＳ細胞を、唯一の活性成分としてＥＤＴＡを含む化学的に規定された細胞解離緩衝液（ＣＤＢ）を使用する解離によって回収した。酵素またはいずれの他の動物生成物も、培養培地中またはＣＤＢ中で使用しなかった。別の化学的に規定されたマトリックス、例えば組換えビトロネクチンもしくはＳｙｎｔｈｅＭａｘ ＩＩ、または培地、例えばｍＴｅＳＲ２、あるいは他の適合性の細胞解離試薬を使用することが可能であることが、当業者に理解されるはずである。
第２に、回収したヒトｉＰＳ細胞を、ＰＥＣＡＭ１＋ＶＥ−カドヘリン＋エンドグリン＋である多分化能ＰＶＥ−ＨＥへの分化のために調製した。胚様体（ＥＢ）形成は必要としなかった。簡潔に述べると、回収した細胞を、ｍＴｅＳＲ１中に再懸濁し、細胞外マトリックスヒトＩＶ型コラーゲン（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＢｉｏＭａｔｒｉｘ、カタログ番号５０２２）の上でプレート形成させた。小分子ＲＯＣＫインヒビターＹ２７６３２を、１０μＭで培養物に添加したが、これは、回収したｉＰＳ細胞がＩＶ型コラーゲン被覆表面に付着するのを助けると考えられた。ｉＰＳ細胞を、５％ＣＯ２中３７℃で１２〜４８時間付着させた。図２Ａに示すように、４８時間後、付着した細胞は、フィーダーフリー条件下で典型的な多能性幹細胞形態を示す。
第３に、調製したヒトｉＰＳ細胞を、ＰＶＥ−ＨＥ細胞に分化させた。簡潔に述べると、Ｙ２７６３２を含むｍＴｅＳＲ１培地を除去し、分化開始培地（ＤＩＭ）を添加した。ＤＩＭは、基本培地としてのイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ヒト血清アルブミン、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ｂ−メルカプトエタノール、可溶性低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、コレステロール、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）５０ｎｇ／ｍｌ、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）５０ｎｇ／ｍｌおよび血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）５０ｎｇ／ｍｌから構成される動物成分フリーの培地（ＡＣＦ）である。５％ＣＯ２中３７℃で４８時間インキュベートした後、所望のＰＶＥ−ＨＥ分化の初期形態を観察した。多能性幹細胞形態から点在する小さな細胞クラスターへのほぼ完全な推移が、図２Ｂにおいて見られ得る。ＰＶＥ−ＨＥ分化開始の９６〜１４６時間後に、単層の上で増殖している小さくコンパクトな細胞クラスターを示す高度分化形態を観察した（図２Ｃ）。
第４に、ＰＶＥ−ＨＥ分化開始の１２０時間後、高度分化形態（ＡＤＭ）細胞を、形態変化（図３Ｂ）および首尾よいＰＶＥ−ＨＥ分化について分析した。簡潔に述べると、細胞の小さな試料を、系列特異的マーカーＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ）、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＣＤ１４４（ＶＥ−カドヘリン）のフローサイトメトリー分析に供した。ＡＤＭ細胞は、分化のこの段階においてＰＶＥ−ＨＥ表現型ＣＤ３１＋ＣＤ１４４＋ＣＤ１０５＋を示す（図３Ａ）。
（実施例２）
ヒトｉＰＳ由来ＰＶＥ−ＨＥ細胞から、剥離した巨核球系列特異的前駆体（ＭＬＰ）を生成する。
第１に、ＭＬＰ分化の開始を、ＰＶＥ−ＨＥ分化を開始した１２０時間後に実施した。簡潔に述べると、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦおよび５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを含むＤＩＭ培地を除去し、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ハムＦ−１２栄養混合物、Ａｌｂｕｃｕｌｔ（ｒｈアルブミン）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、リノール酸、ＳｙｎｔｈｅＣｈｏｌ（合成コレステロール）、モノチオグリセロール（ａ−ＭＴＧ）、ｒｈインスリン−トランスフェリン−セレン−エタノールアミン溶液、タンパク質フリーハイブリドーマ混合物ＩＩ（ＰＦＨＭＩＩ）、アスコルビン酸２ホスフェート、Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉ（Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン）、ペニシリン／ストレプトマイシン、幹細胞因子（ＳＣＦ）２５ｎｇ／ｍｌ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）２５ｎｇ／ｍｌ、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬ）２５ｎｇ／ｍｌ、インターロイキン−３（ＩＬ−３）１０ｎｇ／ｍｌ、インターロイキン−６（ＩＬ−６）１０ｎｇ／ｍｌおよびヘパリン５単位／ｍｌから構成されるＭＬＰ誘導および拡大増殖培地（ＭＬＰ−ＤＥＭ、ＡＰＥＬまたはＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩとも呼ばれる、図１に示すとおり）で置き換えた。次いで、細胞を、５％ＣＯ２中３７℃で最大８日間インキュベートした。ＭＬＰ分化を８日間維持した。
表１は、成熟ＭＬＰおよび成熟ＭＫ細胞によるマーカー発現の比較フローサイトメトリー分析を示す表である。この分析は、凍結保存および規定された表現型のＭＫ細胞への引き続く分化の前のＰＶＥ−ＨＥ由来ＭＬＰ細胞の表現型を特徴付ける。
第２に、付着した細胞集団の上の浮遊ＭＬＰおよび半剥離ＭＬＰを、血清学的ピペットを使用して穏やかな力で洗浄することによって収集した。これらのＭＬＰを含む培地を、コニカルチューブ中に移し、３００×ｇで５分間遠心分離して、ＭＬＰを収集した。培地を廃棄し、ＭＬＰペレットを、リン酸緩衝食塩水中に再懸濁し、形態（図５）について、および表１に示されるマーカーを使用するフローサイトメトリーによって分析した。選択された結果が図４に示される。結果は、この段階で収集したＭＬＰが、２つの集団から主に（９０％を超えて）構成されることを実証しており、１つは、ＣＤ４１ａ＋ＣＤ３１＋ＣＤ３４＋ＣＤ１４−ＣＤ１３＋ＣＤ４２ｂ−によって示される比較的未成熟のＭＬＰ集団を特徴とし、１つは、ＣＤ４１ａ＋ＣＤ３１＋ＣＤ３４＋ＣＤ１４−ＣＤ１３＋ＣＤ４２ｂ＋によって示されるより成熟したＭＬＰ集団を特徴とする。
第３に、ＭＬＰ細胞を凍結保存した。簡潔に述べると、ＭＬＰの凍結保存を、１０％ＤＭＳＯを含む細胞凍結培地ＣＳ１０（Ｓｉｇｍａ）を使用して達成した。
（実施例３）
ヒトｉＰＳ−ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ由来巨核球（ＭＫ）からの成熟血小板の生成。
第１に、血小板分化の開始を、上記のとおりのヒトｉＰＳ−ＰＶＥ−ＨＥ由来ＭＬＰ細胞を使用して実施した。ＭＬＰを、基本培地としてのイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ヒト血清アルブミン、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ｂ−メルカプトエタノール、可溶性低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、コレステロール、ＴＰＯ ３０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ １ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６ ７．５ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−９ １３．５ｎｇ／ｍｌ、Ｙ２７６３２ ５μＭおよびヘパリン５〜２５単位／ｍｌから構成されるＭＫ培地（ＭＫ−Ｍ）中で非接着性表面上に播種した。次いで、細胞を、５％ＣＯ２中３７℃で３日間インキュベートした。
一部の例では、このＭＬＰを、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ハムＦ−１２栄養混合物、Ａｌｂｕｃｕｌｔ（ｒｈアルブミン）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、リノール酸、リノレン酸、ＳｙｎｔｈｅＣｈｏｌ（合成コレステロール）、モノチオグリセロール（ａ−ＭＴＧ）、ｒｈインスリン−トランスフェリン−セレン−エタノールアミン溶液、タンパク質フリーハイブリドーマ混合物ＩＩ（ＰＦＨＭＩＩ）、アスコルビン酸２ホスフェート、Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉ（Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン）、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＴＰＯ ３０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ １ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６ ７．５ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−９ １３．５ｎｇ／ｍｌ、Ｙ２７６３２ ５μＭおよびヘパリン５〜２５単位／ｍｌから構成される培養培地中で非接着性表面上に播種した。次いで、細胞を、５％ＣＯ２中３７℃で３日間インキュベートした。
第２に、ｉＰＳ−ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ由来の成熟化中のＭＫ細胞を分析した。血小板分化の開始の７２時間後に、非常に大きな倍数体ＭＫ（５０μＭ）が、成熟化の進行と共に豊富になった（図５ＡおよびＢ。５Ａ中のスケールバーは１００μＭであり、５Ｂ中のＮはＭＫの内側の核を示す）。７２〜９６時間の間から、伸長した仮足を有する前血小板形成性細胞が、顕微鏡により容易に観察され（図５Ａおよび５Ｃ、矢印によって示される）、ＣＤ４１ａ＋ＣＤ４２ｂ＋血小板粒子の新たに現れてくる量を、フローサイトメトリー分析によって検出した（図６）。図６中、「Ａ」中の細胞は、循環ヒト血小板であった、「Ｂ」はｈＥＳ−ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰである、「Ｃ」は末梢血由来ヒト血小板である、「Ｄ」はｉＰＳ−ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰである、および「Ｅ」はｈＥＳ−ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ）である。開始の８４時間後、ＣＤ４１ａ＋ＣＤ４２ｂ＋血小板の量は劇的に増加し、７０％もの高いレベルに達した（図６Ｄ）。
第３に、高品質の血小板を、少なくとも連続する３〜５日間および場合によってはそれより長くにわたる培養において成熟化中のＭＫを害することなく回収し、ＭＬＰからの血小板の収量を少なくとも３〜５倍に最大化した。血小板含有培地から大きなＭＫを分離するために、細胞懸濁物を５０×ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去し、ＭＫ細胞ペレットを新たなＭＫ−Ｍで再懸濁して、より多くの血小板を後に生成させた。前血小板、大きな細胞デブリおよび小さなＭＫから血小板を分離するために、ＢＳＡ／ＨＳＡ勾配沈降法を適用して、５０×ｇの遠心分離の上清から血小板のより純粋な集団を取得した。精製した血小板を、ＭＫ−Ｍで懸濁し、室温で維持した。粒度、透明度、サイズおよび細胞表面マーカー発現に関する血小板の品質を、ＦＡＣＳ分析によって特徴付け、末梢血由来ヒト血小板と比較した（図６Ａ〜Ｅ）。精製した血小板を、非接着性表面内で室温でＭＫ−Ｍ培地中で貯蔵し、機能的血小板の最小の喪失を確保した。
（実施例４）
ｉＰＳ−ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ由来巨核球（ＭＫ）由来の成熟血小板の分析。
第１に、ｉＰＳ−ＰＶＥ−ＨＥ−ＭＬＰ由来血小板（ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴ）を、形態について分析した。免疫蛍光および透過型電子顕微鏡分析を、以前に記載された方法に従って実施した（Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１１年２１巻：５３０〜４５頁）。ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴは、円盤状であり、循環ヒトＰＬＴと大部分は超微細構造的に同一であることが見出された（透過型電子顕微鏡によって実証されるように、図７）。ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴは、ＤＩＣおよびβ１−チューブリンＩＦ顕微鏡によって実証されるように、平均サイズで循環ヒトＰＬＴに匹敵した（２．３８μｍ±０．８５μｍ対２．２７μｍ±０．４９μｍ）（図８）。ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴは、ガラス上で伸展した−糸状仮足および葉状仮足の両方を形成する（図９に示されるＤＩＣ生細胞顕微鏡画像によって実証されるように）。ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴは無核であり、循環ヒトＰＬＴと同等であった（Ｈｏｅｃｈｓｔ染色によって実証されるように、図８）。ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴは、循環ヒトＰＬＴと比較して、正常なチューブリン細胞骨格を有するように見えた（β１−チューブリン標識化によって実証されるように、図８）。ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴは、循環ヒトＰＬＴと比較して、正常な線維状アクチンを有するように見えた（ファロイジン標識化によって実証されるように、図８）。ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴは、循環ヒトＰＬＴと比較して、正常なアルファ−顆粒発現を有するように見えた（図１０Ａおよび１０Ｂ中でＴＳＰ４およびＰＦ４標識化によって実証されるように）。
第２に、ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴを、活性化された血小板上の細胞接着分子発現を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化アッセイを使用して機能性について分析した。簡潔に述べると、２種の接着分子を、抗ＣＤ６２ｐ抗体およびＰＡＣ−１抗体を使用して分析した。ＰＡＣ−１は、αＩＩｂβＩＩＩインテグリンを認識する。ＣＤ６２ｐおよびαＩＩｂβＩＩＩは共に、活性化された血小板の表面上で発現される。このアッセイを、以前に記載された方法に従って実施した（Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１１年２１巻：５３０〜４５頁）。トロンビン曝露に応答して、ＰＡＣ−１およびＰ−セレクチン結合は共に増加した（図１１）。
第３に、ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴを、マクロファージ除去ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける血栓形成を測定するｉｎ ｖｉｖｏアッセイ系を使用して、機能性について分析した。簡潔に述べると、精巣挙筋細動脈の生体内顕微鏡を、以前に記載されたように実施した（Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１１年２１巻：５３０〜４５頁）。マクロファージ除去ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、ケタミン（１２５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（２５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって麻酔した。気管挿入し、マウスを、熱制御したブランケット上に配置した。陰嚢の切開後、精巣挙筋を生体内顕微鏡トレイ上に露出させた。筋肉調製物を、実験を通じて熱制御し（３７℃）通気した（９５％Ｎ２、５％ＣＯ２）炭酸水素塩緩衝食塩水で灌流した。精巣挙筋細動脈壁を、Ｍｉｃｒｏｐｏｉｎｔ Ｌａｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用してマイクロポイント（ｍｉｃｒｏｐｏｉｎｔ）レーザー焼灼によって傷害した。発達中のマウス血小板血栓を、頸静脈カニューレを介したＤｙｌｉｇｈｔ ６４９コンジュゲート化抗マウスＣＤ４２ｃ抗体（Ｅｍｆｒｅｔ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ、０．０５μｇ／ｇ体重）の注入によって可視化した。カルセインＡＭ標識したｈＰＬＴ、ｉＰＳＣ−ＰＬＴおよびＥＳＣ−ＰＬＴ、３×１０６個もまた、１００×ｇのＲｅｏＰｒｏありまたはなしで、マウス中に注入した。２〜４つの血栓が、１匹のマウスにおいて生成された。蛍光画像および明視野画像を、増幅器（Ｖｉｄｅｏ Ｓｃｏｐｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を介して６０×／１．０ＮＡ水浸対物レンズおよび高速カメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃ９３００）を備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６１Ｗ顕微鏡を使用して記録した。データを、血管壁傷害の後５分間にわたって収集し、Ｓｌｉｄｅｂｏｏｋ ｖ５．０（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）を使用して分析した。図１２Ａに示される結果は、ｉｎ ｖｉｖｏ環境においてｈｉＰＳＣ−ＰＬＴが血餅形成に寄与することを示す。ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴの機能的能力もまた、αＩＩｂβＩＩＩによって媒介されることが決定された。具体的には、ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴを、αＩＩｂβＩＩＩに特異的に結合し血小板機能を阻害するヒト−マウスキメラモノクローナル抗体のＦａｂ断片ＲｅｏＰｒｏで事前処理した（図１２Ｂ）。アスタリスクは、ＲｅｏＰｒｏで処理していない対照と比較した統計的に有意な差異を示す（対照と比較してｐ＜．０１、スチューデントｔ検定）。
第４に、注入後のマクロファージ除去ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるｈｉＰＳＣ−ＰＬＴの動態を決定した。ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴおよびＥＳＣ−ＰＬＴの動態がｉｎ ｖｉｖｏのｈＰＬＴの動態と類似しているかどうかを決定するために、ｉＰＳＣ−ＰＬＴまたはＥＳＣ−ＰＬＴを、マクロファージ除去ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス中に注入し、種々の時点で収集した血液を、フローサイトメトリーによって分析した。簡潔に述べると、マクロファージを、以前に記載されたように、リポソーム封入クロドロネートの静脈内注射によって除去した。クロドロネート−リポソームを、０日目（１００μｌ）および２日目（５０μｌ）に尾部静脈を介してマウス中に注射した。３日目に、ヒト血小板リッチ血漿を、２００×ｇで２５分間の、クエン酸ナトリウム処理血液の遠心分離によって取得し、０．５μＭ ＰＧＥ１および１０％クエン酸塩緩衝液の存在下で８００×ｇで１０分間遠心分離した。ペレットを、０．１５μＭ ＰＧＥ１および１０％クエン酸塩緩衝液を含むＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液で再懸濁し、８００×ｇで５分間遠心分離した。血小板を、０．１％脂肪酸フリーＢＳＡを含むＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液中に再懸濁した。単離されたヒト血小板（ｈＰＬＴ、１．５×１０７個）、本開示の人工多能性幹細胞由来血小板（ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴ、１．５×１０７個）および本開示の胚性幹細胞由来血小板（ＥＳＣ−ＰＬＴ、１．０×１０７個）を、マクロファージ除去マウス中に静脈内注入した。マウス血液３０μｌを、異なる時点（１０分、３０分、６０分、１２０分、２４０分、３６０分および４８０分）において頸静脈を介して収集し、ＡＰＣコンジュゲート化抗ヒトＣＤ４１およびＤｙｌｉｇｈｔ ４８８コンジュゲート化抗マウスＣＤ４２ｃ抗体を使用するフローサイトメトリーによって分析した。結果は、マクロファージ除去ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて、数時間にわたってｈｉＰＳＣ−ＰＬＴが循環することを実証している（図１３）。
（実施例５）
多能性細胞からの血小板の生成。
この実施例は、多能性幹細胞から血小板を生成するさらなる例示的な方法を提供する。
上述のように、ｈＥＳＣ−ＰＬＴおよびｈｉＰＳＣ−ＰＬＴは、ヒト胚性幹細胞および人工多能性幹細胞からｅｘ ｖｉｖｏで生成されたヒト血小板である。上記初期のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの特徴付けにより、ｈＥＳＣ−ＰＬＴおよびｈｉＰＳＣ−ＰＬＴの両方が、ヒトドナー血小板と形態学的および機能的に同等であることが実証されている。例えば、ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴは、ガラス基材上で伸展することができた。
バルク中間体（ＭＫ前駆体）の生成は、承認されたｈｉＰＳＣまたはｈＥＳＣマスター細胞バンク（ＭＣＢ）からのバイアルの解凍で開始する。バルク中間体の生成のためのプロセスのフローチャートが図１４Ａ〜Ｅに示される。１〜２百万個のｈｉＰＳＣまたはｈＥＳＣマスターあるいは作業用細胞バンクを含むクライオバイアルを、ｃＧＭＰ液体窒素貯蔵の蒸気相から取り出し、クリーンルーム（ＩＳＯクラス７）に移す。全ての処理を、認可されたバイオセイフティーキャビネット（ＩＳＯクラス５ ＢＳＣ）中で実施する。解凍およびＤＭＳＯを除去するための洗浄の後；細胞を、ｍＴｅＳＲ１規定培養培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ被覆容器上に播種する。細胞を凝集体として維持するように注意を払う。プレートを、日付、ロット番号および継代数で標識し、各ウェルの蓋を固有の数（例えば、１〜６）で標識する。播種したプレートを、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中に配置する。培養物を、立体顕微鏡および倒立光学顕微鏡を使用して毎日点検する。コロニーサイズ、分化の程度を含む細胞形態および培地の色に関する観察を、ワークシート上に記録する。ｍＴｅＳＲ１培地を、典型的には、培養物が６０〜９０％コンフルエントになるまで、１〜２日毎に交換する。形態およびコンフルエンス評価がその培養物の継代の必要性を示す場合、コロニーを細胞解離緩衝液を使用して回収する。細胞を凝集体として維持するように再度注意を払う。培養物を、ｍＴｅＳＲ１培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ被覆容器上に再播種する。回収されたｃｍ２および播種されるｃｍ２に基づいて、細胞を、典型的には、必要とされる幹細胞の収量に依存して、３〜７日毎に１：４〜１：８の比率で分割する。播種した培養物を、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中に戻す。幹細胞は、必要とされるロットサイズに依存して、造血性分化の誘発の前に１〜６回継代され得る。
造血性細胞分化のための播種の３日後、培養物を試験して、細胞の付着および成長を確認する。この段階では、培養物は、総表面積の１０％未満をカバーする付着した細胞を伴って、典型的には低密度である。十分に付着した細胞は、多能性幹細胞形態から、分化した細胞（明確なコロニー境界を有さずより拡散的に増殖し、核のサイズと比較して顕著により多い細胞質を有する大きな細胞）への顕著な推移を伴う成長を実証するはずである。
幹細胞の拡大増殖期が細胞収量の要件を満たすと推定されるときに、造血性分化を開始させる。代表の容器を、回収のために犠牲にし、単一細胞の懸濁物を創出する。その細胞濃度を定量して、培養物播種パラメーターを確立し、残りの細胞は廃棄する。コロニーを、細胞解離緩衝液を使用して注意深く回収し、１０ｕＭ Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫインヒビター）を補充したｍＴｅＳＲ１培地中において５，０００細胞／ｃｍ２の密度でＩＶ型コラーゲン被覆容器中に再播種する。播種した容器を、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中に配置する。
次の日、いずれの浮遊細胞クラスターの除去も最小化するように注意を払いつつ培地を除去し、組換えヒト（ｒｈ）ＢＭＰ−４ ５０ｎｇ／ｍｌ、ｒｈ ＶＥＧＦ ５０ｎｇ／ｍｌおよびｒｈ ｂＦＧＦ ５０ｎｇ／ｍｌを補充したＳｔｅｍＳｐａｎ ＡＣＦ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で置き換える。培養物を、低Ｏ２（約５％）、３７℃、５％ＣＯ２環境に移し、２日間静置する。２日後、培養物を細胞の付着および成長について形態学的に評価する。いずれの浮遊細胞クラスターの除去も最小化するように注意を払いつつ培地を除去し、新たな培地で置き換える。培養物を、さらに２日間にわたって、低Ｏ２（約５％）、３７℃、５％ＣＯ２環境に戻す。この期間の後、培地をもう１回交換し、培養物を正常酸素圧培養条件中に配置する。２日間の正常酸素圧培養の後、いずれの浮遊細胞クラスターの除去も最小化するように注意を払いつつ培養培地を除去し、５単位／ｍｌヘパリン、ｒｈ ２５ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯ、２５ｎｇ／ｍｌ ｒｈ ＳＣＦ、２５／ｎｇ ｒｈ ＦＬ、ｒｈ ＩＬ−６およびｒｈ ＩＬ−３を補充したＳＴＥＭｄｉｆｆ ＡＰＥＬ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を含むＭＬＰ培地で置き換える。これらの条件を、次の２〜６日間にわたって維持する。培養物は、浮遊ＭＫ前駆体の品質を評価するための形態学的評価を毎日受ける。培地交換は実施されないが、培養物が培地の枯渇を示し始めたとき（培養培地が黄色を呈する）に、さらなる培地を追加する。培養物を、定期的に試料採取し、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４２ｂ発現についてＦＡＣＳによってアッセイする。培養物の形態およびＣＤ４１ａ、ＣＤ４２ｂ発現（約≧１５％が二重陽性）が適切である場合、培養物を回収する。次いで、細胞を、１０％ジメチルスルホキシド、９０％胎仔ウシ血清凍結保存培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中において３〜５百万個の生存ＭＬＰ／ｍＬ／クライオバイアルで凍結保存する。凍結保存を、凍結コンテナ（Ｎａｌｇｅｎｅ）中にバイアルを配置し、次いで−８０℃のフリーザー中に１〜３日間貯蔵し、その後、ｃＧＭＰ液体窒素貯蔵システムの蒸気相に移すことによって、達成する。
最終生成物ｈＥＳＣ−ＰＬＴまたはｈｉＰＳＣ−ＰＬＴの生成プロセスを、承認されたバルク中間体の解凍で開始する。バルク中間体品質試験を合格した３〜５百万個のＭＬＰを含むクライオバイアルを、ｃＧＭＰ液体窒素貯蔵の蒸気相から取り出し、クリーンルームに移す。細胞を、３０ｎｇ／ｍｌ ｒｈ ＴＰＯ、１ｎｇ／ｍｌ ｒｈ ＳＣＦ、７．５ｎｇ／ｍｌ ｒｈ ＩＬ−６、１３．５ｎｇ／ｍｌ ｒｈ ＩＬ−９および５ｕＭ Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫインヒビター）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ ＡＣＦ培地中でおよそ２．３×１０５個／ｃｍ２で超低付着（ＵＬＡ）容器中に播種する。培養容器を、日付およびロット番号で標識し、各容器の蓋を固有の数（例えば、１〜６）で標識する。培養物を、加湿１０％ＣＯ２雰囲気中で３９℃で維持する。典型的には、この培養期の間に顕著な細胞拡大増殖は存在しない。培養に入っておよそ３〜４日で、大きな成熟中の巨核球（ＭＫ）が明白になる。培養物を、定期的な試料収集およびＣＤ４１ａ、ＣＤ４２ｂ発現についてのＦＡＣＳ分析によってモニタリングする。前血小板形成は、典型的には、５日間の培養の後に最初に観察される。前血小板形成が進行し、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４２ｂ発現がおよそ３０％〜７０％に増加した時に、培養物は回収され得る（６〜７日目）。
回収した培地を、５０×ｇで遠心分離して巨核球スラリーを除去する。上清を取り出し、１０００×ｇで遠心分離して血小板を濃縮する。血小板を再懸濁し、次いで、非連続的アルブミン（ヒト）（ＨＳＡ）勾配（１２％、１０％、７％、５％および２％）上にロードして、血小板をさらに単離する。血小板ＨＳＡ勾配を、８０×ｇで１５分間遠心分離する。血小板をこの勾配から回収し、ＰＧＥ１を懸濁物に添加して、活性化を防止する。血小板を、１０００ｇで１０分間の遠心分離によって濃縮する。現在、ｈＥＳＣおよびｈｉＰＳＣ血小板は、培養培地中に貯蔵されている。提案した研究を目的のために、４８〜７２時間の標的生成物安定性が調査される。予備研究は、貯蔵の前および後のＰＡＣ１結合結果によって決定したとき、最低２４時間の安定性を示している。
バルク中間体におけるＭＬＰ細胞集団のＦＡＣＳ分析（ＣＤ３１およびＣＤ４３）は、細胞のおよそ９８％が、造血性内皮系列または造血系列に傾倒しており、したがって、多能性を越えて分化したことを示している。
このプロセスのさらに下流では、製造のＭＫ分化およびＰＬＴ回収期の間に存在する細胞が、ｖＷＦ（フォン・ヴィルブランド因子）発現によって試験されている。製造のこの期にある細胞は、およそ１００％がｖＷＦ＋である。高度に分化した細胞集団の維持は、この培養物が、未分化前駆体のクローン性拡大増殖を経験していないことを示している。
予備研究は、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１ ＳＳＥ３、ＳＳＥ４およびアルカリホスファターゼについてのＩＦＡ染色によって分析したｈｉＰＳ由来ＭＫ細胞集団中の多能性細胞の完全な非存在を示している。多能性マーカーについてのＩＦＡ染色を使用したさらなる研究では、ｈＥＳ由来およびｈｉＰＳ由来のＭＬＰおよびＭＫの集団、ならびにＭＫから誘導された精製ＰＬＴを試験して、多能性細胞の存在についてスクリーニングしている。スパイキング研究が、種々の細胞集団中の幹細胞を検出するためにこのアッセイのＬＯＤを決定するために実施される。
予備研究が実施され、多能性マーカー（ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０）についてのＦＡＣｓ分析を使用して、ＭＫ集団を特徴付けている。ｈＥＳ細胞を１％および０．１％の濃度でＭＫと混合したスパイキング研究が実施されている。それらの結果は、０．１％の検出限界を示す。ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０についてＭＫを特徴付ける最初期研究は、ＭＫ集団において＜０．１％（検出のアッセイレベルを下回る）ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ−１−６０陽性細胞という結果を提供した。
図１４のステップ２〜３を参照すると、解離緩衝液で回収された幹細胞は、細胞凝集塊として取り除かれるので、正確な細胞計数は不可能である。この理由のために、代表の培養容器をＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡを使用して回収し、単一細胞の懸濁物を確保する。この懸濁物を、血球計数器において計数し、回収された細胞数を、ｃｍ２当たりで標準化する。次いで、計数に使用した細胞は廃棄する。残りの生成物培養物を解離緩衝液を使用して回収し、細胞収量を標準化された細胞／ｃｍ２×回収したｃｍ２に基づいて計算する。計算した細胞収量を使用して、造血性細胞分化を誘発するために播種容器についての必要とされる細胞密度／ｃｍ２を設定する。
図１４のステップ１０を参照して、ＭＬＰ培地中の２日目に開始してＭＬＰ培地中の６日目まで、細胞試料を代表の培養容器から採取し、プールし、ＦＡＣＳ分析によってＣＤ４１ａおよびＣＤ４２ｂ二重陽性細胞の百分率について評価する。ＣＤ４１ａは、フィブリノーゲン受容体（αＩＩｂβＩＩＩ）のサブユニットであり、ＣＤ４２ｂは、フォン・ヴィルブランド因子受容体（ＧＰＩｂ−Ｖ−ＩＸ）上のサブユニットである。両方の受容体の発現は、ＭＫ系列に特異的であり、両方とも血小板機能に必要とされる。初期系列の造血性内皮細胞はＣＤ４１ａ陰性であり、造血前駆体における後期段階の造血性分化の間にＣＤ４１ａを発現する。ＣＤ４２ｂは、成熟ＭＫにおいて排他的に発現される。この時点で、培養物は、高い割合のＣＤ４１＋細胞および低い割合のＣＤ４２＋細胞を伴って、不均一である（Ｐｉｎｅａｕｌｔら、Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ ａｎｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１２年；７８８巻：２１９〜４７頁）。
試料調製およびＦＡＣＳ分析を、以下のように実施する。簡潔に述べると、浮遊細胞を収集し、プールする。血清学的ピペットを使用して、増殖培地の穏やかな流れを、培養物表面に向けて方向付けて、全ての緩い接着性のＭＬＰを剥離させ、自由に浮遊する細胞と共にプールする。十分に懸濁しプールした細胞の試料（１００〜２００μＬ）を収集し、遠心分離する（１６０×ｇで５分間）。そのペレットを、ＤＰＢＳ中に再懸濁し、再度遠心分離し、ＣＤ４１ａ−ＡＰＣコンジュゲート化（アロフィコシアニン）およびＣＤ４２ｂ−ＰＥコンジュゲート化（フィコエリトリン）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を含むＤＰＢＳ＋３％ＦＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中に再懸濁する。蛍光コンジュゲート化抗体および適切なアイソタイプ対照（マウスＩｇＧ１ｋ−ＡＰＣおよびマウスＩｇＧ１ｋ−ＰＥ）を、室温で１５分間存在下でインキュベートする。次いで、標識された細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中に希釈し、遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁する。ＦＡＣＳ分析を、１０，０００の事象をモニタリングすることによって実施する。二重陽性（ＣＤ４１ａ＋ＣＤ４２ｂ＋）ＭＬＰを発現する細胞の許容可能な百分率を有する培養物を、回収し、凍結保存する。暫定の最低仕様は、１０％二重陽性細胞である。ｈｉＰＳＣから誘導されたＭＬＰについての代表的な２次元ドットプロットが、図１５に示される。この図では、細胞集団は、二重陽性染色集団２９．９％で、８６．４％ＣＤ４１ａ＋；３１．２％ＣＤ４２ｂ＋である。
凍結保存のための回収の前に、ＭＬＰ培養物を、付着した細胞のおよその百分率、および低い核対細胞質比を有する分化した大きな細胞の程度について評価する。付着した細胞は、明確なコロニー境界を有さない拡散コロニーとして表れるはずである。付着した細胞集団の上に静止している豊富な浮遊ＭＬＰが存在するはずである。生存浮遊ＭＬＰは、最小の複屈折で、平滑な細胞膜によって境界が定められて、明確に目に見えるはずである。典型的には、１ｃｍ２の表面積が、１日当たり５，０００〜１５，０００個のＭＬＰを生成する。ｈｉＰＳＣ株ＭＡ−ｉＰＳ−０１から誘導されたＭＬＰの代表的集団の顕微鏡写真を図１６に示す（Ｈｏｆｆｍａｎ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｃｏｎｔｒａｓｔ、×４００）。
凍結保存のＭＬＰの前に、生存細胞計数を、血球計数器を使用したトリパンブルー排除によって実施する。細胞を、生存細胞数およびパーセント生存度について評価する。代表のバイアルを、マイコプラズマおよび無菌性について試験する。
さらに、凍結保存されたＭＬＰの代表のバイアルを、以下のように、ＣＤ３１およびＣＤ４３発現について評価する。ＣＤ３１は、内皮系列および造血系列の両方において発現される造血性内皮細胞のマーカーである。ＣＤ４３の発現によって、造血傾倒が確認される。凍結保存されたＭＬＰの試料バイアルを解凍し、リンスし、ＤＰＢＳ＋３％ＦＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中に再懸濁し、遠心分離する（１６０×ｇで５分間）。そのペレットを、ＣＤ３１−ＡＰＣコンジュゲート化（アロフィコシアニン）およびＣＤ４３−ＦＩＴＣコンジュゲート化（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を含むＤＰＢＳ＋３％ＦＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中に再懸濁する。解凍したＭＬＰの試料を、蛍光コンジュゲート化抗体および適切なアイソタイプ対照（マウスＩｇＧ−ＡＰＣおよびマウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ）と共に、室温で１５分間インキュベートする。次いで、標識された細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中に希釈し、遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁する。ＦＡＣＳ分析を、１０，０００の事象をモニタリングすることによって実施する。許容可能なＭＬＰバンクは、＞／＝５０％のＣＤ３１陽性細胞および＞／＝５０％のＣＤ４３陽性細胞を有する。ｈｉＰＳＣ株ＭＡ−ｉＰＳ−０１から誘導されたＭＬＰについての代表的な２次元ドットプロットが、図１７に示される。示される実施例では、細胞集団は、二重陽性染色集団９８．４％で、９９．８％ＣＤ３１＋；９８．５％ＣＤ４３＋である。
さらに、凍結保存されたＭＬＰの代表のバイアルを、多能性マーカー、例えばＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０を利用してＦＡＣＳ分析によって評価して、多能性細胞の非存在を確認する。
凍結保存されたＭＬＰの試料クライオバイアルを解凍し、解凍後の生存度および回復について評価する。ＭＬＰを、前血小板形成の時点までさらに処理し、ＭＫ成熟化の間の形態ＭＫ形態、ならびにＣＤ４１ａ＋およびＣＤ４２ｂ＋についてのＦＡＣＳ分析について評価した。培養物を、前血小板形成および血小板形成ならびに二重染色された（ＣＤ４１ａ＋およびＣＤ４２ｂ＋）細胞についてのＦＡＣＳ分析による特徴付けについてモニタリングする。許容基準には以下が含まれる：無菌性（＜ＵＳＰ２１＞浸漬試験で陰性）、マイコプラズマについて陰性（直接（寒天およびブロス）、間接（細胞培養物）によって試験する）、ＦＡＣＳによってＣＤ３１およびＣＤ４３について少なくとも９０％陽性、トリパンブルーによって少なくとも７０％の生存度、ならびに多能性細胞マーカーの発現について陰性。
図１４のステップ１３〜１４を参照して、ＭＬＰの解凍および播種の２〜３日後、培養物を、ＭＫ系列である自由に浮遊する細胞の出現について評価する。この時点で、細胞は、直径１０〜５０ミクロンの範囲で、サイズが不均一である。生存細胞のおよその割合を、明るい細胞質および平滑な細胞膜を示す健康なＭＫ先駆細胞およびＭＫについて、倒立光学顕微鏡での視覚的観察によって評価する。ｈＥＳＣから誘導されたＭＫの代表的集団の顕微鏡写真を図１８に示す（Ｈｏｆｆｍａｎ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｃｏｎｔｒａｓｔ、×４００）。
図１４のステップ１３〜１４を参照して、ＭＬＰの解凍の２〜３日後、細胞試料を、代表の培養容器から取り出し、プールし、処理し、ＣＤ４１ａおよびＣＤ４１ｂに対する蛍光コンジュゲート化抗体で標識し、ＦＡＣＳ分析を受けさせる。ＣＤ４１ａ＋およびＣＤ４２ｂ＋の両方のＭＬＰを発現する細胞の許容可能な百分率を有する培養物を、さらに処理する（好ましくは少なくとも１０％の二重陽性細胞）。
図１４のステップ１５を参照して、ＭＬＰの解凍後３日目に開始して５日目まで、ＭＫ培養物を、前血小板の出現について評価する。図１９中の矢印は、前血小板形態を示す。前血小板を示すＭＫは、断片化の前に、細胞から伸びいくらかのビーズ化および枝分かれを示す長い突起を示す。
図１４のステップ１５〜１６を参照して、前血小板の存在を確認する際に、ＭＬＰの解凍後３日目に開始して８日目まで、前血小板および血小板の試料を、代表の培養物から収集する。簡潔に述べると、１０ｍＬの血清学的ピペットを使用して、試料を、５０ｍＬのコニカルチューブに移し、少なくとも５回吸い上げ、吐き出して、前血小板を砕くのに十分な剪断力を生成する。試料を、１０％ＣＯ２でガス供給した３９℃のインキュベーターに戻し、３０分間静置させる。懸濁された血小板を含むおよそ２５０μＬの上清を染色し、ＣＤ４１ａおよびＣＤ４２ｂについてのＦＡＣＳ分析を受けさせる。血小板の回収および引き続く処理を、血小板のピークレベルが検出されたとき、典型的には、血小板の３０〜７０％が二重陽性染色（ＣＤ４１ａ＋ＣＤ４２ｂ＋）されたときに、開始する。
ｈｉＰＳＣ−ＰＬＴおよびｈＥＳＣ−ＰＬＴを、ｐＨ、血小板計数および正体（ＣＤ６１、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４２ｂの発現によって決定される）、血小板活性化マーカー（ＣＤ６２Ｐ、ＰＡＣ１、血小板因子４）の発現、生理学的応答（凝集（マイクロプレートアッセイ）、ＴＥＧ（トロンボエラストグラフィー）および伸展）について特徴付け、電子顕微鏡ならびにβ１チューブリン染色と共にＤＩＣ顕微鏡によって形態学的に評価する。
細胞を、無菌性（＜ＵＳＰ２１＞浸漬試験の陰性結果）、内毒素（５ＥＵ／ｍｌ未満のゲル血餅ＵＳＰ＜８５＞）、マイコプラズマ（ヨーロッパ薬局方および米国薬局方の試験による陰性結果）、正体（ＦＡＣＳによるものであり、少なくとも７０％のＣＤ４１ａ＋、ＣＤ４２ｂ＋）、ＰＬＴ計数／ｍｐＰＬＴ（ＣＤ６１についてのＦＡＣＳ）、形態（β１チューブリン染色と共にＤＩＣ顕微鏡）、およびＰＡＣ１結合（活性化）による潜在力について、さらに試験する。
精製した血小板を、ＣＤ４１ａおよびＣＤ４１ｂに対する蛍光コンジュゲート化抗体で染色し、上記のようにＦＡＣＳ分析を受けさせた。ｉＰＳ−０１から誘導されたＰＬＴの代表的な２次元ドットプロットが以下に示される。図２０に示される実施例では、集団は、二重陽性染色集団６８．２％で、８１．８％ＣＤ４１ａ＋；６９．２％ＣＤ４２ｂ＋である。
図２０で実施したＣＤ４１ａ＋、ＣＤ４２ｂ＋ＦＡＣＳと併せて、ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｎｅ）（ＰＩ）を、ＣＤ染色の間に試料に添加して、生存度を評価する。ＦＡＣＳ分析を、以前に記載したように、１０，０００の事象を計数して実施し、さらなる事象を、フローチャネル３において収集して、ＰＩ陽性事象（非生存血小板）を検出する。データを分析して、ＣＤ４１ａ＋／ＣＤ４１ｂ＋血小板の百分率、およびパーセント生存度（検出された総血小板−ＰＩ＋血小板／検出された総血小板）を得る。
血小板の各最終生成物ロットを、フローサイトメトリー分析を使用してＣＤ６１陽性事象を検出することによって、血小板の数および血小板微粒子の数について評価する。このアッセイを、既知の数の蛍光ビーズを使用して実施して、データを標準化し、ＰＬＴ／μＬおよびｍｐＰＬＴ／μＬの絶対数を取得する。簡潔に述べると、血小板の５〜１０μＬ試料を、０．９％生理食塩水中に希釈し、２つのチューブのそれぞれの中に分配する：
１）６０μＬ／チューブの最終反応容量中に、既知の数の蛍光ビーズおよびフィコエリトリンコンジュゲート化抗ＣＤ６１ ＩｇＧと共に凍結乾燥ペレットを含む１つのＴｒｕＣｏｕｎｔ（ＢＤカタログ番号３４０３３４）チューブ、ならびに
２）６０μＬ／チューブの最終反応容量中に、非特異的一次抗体結合を説明するためにＰＥコンジュゲート化マウスＩｇＧを含む１つのアイソタイプ対照チューブ。
チューブを穏やかに混合し、２０〜２４℃で２０分間インキュベートし、その後４００μＬの冷（２〜８℃）１％ホルムアルデヒドを添加し、冷所で貯蔵し、２時間にわたって光から保護する。固定した血小板試料を分析する前に、データ獲得の適切な領域についてのピークチャネル、ゲーティング、軸、象限位置およびマーカー境界に関するＦＡＣＳ機械設定を、０．９％生理食塩水中に希釈した１μＭの均一な直径を有する新たに超音波処理したラテックスビーズ（ＣＭＬカタログ番号Ｃ３７４８３）の試料から、最低１０，００の事象を収集することによって決定する。これらの設定を適用した後に、最低１００，０００の事象を、アイソタイプ対照およびＣＤ６１染色試料について獲得する。ＣＤ６１試料で取得された計数は、ＣＤ−６１陽性蛍光染色ＰＬＴ、ＣＤ−６１陽性ｍｐＰＬＴについて、および検出されたＴｒｕｃｏｕｎｔ蛍光ビーズの数についての事象を登録する。予め設定した領域中で計数された事象を、血小板サイズ範囲２〜４ミクロンにおいて、およびアイソタイプ対照において検出された非特異的結合に対して補正されたｍｐＰＬＴ象限において分析する。データを、製造業者によって提供されるチューブ１つ当たりのＴｒｕｃｏｕｎｔビーズの既知の数に基づき、以下の式を使用して、検出されたＴｒｕｃｏｕｎｔビーズの効率に対して標準化する。
計数された事象数／計数されたビーズ数×チューブ１つ当たりのＴｒｕＣｏｕｎｔビーズ数／試料容量＝ｍｐＰＬＴ／μＬまたはＰＬＴ／μＬ。
さらに、顕微鏡検査を利用して、ｈＥＳＣ−ＰＬＴおよびｈｉＰＳＣ−ＰＬＴの形態を評価する。形態を、微分干渉顕微鏡（ＤＩＣ）によって、および血小板に固有の微小管の特徴的外周バンドにおけるβ１−チューブリンについての染色を確認することによって、評価する。簡潔に述べると、血小板を、４％ホルムアルデヒド中で固定し、１μｇ／ｍｌポリ−ｌ−リシン被覆カバーガラス上に遠心分離し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過処理し、免疫蛍光ブロッキング緩衝液（５０ｍｌ ＰＢＳ中、０．５ｇ ＢＳＡ、０．２５ｍｌの１０％アジ化ナトリウムおよび５ｍｌ ＦＣＳ）中で抗体標識化前に最低２時間ブロッキングする。透過処理した細胞の境界を確定するために、試料を、Ｃ末端ペプチド配列ＣＫＡＶＬＥＥＤＥＥＶＴＥＥＡＥＭＥＰＥＤＫＧＨ（Ｇｅｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．）（配列番号１）に対して生成されたヒトβ１−チューブリンに対するウサギポリクローナル一次抗体と共にインキュベートする。次いで、試料を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８ｎｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）にコンジュゲート化した二次ヤギ抗ウサギ抗体で処理し、インキュベーションの間およびインキュベーションの後に、ＰＢＳで広範に洗浄する。カバーガラスを、顕微鏡スライド上にマウントする（Ａｑｕａ Ｐｏｌｙｍｏｕｎｔ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）。背景対照として、スライドを、二次抗体単独と共にインキュベートし、画像を調整して抗体の非特異的結合を説明する。試料を、油浸対物レンズまたは微分干渉対物レンズを備えた顕微鏡で試験する。画像を、電荷結合素子カメラを使用して取得する。画像を、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ画像分析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）およびＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）を使用して分析した。静止血小板の特徴的特性を、以下のように評価する：微分干渉（ＤＩＣ）顕微鏡：ディスク形状、直径およそ２〜３μＭ β１−チューブリン染色：静止血小板と類似した直径を有する微小管の顕著な外周バンド。図２１を参照のこと。
血小板（ｈＥＳＣ−ＰＬＴおよびｈｉＰＳＣ−ＰＬＴ）をさらに試験して、多能性細胞の非存在を（例えば、多能性マーカーを検出するためのＰＣＲ、免疫蛍光および／またはＦＡＣＳによって）確認する。感度を増強するために、検出方法は、低速遠心分離と併せたフィルター、マトリックスまたは勾配で捕捉することによって潜在的な細胞汚染物を濃縮して細胞をペレット化する一方、上清中に血小板を残す手順と組み合わされ得る。
血小板（ｈＥＳＣ−ＰＬＴおよびｈｉＰＳＣ−ＰＬＴ）を、浸漬方法、ＵＳＰ＜２１＞、ＣＦＲ ６１０．１２に従って、微生物の存在についてさらに試験する。
血小板（ｈＥＳＣ−ＰＬＴおよびｈｉＰＳＣ−ＰＬＴ）を、内毒素についてさらに試験する。グラム陰性細菌内毒素を、Ｐｙｒｏｔｅｌｌ（登録商標）Ｇｅｌ Ｃｌｏｔ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．）を使用して定量する。適切な陰性対照、陽性対照および陽性生成物対照を調製する。陽性生成物対照は阻害対照であり、標準的な内毒素が添加される標本または標本の希釈物からなる。試料を、Ｐｙｒｏｔｅｌｌ（登録商標）試薬に直接添加し、完全に混合する。反応チューブを、３７℃±１℃で６０±２分間インキュベートする。陽性試験は、チューブを反転させたときに崩壊しないゲルの形成によって示される。内毒素を、一連の標本希釈物の中から終点を見出すことによって定量する。一連の内毒素の非存在下では、既知の濃度の陽性対照が、この試験に含まれ得る。この内毒素アッセイは、ＰＬＴ試料に対する使用について検証され、内毒素検証に関する１９８７年のＦＤＡガイダンスと一致する様式で実施される。
血小板（ｈＥＳＣ−ＰＬＴおよびｈｉＰＳＣ−ＰＬＴ）を、マイコプラズマについてさらに試験する。ＨＳＡ勾配を実施する前の血小板の遠心分離後、上清（例えば、順化ＳｔｅｍＳｐａｎ ＡＣＦ培地からなる）を収集し、プールする。最終生成物バッチおよび順化培地から精製した血小板の試料を、マイコプラズマ試験に送る。マイコプラズマ検出を、指標細胞培養物上での間接的培養ならびに寒天プレート上およびブロス中への直接的接種を用いて、ヨーロッパ薬局方および米国薬局方のガイドラインに従って実施する。
（実施例６）
血小板潜在力およびＰＡＣ−１結合についてのアッセイ。
本開示の血小板は、この実施例に記載する方法を使用して、潜在力および／またはＰＡＣ−１結合について評価され得る。
血小板活性化は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体のフィブリノーゲン受容体機能を活性化して増強されたリガンド結合をもたらす、αＩＩｂβ３インテグリンにおけるコンフォメーション変化をｉｎ ｖｉｖｏで誘発する。活性化された血小板は、脈管傷害の部位においてフィブリノーゲンおよびフォン・ヴィルブランド因子を含む基質に結合し、血栓形成を刺激する。血小板活性化の際に生じる機能的αＩＩｂβ３インテグリン発現の程度を決定するために、ｈＥＳＣ−ＰＬＴ、ｉＰＳＣ−ＰＬＴおよび精製正常ヒト血小板を活性化し、静止対照ＰＬＴと比較したＰＡＣ−１結合の程度について評価する。ＰＡＣ−１は、αＩＩｂβ３インテグリンの活性化コンフォメーションに排他的に結合するフィブリノーゲン模倣物である。
ＰＬＴを計数し、最低１００，０００個のＰＬＴを取り出し、およそ２０ＰＬＴ／ｕＬの密度まで、さらなる培地で希釈する。ＰＡＣ１−ＦＩＴＣ（ＢＤ、１：１００希釈）ならびに抗体（ＣＤ４１ａ−ＡＰＣコンジュゲート化（アロフィコシアニン）１：１００およびＣＤ４２ｂ−ＰＥコンジュゲート化（フィコエリトリン）１：１００（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を、ＰＬＴ試料に添加する。試料の半分（２５０ｕＬ）を、２つの５ｍＬ ＦＡＣＳチューブの各々中に分配する。１つのチューブに、トロンビン（Ｓｉｇｍａ）を、１Ｕ／ｍＬの最終濃度になるように添加する。トロンビンに曝露させた活性化ＰＬＴおよび対照試料を、室温で１５〜２０分間インキュベートする。試料は、対照としてヒト血液血小板を使用して決定される前方散乱対側方散乱ゲーティングを用いたＦＡＣＳ分析を受ける。活性化したものにおけるＣＤ４１ａおよびＰＡＣ−１陽性事象の数を、非活性化対照におけるＣＤ４１ａおよびＰＡＣ−１陽性事象の数と比較することによって、ＰＡＣ−１結合（活性化）を定量する。
（実施例７）
剪断力下で生成された血小板の収量および純度を改善するためのＭＭＰインヒビターなどのプロテアーゼの使用。
本開示は、剪断力条件を使用する血小板生成法もまた包含する（例えば、培養培地は培養の間流れている）。この培養を、数十マイクロリットル／分の範囲内の流速が造血の間の骨髄腔中の剪断力に近いマイクロ流体デバイスを使用して実施した。一部の例では、この流速は、５〜２５マイクロリットル／分の範囲内である。本開示に従ってｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞から生成された巨核球は、剪断力下で培養した場合、はるかにより効率的に、血小板を脱落することが見出されている。
ＭＬＰを培養するために使用されるデバイスは、付着なしにＭＬＰを固定化することができなければならない。一部の例では、これは、ＭＬＰが、動いている培養培地にアクセス可能であるがそれら自体は顕著に動くことができないデバイスの領域またはチャンバー内に位置付けられることを意味する。
本開示では、血小板の収量および純度がこれらの培養系において改善され得ることを認識している。一態様では、この改善は、剪断力培養の間の１種または複数の特定のプロテアーゼインヒビターの使用によって達成される。この実施例は、これらの培養条件の間にマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）インヒビターを添加することの利益を実証している。ＭＭＰインヒビターは、プラスミノーゲン活性化因子インヒビターなどであるがこれに限定されない、これらの方法で同様に使用され得る他のプロテアーゼインヒビターの代表であることを理解すべきである。
別の一態様では、血小板の収量および純度における改善は、増加した剪断力で培養を実施することによって達成される。この剪断力は、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４または４．５ダイン／ｃｍ２であり得る。
ＨＡ−ｉＰＳおよびＭＡ０９ ｈＥＳ株から誘導した成熟ＭＫを使用した。ＭＫ特異的培地中に懸濁した等しい数のＭＫを、２０μＭのＭＭＰインヒビターＧＭ６００１の存在下または非存在下でマイクロ流体デバイス中にロードした。一定の剪断力を、培養期間を通じてＭＫに適用した。ＭＫの下流のＭＫ−培地を、６時間の期間にわたって３０分間隔で収集した。収集した培地中の血小板の数および純度（即ち、ＣＤ４１ａ＋ＣＤ４２ｂ＋である総細胞の百分率）を、フローサイトメーターを使用して測定した。
図２２〜２４は、ＨＡ−ｉＰＳから誘導されたＭＫからの血小板生成の結果を提供する。血小板を、［提供してください（ＰＬＥＡＳＥ ＰＲＯＶＩＤＥ）］μＬ／分の流速によって規定される一定の剪断力下で生成した。培養の開始時でのＭＭＰインヒビターＧＭ６００１の添加は、新たに生成された血小板の純度（図２２）および収量（図２４）を顕著に改善した。純度は、ＣＤ４１ａ＋ＣＤ４２ｂ＋である回収された総細胞の百分率で表される。８％デキストランを添加することによって培養培地の粘度を増加させることは、血小板形成に対して負の影響を有した。
図２３は、ＭＭＰインヒビターＧＭ６００１が存在する場合に、顕著により多い血小板が剪断力培養下でＭＫから生成されたことを実証している。
図２４は、ＭＭＰインヒビターＧＭ６００１もしくはＤＭＳＯの存在下での剪断力培養における、または静置培養下での、血小板収量における差異を実証している。
図２５は、ＭＡ０９（ＥＳ）由来ＭＫを使用して血小板を生成した場合に同様の結果が達成されることを実証している。図２５および２６は、剪断力の中程度の変化（１２〜１６μＬ／分の流速変化によって示される）もまた、血小板の純度および収量を改善することも実証している。
（実施例８）
静置培養での血小板形成において有用な保護的インヒビターとしての、ＭＭＰ８特異的インヒビター。
プロテアーゼ、例えばＭＭＰは、ＧＰＩｂαとも呼ばれるＣＤ４２ｂの脱落に関与する。血小板ＣＤ４２ｂは、ｖＷＦの受容体であり、創傷治癒における初期の血小板関与を媒介する。したがって、ＣＤ４２ｂの喪失は、低い血小板品質を生じ得る。広域スペクトルのＭＭＰインヒビターＧＭ６００１は、血小板からのＣＤ４２ｂの脱落を阻害することが報告されている。
いくつかの特異的ＭＭＰインヒビターを使用した比較研究では、ＭＭＰ８インヒビターは、血小板機能を保護することにおいて、ＧＭ６００１よりも高い潜在力を有すると識別された。図２６に示すように、ＭＫの血小板生成のピーク時におけるＭＭＰ８特異的インヒビターの添加は、ｉＰＳ由来血小板の純度を、４３．７％から６５．５％に顕著に改善し、後者は、ＧＭ６００１処理した培養物から取得されたものよりも、およそ１０％高い。顕著により多いＣＤ４１ａ＋ＣＤ４２ｂ＋血小板が、ＧＭ６００１と比較して、ＭＭＰ８特異的インヒビターの存在下で生成される。ＭＭＰ８特異的インヒビターおよびＧＭ６００１を組み合わせて使用した場合、純度レベルは影響を受けないように見えるが（図２７）、血小板収量は増加される（図２８）。血小板生成のピークは、培養物中の血小板含有量を測定することによって決定される（例えば、数日間にわたり毎日）。これは、典型的には、ＭＬＰ分化培養期間の開始の４〜７日後であるが、より長くてもよく、またはシフトしていてもよい。
図２７および２８中のデータは、ｉＰＳ由来巨核球を使用して生成したものであるが、本開示は、骨髄および臍帯血ＣＤ３４＋前駆細胞などの、血小板の天然に存在する供給源の培養におけるＭＭＰ８特異的インヒビターの使用を提供する。
（実施例９）
昇温でのｉＰＳ血小板生成。
図２９および３０は、穏やかな温熱条件下で巨核球を培養することで、血小板の純度および収量の両方が顕著に改善されたことを実証している。ＣＤ４１ａ＋ＣＤ４２ｂ＋血小板の百分率は、３７℃よりも３９℃でインキュベートした培養物において有意に高い。この効果は、血小板生成のピークに達する前に最も明白である。純度を改善することに加えて、巨核球のより高い温度でのインキュベーションは、同じ出発数の巨核球に由来する血小板のより高い収量にも寄与し、これは、昇温が本明細書で提供される培養系において巨核球または血小板に対して有害な影響を有さないことを示している。
（実施例１０）
ｉＢＥＴは、ｃ−ｍｙｃ遺伝子の下方調節を介して、巨核球傾倒を促進し、全体的血小板収量を増加させる。
巨核球系列特異的分化の本発明者らの新たな方法では、血小板生成に最も適した巨核球前駆体の出現が、ＰＶＥ−ＨＥ細胞培養期間の開始から３〜４日の短い期間中でのみ回収され得る。骨髄系列ＣＤ１４＋細胞の段階的増加は、巨核球の品質および血小板の収量における減少と関連するようである。巨核球前駆体のより高くより良い収量を達成するための試みにおいて、ｃ−ｍｙｃ遺伝子を、新規巨核球促進性因子を同定することを目的として、初期巨核球形成の間の重要な調節遺伝子として標的に定めた。
ＧＳＫ１２１０１５１Ａ（Ｉ−ＢＥＴ１５１）は、ブロモドメインのＢＥＴファミリーの経口投与可能なイミダゾロノキノリン（ｉｍｉｄａｚｏｌｏｎｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）ベースのインヒビターである。Ｉ−ＢＥＴ１５１は、初期細胞周期停止およびアポトーシスの誘発を介して、ヒトおよびマウスのＭＬＬ−融合白血病細胞株に対して著明な効力を有することが示された。作用の様式は、クロマチンを介したＢＲＤ３／４、ＰＡＦｃおよびＳＥＣ成分の置き換えを介した重要な遺伝子（ＢＣＬ２、Ｃ−ＭＹＣおよびＣＤＫ６）の転写の阻害に、一部起因する。
高用量のｉ−ＢＥＴ−１５１は、大量のアポトーシスを惹起するが、マイクロモル濃度範囲（またはマイクロモル濃度未満の範囲）のより低い用量でｉｎ ｖｉｔｒｏの巨核球形成を起こしている細胞を処置することで、ＭＫ前駆体の数の増加が生じた。図３１は、定量的ｍＲＮＡ分析を介して、ｉ−ＢＥＴ−１５１によるｃ−ｍｙｃ遺伝子発現の用量依存的阻害を実証している。対照的に、前ＭＫ遺伝子ＧＡＴＡ１遺伝子は、ｉ−ＢＥＴ−１５１に応答して上方調節された（図３２）。ｉ−ＢＥＴ−１５１による処理は、ＣＤ１４＋骨髄細胞の数における用量依存的減少もまた生じた。
したがって、ｉＰＳ由来（およびＥＳ由来）巨核球および血小板のｉｎ ｖｉｔｒｏの生成のために本明細書に提供される方法を使用して、巨核球形成を起こしている細胞における内因性ｃ−ｍｙｃ遺伝子発現の抑制が、ＭＫ系列に有利な細胞分化のバランスを変化させ得ることが、さらに発見されている。

Claims (73)

  1. 少なくとも１０８個の血小板を含む、ヒト患者における使用に適切な医薬調製物であって、該調製物が白血球を実質的に含まず、該血小板の実質的に全てが機能的である、医薬調製物。
  2. １０９〜１０１４個の血小板、任意選択で、１０９個、１０１０個、１０１１個、１０１２個、１０１３個または１０１４個の血小板を含む、請求項１に記載の医薬調製物。
  3. 前記血小板が、以下の属性：９．７〜１２．８ｆＬの平均血小板容量範囲；前記調製物中のサイズの単峰型分布；および／または１標準偏差が２μｍ３未満（好ましくは、１．５μｍ３未満、１μｍ３未満またはさらには０．５μｍ３未満）である対数正規型血小板容量分布のうち１つまたは複数を有する、請求項１〜２のいずれか一項に記載の医薬調製物。
  4. 前記血小板が、以下のマーカー：ＣＤ４１ａおよびＣＤ４２ｂのうち少なくとも１つについて陽性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の調製物。
  5. 前記血小板がヒト血小板である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の調製物。
  6. 前記血小板の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％が、室温での貯蔵後少なくとも２、３または４日間にわたって機能的である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の調製物。
  7. フィーダー細胞なしに機能的血小板を生成する弱い接着性のまたは非接着性の巨核球を有するバイオリアクター。
  8. 少なくとも１０９個のＭＬＰを含む組成物。
  9. ＭＬＰを含む凍結保存組成物。
  10. 凍結保存されたＭＬＰを含むバンク。
  11. 前記ＭＬＰが、規定されたＨＬＡ型のものである、請求項９または１０に記載の凍結保存組成物またはバンク。
  12. 患者に対してＨＬＡがマッチしている、請求項９に記載の凍結保存組成物。
  13. １０９〜１０１４個のＭＬＰ、任意選択で１０９個、１０１０個、１０１１個、１０１２個、１０１３個または１０１４個のＭＬＰを含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の凍結保存組成物またはバンク。
  14. 巨核球から血小板を生成するための方法であって、
    ａ）巨核球の非接着性培養物を提供するステップ；
    ｂ）該巨核球をＴＰＯまたはＴＰＯアゴニストと接触させて、培養において前血小板の形成を引き起こすステップであって、該前血小板が血小板を放出するステップ；および
    ｃ）該血小板を単離するステップ
    を含む方法。
  15. 巨核球から血小板を生成するための方法であって、
    ａ）巨核球の非接着性培養物を提供するステップ；
    ｂ）該巨核球を、造血拡大増殖培地ならびに任意選択で（１）ＴＰＯもしくはＴＰＯアゴニスト、ＳＣＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−９または（２）ＴＰＯもしくはＴＰＯアゴニスト、ＳＣＦおよびＩＬ−１１と接触させて、培養中において前血小板の形成を引き起こすステップであって、該前血小板が血小板を放出するステップ；および
    ｃ）該血小板を単離するステップ
    を含む方法。
  16. 前記ＴＰＯアゴニストが、ＡＤＰ、エピネフリン、トロンビン、コラーゲン、ＴＰＯ−Ｒアゴニスト、ＴＰＯ模倣物、第２世代血小板新生剤、ロミプロスチム、エルトロンボパグ（ＳＢ４９７１１５、Ｐｒｏｍａｃｔａ）、組換えヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）、ペグ化組換えヒト巨核球増殖発達因子（ＰＥＧ−ｒＨｕＭＧＤＦ）、Ｆａｂ ５９、ＡＭＧ ５３１、Ｐｅｇ−ＴＰＯｍｐ、ＴＰＯ非ペプチド模倣物、ＡＫＲ−５０１、モノクローナルＴＰＯアゴニスト抗体、ポリクローナルＴＰＯアゴニスト抗体、ＴＰＯミニボディ、ＶＢ２２Ｂ ｓｃ（Ｆｖ）２、ドメインサブクラス変換ＴＰＯアゴニスト抗体、ＭＡ０１Ｇ４Ｇ３４４、組換えヒトトロンボポエチン、組換えＴＰＯ融合タンパク質またはＴＰＯ非ペプチド模倣物のうち１つまたは複数を含む、請求項１４または１５に記載の方法。
  17. 実質的に全ての前記単離された血小板が機能的である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 巨核球の前記非接着性培養物が、フィーダーフリーの培養物である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. ステップ（ｂ）における前記培養が、０．５〜１００ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ）、１０〜１００ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン（ＴＰＯ）および１０〜１００ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、少なくとも１種のＲＯＣＫインヒビター、ならびに／または２．５〜２５単位／ｍｌのヘパリンのうち１つまたは複数を含む培地中である、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. ステップ（ｂ）における前記培養が、１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、０．５〜１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、５〜２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、５〜２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−９、少なくとも１種のＲＯＣＫインヒビター、および／または２．５〜２５単位／ｍｌのヘパリンのうち１つまたは複数を含む培地中である、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記少なくとも１種のＲＯＣＫインヒビターがＹ２７６３２を含む、請求項１９または２０に記載の方法。
  22. 前記Ｙ２７６３２が、２〜２０μＭ、約３〜１０μＭ、約４〜６μＭまたは約５μＭの濃度内である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記巨核球を剪断力に供するステップをさらに含む、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 巨核球１個当たり少なくとも２個、３個、４個または５個の血小板が生成される、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 巨核球１個当たり少なくとも５０個の血小板が生成される、請求項２４に記載の方法。
  26. 巨核球１個当たり少なくとも１００個、５００個、１０００個、２０００個、５０００個または１００００個の血小板が生成される、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記血小板の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、ＣＤ４１ａ＋およびＣＤ４２ｂ＋である、請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記血小板が、フィーダー細胞または間質フィーダー細胞の非存在下で生成される、請求項１４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記血小板が、全ての異種細胞の非存在下で生成される、請求項１４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記血小板がヒトのものである、請求項１４〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記巨核球が、外因的に添加されたプロテアーゼインヒビターの存在下で培養される、請求項１４〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記巨核球が、外因的に添加されたＭＭＰインヒビターの存在下で培養される、請求項１４〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記巨核球が、外因的に添加されたＭＭＰ８インヒビターの存在下で培養される、請求項１４〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記巨核球が、外因的に添加されたＭＭＰ８特異的インヒビターおよび汎ＭＭＰインヒビターの存在下で培養される、請求項１４〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記巨核球が、約３９℃の温度で培養される、請求項１４〜３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記巨核球が、
    （ａ）多能性幹細胞を培養して、造血性内皮細胞（ＰＶＥ−ＨＥ）を形成するステップ；
    （ｂ）該造血性内皮細胞を培養して、ＭＬＰを形成するステップ；および
    （ｃ）該ＭＬＰを培養して、巨核球を形成するステップ
    を含むステップによって生成される、請求項１４〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. ＢＥＴインヒビターが、ステップ（ｂ）における前記培養物に添加される、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記ＢＥＴインヒビターがＩＢＥＴ１５１である、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記多能性幹細胞がヒトのものである、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記造血性内皮細胞が、胚様体形成なしに誘導される、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記ｉＰＳＣがヒトのものである、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記造血性内皮細胞が、胚様体形成なしに誘導される、請求項４１または４２に記載の方法。
  44. 前記造血性内皮細胞が、１％〜１０％の酸素、２％〜８％の酸素、３％〜７％の酸素、４％〜６％の酸素または約５％の酸素を含む低酸素条件下で、前記多能性幹細胞から分化させられる、請求項３６〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記ＭＬＰが、３８〜４０セルシウス度の間の温度、または約３９セルシウス度の温度で培養されて、巨核球を形成する、請求項３６〜４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 請求項１４〜４５のいずれか一項に記載の方法によって生成された血小板を含む医薬調製物。
  47. ヒト患者における使用に適切であり、少なくとも１０８個の血小板を含む、請求項４６に記載の調製物。
  48. ヒト患者における使用に適切であり、白血球を実質的に含まない、請求項４６に記載の調製物。
  49. 前記請求項のいずれかに記載の組成物または前記請求項のいずれかに記載の方法によって生成された組成物の使用であって、それを必要とする患者あるいは凝固に影響する疾患もしくは障害に罹患している患者またはそれによって処置可能な疾患もしくは障害に罹患している患者の処置のための医薬の製造における使用。
  50. 前記疾患または障害が、血小板減少症、外傷、血液媒介寄生生物またはマラリアを含む、請求項４９に記載の使用。
  51. 血小板輸血を必要とする患者を処置する方法であって、前記請求項のいずれかに記載の組成物または前記請求項のいずれかに記載の方法によって生成された組成物を、該患者に投与するステップを含む方法。
  52. 血小板減少症、外傷、血液媒介寄生生物またはマラリアを含む疾患または障害を処置するために有効である、請求項５１に記載の方法。
  53. 巨核球またはＭＬＰから血小板を生成するための方法であって、
    プロテアーゼインヒビターの存在下において、剪断力条件下で、ＭＬＰの巨核球の非接着性集団を培養するステップ、および
    該培養物から血小板を回収し、任意選択で単離するステップ
    を含む方法。
  54. 前記プロテアーゼインヒビターがＭＭＰインヒビターである、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記剪断力条件が一定の剪断力条件である、請求項５３または５４に記載の方法。
  56. 前記剪断力条件が、１〜４．１ダイン／ｃｍ２の剪断力を含む、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記巨核球またはＭＬＰが、マイクロ流体デバイス中で培養される、請求項５３〜５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記巨核球またはＭＬＰが、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、または天然に存在するＣＤ３４＋細胞、任意選択で、骨髄もしくは臍帯血ＣＤ３４＋細胞から誘導される、請求項５３〜５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記プロテアーゼインヒビターがＧＭ６００１である、請求項５３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記プロテアーゼインヒビターがＭＭＰ８特異的インヒビターである、請求項５３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記ＭＭＰ８特異的インヒビターが、ＭＭＰ８−Ｉ（（３Ｒ）−（＋）−［２−（４−メトキシベンゼンスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−ヒドロキサメート］）である、請求項６０に記載の方法。
  62. ２種またはそれより多くのプロテアーゼインヒビターが使用される、請求項５３〜６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記２種のプロテアーゼインヒビターが、ＭＭＰ一般的インヒビターおよびＭＭＰ８特異的インヒビターである、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記プロテアーゼインヒビターが、前記培養物内の血小板のピーク生成の時点で添加される、請求項５３〜６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記巨核球またはＭＰＬが、ＴＰＯまたはＴＰＯアゴニストの存在下で培養されて、前血小板の形成を引き起こし、該前血小板が血小板を放出する、請求項５３〜６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記巨核球またはＭＰＬが、造血拡大増殖培地中、および任意選択で
    （１）ＴＰＯもしくはＴＰＯアゴニスト、ＳＣＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−９または
    （２）ＴＰＯもしくはＴＰＯアゴニスト、ＳＣＦおよびＩＬ−１１
    中で培養されて、培養において前血小板の形成を引き起こし、該前血小板が血小板を放出する、請求項５３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記巨核球またはＭＰＬが、３７℃よりも高く４０℃と等しいかまたはそれより低い温度で培養される、請求項５３〜６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記巨核球またはＭＰＬが約３９℃の温度で培養される、請求項６７に記載の方法。
  69. 巨核球またはＭＰＬから血小板を生成するための方法であって、
    ３７℃よりも高く４０℃と等しいかまたはそれより低い温度で、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞から誘導された巨核球またはＭＰＬの非接着性集団を培養するステップ、および
    該培養物から血小板を回収し、任意選択で単離するステップ
    を含む方法。
  70. 前記巨核球またはＭＰＬが約３９℃の温度で培養される、請求項６９に記載の方法。
  71. ＰＶＥ−ＨＥ細胞からＭＰＬを生成するための方法であって、
    ＢＥＴのインヒビターの存在下で、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞から誘導されたＰＶＥ−ＨＥ細胞の集団を培養するステップ、および
    該培養物からＭＰＬを回収し、任意選択で単離するステップ
    を含む方法。
  72. ＢＥＴの前記インヒビターがＩ−ＢＥＴ１５１である、請求項７１に記載の方法。
  73. ＰＶＥ−ＨＥ細胞からＭＰＬを生成するための方法であって、
    ｃ−ｍｙｃサプレッサーの存在下で、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞から誘導されたＰＶＥ−ＨＥ細胞の集団を培養するステップ、および
    該培養物からＭＰＬを回収し、任意選択で単離するステップ
    を含む方法。
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