CN105101979A - 由多能干细胞制备血小板的方法及其组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了从多能干细胞例如人胚胎干细胞(hESC)和诱导的多能干细胞(iPSC)制备血小板的方法。这些方法可在不形成拟胚体或多能干细胞簇的情况下进行，并且可以在不使用基质诱导细胞的情况下进行。另外，产量和/或纯度都比之前针对从多能干细胞制备血小板的方法报道的要高。还提供了包含血小板、优选地从多能干细胞制备的血小板的组合物和药物制剂。

Description

由多能干细胞制备血小板的方法及其组合物
相关申请
本申请要求2012年12月21日递交的、系列号为61/740,699的美国临时申请和2013年3月15日递交的、系列号为61/787,476的美国临时申请的权益，两件申请的发明名称都为“由多能干细胞制备血小板的方法及其组合物”，两件申请的内容在此整体引入作为参考。
发明背景
血小板是发挥重要和高度特异的血液凝固功能的微小血液细胞。一般人的血液中有几乎1兆血小板在循环，而血小板每10天就全部更换一次。这意味着血小板在进行着大量持续的生产。血小板有高度组织的细胞骨架，并且细胞内储存超过300种蛋白质，它们分泌在血管损伤部位。血小板也在炎症、血管生长和肿瘤转移中发挥作用。
血管损伤后，血小板迅速粘附于受损血管，并触发复杂的级联事件，导致血栓形成。在过去几十年间对血小板输注的需求不断增加(51)。用常规的方法，血小板只能存储不到一个星期，因而对依赖捐献的程序不断地产生挑战。血小板的供应短缺可具有潜在威胁生命的后果，尤其是对必须进行多次输血的患者。反复的输血也可能导致与免疫介导的宿主反应相关的耐受反应，并可能需要昂贵的患者配型(52，53)。能够在体外生成血小板，尤其是与患者匹配的血小板，在这些临床方案中具有显著的优势。
对于具有不寻常/罕见血型的输血依赖患者，特别是那些同种异体免疫的患者，以及经常产生血小板同种异体免疫的癌症或白血病患者，血小板供应上的限制可能产生威胁生命的后果。因为输注的人血小板的半衰期为4-5天，所以临床上必需对这些患者频繁输注血小板。此外，来自志愿捐献程序的血小板常常具有各种病原体污染的风险。血小板不能使用常规技术低温保存，因此能够体外生成血小板将为临床情况下的血小板替代疗法带来重大进展。
十几年来，对来自骨髓(BM)、脐带血(CB)或外周血(PB)的人类造血干细胞(HSC，CD34+)研究了巨核细胞(MK)和血小板生成。通过使用细胞因子、生长因子和/或基质饲养细胞的一定组合，由HSC制备功能性血小板已取得了重大成功(1；2)。然而，HSC仍需从献血者收集，并且在当前的培养条件下其扩增能力有限，这妨碍了大规模生产和未来的临床应用。
人类胚胎干细胞(hESC)可以体外无限繁殖和扩增，为人类治疗提供了可能取之不尽、用之不竭的无需献血者的细胞来源。在过去十年，对hESC向造血细胞的体外分化进行了广泛的研究。通过两种不同的培养体系，在体外成功地实现了hESC的定向造血分化。其中之一采用hESC与基质饲养细胞在含血清培养基中共培养(3；4)。另一种方法采用在超低细胞结合培养板中存在细胞因子以及有/无血清的悬浮培养条件(5-7)；其终点是细胞聚集体或胚状体("EB")的形成。在上述两种分化的hESC培养体系中都发现了造血的前体，以及代表红系、粒细胞、巨噬细胞、巨核细胞和淋巴系的成熟、功能性后代(3-6:8-14)。先前的研究还通过在血清存在下与基质细胞共培养从hESC产生了巨核细胞/血小板(15；16)。然而，巨核细胞/血小板在上述研究中的产率较低(15；16)。
发明概述
本发明提供了从多能干细胞制备血小板的方法，所述多能干细胞比如人胚胎干细胞(hESC)和诱导的多能干细胞((iPSC或iPS细胞)，例如人类诱导的多能干细胞(hiPSC或hiPS细胞)。进行这些方法可能不产生胚状体，也可能无需使用基质诱导细胞。另外，产率和/或纯度可以高于之前报道的从多能干细胞制备血小板的方法。因为可以更高效和更大规模制备血小板，所以本发明的方法和组合物在医学输血应用中具有很大的潜力。另外，因为血小板不具有细胞核，并且只含有最低量的遗传物质，所以本发明的制剂可在输注前进行辐射以有效去除任何污染的有核细胞，比如未分化的hESC。因此，有核细胞的可能存在不会产生安全问题。
从献血者收集的血小板具有非常有限的有效期，而且患者的预防性输注对血小板的需求不断增长。与依赖献血者的脐带血或骨髓CD34+人造血干细胞不同，人胚胎干细胞(hESC)可以成为在可控条件下体外持续制备血小板的非常好的替代源。如这里进一步所述，本发明提供了在无血清和无基质的条件下从多能干细胞制备巨核细胞(MK)的体系和方法。在具体实施方案中，通过生血内皮细胞的分化(PVE-HE，下面将进一步描述)使多能干细胞定向于巨核细胞。在PVE-HE培养末期鉴定表达CD31、CD144和CD105标志的瞬时多潜能细胞群。在无饲养细胞、无血清的悬浮培养中，存在TPO、SCF和其它细胞因子时，可以在18－20天内获得从hESC或hiPS细胞到MK的高达100倍的扩增。该方法可以由多能干细胞体外大量生成MK。在无饲养细胞的条件下培养时，多能干细胞产生的MK可以用来产生血小板样的颗粒(由人诱导的多能干细胞(hiPSC-PLT)或人胚胎干细胞(ESPLT)产生血小板或血小板样颗粒)。这些hiPSC-PLT和ES-PLT响应于凝血酶刺激并能参与微聚体形成。
一方面，本发明提供了适用于人类患者的药物制剂，其含有至少108的血小板。
另外，本发明提供了含有从人干细胞分化来的血小板的药物制剂，例如含有至少108个血小板。可选地，该制剂可基本上不含有白细胞。可选地，基本上所有的的血小板都可能是功能性的。
所述的药物制剂可含有109-1014个血小板，可选地109、1010、1011、1012、1013或1014个血小板。
血小板可具有一种或多种下列特性：平均血小板体积范围为9.7-12.8fL；制剂中大小的单峰分布；和/或血小板体积对数分布，其中一个标准差小于2μm3(优选小于1.5μm3、1μm3或甚至0.5μm3)。
血小板可能对至少一种下述标记呈阳性：CD41a和CD42b。
血小板可以是人类血小板。
至少50％、60％、70％、80％或90％的血小板是功能性的，并且可选地在室温保存至少2、3或4天后是功能性的。
另一方面，本发明提供了具有弱贴壁或非贴壁巨核细胞的生物反应器，其可在没有饲养细胞的情况下产生功能性血小板。
另一方面，本发明提供了含有至少109个巨核细胞系特异性前体(MLP)的组合物。
另一方面，本发明提供了含有MLP的低温保存的组合物。
另一方面，本发明提供了含有低温保存的MLP的库。
MLP可以具有确定的HLA型。
低温保存的组合物可以是与患者HLA匹配的。
另一方面，本发明提供了低温保存的组合物或库，其包含109-1014个MLP，可选地含有109、1010、1011、1012、1013或1014个MLP。
另一方面，本发明提供了由巨核细胞或MPL制备血小板的方法，包含步骤：(a)提供巨核细胞的非贴壁培养物；(b)使巨核细胞或MPL与TPO或TPO激动剂接触，从而导致在培养物中形成前血小板，其中所述的前血小板释放血小板；以及(c)分离血小板。
另一方面，本发明提供了由巨核细胞或MPL制备血小板的方法，包含步骤：(a)提供巨核细胞或MPL的非贴壁培养物；(b)使巨核细胞或MPL与造血扩增培养基以及可选地(1)TPO或TPO激动剂、SCF、IL-6和IL-9或(2)TPO或TPO激动剂、SCF和IL-11接触，其可导致在培养物中形成前血小板，其中所述的前血小板释放血小板。所述的方法可进一步包括(c)分离血小板。
所述的TPO激动剂包含下列中的一种或多种：ADP，肾上腺素，凝血酶，胶原蛋白，TPO-R激动剂，TPO模拟物，第二代血小板生成剂，罗米司亭(romiplostim)，艾曲波帕(eltrombopag)(SB497115，Promacta)，重组人血小板生成素(TPO)，聚乙二醇化重组人巨核细胞生长和发育因子(PEG-rHuMGDF)，Fab59，AMG531，Peg-TPOmp，TPO非肽模拟物，AKR-501，单克隆TPO激动剂抗体，多克隆TPO激动剂抗体，TPO微抗体(minibody)，VB22Bsc(Fv)2，结构域亚类转换的TPO激动剂抗体，MA01G4G344，重组人促血小板生成素，重组TPO融合蛋白或TPO非肽模拟物。
可选地，基本上所有分离的血小板可以是功能性的。
巨核细胞或MPL的非贴壁培养物可以是不含饲养细胞的培养物。
步骤(b)的培养物可在含有一种或多种下列物质的培养基中：0.5-100ng/ml的干细胞因子(SCF)，10-100ng/ml的血小板生成素(TPO)和10-100ng/ml的白细胞介素－11(IL-11)，至少一种ROCK抑制剂和/或2.5-25单位/ml的肝素。
步骤(b)的培养物可在含有一种或多种下列物质的培养基中：10-100ng/ml的TPO、0.5-100ng/ml的SCF、5-25ng/ml的IL-6、5-25ng/ml的IL-9、至少一种ROCK抑制剂和/或2.5-25单位/ml的肝素。
所述的至少一种ROCK抑制剂可包含Y27632，其中Y27632的浓度可为2-20μM、大约3-10μM、大约4-6μM或大约5μM。
所述的方法可进一步包含对巨核细胞使用剪切力。
每个巨核细胞可制备至少2、3、4或5个血小板。
每个巨核细胞可制备至少50个血小板。
每个巨核细胞可制备至少100、500、1000、2000、5000或10000个血小板。
至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的所述血小板为CD41a+和/或CD42b+，例如CD41a+和CD42b+。
所述的血小板可在不存在饲养细胞和/或不存在基质饲养细胞的条件下制备。
所述的血小板可在不存在任何异种细胞的条件下制备。
所述的血小板可为人类血小板。
巨核细胞或MPL可在外加蛋白酶抑制剂存在的条件下培养。所述的巨核细胞或MPL可在外加MMP抑制剂存在的条件下培养。所述的巨核细胞或MPL可在外加MMP8抑制剂存在的条件下培养。所述的巨核细胞或MPL可在外加MMP特异性抑制剂和泛MMP抑制剂存在的条件下培养。
巨核细胞或MPL可在大约39℃的温度下培养。
可通过下列步骤制备巨核细胞或MPL，包括：(a)培养多能干细胞以形成生血内皮细胞(PVE-HE)；(b)培养生血内皮细胞以形成MLP；以及可选地(c)培养MLP以形成巨核细胞。所述多能干细胞可以为人类多能干细胞。
可在步骤(b)中在BET抑制剂存在下培养生血内皮细胞。所述的BET抑制剂可为IBET151。
可以在没有胚状体形成的情形下产生生血内皮细胞。
多能干细胞可以是诱导的多能干细胞(iPSC)。iPSC可以是人类iPSC。
可以在没有胚状体形成的情形下产生生血内皮细胞。
生血内皮细胞可由多能干细胞在包含1％-10％的氧、2％-8％的氧、3％-7％的氧、4％-6％的氧或大约5％的氧的低氧条件下分化而来。
巨核细胞可在38－40℃或大约39℃的温度下由MLP分化形成。
一方面，本发明提供了包含由此处所述的任一方法(例如任何上述方法)制备的血小板的药物制剂。
所述的制剂可适用于人类患者。例如所述制剂可适用于人类患者，并基本上不含有白细胞。所述制剂可含有至少108个血小板。
另一方面，本发明提供了包含血小板的组合物(例如此处所述的组合物，如前面段落所述的)或包含此处所述的方法(例如前面段落所述的方法)制备的血小板的组合物在制备治疗有此需要的患者或患有影响凝血的疾病或障碍或可借此治疗的疾病或障碍的患者的药物中的用途。
所述的疾病或障碍可包括血小板减少症、创伤、血源性寄生虫或疟疾。
另一方面，本发明提供了治疗需要血小板输注的患者的方法，包括给所述患者施用包含血小板的组合物(例如此处所述的组合物，如前面段落所述的)或包含此处所述的方法(例如前面段落所述的方法)制备的血小板的组合物。
所述的方法可有效治疗包括血小板减少症、创伤、血源性寄生虫或疟疾的疾病或障碍。
另一方面，本发明提供了包含分离的PVE-HE细胞的组合物，其可选地衍生自多能干细胞，并可选地由此处所述的方法制备。
一方面，本发明提供了包含分离的iPS-PVE-HE细胞的组合物，其可选地根据此处所述的方法制备。
一方面，本发明提供了包含分离的hES-PVE-HE细胞的组合物，其可选地根据此处所述的方法制备。
一方面，本发明提供了包含分离的PVE-HE-MLP的组合物，其可选地产生自多能干细胞，并可选地根据此处所述的方法制备。
一方面，本发明提供了包含分离的iPS-PVE-HE-MLP的组合物，其可选地根据此处所述的方法制备。
一方面，本发明提供了包含分离的hES-PVE-HE-MLP的组合物，其可选地根据此处所述的方法制备。
一方面，本发明提供了包含分离的PVE-HE-MLP-MK的组合物，其可选地衍生自多能干细胞，并可选地根据此处所述的方法制备。
一方面，本发明提供了包含分离的iPS-PVE-HE-MLP-MK的组合物，其可选地根据此处所述的方法制备。
一方面，本发明提供了包含分离的hES-PVE-HE-MLP-MK的组合物，其可选地根据此处所述的方法制备。
另一方面，本发明提供了适用于人类患者的药物制剂，含有至少108个血小板，其中该制剂基本上不含有白细胞，并且基本上所有的血小板都是功能性的。
在各实施方案中，对药物制剂进行辐射以去除或失活有核细胞。
另一方面，本发明提供了适用于人类患者的药物制剂，其包含至少108个功能性血小板，其中制剂中功能性血小板的平均血浆半衰期为至少4天。
所述的药物制剂可含有109-1014个血小板，可选地109、1010、1011、1012、1013或1014个血小板。
药物制剂含有的血小板可具有一种或多种下列特性：平均血小板体积范围为9.7-12.8fL；制剂中大小的单峰分布；和/或血小板体积对数分布，其中一个标准差为小于2μm3(优选小于1.5μm3、1μm3或甚至0.5μm3)。
药物制剂含有的血小板可以是至少一种下列标志阳性的：CD41a和CD41b。
至少一半的血小板在室温保存例如(22－25℃)后至少2、3、4或5天是功能性的。例如，至少60％、70％、80％或90％的血小板具有功能性至少两天。血小板可以在室温保存至少5天。
一方面，本发明提供了低温保存MLP的库或制剂。
可以在PVE-HE开始在悬浮液中悬浮起来时收集而获得MLP。优选地，MLP没有被铺板，并优选地不允许MLP贴壁，因此避免分化成其它细胞类型，并促进MK的生成。
所述的库或制剂可包含109至1014个MLP，可选地包含109、1010、1011、1012、1013或1014个MLP。
一个MLP可产生2、3、4、5或更多个血小板。在示例性实施方案中，以每个MLP产生5个血小板的产率，提供6x1010-1.2x1011个MLP的组合物则足以产生300-600x109个血小板的治疗剂量。在示例性实施方案中，以每个MLP产生至少100个血小板的产率，提供3-6x109个MLP的组合物则足以产生治疗剂量。
另一方面，本发明提供了具有弱贴壁或不贴壁巨核细胞的生物反应器，其无需饲养细胞即产生功能性血小板。弱贴壁细胞，包括所述的巨核细胞，可以彼此或从表面发生机械分离，例如，通过使用血清移液管用微小力进行清洗。优选地，在非贴壁条件下培养MK，认为这样可促进MK表型的维持。也可对MK培养物应用剪切力，以提高血小板产生的效率。例如，可使用微观流体室或芯片控制剪切应力，其可提高每个MK的血小板产率。一方面，可以将MK接种到微观流体芯片的一个槽中，使培养液以接近生理速率流过MK。
另一方面，本发明提供了含有至少109MLP的组合物。
另一方面，本发明提供了含有MLP的低温保存的组合物。
另一方面，本发明提供了由巨核细胞制备血小板的方法，包含步骤：a)提供巨核细胞的非贴壁培养物；b)使巨核细胞与TPO或TPO激动剂接触，从而导致在培养物中形成前血小板，其中所述的前血小板释放血小板；以及c)分离血小板。
促血小板生成素(TPO)被认为是参与血栓形成和巨核细胞形成的关键的细胞因子，是表达于血小板、巨核细胞和巨核细胞前体表面上的促血小板生成素受体的内源性配体。TPO是具有332个氨基酸(95kDa)的糖蛋白，包含两个结构域：受体结合结构域(残基1－153)和高度糖基化的、对蛋白质稳定性重要的、富含碳水化合物的结构域(残基154－332)。TPO受体c-Mpl(也称为CD110)是典型的造血细胞因子受体，含有两个细胞因子受体同源性模块。TPO只结合远端的细胞因子受体同源性模块，并因此起始信号转导。在远端的细胞因子受体同源性模块缺失的情况下，c-Mpl变得有活性，意味着远端的细胞因子受体同源性模块起到c-Mpl抑制剂的功能，直到其被TPO结合。TPO的结合激活Janus激酶2(Jak2)信号转导因子和转录活化因子(STAT)信号通路，促使细胞增殖和分化。巨核细胞生长和发育因子(MGDF)是另一种血小板生长因子。重组形式的TPO和MGDF，包括人和聚乙二醇化的形式，可被用于诱导巨核细胞和血小板分化和成熟。TPO受体－活化肽和融合蛋白(例如Fab59，促血小板生成剂罗米司亭(romiplostim)/AMG531,或聚乙二醇化的(Peg-TPOmp))可被用于代替TPO。非肽模拟物(Eltrombopag(SB497115,Promacta)和AKR-501)通过与TPO不同的机制结合并激活TPO受体，对TPO可能具有累加效应。激活TPO受体的TPO激动剂抗体(例如MA01G4G344)或微抗体(minibody)(例如VB22Bsc(Fv)2)也可用于模拟TPO的作用。示范性TPO激动剂公开于Stasietal.,BloodReviews24(2010)179-190和Kuter,Blood.2007；109:4607-4616，其中每一篇在此整体引入作为参考。示范性TPO激动剂包括：ADP、肾上腺素、凝血酶和胶原蛋白，以及其它在文献中确定为TPO-R激动剂或TPO模拟物的化合物、第二代血小板生成剂、促血小板生成剂罗米思亭、艾曲波帕(Eltrombopag)(SB497115，Promacta)、第一代血小板生长因子、重组人促血小板生成素(TPO)，聚乙二醇化重组人巨核细胞生长和发育因子(PEG-rHuMGDF)、TPO肽模拟物、插入到Fab互补决定区的TPO受体－激活肽(Fab59)、AMG531(一种“肽体”(“peptibody”)，由两个二硫键连接的人IgG1-HC恒定区(Fc片段)组成，每个共价结合到残基228上，具有两个相同的通过多聚甘氨酸连接的肽序列。)，Peg-TPOmp(聚乙二醇化的TPO肽激动剂)、可口服的TPO激动剂、TPO非肽模拟物、AKR-501、单克隆TPO激动剂抗体、多克隆TPO激动剂抗体、TPO微抗体(minibody)如VB22Bsc(Fv)2，结构域亚类转换的TPO激动剂抗体比如MA01G4G344，重组人促血小板生成素或重组TPO融合蛋白、TPO非肽模拟物。无论TPO在何处用于本发明的实施方案，示范性的TPO激动剂都能代替TPO用于本发明进一步的实施方案中。
另一方面，本发明提供了由巨核细胞制备血小板的方法，包含步骤：a)提供巨核细胞或巨核细胞祖细胞的非贴壁培养物，b)使巨核细胞或巨核细胞祖细胞与含有造血扩增培养基的组合物接触，从而导致在培养物中形成前血小板，其中所述的前血小板释放血小板，以及c)分离血小板。
在示范实施方案中，基本上所有分离的血小板是功能性的。在示范实施方案中，巨核细胞或巨核细胞祖细胞的非贴壁培养物是不含饲养细胞和/或不含异种细胞的培养物。相应地，本发明提供了无需饲养细胞而制备血小板的方法。
步骤(b)的培养物可在包含一种或多种下列物质的培养基中进行：干细胞因子(SCF)、促血小板生成素(TPO)、白细胞介素-11(IL-11)、ROCK抑制剂如Y27632和/或肝素。步骤(b)的培养物可在包含TPO、SCF、IL-6、IL-9、ROCK抑制剂如Y27632和/或肝素中一种或多种的培养基中。
在一个实施方案中，所述的造血扩增培养基包含StemSpamTMACF(ACF)(StemCellTechnologiesInc.有售)，并可进一步包含TPO(促血小板生成素)或TPO激动剂、SCF(干细胞因子)、IL-6(白细胞介素6)和IL-9(白细胞介素9)，其可以StemSpamTMCC220细胞因子组合的形式提供(CC220)(StemCellTechnologiesInc.有售)。它可选地可包含ROCK抑制剂和/或肝素。已知TPO、SCF、IL-6、IL-9和IL-11是巨核细胞发育和成熟因子(Stasietal.,BloodReviews24(2010)179-190)。
在一个实施方案中，造血扩增培养基包含Stemline-II造血干细胞扩增培养基(Stemline-II)(SigmaAldrich有售)，并可进一步包含TPO或TPO激动剂、SCF和IL-11。它可选地可包含ROCK抑制剂和/或肝素。ROCK抑制剂可以是但不限于Y27632。
在另一实施方案中，所述的造血扩增培养基包含Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium(IMDM)作为基础培养基、人血清白蛋白(重组或纯化的)、铁饱和转铁蛋白、胰岛素、b-巯基乙醇、可溶性低密度脂蛋白(LDL)和胆固醇(此处可被称为确定成分的培养基)，并可进一步包含TPO或TPO激动剂、SCF和IL-11。它可选地可包含ROCK抑制剂和/或肝素。ROCK抑制剂可以是但不限于Y27632。
在另一实施方案中，所述的造血扩增培养基包含Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium(IMDM)作为基础培养基、人血清白蛋白(重组或纯化的)、铁饱和转铁蛋白、胰岛素、b-巯基乙醇、可溶性低密度脂蛋白(LDL)和胆固醇(此处可被称为确定成分的培养基)，并可进一步包含TPO(促血小板生成素)或TPO激动剂、SCF(干细胞因子)、IL-6(白细胞介素6)和IL-9(白细胞介素9)。它可选地可包含ROCK抑制剂和/或肝素。
的确定步骤(b)的培养物可在包含ACF的培养基、Stemline-II或前面段落中的确定成分的培养基中进行，以及(1)SCF(例如0.5-100ng/ml)、TPO(例如10-100ng/ml)、IL-6(例如5-25ng/ml)、IL-9(例如5-25ng/ml)和肝素(例如2.5-25单位/ml)中的一种或多种；(2)TPO(例如10-100ng/ml)、SCF(例如0.5-100ng/ml)、IL-6(例如5-25ng/ml)、IL-9(例如5-25ng/ml)、Y27632(例如5μM，或可选地2-20μM或可选地有效浓度的另一种ROCK抑制剂)和肝素(例如2.5-25单位/ml)中的一种或多种；(3)TPO(例如10-100ng/ml)、SCF(例如0.5-100ng/ml)、IL-11(例如5-25ng/ml)、Y27632(例如5μM，或可选地2-20μM或可选地有效浓度的另一种ROCK抑制剂)和肝素(例如2.5-25单位/ml)中的一种或多种；或(4)TPO(例如10-100ng/ml)、SCF(例如0.5-100ng/ml)、IL-6(例如5-25ng/ml)、IL-9(例如5-25ng/ml)、Y27632(例如5μM，或可选地2-20μM或可选地有效浓度的另一种ROCK抑制剂)和肝素(例如2.5-25单位/ml)的一种或多种。
所述方法可进一步包含对巨核细胞使用剪切力。
所述方法按每个巨核细胞可产生至少2、3、4或5个血小板，至少20、30、40或50个血小板，或至少100、500、1000、2000、5000或10000个血小板。
至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的所述血小板可能是CD41a+和CD42b+。
血小板可以在无饲养细胞或基质饲养细胞条件下制备。
血小板可以在无任何异种细胞条件下制备。
血小板可以是人类血小板。
血小板可以是CD41a+和/或CD42b+。
另一方面，本发明提供了制备巨核细胞祖细胞(此处也称为MLP)(比如应用于制备血小板的方法中或其它目的时的那些)的方法，其可包含步骤(a)培养多能干细胞以形成生血内皮细胞(PVE－HE)；和(b)培养生血内皮细胞以形成巨核细胞祖细胞(MLP)。步骤(a)可在不含动物成分的培养基中进行，所述培养基包含Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium(IMDM)、人血清白蛋白、铁饱和转铁蛋白、胰岛素、b-巯基乙醇、可溶性低密度脂蛋白(LDL)、胆固醇、骨形态发生蛋白4(BMP4)(例如50ng/ml)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(例如50ng/ml)和血管内皮生长因子(VEGF)(例如50ng/ml)。步骤(b)可以在Iscove’smodifiedDulbecco’smedium(IMDM)、Ham’sF-12营养混合物、Albucult(重组人白蛋白)、聚乙烯醇(PVA)、亚油酸、SyntheChol(合成胆固醇)、单硫代甘油(monothioglycerola-MTG)、重组人胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺溶液、无蛋白的杂交瘤混合物II(PFHMII)、抗坏血酸2磷酸盐、GlutamaxI(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)、青霉素/链霉素、25ng/ml的干细胞因子(SCF)、促血小板生成素(TPO)(例如25ng/ml)、Fms-相关酪氨酸激酶3配体(FL)(例如25ng/ml)、白细胞介素-3(IL-3)(例如10ng/ml)、白细胞介素-6(IL-6)(例如10ng/ml)和肝素(例如5单位/ml)中进行。
另一方面，本发明提供了制备巨核细胞(比如那些在制备血小板的方法中或其它目的中使用的巨核细胞)的方法，其可通过以下步骤制备：(a)培养多能干细胞以形成生血内皮细胞(PVE-HE)；(b)培养生血内皮细胞以形成MLP；以及(c)培养MLP以形成巨核细胞，如实施例1和2所示。步骤(a)和(b)可以如前面段落所述进行。步骤(c)可以在Iscove’sModifiedDulbecco'sMedium(IMDM)作为基础培养基、人血清白蛋白、铁饱和的转铁蛋白、胰岛素、β-巯基乙醇、可溶性低密度脂蛋白(LDL)、胆固醇、TPO(例如30ng/ml)、SCF(例如1ng/ml)、IL-6(例如7.5ng/ml)、IL-9(例如13.5ng/ml)和可选地ROCK抑制剂比如但不限于Y27632(例如5μM)和/或肝素(例如5-25单位/ml)中进行。
另一方面，本发明提供了包含上述方法制备的血小板的药物制剂。所述制剂可适用于人类患者和/或可包含至少108个血小板，和/或基本不含有白细胞。
另一方面，本发明提供了此处所述或此处所述任何方法制备的任何组成的血小板在制备治疗有此需要的或遭受影响凝血的疾病或障碍的患者的药物中的用途。
另一方面，本发明提供了需要血小板输注的患者的治疗方法，包括给所述患者施用此处所述或此处所述任何方法制备的任何组成的血小板，其可为治疗影响凝血和/或其它血小板功能的疾病或障碍和/或可由此治疗的其它疾病(如血小板减少症或创伤)的有效剂量。血小板产生、分布或破坏的失调导致了血小板减少症。其常见于多种医学状况，包括包括肝硬化、HIV感染、自体免疫性疾病、特发性血小板减少性紫癜、化疗引起的骨髓抑制和骨髓疾病。血小板数量低与出血风险增加相关。可由此治疗的其它典型疾病或障碍是疟疾和其它寄生虫感染，而不受理论限制，认为这是通过人类血小板因子4选择性溶解寄生虫的消化液泡而杀死红细胞内疟疾寄生虫的能力介导的(参见Loveet.al.,CellHostMicrobe12(6):815-23，在此整体引入作为参考)。
另一方面，本发明提供了给药方法，包括对所述患者施用此处所述或此处所述任何方法制备的任何组合成的血小板，其中所述血小板递送所述药物。例如，由于血小板在体内的寿命、给药后缺乏植入、归巢的特性，认为其可以用作药物载体。hESC、hiPC和MLP可经遗传修饰，用来产生表达治疗疾病所需药物的血小板。一方面，hESC、hiPC或MLP可经遗传修饰以表达抗肿瘤剂。由所述遗传修饰的hESC、hiPC和MLP制备的血小板可用于向肿瘤递送所述的抗肿瘤剂进行肿瘤疾病的治疗。
本发明的血小板可以被工程化以包含一种或多种治疗剂，其可以由血小板以被动方式(随时间从血小板扩散出)或以主动方式(因血小板活化或脱颗粒而释放)释放。广泛的药物可以使用。可以制备工程化的血小板使其包含选自下列药物组成的组中的一种或多种化合物：作用在突触和神经效应器连接部位的药物；作用于中枢神经系统的药物；调节炎症反应的药物；影响肾脏和/或心血管功能的药物；影响胃肠道功能的药物；抗生素；抗癌药；免疫调节剂；作用于血液和/或血液形成器官的药物；激素；激素拮抗剂；影响钙化和骨转换的药物，维生素，基因治疗剂；或其它药物比如靶向剂等。
在某些实施方案中，血小板已被工程化以包含一种或多种治疗剂，例如小分子药物、适体(aptamer)或其他核酸药物或重组蛋白，其可以被存储在血小板颗粒(例如α-颗粒)，并优选在血小板活化后释放。
在某些实施方案中，血小板包括一种或多种促进或加速正常伤口愈合、减少瘢痕、减少纤维化的外源性药剂或其组合。
在某些实施方案中，血小板包含一种或多种外源抗纤维化药物。工程化以递送抗血栓/抗再狭窄药物的血小板，可以用于血管成形术和溶栓治疗过程。在某些实施方案中，所述工程化的血小板可以用来预防或减少动脉粥样硬化的严重程度。在某些实施方案中，所述工程化的血小板可以用来预防或减少再狭窄的严重程度。在其他实施方案中，所述工程化的血小板可以作为实体肿瘤治疗的一部分。该工程化的血小板可以包括一种或多种免疫刺激剂。
本发明公开进一步提供了生产β2微球蛋白缺乏的血小板的方法，例如免疫原性降低的或“通用”血小板，包括使用此处公开的任何方法从被加工成β2微球蛋白表达缺失的细胞如β2微球蛋白基因敲除的多能干细胞制备血小板。本发明公开还提供了不表达β2微球蛋白的β2微球蛋白缺陷型血小板、巨核细胞或血小板祖细胞。β2微球蛋白缺陷型血小板通常在其细胞质膜上具有低或优选地检测不到的I类MHC分子，从而减少血小板的免疫原性。
另一方面，提供了由巨核细胞或MLP制备血小板的方法，包括在蛋白酶抑制剂存在的剪切力条件下培养非贴壁的巨核细胞或MLP群体，并收集培养物以及可选地从培养物分离血小板。
所述的蛋白酶抑制剂可以是MMP抑制剂。
所述的剪切力条件可以是恒定剪切力条件。所述的剪切力条件可包含1-4.1达因/cm2的剪切力。
所述的巨核细胞或MLP可以在微观流体装置中进行培养。
所述的巨核细胞或MLP可以衍生自iPS细胞、ES细胞，或天然产生的CD34+细胞，可选地为骨髓或脐带血CD34+细胞。
所述的蛋白酶抑制剂可以是MMP抑制剂，比如GM6001。
所述的蛋白酶抑制剂可以是MMP特异性抑制剂，比如MMP8-I((3R)-(+)-[2-(4-甲氧基苯磺酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-氧肟酸盐])。
所述的蛋白酶抑制剂可以是两种或多种蛋白酶抑制剂。
所述的两种蛋白酶抑制剂可以是MMP通用(泛)抑制剂和MMP8特异性抑制剂。
可以在培养物中血小板产生峰值时加入蛋白酶抑制剂。
可在TPO或TPO激动剂存在下培养巨核细胞或MPL而导致前血小板的形成，其中前血小板释放血小板。在造血扩增培养基中并可选地在(1)TPO或TPO激动剂、SCF、IL-6和IL-9或(2)TPO或TPO激动剂、SCF和IL-11中培养巨核细胞或MPL，从而在培养物中形成前血小板，其中前血小板释放血小板。
可在高于37℃和等于或低于40℃的温度下培养巨核细胞或MPL。
可在大约39℃的温度培养巨核细胞或MPL。
另一方面提供了由巨核细胞或MPL制备血小板的方法，包括在高于37℃和等于或低于40℃的温度下培养自iPS细胞或ES细胞衍生的非贴壁巨核细胞或MPL群体，收集并可选地从培养物分离血小板。
可在大约39℃的温度培养巨核细胞或MPL。
另一方面提供了由PVE-HE制备MPL的方法，包括在BET抑制剂存在下培养自iPS细胞或ES细胞衍生的PVE-HE细胞群体，收集并可选地从培养物分离MPL。
BET的抑制剂可以是I-BET151。
可以在培养的最后48小时、最后36小时、最后24小时、最后18小时、最后12小时或最后6小时将BET的抑制剂加到PVE-HE细胞中。
另一方面提供了由PVE-HE细胞制备MPL的方法，包括在c-myc抑制因子或抑制剂存在下培养自iPS细胞或ES细胞衍生的PVE-HE细胞群体，收集并可选地从培养物分离MPL。
可以在培养的最后48小时、最后36小时、最后24小时、最后18小时、最后12小时或最后6小时将c-myc的抑制因子或抑制剂加到PVE-HE细胞中。
附图简述
图1.描绘由多能干细胞生成血小板的逐步过程。此图显示通过多能干细胞经多能产生的生血内皮细胞(PVE-HE)并经巨核细胞系特异祖细胞(MLP)和经巨核细胞(MK)的分化进程。
图2.iPS细胞通过高度分化形态细胞(ADM)的分化进程。此图显示iPS细胞向PVE-HE的发展。图2A.在不含有饲养细胞的条件下48后贴壁细胞显示典型的多能干细胞形态。图2B，显示从多能干细胞向分散的小细胞团的转变基本完成。图2C，在PVE-HE分化起始后96－146小时观察到高度分化形态，显示在单细胞层上生长的小的致密细胞团。
图3.PVE-HE的高度分化形态鉴定。此图显示已经分化成PVE-HE的ADM细胞的表型和形态。在该分化阶段，ADM细胞显示PVE-HE表型CD31+CD144(VE-Cad)+CD105+。也分析了ADM细胞的形态变化(图3B)。
图4.通过流式细胞术对iPS-PVE-HE衍生的巨核细胞系特异祖细胞(MLP)的鉴定。此图显示了人iPS-PVE-HE-MLP细胞的表型为CD34+CD31+CD41a+CD43+CD13+CD14-CD42b-/+。
图5.iPS-PVE-HE-MLP衍生的成熟MK细胞的形态学分析。此图显示NK细胞内的细胞核(如“N”所示)，以及容易观察到的具有细长伪足的前血小板形成细胞(如箭头所示)。血小板分化起始后72小时，随着成熟进程，非常大的多倍体MK(50μM)变得丰富起来(在图5A&B.5A中的刻度尺是100μM，5B中的N指示MK内的细胞核)。在72－96小时之间，具有细长伪足的前血小板形成细胞显微镜下容易可见。(FIG.5A&5C,箭头所示)。
图6A-E.不同来源的血小板制备物的表型和纯度比较。此图显示外周血来源的人血小板与iPS-PVE-HE-MLP-MK衍生的血小板的形态学和细胞表面CD41a与CD42b的表达的流式细胞术分析。起始后72－96小时之间，CD41a+CD42b+血小板的量急剧增加，水平高达大约70％(图6D)。图6A-6B显示了献血来源的人血小板(6A)和如实施例3制备的hES衍生血小板(hES-PVE-HE-MLP)(6B)的正向散射(“FSC-A”)和侧向散射(“SSC-A”)。图6C-E显示献血来源的人血小板(6C)、iPS衍生血小板(iPS-PVE-HE-MLP)(6D)和hES衍生血小板(hES-PVE-HE-MLP)(6E)的CD41a和CD42B的表达，后面两个样品如实施例3所述制备。
图7.通过透射扫描显微镜术对外周血来源的人血小板和由人诱导的多能干细胞分化产生的血小板(hiPSC-PLT)进行超微结构的比较。此图显示了外周血来源的人血小板和本发明公开的hiPSC-PLT的细胞特征的相似性。hiPSC-PLT是圆盘状的。
图8.外周血来源的人血小板(hPRP)和hiPSC-PLT的比较。此图显示了两种细胞制备物在血小板直径(左图)以及结构细胞蛋白β1-微管蛋白和F-肌动蛋白(通过FITC-鬼笔环肽(Phalloidin)结合)表达上的相似性(右图)，所述的结构蛋白参与活化诱导的血小板形态变化。Hoechst染色阴性(右图)证实了在iPSC-PLT和献血来源的PLT中没有细胞核DNA。
图9.外周血来源的人血小板(hPRP)和hiPSC-PLT的比较。此图显示通过微分干涉差(DIC)活细胞显微技术表明的外周血来源的人血小板和本发明公开的hiPSC－PLT在形态学特征上的相似性。当结合到带负电荷的玻璃表面时，外周血来源的人血小板和hiPSC-PLT都显示了指示活化的伪足伸出。
图10.外周血来源的人血小板(hPRP)和hiPSC-PLT的比较。此图显示通过血小板反应蛋白4(TSP4)和血小板因子4(PF4)标记证明的α-颗粒表达上的相似性。TSP4和PF4是由活化血小板的α-颗粒释放的趋化因子。TSP4和PF4标记证实了，相对于正常人血小板(图10A)，hiPSC-PLTs(图10B)具有正常的α-颗粒表达。
图11.hiPSC-PLT的功能评价。此图显示了通过两种粘附分子CD62p和αIIbβIII的上调(PAC-1Ab所测量的)测量的凝血酶对hiPSC-PLT的体外活化。
图12.循环人血小板和自人iPSC和ESC衍生的血小板的功能比较。此图显示了循环人血小板、hiPSC-PLT和hESC-PLT的体内凝块形成能力。使用天然人血小板(“hPLT”)、iPSC-PLT和hES细胞衍生血小板(“hESC-PLT”)进行实验。图12A显示了小鼠血管壁损伤模型中形成的血栓的代表性图像。图12B图形说明了每一实验中结合到血栓上的血小板平均数。血小板的结合受到一种抗-αIIbβIII抗体片段ReoPro作用的抑制，说明所述结合如所预期依赖于αIIbβIII。(图12B)。
图13.输注后在巨噬细胞耗尽的NOD/SCID小鼠中的血小板动力学研究。该图显示了hiPSC-PLT和hESC-PLT8小时的可检测循环。
图14A-D.从多能干细胞制备血小板的典型工艺流程图。
图15.FACS分析衍生自hiPSC的CD41a,CD42b-MLP。
图16.由hiESC衍生的代表性MLP。
图17.FACS分析衍生自hiPSC的CD31+,CD43+MLP。
图18.由hESC衍生的代表性MK。
图19.由MK形成前血小板。
图20.FACS分析CD41a,CD42b。
图21.β1-微管蛋白染色的DIC显微术，人供体PLT(顶部)，hESC-PLT(底部)。
图22.在恒定剪切力培养条件下，在DMSO(菱形)，MMP抑制剂GM6001(正方形)，以及GM6001和8％葡聚糖(称为“粘度”)(三角形)存在时血小板纯度随时间的变化。X-轴相当于样品号，在6+小时的培养中，每30分钟取样。
图23.在恒定剪切力培养条件下，在DMSO(菱形)，MMP抑制剂GM6001(正方形)，以及GM6001和8％葡聚糖(称为“粘度”)(三角形)存在时血小板数随时间的变化。GM6001在第0天加入培养物中。
图24.在恒定剪切力培养条件下，在DMSO(左侧条)和MMP抑制剂GM6001(中间条)存在时的血小板数，以及在静态培养条件下(缺少MMP抑制剂GM6001时)(右侧条)的血小板数。
图25.在MMP抑制剂GM6001存在下，流速为12μl/分钟时(正方形)和流速为16μl/分钟时(三角形)在微观流体装置中随时间变化的血小板纯度。对照(菱形)为DMSO存在下的情况，因为MMP抑制剂溶解在DMSO中。
图26.血小板数作为流速的函数。左侧条：12μl/分钟，右侧条：16μl/分钟。
图27.在MMP特异性抑制剂MMP8-I(第二条)，泛MMP抑制剂GM6001(第三条)或MMP8-I和GM6001的组合(第四条)存在下的静态培养中血小板的纯度。MMP8-I是(3R)-(+)-[2-(4-甲氧基苯磺酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-氧肟酸盐]，其在Millipore有售。第一条是对照。
图28.在MMP特异性抑制剂MMP8-I(第二条)，泛MMP抑制剂GM6001(第三条)或MMP8-I和GM6001的组合(第四条)存在下的静态培养中血小板数。第一条是对照。
图29.在37℃(每一对中的左侧条)和39℃(每一对中的右侧条)培养时血小板纯度作为时间的函数。在开始时设置并在整个培养中维持该温度。
图30.在37℃(每一对中的左侧条)和39℃(每一对中的右侧条)培养时血小板数作为时间的函数。
图31.作为iBET-151(μM)增加剂量的函数，在第6+4天(即分化的第10天)收集的巨核细胞前体(MLP)数。在6+3天的时间段内在培养物中加入iBET，在收集MLP前使其暴露于iBET大约24小时。iBET浓度：0(左侧条)，0.1μM(中间条)，0.25μM(右侧条)。
图32.在第6+4天，作为iBET-151增加剂量的函数，c-myc和GATA-1的mRNA的相对定量分析。iBET浓度:对于每三个一组，0(左侧条)、0.1μM(中间条)、0.25μM(右侧条)。
图33.在第6+4天，作为iBET-151增加剂量的函数，在收集的细胞群中CD14+细胞的纯度。iBET浓度:对于每三个的一组，0(左侧条)、0.1μM(中间条)、0.25μM(右侧条)。
发明详述
用于本发明公开的定义和缩写词提供于本发明详述的末尾。
如上所述，血小板供应上的限制对依赖输血的患者具有潜在的危及生命的后果。多能干细胞可以体外无限增殖，对人类治疗可以说是一个取之不尽的、无需献血者的血小板来源。建立具有匹配的或降低的不相容性的hESC库的能力或许有可能降低或消除对免疫抑制药物和/或免疫调节方案的需求。示范性实施例提供了一种方法，包括制备患者特异性iPS细胞(例如使用此处所述的方法或其它现有技术已知的任何其它方法)，以及从所述的患者特异性iPS细胞制备患者特异性血小板，所述血小板可用于治疗患者，例如已经发展了血小板同种异体免疫力或具有其发展风险的患者。
示范性实施方案提供了在无血清和无饲养细胞的条件下从多能干细胞产生巨核细胞(MK)的有效方法。优选地，所述的MK从巨核细胞系谱特异性祖细胞(MLP，此处将进一步描述)制备。优选地，所述的MK不从成血管细胞或成血管集落形成细胞制备，比如那些在美国专利No.8017393中公开的。使用此处公开的方法，多能干细胞(iPSC和ESC)被定向向MK分化。从MLP向巨核细胞分化的效率已经非常高(高达90％)。无需进一步纯化，MK悬浮培养物的85％的活细胞是CD41a+CD42b+，并且成熟的MK也是CD29+和CD61+。这些体外产生的MK可以经历核内的有丝分裂，成为成熟的多倍体MK。重要的是，在MK培养的末期观察到具有细长伪足的前血小板形成细胞，表明在该体系中产生的MK能够进行终末分化，并在无饲养细胞条件下产生功能性血小板。
此处所述的是适用于使用iPSC或其它多能干细胞作为细胞来源，在控制条件下大规模进行体外巨核细胞制备的有效体系。另外，可以制备足够量的血小板以补充或取代对献血来源的血小板的需求。另外，所公开的方法可用于以可预测的方式制备血小板和血小板祖细胞，因此可以根据“要求”或以满足预期需要的要求量制备所述的细胞。所述细胞表达CD41a和CD42b，进行核内有丝分裂，形成成熟的多倍体MK。经进一步成熟，它们产生功能性或活化的血小板，受到凝血酶刺激而变得细胞粘附分子CD62p和αIIbβIII阳性(认为是活化时αIIbβIII构象变化后其PAC-1结合位点暴露发生的，而CD62p被认为由于颗粒释放而暴露在外面的膜)。已知这两种标记在活化的血小板表面表达，使用PAC-1和CD62p(p-选择素)结合分析在hiPSC-PLT上检测到。因为在巨核细胞制备中不需要基质诱导细胞，因此此处描述的方法可以提供不含有饲养细胞的血小板制备，如无需使用任何异种细胞进行血小板制备。
在示范实施方案中，也可使用包括雌二醇、维生素B3、基质金属蛋白酶抑制剂(MMP)、c-myc表达抑制剂和胞外基质蛋白的其它因子增强血小板的制备，比如通过刺激巨核细胞成熟和/或刺激血小板生成，其可在不含基质细胞的条件下进行。
在无血清和无基质细胞条件下制备巨核细胞可筛选在非常确定的条件下对调节巨核细胞生成和血栓形式重要的因子。如此鉴定的因子可有助于临床应用。该领域的进步也有可能提供对调节巨核细胞生成的不同方面的细胞和分子机制的理解，包括谱系定向、扩增和成熟。
示范性实施方案整合了从多能干细胞进行巨核细胞分化的逐步诱导。可以进行进一步优化和建立过程质量控制以提高该体系用于临床应用的一致性和效率。不必完全确定调节巨核细胞成熟的潜在细胞或细胞外机制来实施这些方法。可以鉴定和包括促进多倍体化和细胞质成熟的其它因子来促进体外产生的巨核细胞的终末分化。例如，至少一种ROCK激酶抑制剂可以被用来在早期诱导巨核细胞核内有丝分裂。但是，该作用被认为可能是由于染色体分离和胞质分裂的人工阻断，而不是分化的巨核细胞有计划的细胞和核成熟。这可能对达到增殖、核内有丝分裂和细胞质成熟之间的平衡以获得最高的体外巨核细胞产率、终末分化状态以及确定条件下功能性血小板的下游产生是有利的。
目前的这些结果表明从多能干细胞衍生的血小板与正常的血液血小板具有相同的形态学和功能特性。这些多能干细胞衍生的人血小板在体内也具有功能。
在活的有机体内的血小板血栓形成和增殖过程中会发生另外的血流动力学事件，其不可能完全由体外系统模拟。活体成像技术的应用提供了直接检测和定量血管损伤后复杂体内系统中发生的依赖血小板的血栓形成过程。使用活体高速广角显微镜，发明人证实了多能干细胞衍生的血小板类似于正常人血液血小板一样，在激光诱导的活体小鼠小动脉壁损伤位点掺入发展的小鼠血小板血栓中。用ReoPro预处理多能干细胞衍生的和对照血小板显著地降低了掺入血栓的献血来源的和多能干细胞衍生的血小板数目，证明所述的结合由αIIbβIII整合素介导。这些结果表明多能干细胞衍生的血小板在活体动物内血管损伤位点处发挥作用。
血小板是无细胞核细胞，可响应血管损伤而粘附到组织并互相粘附。这个过程主要由血小板整合素αIIbβIII所介导，其结合几种粘附性底物如血管性血友病因子(vonWillebrandFactor,vWF)和纤维蛋白原，发生桥接并进一步激活不断形成的血栓中的血小板(36)。此处的结果表明由多能干细胞衍生的血小板在体外和活体动物中与正常血液血小板功能相似。多能干细胞衍生的血小板显示具有重要的参与止血的功能，包括受到生理激动剂的刺激时发生聚集的能力。另外，免疫荧光术和透射电子显微术结果进一步证明由多能干细胞衍生的血小板与正常的血液血小板相似。
如下面实施例中进一步所述，在多能干细胞衍生的血小板和纯化的正常人血小板之间发现了很多相似性。这些相似性包括以下。
hiPSC-PLT是圆盘状的(通过透射电子显微术所证实)。
hiPSC-PLT与循环人血小板在超微结构上大部分相同(通过透射电子显微术所证实)。
通过DIC和β1-微管蛋白IF显微术证实了hiPSC-PLT的大小与循环人PLT的大小相当(2.38μm±0.85μm与2.27μm±0.49μm)。
通过DIC活细胞显微成像证明了hiPSC-PLT能在玻璃上伸展开并形成丝状伪足和板状伪足。
hiPSC-PLT无细胞核-与循环人PLT相当(通过Hoeschst标记证实)。
hiPSC-PLT具有相对于循环人PLT的正常微管蛋白细胞骨架(通过β1-微管蛋白标记证实)。
hiPSC-PLT具有相对于循环人PLT的正常丝状肌动蛋白(通过鬼笔环肽标记证实)。
hiPSC-PLT具有相对于循环人PLT的正常α-颗粒表达(通过TSP4和PF4标记证实)。
另一个科学和临床问题是多能干细胞衍生的血小板在复杂的体内环境中是否具有功能。在过去的十年间，为研究小鼠内的血栓形成建立了大量的试验模型，包括最近几个小组使用的激光损伤血栓形成模型(37:38:39)。激光诱导的血栓形成模型在快达损伤后5－30秒就启动血小板血栓形成。因此，该模型可以用来监测快速被清除的人血小板和hESC-PLT在发展的小鼠血小板血栓中的实时掺入情况，这涉及大量的信号通路、酶学级联反应以及无数的细胞和蛋白质组分的相互作用。该模型也可反映与凝血酶诱导的血栓形成相关的炎症反应。
使用激光诱导的血管损伤模型，通过活体内显微术分析证实hiPSC-PLT和hESC-PLT和血液血小板一样，在血管损伤后通过αIIbβIII整合蛋白参入到发展的小鼠血小板血栓中(图12A)。通过用ReoPro预处理确定了hiPSC-PLT和hESC-PLT的功能性由αIIbβIII所介导，其中ReoPro是人-鼠嵌合单克隆抗体的Fab片段，其特异性结合αIIbβIII并抑制血小板功能(图12B)。这些结果提供了hESC-PLT在体内血管损伤部位具有功能的证据。重要的是，第一次显示了在无血清和饲养细胞的条件下从多能干细胞衍生的血小板能够促进体内凝血和血栓形成。
两个之前的研究已经报道由hESC制备MK。这些体系的产率非常低，与本体系不同的是，它们依赖于与补充了血清的动物基质细胞的共培养(15，16)。另外，对体内的功能性没有报道(15，16)。在多能性干细胞分化过程中消除这两个变量可以让血小板的产生不接触动物产品。此外，本发明公开证实了此处所述的无饲养细胞体系可以高效率产生MK，并且可以在无饲养细胞条件下有效地生成功能血小板。
血栓形成是非常复杂的过程，伴有膜和微管的复杂重组以及颗粒和细胞器的精确分布(40)。尽管在血小板生成机制的理解上取得最新进展，但是有关膜的再组织、前血小板的起始、血小板细胞器和分泌颗粒的运输以及血小板大小的控制的详细机制还有待阐明。在无血清和无饲养细胞的条件下生成MK的能力应该有助于筛选在确定条件下对于调节巨核细胞减少症的不同方面至关重要的因子，包括谱系定向、扩增和成熟。
本发明公开提供了体外(或离体)制备PVE-HE细胞、MLP、MK、前血小板和血小板的各种方法，所述细胞衍生自iPS或ESC。
本发明公开提供了由iPS细胞或ES细胞转化为PVE-HE细胞或MLP或MK或血小板的方法。本发明公开提供了由PVE-HE细胞转化为MLP或MK或血小板的方法。本发明公开提供了由MLP转化为MK或血小板的方法。本发明公开提供了由MK转化为血小板的方法。下面简单描述了这些不同的培养物。
可以由iPS或ES通过包括在下述培养基中培养iPS或ES的方法制备PVE-HE细胞，所述培养基包含Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium(IMDM)作为基本培养基、人血清白蛋白、铁饱和转铁蛋白、胰岛素、b-巯基乙醇、可溶性低密度脂蛋白(LDL)、胆固醇，并进一步包含骨形态发生蛋白4(BMP4)(例如50ng/ml)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(例如50ng/ml)和血管内皮生长因子(VEGF)(例如50ng/ml)。该培养期可持续平均6天。
可以通过包含在培养基中培养PVE-HE细胞的方法由PVE-HE细胞制备MLP，所述的培养基包含Iscove’smodifiedDulbecco’smedium(IMDM)、Ham’sF-12营养混合物、Albucult(重组人白蛋白)、聚乙烯醇(PVA)、亚油酸、SyntheChol(合成胆固醇)、单硫代甘油(a-MTG)、重组人胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺溶液、无蛋白杂交瘤混合物II(PFHMII)、抗坏血酸2磷酸盐、GlutamaxI(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)、青霉素/链霉素，以及进一步包含干细胞因子(SCF)(例如25ng/ml)、血小板生成素(TPO)(例如25ng/ml)、Fms-相关酪氨酸激酶3配体(FL)(例如25ng/ml)、白细胞介素-3(IL-3)(例如10ng/ml)、白细胞介素-6(IL-6)(例如10ng/ml)和可选地肝素(例如5单位/ml)。该培养期可持续平均3-4天。在培养的后半段，包括在最后的48小时、在最后的36小时、在最后的24小时、在最后的18小时、在最后的12小时或在最后的6小时，可在培养物中加入BET抑制剂，优选地以亚细胞毒性水平。从这些培养物收获的MLP可低温保存或立即用于血小板制备或其它分析。
可以通过包括在培养基中培养MLP的方法由MLP制备巨核细胞，所述的培养基包含Iscove’sModifiedDulbecco'sMedium(IMDM)、人血清白蛋白、铁饱和的转铁蛋白、胰岛素、β-巯基乙醇、可溶性低密度脂蛋白(LDL)、胆固醇，以及进一步包含TPO(例如30ng/ml)、SCF(例如1ng/ml)、IL-6(例如7.5ng/ml)、IL-9(例如13.5ng/ml)和可选地ROCK抑制剂比如Y27632(例如5μM)和/或肝素(例如5-25单位/ml)。
可以通过包括在培养基中培养MLP的方法由MLP制备巨核细胞，所述的培养基包含Iscove’sModifiedDulbecco'sMedium(IMDM)、人血清白蛋白、铁饱和的转铁蛋白、胰岛素、β-巯基乙醇、可溶性低密度脂蛋白(LDL)、胆固醇，以及进一步包含TPO(例如10-100ng/ml)、SCF(例如0.5-100ng/ml)、IL-11(例如5-25ng/ml)和可选地ROCK抑制剂比如Y27632(例如5μM)和/或肝素(例如2.5-25单位/ml)中的一种或多种。
后一培养物产生MK和血小板，这取决于培养的长度。通常在培养大约3－4天观察到血小板。应该理解，在培养过程中，MLP将成熟为MK，MK将成熟为前血小板，前血小板将成熟为血小板。
因此可以通过包括在培养基中培养MLP或MK的方法从MLP或MK制备血小板，所述的培养基包含Iscove’sModifiedDulbecco'sMedium(IMDM)、人血清白蛋白、铁饱和的转铁蛋白、胰岛素、β-巯基乙醇、可溶性低密度脂蛋白(LDL)、胆固醇，以及进一步包含TPO(例如30ng/ml)、SCF(例如1ng/ml)、IL-6(例如7.5ng/ml)、IL-9(例如13.5ng/ml)和可选地ROCK抑制剂比如Y27632(例如5μM)和/或肝素(例如5-25单位/ml)。该培养期可持续4-8天或更长。
可以通过包括在培养基中培养MLP或MK的方法从MLP或MK制备血小板，所述的培养基包含Iscove’sModifiedDulbecco'sMedium(IMDM)、人血清白蛋白、铁饱和的转铁蛋白、胰岛素、β-巯基乙醇、可溶性低密度脂蛋白(LDL)、胆固醇，以及进一步包含TPO(例如10-100ng/ml)、SCF(例如0.5-100ng/ml)、IL-11(例如5-25ng/ml)和可选地ROCK抑制剂比如Y27632(例如5μM)和/或肝素(例如2.5-25单位/ml)中的一种或多种。
这些血小板制备方法包括在静止或剪切力培养条件下培养MLP或MK。静止培养条件是其中与培养的细胞接触的培养基是相对静止的培养条件。剪切力培养条件是包含与培养的细胞接触的培养基有意和持续的运动的培养条件。剪切力以达因/cm2测量。在一些实例中，剪切力接近骨髓造血环境中发生的剪切力。据报道，BM窦状隙中的剪切力为大约1.3-4.1达因/cm2。本发明公开涉及剪切力培养可以在大约1至大约4.5达因/cm2或大约1.3至大约4.1达因/cm2的范围的剪切力下进行，包括在大约1.5、大约2.0、大约2.5、大约3.0、大约3.5、大约4.0和大约4.1达因/cm2之间包括的任何力和任何范围的力。
应该理解可以在产生这种剪切力的的流速下进行培养。对于给定的培养，剪切力与流速(体积/时间)相关。对于任意给定的培养或培养装置，使用本领域的现有知识，可以根据流速的知识确定剪切力。此处提供的一些实验性结果比较了在给定的微观流体装置中，在12ul/分钟和16ul/分钟的流速下血小板的产量。在一些实例中，流速可以在5-25ul/分钟的范围内，或为10-20ul/分钟之内。在一些实例中，流速可以在10-15ul/分钟的范围内，以及在其它实例中，其可以在16-20ul/分钟的范围内。
当使用剪切力培养时，血小板的制备方法可以包括静止培养3-4天或直至观察到血小板的第一培养时期，接下来在剪切力环境下如微观流体装置或其它能引起剪切力的装置中的第二培养。
应当理解可以从这样的培养物中收获小量样品，并使用例如FACS进行血小板含量的测量。这将鉴定血小板产生的峰值期。
也应当理解血小板制备方法经常以MLP和MK的混合物作为起始材料，或在培养过程的某些点，在它们的培养基中包含MLP和MK的混合物。
本发明公开涉及在微观流体装置或其它其中可以获得剪切力的装置中培养MLP或MK。在一些实例中，设计装置使得MLP或MK被固定在装置中但不粘附到装置。在一些实例中，装置是由合成树脂制成，如聚二甲基硅氧烷(PDMS)或二甲基硅油。这些常见用于微观流体装置和芯片。
本发明公开进一步涉及，当使用剪切力培养条件制备血小板时，如果在培养中加入特别的蛋白酶抑制剂，可以获得更好的血小板产量和功能性。根据本发明公开发现，当血小板置于剪切力下时，细胞表面CD42b可以从血小板表面失去，使得血小板活性降低。为了避免这方面并仍然获得剪切力培养的好处，本发明公开涉及使用蛋白酶抑制剂防止CD42b的脱落或丢失。这种抑制剂的实例包括金属蛋白酶抑制剂，更具体地基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂。可以用于剪切力培养的抑制剂的另一实例是纤溶酶原激活剂抑制剂。这些抑制剂可以是泛抑制剂，指单一一种抑制剂可抑制一种以上以及可能抑制所有此类蛋白酶。或者，它们可以是特异性抑制剂，指单一一种抑制剂总共或主要抑制一种蛋白酶。
在一些情况下，所述的培养可以在MMP抑制剂存在下进行。所述的抑制剂可以是小分子，比如小的有机分子，抗体或抗体片段、反义或RNAi核酸等等。
MMP抑制剂的实例包括，但不限于，GM6001(一种泛抑制剂)、N-丹酰基-D-苯丙氨酸、4-表金霉素(4-epi-chlortetracycline)、盐酸吡哆醇(HydrochloridePyridoxatin)、ARP100、ARP101、巴马司他(Batimastat)、洗必泰(Chlorhexidine)、二盐酸盐(Dihydrochloride)、cis-ACCP、CL82198盐酸盐、米诺环素(Minocycline)、盐酸盐、阿仑膦酸钠(Alendronate)、钠盐、GM1489、TAPI-1、TAPI-2、GM6001、马马司他(Marimastat)、MMP抑制剂II、MMP抑制剂III、EGTA、MMP抑制剂V、MMP-13抑制剂、MMP-2抑制剂I、MMP-2抑制剂II、CP471474、MMP-2/MMP-3抑制剂I、MMP-2/MMP-3抑制剂II、MMP-2/MMP-9抑制剂I、MMP-2/MMP-9抑制剂II、MMP-2/MMP-9抑制剂V.Ecotin、大肠杆菌、MMP-3抑制剂、MMP-3抑制剂III、MMP-3抑制剂IV、放线酰胺素、MMP-3抑制剂V、MMP-3抑制剂VIII、MMP-7反义寡核苷酸、钠盐、MMP-8抑制剂I、MMP-9抑制剂I、MMP-9/MMP-13抑制剂I、MMP-9/MMP-13抑制剂II、NNGH、NSC23766、PD166793、Pro-Leu-Gly盐酸羟胺、Ro32-3555、PF-356231、SB-3CT、磷酸阿米酮、WAY170523、UK370106、UK356618、二水氯化钡、木犀草素(Luteolin)、异补骨脂查尔酮(Isobavachalcone)、盐酸多西环素(DoxycyclineHyclate)、胶原酶抑制剂I、邻菲咯啉(o-Phenanthroline)和SantaCruzBiotechnology,Inc.的TAPI-0。它们还包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4、GM6001、甲基强的松(methylprednisolone)、巴马司他、马马司他、普啉司他(prinomastat)、BAY12-9566、MMI270(B)、BMS-275291、metastat和MMP-1至MMP-26的其它抑制剂。应当理解MMP抑制剂可能只抑制一个MMP家族成员或其可抑制一种以上或所有MMP家族成员。
某些合成的MMP抑制剂通常含有螯合基团，其可以在MMP活化位点紧密结合催化性锌原子。常见的螯合基团包括异羟肟酸(酯)、羧酸(酯)、巯基和氧膦基。
其它MMP抑制剂包括BB-94、Ro32-3555、BB-1101、BB-2516、SE205、CT1746、CGS27023A、AG3340、BAY12-9566、D2163、D1927、PNU-142372、CMT-1和放线酰胺素。
许多MMP抑制剂都商业有售。
现有技术中熟知MMP抑制剂，更多的实例提供于美国专利No.4,877,805；5,837,224；6,365,630；6,630,516；6,683,069；6,919,072；6,942,870；7,094,752；7,029,713；6,942,870；6,919,072；6,906,036；6,890,937；6,884,425；6,858,598；6,759,432；6,750,233；6,750,228；6,713,074；6,699,486；6,645,477；6,630,516；6,548,667；6,541,489；6,379,667；6,365,630；6,130,254；6,093,398；5,962,466；5,837,224；7,705,164；7,786,316；8,008,510；7,579,486；8,318,945和7,176,217；公开的美国专利申请20070037253；20060293345；20060173183；20060084688；20050058709；20050020607；20050004177；20040235818；20040185127；20040176393；20040067883；20040048852；20040034098；20040034086；20040034085；20040023969；20040019055；20040019054；20040019053；20040006137；20040006077；20030212048；20030004165；20020198176；20020177588；20020169314；20020164319；20020106339；20020061866；20020054922；20020049237；20020010162；20010039287和20010014688和公开的PCT申请WO02/064552、WO05/1103399、WO06/028523、WO2008/024784、WO02/064552、WO05/110399、WO06/028523、WO01/62261和WO2008/024784中，每个在此引用作为参考。
MMP抑制剂也已经在科技文献中有描述，参见，例如，Whittakeretal.ChemRev.99:2735-2776,1999；Whittakeetal.Celltransmissions17(1):3-14(TableAB)和Harrison,NatureReviewsDrugDiscovery6:426-427,2007(TableAC)，其具体教导在此引用作为参考。
一些MMP抑制剂可能是
在一些实例中，MMP8抑制剂比如特异性MMP8抑制剂可被用于静止或剪切力培养中。在一些实例中，MMP8抑制剂可被用于天然产生的MLP和MK的培养中，比如骨髓或脐带血来源的MLP(例如CD34+祖细胞)或MK。
MMP特异性抑制剂的一个实例是MMP8-I，其化学名称是(3R)-(+)-[2-(4-甲氧基苯磺酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-氧肟酸]，其在Millipore商业有售.
在一些实例中，蛋白酶抑制剂可以是纤溶酶原激活剂抑制剂。纤溶酶原激活剂抑制剂的例子包括，但不限于，纤溶酶原激活剂抑制剂1(PAI-1)、纤溶酶原激活剂抑制剂2(PAI-2)和组织纤溶酶原激活剂(tPA)抑制剂。其它纤溶酶原激活剂抑制剂包括那些在美国专利4,923,807；国际PCT申请WO/13063331；WO/1316974；和参考文献FortenberryYM.Plasminogenactivatorinhibitor-1inhibitors:apatentreview(2006-present).ExpertOpinTherPat.2013Jul；23(7):801-15；以及Pannekoeketal.,EMBOJ.1986；5(10):2539-44中所描述的。在此全部引入作为参考。
在一些实例中，两种或多种蛋白酶抑制剂可以在培养中一起使用。作为例子，MMP抑制剂GM6001可以与MMP8特异性抑制剂MMP8-I一起使用。
在一些实例中，可以在37℃以上的温度进行培养。培养温度可以在37℃-45℃、或37℃-42℃、或38℃-41℃、或39℃-40℃的范围或大约39℃或大约40℃。可以在设定的温度进行培养。37℃以上温度的培养此处称为升高温度的培养。
在一些实例中，由PVE-HE细胞制备MLP的方法可以在含有布罗莫结构域(bromodomain)的蛋白质的BET家族抑制剂存在下进行。BET抑制剂可以是抑制BET家族成员的任何分子或化合物，可以是核酸比如DNA和RNA适体、反义寡核苷酸、siRNA和shRNA、小肽、抗体或抗体片段以及小分子比如小化学化合物。BET抑制剂可以防止或降低至少一种BET家族成员的布罗莫结构域对蛋白质的乙酰-赖氨酸残基的结合。应该理解BET抑制剂可以只抑制一种BET家族成员或其可抑制一种以上或所有BET家族成员。
BET抑制剂的实例描述于US2011143651、WO2009/084693A1、WO2011143669、WO2011143660、WO2011054851和JP2008156311中，其在此引用作为参考。
现有技术中已知的BET实例包括，但不限于RVX-208(Resverlogix)、PFI-1(StructuralGenomicsConsortium)、OTX015(MitsubishiTanabePharmaCorporation)、BzT-7、GSK525762A(iBET,GlaxoSmithKline)、JQ1(Cell2011146(6):904-17)和以下化合物(WO2011054851,GlaxoSmithKline)：
在一些实施方案中，BET抑制剂是小分子化合物(例如JQ1或其衍生物)，其结合BET家族成员第一布罗莫结构域的结合口袋(例如BRD1、BRD2、BRD3、BRD4、BRD7、BRDT；参见WO2011143669)。其它BET抑制剂包括JQ1S、JQ1R、JQ20、JQ8、JQ6、JQ13、JQ19、JQ18、JQ11、JQ21、JQ24B和KS1。
BET抑制剂(此处称为iBET)的另外实例是GSK1210151A(此处称为I-BET-151)。其它BET抑制剂包括IBET151和IBET762。
许多BET抑制剂可用作抗白血病药物。当用于本发明公开的方法中时，它们通常以低浓度使用(即低于它们可观察到细胞毒性作用的水平)。
本发明公开涉及在将PVE-HE分化(或成熟)成MLP的培养过程中使用BET抑制剂。这个培养时期通常持续大约4天。BET抑制剂典型地在培养的后半段加入，包括在培养的最后48小时、最后36小时、最后24小时、最后12小时或最后6小时。
Myc抑制剂包括10058-F4和CX-3543。
巨核细胞系祖细胞
本发明公开的各个实施方案提供了从多能干细胞(包括人iPS和人ES)产生巨核细胞谱系祖细胞(MLP)的方法，以及MLP的组合物。
早期谱系生血内皮细胞是CD41a阴性的，在造血祖细胞造血分化晚期表达CD41a。CD42b只表达于成熟巨核细胞。MLP培养物可能是异质的，具有高百分比的CD41+细胞和低百分比的CD42+细胞。
可以通过FACS分析测定MLP的CD41a和CD42b双阳性细胞的百分比。CD41a是纤维蛋白原受体(αIIbβIII)的亚基，CD42b是血管性血友病因子受体(GPIb-V-IX)的亚基。两种受体的表达是巨核细胞谱系特异的，并且二者都是血小板功能所必需的。
在收获进行低温保存前，可对MLP中贴壁细胞的大约百分比和具有低核质比的分化大细胞的程度进行测定。贴壁细胞可能呈现为无清晰集落边界的分散的集落。可能有大量的漂浮MLP静止在贴壁细胞群之上。活的漂浮MLP可显为清晰，具有最低限度的双折射，被光滑细胞膜脱标志。
MLP及其组合物可任选地提供为低温保存的组合物。
在另一实施方案中，本发明公开提供了筛选细胞分化调节剂的方法，包括：提供一定量的PVE-HE细胞或巨核细胞祖细胞(MLP)；使PVE-HE细胞或MLP与测试化合物接触；测定PVE-HE细胞或MLP与测试化合物的接触是否存在功能作用，其中功能性作用的存在说明该测试化合物是调节细胞分化的巨核细胞形成因子、血栓形成因子和/或造血因子，没有功能性作用说明该测试的化合物不是调节细胞分化的巨核细胞形成因子、血栓形成因子和/或造血因子。在其它实施方案中，巨核细胞形成因子、血栓形成因子和/或造血因子与增殖、核内有丝分裂、细胞质成熟以及功能性血小板的末期分化有关。
巨核细胞
本发明公开的各个实施方案提供了在无基质细胞和/或无血清的条件下从多能干细胞(包括人iPS和人ES)产生巨核细胞的方法。这些实施方案包括产生巨核细胞。进一步的实施方案提供了从多能衍生的生血内皮细胞制备巨核细胞的方法。所述的巨核细胞优选能产生血小板，例如当在此处所述的条件下培养时。
在一个实施方案中，所述方法包括：提供多能干细胞；以及分化该多能干细胞为巨核细胞。在一个实施方案中，所述的多能干细胞是人类细胞。在另一个实施方案中，多能干细胞是hESC，其任选地是不损坏胚胎而制备的，比如NED7细胞系。在另一实施方案中，多能细胞是人ES细胞。在另一实施方案中，巨核细胞源自诱导的多能干细胞。在另一实施方案中，多能干细胞是人iPS细胞，其由重编程体细胞(reprogrammingsomaticcell)衍生。在一个实施方案中，所述体细胞来自胎儿组织。在另一实施方案中，所述体细胞来自成年组织。
在另一实施方案中，本发明公开提供了筛选细胞分化调节剂的方法，包括：提供一定量的巨核细胞(MK)；使MK与测试化合物接触；测定MK与测试化合物的接触是否存在功能作用，其中功能性作用的存在说明该测试化合物是调节细胞分化的巨核细胞形成因子、血栓形成因子和/或造血因子，没有功能性作用说明该测试化合物不是调节细胞分化的巨核细胞形成因子、血栓形成因子和/或造血因子。在其它实施方案中，巨核细胞形成因子、血栓形成因子和/或造血因子与增殖、核内有丝分裂、细胞质成熟以及功能性血小板的末期分化有关。
血小板
本发明公开的其他实施方案提供了从人胚胎干细胞和多能干细胞(包括iPSC和人iPSC)制备血小板的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：提供人胚胎干细胞(hESC)；形成PVE-HE细胞；分化PVE-HE细胞成为巨核细胞；以及分化巨核细胞成为血小板。
在另一实施方案中，制备血小板的方法包括：提供PVE-HE细胞；分化PVE-HE细胞成为MLP或巨核细胞；以及可选地，分化MLP成为巨核细胞；然后分化(或成熟)巨核细胞成为血小板，典型地通过前血小板步骤。使PVE-HE细胞分化成巨核细胞的过程可如上所述进行。在一个实施方案中，PVE-HE细胞衍生自人ES细胞。在另一实施方案中，PVE-HE细胞衍生自诱导的多能干细胞(iPESC)。在一个实施方案中，iPS细胞是来自重编程体细胞的人iPS细胞。在一个实施方案中，该体细胞来自胎儿组织。在另一实施方案中，体细胞来自成人组织。在各个实施方案中，将巨核细胞分化成血小板的过程包括继续培养巨核细胞以使巨核细胞分化成血小板。在各个实施方案中，将巨核细胞分化成血小板的过程在无饲养细胞的条件下进行，并包括收集由巨核细胞谱系特异的祖细胞分化的巨核细胞。
在进一步的实施方案中，从在MK-M培养基或其他培养基中的第4天到第10天巨核细胞培养物中收集血小板，所述的其他培养基包含Iscove’sModifiedDulbecco'sMedium(IMDM)作为基础培养基、人血清白蛋白、铁饱和的转铁蛋白、胰岛素、b-巯基乙醇、可溶性低密度脂蛋白(LDL)、胆固醇、TPO(例如30ng/ml)、SCF(例如1ng/ml)、IL-6(例如7.5ng/ml、L-9(例如13.5ng/ml)和可选地ROCK抑制剂比如Y27632(例如5μM)，和/或肝素(例如5-25单位/ml)。在优选的实施方案中，在MK-M培养基中的巨核细胞培养物中首次出现前血小板形成细胞后3-5天收集血小板。在某些实施方案中，使用密度梯度离心纯化血小板。在进一步的实施方案中，密度梯度离心使用Percoll介质。在更进一步实施方案中，密度梯度离心使用BSA/HAS介质。在另一实施方案中，血小板纯化方法分离CD41a阴性颗粒。在另一实施方案中，血小板纯化方法分离CD42b阴性的颗粒。在另一实施方案中，血小板纯化方法保持细胞活力和形态学完整性。在其他实施方案中，血小板表达CD41a和CD42b。在其他实施方案中，血小板对凝血酶刺激有反应。在另一实施方案中，血小板可以在纤维蛋白原和血管性血友病因子(vWF)表面上伸展。再一实施方案中，血小板具有PAC-1结合和整合素活化的能力。在另一实施方案中，血小板形成微聚体，并促进凝块形成和收缩。在另一实施方案中，血小板在腺苷三磷酸双磷酸酶和/或EDTA存在下不活化。
在本发明公开的多个实施方案中提供了多能干细胞衍生的血小板的使用方法。在某些实施方案中，多能干细胞衍生的血小板被用于血小板输注。该方法可包括提供一定量的多能干细胞衍生的血小板；给有此需要的受试者施用一定量的多能干细胞衍生的血小板。在多个实施方案总，多能干细胞衍生的血小板可以是患者匹配的血小板。在另一实施方案中，血小板衍生自iPSC细胞。在某一实施方案中，血小板衍生自人iPS细胞。在其他实施方案中，血小板保存在一种溶液中，所述溶液在使得给受试者施用血小板后在该受试者中不产生HLA同种异体免疫反应。在另外的具体实施方案中，多能干细胞衍生的血小板可基本上不含有白细胞，例如含有低于5％、低于4％、低于3％、低于2％或低于1％的白细胞，优选低于0.1％、0.001％或甚至0.0001％。另一具体实施方案提供了多能干细胞衍生的血小板的制剂，该制剂中包含低于106个白细胞，更优选地低于105、104或甚至103个白细胞。
另外的具体实施方案提供了包含至少108个血小板的组合物，更优选地包含至少109,至少1010或至少1011个血小板。
使用当前的22-24℃血库保存条件，人血小板(来自血液采集)的存活和功能只能保持5天-认为有限的保存时间是因为血小板的老化和不断增加的细菌增殖的风险。预期本发明方法制备的血小板会比血库血小板有更长的存活期，比如在22-24℃能够维持至少6,7,8,9,10,11,12,13,14或甚至15天，并且维持人类患者中使用的适当的活力。
在某些实施方案中，在分离后或在产生血小板的一个或多个培养步骤中，可以用一种或多种延长血小板22-24℃贮存的药剂处理血小板，冷藏(例如4℃)或冷冻。
例如，本发明涉及用药剂处理血小板，或在一定条件下衍生血小板，所述药剂或条件可以降低唾液酸酶活性和(可选地)抑制血小板产品制剂中一种或多种细菌的增殖。该方法可以包括将血小板产品制剂与一定量的唾液酸酶抑制剂接触的步骤，从而获得唾液酸酶处理的血小板产品制剂，其与没有受到唾液酸酶抑制剂处理的血小板产品制剂比较，唾液酸酶活性降低，并且一种或多种细菌的增殖受到抑制。
被抑制的细菌类型包括常见于血小板产物制剂中的那些细菌。这种细菌的例子包括:曲霉菌(Aspergillus)、芽孢杆菌(Bacillussp)、埃氏拟杆菌(Bacteroideseggerthii)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、柠檬酸杆菌(Citrobactersp)、产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridiumperfringens)、棒状杆菌(Corynebacteriumsp)、类白喉菌(Diphtheroid)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、栖水肠杆菌(Enterobacteramnigenus)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、鸟肠球菌(Enterococcusavium)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、梭杆菌属(Fusobacteriumspp.)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、幽门螺杆菌(Heliobacterpylori)、克雷伯氏菌(Klebsiellasp)(克雷伯氏肺炎杆菌(K.pneumonia)、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca))、乳酸杆菌(Lactobacillussp)、李斯特菌(Listeriasp)、微球菌(Micrococcussp)、消化链球菌(Peptostreptococcus)、普通变形杆菌(Proteusvulgaris)、假单胞菌(Pseudomonassp)、Pseudomysoxalis、丙酸杆菌(Propionibacteriumsp)、沙门氏菌(Salmonellasp)、沙雷氏菌(Serratiasp)、粘质沙雷氏菌葡萄球菌(SerratiamarcescensStaphylococcussp)(凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase-negativeStaphylococcus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus))、链球菌(Streptococcussp)(S.gallolyticus、牛链球菌(S.bovis)、化脓性链球菌(S.pyogenes)、草绿色链球菌(S.viridans))和结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)。
可以与本发明一起使用的唾液酸酶抑制剂包括，例如，胎球蛋白，2,3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸(DANA)或其药物可接受的盐；(3R,4R,5S)-5-氨基-4-乙酰氨基-3-(戊烷-3-基氧基)-1-环己-1-烯-1-羧酸乙酯；(2R,3R,4S)-4-胍基-3-(丙-1-烯-2-基氨基)-2-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)-3,4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸；(4S,5R,6R)-5-乙酰氨基-4-carbamimidamido-6-[(1R,2R)-3-羟基-2-甲氧基丙基]-5,6-二氢-4H-吡喃-2-甲酸；和(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基-丁基]-4-(二氨基亚甲基氨基)-2-羟基-环戊烷-1-甲酸或其药物可接受的盐。
可以将一种或多种多糖修饰剂加到血小板。这些多糖修饰剂包括，例如，CMP-唾液酸、CMP-唾液酸前体、UDP-半乳糖或其组合。一方面，将CMP唾液酸前体转换为CMP-唾液酸的酶也可以被添加到血小板。
在某些实施方案中，可以用降低血小板群体清除率有效量的至少一种多糖修饰剂处理血小板。在一些实施方案中，多糖修饰剂选自UDP-半乳糖和UDP-半乳糖前体。在一些优选的实施方案中，多糖修饰剂是UDP-半乳糖。
在某些实施方案中，可以用某些糖分子处理血小板，所述的糖分子引起GP1b上暴露的GlcNAc残基糖基化，从而降低血小板清除率，阻断血小板吞噬作用，增加血小板循环时间，和/或增加血小板保存时间。
在某些实施方案中，可以用海藻糖或其它低分子量的多糖处理血小板。
在某些实施方案中，可以用蛋白酶抑制剂处理血小板，如基质金属蛋白酶抑制剂。
在某些实施方案中，血小板的体内循环时间可以被增加至少大约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、100％、150％、200％或更多。
本发明的血小板可以被冷却保存至少大约3天、至少大约5天、至少大约7天、至少大约10天、至少大约14天、至少大约21天或至少大约28天。
进一步，在培养中由干细胞衍生血小板提供了对血小板和巨核细胞预先处理的机会，以及甚至基因修饰干细胞或祖细胞如巨核细胞的机会，从而延长血小板的保质期以及增加产量和冷藏和/或低温保存后的存活。例如，可以工程化MK使其参与膜脂比例、蛋白糖基化模式、压力诱导蛋白、14-3-3ζ转位等的基因的表达水平改变。
在进一步的实施方案中，血小板是功能性血小板。在进一步的实施方案中，功能性血小板的百分比是至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。在还进一步的实施方案中，功能性血小板在22-37℃保存时至少两天是有活力的。
本发明公开进一步涉及根据此处提供的方法产生的血小板可以被工程化以包含一种或多种药物，所述的药物可以被动方式(例如，它们可以随时间从血小板扩散出去)或主动方式由血小板释放(例如，在血小板活化和去颗粒化时释放)。多种药物可以使用，可包括抗生素、抗病毒药、麻醉剂、类固醇药、抗炎症药物、抗肿瘤药物、抗原、疫苗、抗体、减充血剂、降压药、镇静药、避孕药、促孕药、抗胆碱能药、镇痛药、抗抑郁药、抗精神病药、β-肾上腺素能阻滞剂、利尿剂、心血管活性剂、血管活性剂、非类固醇类抗炎剂、营养剂等。
例如，可以制备工程化的血小板，使其包括选自下列药物组成的组中的一种或多种化合物：作用在突触和神经效应器连接部位的药物(例如，乙酰胆碱、乙酰甲胆碱、毛果芸香碱、阿托品、东莨菪碱、毒扁豆碱、琥珀胆碱、肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、多巴酚丁胺、异丙肾上腺素、沙丁胺醇、普萘洛尔(propranolol)、5-羟色胺)；作用于中枢神经系统的药物(例如，氯硝西泮(clonazepam)、地西泮(diazepam)、劳拉西泮(lorazepam)、苯佐卡因(benzocaine)、布比卡因(bupivacaine)、利多卡因(lidocaine)、丁卡因(tetracaine)、罗哌卡因(ropivacaine)、阿米替林(amitriptyline)、氟西汀(fluoxetine)、帕罗西汀(paroxetine)、丙戊酸(valproicacid)、卡马西平(carbamazepine)、溴隐亭(bromocriptine)、吗啡(morphine)、芬太尼(fentanyl)、纳曲酮(naltrexone)、纳洛酮(naloxone))；调节炎症反应的药物(例如，阿司匹林(aspirin)、消炎痛(indomethacin)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、类固醇、色甘酸钠(cromolynsodium)、茶碱(theophylline))；影响肾脏和/或心血管功能的药物(例如，呋塞米(furosemide)、噻嗪类(thiazide)、阿米洛利(amiloride)、安体舒通(spironolactone)、卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、赖诺普利(lisinopril)、地尔硫卓(diltiazem)、硝苯地平(nifedipine)、维拉帕米(verapamil)、地高辛(digoxin)、消心痛(isordil)、多巴酚丁胺(dobutamine)、利多卡因(lidocaine)、奎尼丁(quinidine)、腺苷(adenosine)、洋地黄(digitalis)、美伐他汀(mevastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)，甲羟戊酸(mevalonate))；影响胃肠功能的药物(例如，奥美拉唑(omeprazole)、硫糖铝(sucralfate))；抗生素(例如，四环素(tetracycline)、克林霉素(clindamycin)、两性霉素B(amphotericinB)、奎宁(quinine)、甲氧西林(methicillin)、万古霉素(vancomycin)、青霉素G(penicillinG)、阿莫西林(amoxicillin)、庆大霉素(gentamicin)、红霉素(erythromycin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、强力霉素(doxycycline)、阿昔洛韦(acyclovir)、齐多夫定(zidovudine)(AZT)、ddC、ddI、利巴韦林(ribavirin)、头孢克洛(cefaclor)、头孢氨苄(cephalexin)、链霉素(streptomycin)、庆大霉素(gentamicin)、妥布霉素(tobramycin)、氯霉素(chloramphenicol)、异烟肼(isoniazid)、氟康唑(fluconazole)、金刚烷胺(amantadine)、干扰素(interferon))；抗肿瘤剂(例如，环磷酰胺、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、阿糖胞苷(cytarabine)、巯基嘌呤、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、阿霉素(doxorubicin)、博莱霉素(bleomycin)、丝裂霉素C(mitomycinC)、羟基脲、泼尼松(prednisone)、三苯氧胺(tamoxifen)、顺铂(cisplatin)、decarbazine)；免疫调节剂(例如，白细胞介素，干扰素，GM-CSF、TNFα、TNFβ、环孢素(cyclosporine)、FK506，硫唑嘌呤(azathioprine)、类固醇)；作用于血液和/或血液形成器官的药物(例如，白细胞介素、G-CSF、GM-CSF、促红细胞生成素、维生素、铁、铜、维生素B12、叶酸、肝素、华法林(warfarin)、香豆素(coumarin))；激素(例如，生长激素(GH)、催乳素、促黄体生成激素、TSH、ACTH、胰岛素、FSH、CG、生长抑素(somatostatin)、雌激素、雄激素、孕激素、促性腺激素释放激素(GnRH)、甲状腺素、三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine))；激素拮抗剂；影响钙化和骨转换的药物(例如，钙、磷酸、甲状旁腺激素(PTH)、维生素D、双膦酸盐、降钙素、氟化物)，维生素(例如，核黄素、烟酸、吡哆醇、泛酸、生物素、胆碱、肌醇、camitine、维生素C、维生素A、维生素E、维生素K)，基因治疗剂(例如，病毒载体、携带核酸的脂质体(nucleic-acid-bearingliposomes)、DNA-蛋白质缀合物、反义制剂)；或其它药物，比如靶向药物等。
在某些实施方案中，血小板被工程化以包含一种或多种药物，比如小分子药物、适体或其它核酸药物、或重组蛋白质，即，其可被储存在血小板的颗粒中(例如α-颗粒)，并优选地由于血小板的活化而释放，比如在血管损伤或其它伤口处、粥样硬化斑块或内皮细胞侵蚀、感染或能使血小板活化的血栓前环境，比如实体肿瘤的脉管系统。在其它实施方案中，工程化的血小板可以用于降低纤维化的严重程度或防止纤维化，比如在肺纤维化的治疗中，即比如可以选自肺纤维化、肺动脉高压、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘和囊性纤维化。
在某些实施方案中，血小板包括一种或多种外源性剂，其促进或加速正常的伤口愈合、减少瘢痕形成、降低纤维化或其组合。可以在巨核细胞中表达并包装于由其产生的血小板的颗粒中的一种示例性重组蛋白质是红细胞生成素。局部给药红细胞生成素加速纤维蛋白引起的伤口愈合反应，加载有重组EPO的血小板可用于开放性伤口和溃疡的治疗，包括糖尿病溃疡、烧伤等，以及封闭的(内部)伤口，包括外科手术(手术损伤，如椎板切除术，椎间盘切除术，关节手术，腹部手术或开胸手术导致的损伤)。可以根据本发明实现在MK细胞中的表达和在血小板颗粒中的储存的其它伤口愈合蛋白质、特别是非纤维化的生长因子包括胰岛素样生长因子1(IGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGFββ-3)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、角质细胞生长因子(KGF)、纤连蛋白、玻连蛋白、血小板反应蛋白、层粘连蛋白、生腱蛋白(tenasin)。
在某些实施方案中，血小板包含一种或多种外源抗纤维化剂，比如，但不限于，包括抗TGFβ-1、TGFβ-2和/或PDGF的抗体(特别是单链抗体)；可以通过结合生长因子本身或结合其受体而防止TGFβ-1、TGFβ-2和/或PDGF与它们的受体结合的结合蛋白(例如包含受体结合位点序列的肽)或可溶形式的生长因子受体或这些受体的生长因子结合结构域；或抑制受体-配体相互作用的适体。
在某些实施方案中，血小板包含一种或多种调节伤口愈合的外源药剂，比如蛋白酶；血管活性物质如5-羟色胺和/或组胺；纤连蛋白；胶原酶；纤溶酶原激活剂；中性蛋白酶；弹性蛋白；胶原蛋白；蛋白多糖；表皮生长因子(EGF)；激素，如雌激素，睾酮或孕酮；巨噬细胞衍生的生长因子(MDGF)；肾上腺髓质素；血管生长素；血管生成素-1；血管生成素相关生长因子；脑源性神经营养因子；促肾上腺皮质激素释放激素；Cyr16；卵泡抑素；肝细胞生长因子；白细胞介素；中期因子；神经激肽A；神经肽Y(NPY)；多效蛋白(pleiotrophin)；颗粒蛋白前体(progranulin)，prolifern；分泌神经素；P物质；VG5Q；募集周细胞的因子和贝卡普勒明(becaplermin)。
在某些实施方案中，血小板包含一种或多种核适体，其可以促进伤口愈合和/或降低伤口处纤维化和瘢痕形成。认为瘢痕形成是由于持续的炎症和过度活跃的成纤维细胞活化造成的。骨桥蛋白(OPN)是一种促进细胞活化的细胞因子。体内OPN的缺乏降低皮肤的瘢痕形成。RNA适体是以高亲和性结合靶蛋白的短RNA分子。适体TheOPN-R3(R3)阻断OPN的信号发生。在某些实施方案中，血小板可以荷载主动或被动释放的OPN-R3，优选主动释放到血小板活化位点。示例性OPN抑制性适体描述于US20110190386。
在某些实施方案中，血小板包括一种或多种小的(有机)试剂，其可以促进伤口愈合和/或降低伤口处纤维化和瘢痕形成。例如，A2A受体激动剂，比如CGS-21680，可以显著加速切除性伤口闭合(Montesinos等人，JEM1997,186(9)，p1615-1620)。因此，只为进行说明，血小板可以荷载主动或被动释放的A2A受体激动剂，优选主动释放到血小板活化位点。其它小分子试剂包括类固醇、非类固醇抗炎症化合物(NSAID)、5-脂肪加氧酶(5-LO)抑制剂、白细胞三烯B4(LTB4)受体拮抗剂，白细胞三烯A4(LTA4)水解酶抑制剂、5-HT激动剂、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)抑制剂、H2拮抗剂、抗肿瘤剂和环加氧酶-2抑制剂。
在某些实施方案中，血小板包含一种或多种外源性抗生素。示范性抗生素包括氯霉素(chloramphenicol)、金霉素(chlortetracycline)、氯洁霉素(clyndamycin)、氯碘羟喹(clioquinol)、红霉素(erythromycin)、新霉素B(framycetin)、短杆菌肽(gramicidin)、夫西地酸(fusidicacid)、庆大霉素(gentamicin)、磺胺米隆(mafenide)、mupiroicin、新霉素(neomycin)，多粘菌素B(polymyxinB)、杆菌肽(bacitracin)、磺胺嘧啶银(silversulfadiazine)、四环素(tetracycline)、金霉素(chlortetracycline)、妥布霉素(tobramycin)、阿米卡星(amikacin)、万古霉素(vancomycin)、雷莫拉宁(ramoplanin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、克林霉素(clindamycin)或其组合。
在某些实施方案中，血小板包含一种或多种外源性的止痛或麻醉和/或抗炎剂。示范性抗炎药可以选自对乙酰氨基酚(acetaminophen)、阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸(diclofenac)、吲哚美辛(indometacin)、吡罗昔康(piroxicam)、非诺洛芬(fenoprofen)、氟比洛芬(flubiprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、萘普生(naproxen)、布洛芬(suprofen)、洛索洛芬(loxoprofen)、辛诺昔康(cinnoxicam)、替诺昔康(tenoxicam)及其组合。
在血管成形术和溶栓治疗过程中可以采用被加工成递送抗血栓/抗再狭窄药的血小板。
在某些实施方案中，工程化的血小板可以用于预防或降低动脉粥样硬化的严重程度，其可包含一种或多种外源性抗动脉粥样硬化药(即降低动脉粥样硬化损伤或防止其形成的药物)，以及可能包括：抗增殖/抗有丝分裂药物，包括天然产物如长春花碱(即长春碱、长春新碱和长春瑞滨(vinorelbine))、紫杉醇(paclitaxel)、epidipodophyllotoxins(即依托泊苷(etoposide)、替尼泊甙(teniposide))、抗生素(更生霉素(dactinomycin)(放线菌素D(actinomycinD))、柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素和伊达比星(idarubicin))、蒽环类药物、米托蒽醌、博莱霉素(bleomycins)、普卡霉素(plicamycin)(光辉霉素(mithramycin))和丝裂霉素、酶类(全身代谢L-天门冬酰胺和剥夺不具有合成自己的天门冬酰胺能力的细胞的L-天门冬酰胺酶)；抗增殖/抗有丝分裂的烷化剂，比如氮芥类物质(双氯乙基甲胺、环磷酰胺和类似物、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil))、乙撑亚胺(ethylenimines)和甲基蜜胺(methylmelamines)(六甲蜜胺和噻替派(thiotepa))、烷基磺酸盐-白消安(alkylsulfonates-busulfan)、亚硝基脲(卡莫司汀(carmustine)(BCNU)和类似物、链脲菌素(streptozocin))、trazenes-dacarbazinine(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂的抗代谢物如叶酸类似物(甲氨蝶呤)、嘧啶类似物(氟尿嘧啶、氟尿苷和阿糖胞苷(cytarabine))、嘌呤类似物和相关的抑制剂(巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他汀(pentostatin)和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨(cladribine)))；铂配位络合物(顺铂、卡铂)、丙卡巴肼(procarbazine)、羟基脲、米托坦(mitotane)、氨鲁米特(aminoglutethimide)；激素(如雌激素)；纤溶剂(如组织型纤溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫(dipyridamole)、噻氯匹定(ticlopidine)、氯吡格雷(clopidogrel)，阿昔单抗(abciximab)；抗迁移剂；抑制分泌剂(breveldin)；抗炎剂：如肾上腺皮质甾族化合物(可的索(Cortisol)、可的松(cortisone)、氟可的松(fludrocortisone)、泼尼松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)、6α-甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、曲安西龙(triamcinolone)、倍他米松(betamethasone)和地塞米松(dexamethasone))、非甾体药物(水杨酸衍生物即阿司匹林)；对氨基苯酚衍生物即对乙酰氨基酚；吲哚和茚乙酸(吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、和依托度酸(etodalac))、杂芳基乙酸(托美丁(tolmetin)、双氯芬酸(diclofenac)、和酮咯酸(ketorolac))、芳基丙酸(布洛芬(ibuprofen)和衍生物)、邻氨基苯甲酸(甲芬那酸(mefenamicacid)和甲氯芬那酸(meclofenamicacid))、烯醇酸(吡罗昔康(piroxicam)、替诺昔康(tenoxicam)、保泰松(phenylbutazone)、和Oxyphenthatrazone)、萘普酮(nabumetone)、金化合物(金诺芬(auranofin)、金硫代葡萄糖(aurothioglucose)、硫代苹果酸金钠(goldsodiumthiomalate))；免疫抑制剂(环孢素(cyclosporine)，他克莫司(tacrolimus)(FK-506：)，西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素(rapamycin))，硫唑嘌呤，霉酚酸酯(mycophenolatemofetil))；血管生成药物：血管内皮生长因子(VEGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)；血管紧张素受体阻滞剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸及其组合；细胞周期抑制剂，mTOR抑制剂，生长因子受体信号转导激酶抑制剂；类维生素A类；细胞周期蛋白/CDK抑制剂；HMG辅酶还原酶抑制剂(他汀类药物(statins))；和蛋白酶抑制剂。
在某些实施方案中，工程化血小板可以用来预防或降低再狭窄的严重程度，可能包括一种或多种外源性的抗增殖物质、消炎和抗血栓形成的化合物作为活性剂。再狭窄的示例性活性剂包括西罗莫司(sirolimus)、依维莫司(everolimus)、生长抑素(somatostatin)、他克莫司(tacrolimus)、罗红霉素(roxithromycin)、dunaimycin、子囊霉素(ascomycin)、巴佛洛霉素(bafilomycin)、红霉素(erythromycin)、麦迪霉素(midecamycin)、交沙霉素(josamycin)、刀球肮霉素(concanamycin)、克拉霉素(clarithromycin)、醋竹桃霉素(troleandomycin)、多叶霉素(folimycin)、西立伐他汀(cerivastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、罗伐他汀(rosuvastatin)、阿伐他汀(atorvastatin)、普伐他汀(pravastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)、依托泊苷(etoboside)、替尼泊甙(teniposide)、尼莫司汀(nimustine)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、环磷酰胺、4-羟基环磷酰胺(4-hydroxyoxycyclophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、美法仑(melphalan)、异环磷酰胺(ifosfamide)、曲洛磷铵(tropfosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、苯达莫司汀(bendamustine)、卡巴嗪(dacarbazine)、白消安(busulfan)、丙卡巴肼(procarbazine)、苏消安(treosulfan)、替莫唑胺(tremozolomide)、噻替哌(thiotepa)、柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、阿克拉霉素(aclarubicin)、表阿霉素(epirubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、去甲氧柔红霉素(idarubicin)、博莱霉素(bleomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、更生霉素(dactinomycin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、氟达拉滨(fludarabine)、氟达拉滨-5'-二氢磷酸盐(fludarabine-5'-dihydrogenphosphate)、克拉屈滨(cladribine)、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、卡培他滨(capecitabine)、多西紫杉醇(docetaxel)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、安吖啶(amsacrine)、伊立替康(irinotecan)、拓扑替康(topotecan)、脲羟基脲(hydroxycarbamide)、米替福新(miltefosine)、喷司他汀(pentostatin)、阿地白介素(aldesleukin)、维甲酸(tretinoin)、门冬酰胺酶、培加帕酶(pegasparase)、阿那曲唑(anastrozole)、依西美坦(exemestane)、来曲唑(letrozole)、福美坦(formestane)、安鲁米特(aminoglutethemide)、阿霉素(adriamycin)、阿奇霉素(azithromycin)、螺旋霉素(spiramycin)、千金藤素(cepharantin)、smc增殖抑制剂-2w、埃博霉素A和B(epothiloneAandB)、米托蒽醌(mitoxantrone)、硫唑嘌呤(azathioprine)、吗替麦考酚酯胶囊(mycophenolatmofetil)、c-myc-反义物、b-myc-反义物、白桦脂酸(betulinicacid)、喜树碱(camptothecin)、拉帕醇(lapachol)、β-拉帕醌(β-lapachone)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、白桦脂醇(betulin)、鬼臼酯素酸(podophyllicacid2-ethylhydrazide)、莫拉司亭(molgramostim)、聚乙二醇干扰素α--2b(peginterferonα-2b)、来格司亭(lenograstim)；非格司亭(filgrastim)、聚乙二醇(macrogol)、达卡巴嗪(dacarbazine)、巴利昔单抗(basiliximab)、达利珠单抗(daclizumab)、选择素、细胞因子拮抗剂、CETP抑制剂、钙粘蛋白、细胞分裂素抑制剂、COX-2抑制剂、NF.B、血管肽、环丙沙星(ciprofloxacin)、喜树碱(camptothecin)、fluroblastin、抑制肌肉细胞增殖的单克隆抗体、bFGF拮抗剂、普罗布考(probucol)、前列腺素、1，11-二甲氧基铁屎米-6-酮(1,11-dimethoxycanthin-6-one)、1-羟基-11-甲氧基铁屎米-6-酮(1-hydroxy-11-methoxycanthin-6-one)、东莨菪亭(scopolectin)、秋水仙碱(colchicine)、NO供体(NOdonors)、季戊四醇四硝酸酯(pentaerythritoltetranitrate)、syndnoeimines、S亚硝基衍生物模范积极活性剂(Snitrosoderivatives)、他莫昔芬(tamoxifen)、星孢菌素(staurosporine)、β-雌二醇、α-雌二醇、雌三醇、雌酮、乙炔雌二醇(ethinylestradiol)、磷雌酚(fosfestrol)、甲孕酮(medroxyprogesterone)、雌二醇环戊丙酸酯(estradiolcypionates)、雌二醇苯甲酸酯(estradiolbenzoates)、曲尼司特(tranilast)、尾叶香茶菜丙素(kamebakaurin)和用于癌症治疗的其他萜类化合物、维拉帕米(verapamil)、酪氨酸激酶抑制剂、tyrphostines、环孢素A(cyclosporineA)、紫杉醇及其衍生物、巴卡亭(baccatin)、泰索帝(taxotere)和其他合成或天然来源的低氧化碳(MCS)的大环低聚物及其衍生物、莫非保松(mofebutazone)、阿西美辛(acemetacin)、双氯芬酸(diclofenac)、氯那唑酸(lonazolac)、氨苯砜(dapsone)、o-carbamoylphenoxyaceticacid、利多卡因(lidocaine)、酮洛芬(ketoprofen)、甲芬那酸(mefenamicacid)、吡罗昔康(piroxicam)、美洛昔康(meloxicam)、磷酸氯喹(chloroquinephosphate)、青霉胺(penicillamine)、羟氯喹(hydroxychloroquine)、金诺芬(auranofin)、金硫丁二钠(sodiumaurothiomalate)、奥沙西罗(oxaceprol)、塞来昔布(celecoxib)、β-谷甾醇(β-sitosterin)、腺苷蛋氨酸、麦替卡因(myrtecaine)、聚桂醇(polidocanol)、诺香草胺(nonivamide)、左薄荷脑(levomenthol)、苯佐卡因(benzocaine)、七叶素(aescin)、玫瑰树碱(ellipticine)、CalbiochemD24851、秋水仙胺(colcemid)、细胞松驰素A-E、indanocine、诺考达唑(nocadazole)、s-100蛋白、杆菌肽(bacitracin)、玻连蛋白受体拮抗剂、氮卓斯汀(azelastine)、金属蛋白酶-1和-2的胍环化酶刺激组织抑制剂、游离核酸、结合到病毒传导物中的核酸、DNA和RNA片段、纤溶酶原激活剂抑制剂-1、纤溶酶原激活剂抑制物-2、反义寡核苷酸、VEGF抑制剂、IGF-1、抗生素、抗血栓药、阿加曲班(argatroban)、阿司匹林、阿昔单抗(abciximab)、合成抗凝血酶、比伐卢定(bivalirudin)、香豆定(coumadin)、依诺肝素(enoxoparin)、N-脱硫酸化和重乙酰化肝素、组织纤溶酶原激活剂、GpIIb/IIIa血小板膜受体、因子X抑制剂抗体、水蛭素、r-水蛭素、PPACK、(鱼)精蛋白(protamin)、尿激酶原、链激酶、华法林(warfarin)、尿激酶、血管扩张剂、潘生丁(dipyramidole)、曲匹地尔(trapidil)、硝普盐(nitroprussides)、PDGF拮抗剂、三唑并嘧啶和苏拉明(triazolopyrimidineandseramin)、ACE抑制剂、卡托普利(captopril)、西拉普利(cilazapril)、赖诺普利(lisinopril)、依那普利(enalapril)、氯沙坦(losartan)、巯基蛋白酶抑制剂、前列环素(prostacyclin)、伐哌前列素(vapiprost)、干扰素α、β和、组胺拮抗剂、5-羟色胺阻滞剂、细胞凋亡抑制剂、细胞凋亡调控剂、p65NF-.B和BclxL反义寡核苷酸、卤夫酮(halofuginone)、硝苯吡啶(nifedipine)、生育酚、tranirast、吗多明(molsidomine)、茶多酚、表儿茶素没食子酸(epicatechingallate)、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechingallate)、乳香酸(Boswellicacids)及其衍生物、来氟米特(leflunomide)、阿那白滞素(anakinra)、依那西普(etanercept)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、依托泊苷(etoposide)、双氯西林(dicloxacillin)、四环素(tetracycline)、曲安奈德(triamcinolone)、突变霉素(mutamycin)、procainimid、维甲酸、奎尼丁(quinidine)、双异丙吡胺(disopyrimide)、氟卡胺(flecainide)、普罗帕酮(propafenone)、索他洛尔(sotolol)、amidorone、天然和合成的类固醇、落地生根毒素A(bryophyllinA)、inotodiol、maquirosideA、ghalakinoside、mansonine、strebloside、氢化可的松(hydrocortisone)、倍他米松(betamethasone)、地塞米松(dexamethasone)、非诺洛芬(fenoporfen)、布洛芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、萘普生(naproxen)、保泰松(phenylbutazone)、抗病毒药物、抗真菌素、antiprozoalagents、天然的萜类化合物、hippocaesculin、玉蕊皂甙元-C21-当归酸酯(barringtogenol-C21angelate)、14脱氢阿咯思泰啉(14-dehydroagrostistachin)、agroskerin、阿咯思泰啉(agrostistachin)、17-羟基阿咯思泰啉(17-hydroxyagrostistachin)、ovatodiolids、4,7-氧环防风酸(4,7-oxycycloanisomelicacid)、baccharinoidsB1、B2、B3和B7、土贝母皂甙(tubeimoside)、bruceanolA、B和C、抗痢鸦胆子甙(bruceantinosideC)、yadanziosidesN和P、异去氧地胆草素(isodeoxyelephantopin)、白花地胆草内酯A和B(tomenphantopinAandB)、二羟丙茶碱A、B、C和D、熊果酸(ursolicacid)、庚酸A(hyptaticacidA)、泽渥萜(zeorin)、鸢尾醛(iso-iridogermanal)、变叶美登木醇(maytenfoliol)、艾佛散丁A(effusantinA)、艾思散宁A和B(excisaninA和B)、长栲利素B(longikaurinB)、黄花香茶菜C(sculponeatinC)、卡美宝宁(kamebaunin)、路卡梅宁A和B(leukameninA和B)、13，18-脱水-6-α--异戊烯酰查杷林(13,18-dehydro-6-α-senecioyloxychaparrin)、美丽红豆杉素A和B(taxamairinA和B)、regenilol、雷公藤内酯(triptolide)、磁麻苷(cymarin)、毒毛旋花(子)甙元(apocymarin)、马兜铃酸(aristolochicacid)、阿诺蝶呤(anopterin)、水合阿诺蝶呤(hydroxyanopterin)、白头翁素(anemonin)、花皂甙原白头翁素(protoanemonin)、黄连素(berberine)、氯化柯立不啉(cheliburinchloride)、毒芹毒素(cictoxin)、西诺印防己毒素(sinococuline)、本波雷思它丁A和B(bombrestatinA和B)、库拉异黄酮A(cudraisoflavoneA)、姜黄素(curcumin)、二氢光花椒碱(dihydronitidine)、氯化两面针碱(nitidinechloride)、12-Β-羟基孕二亚乙基三胺-3，20-二酮(12-β-hydroxypregnadien-3,20-dione)、银杏酚(bilobol)、白果酚(ginkgol)、银杏酸(ginkgolicacid)、锦鸡菌素(helenalin)、大尾摇辛(indicine)、大尾摇辛-N-氧化物(indicine-N-oxide)、毛果天芥菜碱(lasiocarpine)、衣诺脱二醇(inotodiol)、苷拉(glycosidela)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、爵床脂素A和B(justicidinA和B)、拉力亭(larreatin)、马咯特啉(malloterin)、马咯特色原烷醇(mallotochromanol)、异丁酰马咯特色原烷醇(isobutyrylmallotochromanol)、马奎尔糖苷A(maquirosideA)、麦陈亭A(marchantinA)、美登素(maytansine)、立柯力二鲨素(lycoridicin)、石蒜西定(margetine)、盘克拉特思坦丁(pancratistatin)、鹅掌楸碱(liriodenine)、百思帕森诺立丁(bisparthenolidine)、氧化黄心树宁碱(oxoushinsunine)、马兜铃AII(aristolactam-AII)、百思帕森诺立丁(bisparthenolidine)、杠柳毒苷A(periplocosideA)、哈喇秦糖苷(ghalakinoside)、熊果酸(ursolicacid)、脱氧普思咯思婆明(deoxypsorospermin)、菲克卢宾(psycorubin)、蓖麻毒素A(psycorubin,ricinA)、血根碱(sanguinarine)、曼舞小麦酸(manwuwheatacid)、甲基珍珠梅甙(methylsorbifolin)、sphatheliachromen、思地唑非林(stizophyllin)、曼森南天竹碱(mansonine)、斯坦卜糖苷(strebloside)、东非马钱碱(akagerine)、二水合乌撒巴林(dihydrousambaraensine)、羟基乌撒巴林(hydroxyusambarine)、strychnopentamine、思吹克诺非林(strychnophylline)、乌撒巴林(usambarine)、usambarensine、黄连素(berberine)、鹅掌楸碱(liriodenine)、氧化黄心树宁碱(oxoushinsunine)、瑞香亭(daphnoretin)、落叶松树脂醇(lariciresinol)、甲氧基落叶松树脂醇(methoxylariciresinol)、丁香脂素(syringaresinol)、伞形花内酯(umbelliferon)、阿咯蒙森(afromoson)、乙酰基维斯米酮B(acetylvismioneB)、去乙酰基维斯米酮A(desacetylvismioneA)或维斯米酮A和B(vismioneA和B)。
在又一些其它实施方案中，所述工程化的血小板可以作为实体肿瘤治疗的一部分。实体肿瘤生成能使血小板活化的血栓前环境。最近的发现表明，激活的血小板是关键的肿瘤血管平衡的调节物，因为它们能够预防肿瘤出血。令人惊讶的是，这种影响不依赖于血小板形成血栓的能力，而依赖于他们颗粒物质的分泌。因此，利用血小板分泌活性指导抗肿瘤和/或抗血管生成药物的释放代表了特异地杀伤肿瘤细胞和/或破坏肿瘤血管的一种方法。在某些优选实施方案中，所述工程化的血小板可以荷载抗血管生成剂和/或肿瘤血管结构破坏剂。
为了进一步说明，工程化的血小板可以装载有抗癌剂如抗肿瘤剂或化疗剂，其可包括(a)烷化剂，比如氮芥(mechlorethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphaan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、六甲密胺(hexamethylmelamine)、噻替哌(thiotepa)、白消安(busulfan)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、链脲菌素(streptozocin)、达卡巴嗪(dacarbazine)等；(b)抗代谢物，比如甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶5-FU、FudR、阿糖胞苷(cytarabine)、6MP、硫鸟嘌呤(thioguanine)、喷妥司汀(pentostatin)等；(c)天然产物，比如紫杉醇(taxol)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、依托泊苷、替尼泊甙(teniposide)等；(d)抗生素，比如用放线菌(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、博来霉素(bleomycin)、光辉霉素(plicamycin)、丝裂霉素c(mitomycinc)等；(e)酶，比如L-天门冬酰胺酶、肝素酶、软骨素酶等；(f)干扰素和白细胞介素，比如干扰素-α、干扰素γ、肿瘤坏死因子等；(g)铂配合物，比如顺铂、卡铂或其衍生物；和(h)其他各种各样的试剂，比如米托蒽醌(mitoxantrone)、亚硝脲氮芥、羟基脲、氯乙基环己亚硝脲、泼尼松(prednisone)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、他莫昔芬(tamoxifen)、米托坦(mitotane)、丙卡巴肼(procarbazine)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、孕激素、雄激素、抗雄激素、亮丙瑞林(Leuprolide)等。
在一个示范性的实施方案中，所述工程化的血小板包括一种作为VEGF抑制剂(即VEGF拮抗剂)的重组蛋白。这类蛋白包括抗体和抗体类似物(如单链抗体、单抗体(monobodies)、抗原结合位点等)，比如雷珠单抗(ranibizumab)；VEGF陷阱，比如阿柏西普(Aflibercept)，其为包括VEGF受体的配体结合结构域的可溶性蛋白，它们结合VEGF或VEGF受体并阻断受体活化。在优选实施方案中，多肽VEGF拮抗剂以掺入到血小板的颗粒、尤其是α-颗粒中的方式在MK细胞中表达，在血小板活化时释放。
虽然，所述工程化的血小板组合物优选的用途是肿瘤治疗，包括实体肿瘤和髓细胞瘤，但其同样可以用于其它基于异常血管生成的病理现象的治疗中。其他病理现象可包括关节炎、视网膜病变、银屑病、实体肿瘤、良性肿瘤、卡波西肉瘤(Kaposi'ssarcoma)、恶性血液病。这可能包括之前描述的药物；或例如在关节炎的情况下，它可能包括疾病修饰药物(DMARD)、非类固醇类抗炎药(NSAID)、秋水仙碱(Colchicine)、甲氨蝶呤等。
在示范性实施方案中，工程化血小板可以装载有抗癌药，所述的抗癌药可选自：阿西维辛(acivicin)、阿柔比星(aclarubicin)、阿考达唑(acodazole)、山油柑碱(acronycine)、阿多来新(adozelesin)、丙氨菌素(alanosine)、阿地白介素(aldesleukin)、别嘌醇钠(allopurinolsodium)、六甲蜜胺(altretamine)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、氨萘非特(amonafide)、聚肌胞(ampligen)、安吖啶(amsacrine)、雄激素、anguidine(anguidine)、阿非迪霉素甘氨酸(aphidicolinglycinate)、亮氨酸溶肉瘤素(asaley)、门冬酰胺酶、5-氮胞苷、硫唑嘌呤、卡介苗(BCG)(Bacilluscalmette-guerin(BCG))、Baker'sAntifol(水溶性)(Baker'sAntifol(soluble))、β-2′-硫代鸟嘌呤脱氧核甙、盐酸比生群(bisantreneHCl)、硫酸博来霉素(bleomycinsulfate)、白消安(busulfan)、丁硫氨酸硫酸亚胺(buthioninesulfoximine)、BWA773U82、BW502U83.HCl、甲磺酸、神经酰胺(ceracemide)、卡贝替姆(carbetimer)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯喹恶啉磺胺类(chloroquinoxaline-sulfonamide)、氯脲霉素(chlorozotocin)、色霉素A3(chromomycinA3)、顺铂、克拉屈滨(cladribine)、糖皮质激素、短小棒状杆菌、CPT-11、克立那托(crisnatol)、环胞苷、环磷酰胺、阿糖胞苷、色他巴(cytembena)、马来酸(dabismaleate)、氮烯唑胺(dacarbazine)、更生霉素(dactinomycin)、盐酸柔红霉素(daunorubicinHCl)、deazauridine、右丙亚胺(dexrazoxane)、去水卫矛醇(dianhydrogalactitol)、二氮化合物(diaziquone)、二溴卫矛醇(dibromodulcitol)、膜海鞘素(didemninB)、乙硫氮(diethyldithiocarbamate)、肌苷二醛(diglycoaldehyde)、二氢-5-氮(杂)胞苷dihydro-5-azacytidine(dihydro-5-azacytidine)、阿霉素(doxorubicin)、棘霉素(echinomycin)、依达曲沙(edatrexate)、依地福新(edelfosine)、依氟鸟氨酸(eflornithine)、Elliott's溶液、依沙芦星(elsamitrucin)、表阿霉素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、磷酸雌莫司汀(estramustinephosphate)、雌激素、依他硝唑(etanidazole)、氨磷汀(ethiofos)、依托泊苷(etoposide)、法曲唑(fadrazole)、法扎拉滨(fazarabine)、芬维A胺(fenretinide)、非格司亭(filgrastim)、非那雄胺(finasteride)、黄酮醋酸、氟尿苷、磷酸氟达拉滨(fludarabinephosphate)、5-氟尿嘧啶、弗洛索达(Fluosol)、氟他胺(flutamide)、硝酸镓(galliumnitrate)、吉西他滨(gemcitabine)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、hepsulfam、六亚甲基双乙酰胺(hexamethylenebisacetamide)、高三尖杉酯碱(homoharringtonine)、硫酸肼(hydrazinesulfate)、羟基脲、4-羟基雄烯二酮(4-hydroxyandrostenedione)、伊达比星(hydrozyurea)、盐酸伊达比星(idarubicinHCl)、异环磷酰胺、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白细胞介素-1α和β、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-6、4-甘薯黑疤霉二醇(4-ipomeanol)、异丙铂(iproplatin)、异维A酸(isotretinoin)、亚叶酸钙(leucovorincalcium)、醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)、左旋咪唑(levamisole)、脂质体阿霉素、脂质体包被柔红霉素、洛莫司汀(lomustine)、氯尼达明(lonidamine)、美登素(maytansine)、盐酸氮芥(mechlorethaminehydrochloride)、美法仑(melphalan)、美诺立尔(menogaril)、巴龙(merbarone)、6-巯基嘌呤、美司钠(mesna)、卡介苗甲醇提取残基、甲氨蝶呤、N-甲基甲酰胺、米非司酮(mifepristone)、米托胍腙(mitoguazone)、丝裂霉素C、米托坦(mitotane)、盐酸米托蒽醌德(mitoxantronehydrochloride)、单核/巨噬细胞集落刺激因子、大麻(nabilone)、四氢吡咯(nafoxidine)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、醋酸奥曲肽(octreotideacetate)、奥马铂(ormaplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇、帕拉(pala)、喷司他丁(pentostatin)、哌嗪(piperazinedione)、哌血生(pipobroman)、吡柔比星(pirarubicin)、吡曲克辛(piritrexim)、盐酸吡咯蒽醌(piroxantronehydrochloride)、PIXY-321、普卡霉素(plicamycin)、卟吩姆钠(porfimersodium)、松龙苯芥(prednimustine)、丙卡巴肼(procarbazine)、孕激素、吡唑呋喃菌素(pyrazofurin)、雷佐生(razoxane)、沙格司亭(sargramostim)、司莫司汀(semustine)、螺旋锗(spirogermanium)、螺莫司汀(spiromustine)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、磺氯苯脲(sulofenur)、舒拉明钠(suraminsodium)、他莫昔芬(tamoxifen)、泰索帝(taxotere)、替加氟(tegafur)、替尼泊苷(teniposide)、terephthalamidine、替罗昔隆(teroxirone)、硫鸟嘌呤、塞替派(thiotepa)、胸苷注射液、噻唑呋林(tiazofurin)、拓扑替康(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、维甲酸(tretinoin)、盐酸三氟拉嗪(trifluoperazinehydrochloride)、三氟尿苷、三甲曲沙(trimetrexate)、肿瘤坏死因子、尿嘧啶氮芥、硫酸长春碱(vinblastinesulfate)、硫酸长春新碱(vincristinesulfate)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春地辛(vindesine)、长春利定(vinzolidine)、Yoshi864、佐柔比星(zorubicin)及其组合。
所述工程化血小板可以包括一种或多种免疫刺激剂以促进抗肿瘤细胞的免疫活化，因此可能包括比如Toll样受体(TLR)激动剂、TLR4、TLR7、TLR9、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酸-D-异谷氨酰胺(MDP)、脂多糖(LPS)、基因修饰和/或降解的LPS、明矾、葡聚糖、集落刺激因子、EPO、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、聚乙二醇化的G-CSF、SCF、IL-3、IL-6、PIXY321、干扰素、γ-干扰素、α-干扰素、白细胞介素、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、MHCII类结合肽、皂苷、QS2I、非甲基化CpG序列、I-甲基色氨酸、精氨酸酶抑制剂、环磷酰胺或阻断免疫抑制功能的抗体、抗CTLA4抗体，或其两种或多种的混合物。
在某些情况下，特别是为创建包括小分子药物和/或核酸的工程化血小板，可以通过将活性剂添加到巨核细胞、前血小板或分化途径中其它细胞的培养基中，或在温育血小板的培养基/溶液中提供活性剂，而将活性剂引入到血小板中。
在其他情况下，特别是为创建包括蛋白质药物的工程化血小板，活性剂可以由巨核细胞、前血小板或分化途径中的其他细胞重组表达，从而使其在所产生的血小板中存在。在优选实施方案中，该重组蛋白被包装在血小板颗粒(尤其是α-颗粒)中。某些重组蛋白比如VIII因子是自动进入到颗粒中，否则可能需要使用融合蛋白，其包括将所述融合蛋白运输到血小板颗粒的颗粒靶向部分。一个典型的颗粒靶向部分是血小板因子4(PF4)，或其足以将产生的融合蛋白运输至血小板颗粒的部分。参见，例如，Briguet-Laugieretal.,JThrombHaemost.20042(12):2231-40；ElGolietal.JBiolChem.2005280(34):30329-35。
一种不需要添加颗粒运输部分的重组蛋白的示例性实施方案是VIII因子。本发明涉及被工程化而在其a-颗粒中贮存有VIII因子的血小板，其比如在伤口处活化时释放重组蛋白。A型血友病是一种X染色体连锁的出血性疾病，由VIII因子(FVIII)基因缺陷造成，影响大约1:5000的男性个体。目前的治疗方法包括因子替代法，使用合并的FVIII浓缩物或重组产品。这些产品的局限性包括其费用和这些产品防止长期后遗症的有限能力，除非以严格的预防方案使用。约10％的A型血友病患者会产生对输注产品的抑制剂，需要替代物、甚至更昂贵、更低效形式的治疗。即便有新的制备技术，对血液来源的替代产品引起的感染性并发症的担心始终都是一个问题。高治疗成本、治疗的感染和免疫并发症以及预防A型血友病的长期并发症的限制，使用于A型血友病治疗的血小板递送方法成为一个有吸引力的替代治疗形式。
为了进一步说明，Yarovoietal.Blood,2003102(12):4007中描述了一种可用于产生本发明的VIII因子工程化的血小板的表达构建体。特别是，可以将(人类)VIII因子编码序列置于巨核细胞特异性糖蛋白Ib(GPIbα)近端启动子区的调控下。参见Fujitaetal.Blood.1998；92:488-495。在发育的巨核细胞中外源表达的VIII因子贮存于MK产生的血小板内包含的α-颗粒中，然后由循环血小板在受到活化时释放。
药物制剂
本发明公开的示范性组合物可以是适于治疗人类患者的配方，如无热原或基本无热原和无病原体。给药时，用于此发明公开的药物制剂可以是无热原、无病原微生物、生理上可接受的形式。
本发明公开的另外的示范性组合物可在例如给药之前照射。例如，细胞可以用γ射线照射，例如大约25gy的剂量。例如，该组合物可以用足以在有丝分裂方面灭活组合物中任何有核的真核细胞和/或病原体的剂量照射，例如以足够在有丝分裂方面灭活其中可能包含的任何多能干细胞、MK、白细胞和/或PVE-HE的剂量。
血小板的递送
已经有多种膜、装置及其制造方法被推荐作为移植细胞及其分泌产物进入人体的手段并进行了评价，其在专利文献中统称为生物人工植入物。通常它们具有共同的操作原则，即细胞被封在一个半透膜限定的室中。长期细胞存活率被认为依赖于营养物质和废物与相邻的血管组织的持续扩散性交换。(美国专利Nos6,372,244、6,113,938、6,322,804、4,911,717、5,855,613、6,083,523、5,916,554、6,511,473、6,485,723)。有三种主要类型的装置在科学和专利文献中被描述用于细胞植入到各种组织区室，包括：平面盘设计，中空纤维为基础的设计，和几何实体为基础的设计。这些设备通常被设计为放置在一个体腔中。
定义
“胚状体”是指多能干细胞(例如，iPSC或ESC)块或团，其可在非贴壁条件下培养多能干细胞而形成，例如在低粘附性基底上或在“悬滴”中。在这些培养物中，多能干细胞能形成细胞团或块，被命名为胚状体。参见Itskovitz-Eldoretal.,MolMed.2000Feb；6(2):88-95，此处整体引入作为参考。通常情况下，胚状体开始形成为多能干细胞的固体团块，并随着时间的推移，一些胚状体开始包括充液腔，在文献中前者称为“简单”的EB，后者为“囊状”的胚状体。
此处所用术语“胚胎干细胞”(ES细胞)与现有技术中的一致。该术语包括来自人类囊胚或桑椹胚的内细胞团的细胞，包括那些已作为细胞系连续传代的细胞。ES细胞可能来源于精子对卵细胞的受精，以及使用DNA、核转移、孤雌生殖、或通过在HLA区纯合产生ES细胞。ES细胞也可以是来自通过精子和卵细胞的融合产生的受精卵、卵裂球或囊胚阶段的哺乳动物胚胎、核转移、孤雌生殖、雄性单性生殖、或染色质重编程(reprogamming)以及随后将重编程染色质掺入质膜产生细胞。胚胎干细胞，不论其来源或用于生产它们的具体方法，可基于以下确定：(i)分化为所有三个胚层的细胞的能力，(ii)至少Oct4和碱性磷酸酶的表达，及(iii)当移植到免疫缺陷动物时产生畸胎瘤的能力。可用于本发明的实施方案的胚胎干细胞包括，但不限于，人类ES细胞(“ESC”或“hES细胞”),如MA01、MA09、ACT-4、No.3、H1、H7、H9、H14和ACT30胚胎干细胞。另外的示例性细胞系包括NED1、NED2、NED3、NED4、NED5和NED7。也参见NIH人类胚胎干细胞注册表。一个可用的示例性人类胚胎干细胞系是MA09细胞。MA09细胞的分离和制备先前描述于Klimanskaya,etal.(2006)“HumanEmbryonicStemCelllinesDerivedfromSingleBlastomeres.”Nature444:481-485。可按照本发明公开使用的其它ES细胞的分离和制备也曾描述于Chungetal.(2008)“HumanEmbryonicStemCellLineGeneratedWithoutEmbryoDestruction”,CellStemCell,2:113-117。按照本发明的示范性实施方案使用的人类ES细胞可以按照GMP标准生产和维持。
此处所用术语“多能干细胞”包括胚胎干细胞、来自胚胎的干细胞、诱导的多能干细胞，无论制备多能干细胞的方法如何。多能干细胞在功能上被定义为如下的干细胞：(a)当移植到免疫缺陷(SCID)小鼠时能引起畸胎瘤；(b)能分化为所有三个胚层的细胞类型(例如，能分化成外胚层，中胚层和内胚层细胞类型)；以及(c)表达一种或多种胚胎干细胞标记(例如表达Oct4、碱性磷酸酶、SSEA-3表面抗原、SSEA-4表面抗原、nanog、TRA-1-60、TRA-1-81、SOX2、REX1等)。在某些实施方案中，多能干细胞表达一种或多种选自下述的标记：Oct4、碱性磷酸酶、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81。示例性的多能干细胞可以例如使用现有技术已知的方法产生。示例性的多能干细胞包括来自囊胚阶段胚胎ICM的胚胎干细胞，以及来自一种或多种卵裂阶段的卵裂球或桑椹体阶段胚胎(可选地不破坏胚胎的其它部分)的胚胎干细胞。这样的胚胎干细胞可以从通过受精或通过无性方式制备的胚胎物质产生，包括体细胞核转移(SCNT)、孤雌生殖和单雄生殖。进一步的示范性多能干细胞包括诱导的多能干细胞(iPSC)，其由通过表达多种因子组合(此处称为重编程因子(reprogrammingfactor))而重编程(reprogamming)体细胞来产生。iPSC可以使用胎儿、初生婴儿、新生儿、青少年或成年体细胞产生。
在某些实施方案中，可以将体细胞重编程为多能干细胞的因子包括，例如，OCT4(有时称为OCT3/4)、Sox2、c-Myc和Klf4的组合。在其它实施方案中，可以用于将体细胞重编程为多能干细胞的因子包括，例如，OCT4、SOX2、Nanog和Lin28的组合。在某些实施方案中，至少有两种重编程因子在体细胞中表达以成功重编程体细胞。在其它实施方案中，至少有三种重编程因子在体细胞中表达以成功重编程体细胞。在其它实施方案中，至少有四种重编程因子在体细胞中表达以成功重编程体细胞。在其它实施方案中，确定另外的重编程因子，并单独使用或与一种或多中已知的重编程因子组合使用，以使体细胞重新编程为多能干细胞。诱导的多能干细胞被功能性定义，包括使用各种方法(整合载体、非整合载体、化学手段等)重新编程的细胞。多能干细胞可以被基因修饰或以其它方式修饰以增加寿命、效力、归巢(homing)，以防止或减少同种异体免疫反应或在从此类多能细胞分化而来的细胞(例如，血小板)中提供所需的因子。
“诱导的多能干细胞”(iPS细胞或iPSC)可以通过体细胞内重编程因子的蛋白转导而产生。在某些实施方案中，至少两种重编程蛋白被转导入体细胞以成功重编程体细胞。在其它实施方案中，至少三种重编程蛋白被转导入体细胞以成功重编程体细胞。在其它实施方案中，至少四种重组蛋白被转导入体细胞以成功重编程体细胞。
多能干细胞可以来自任何物种。已经在例如小鼠、多种类的非人类灵长类动物和人类中成功地得到了胚胎干细胞，并且已经从许多另外的物种中产生了胚胎干细胞样细胞。因此，本领域技术人员可以从任何物种产生胚胎干细胞和胚胎衍生干细胞，包括但不限于人类、非人类的灵长类动物、啮齿类动物(小鼠、大鼠)、有蹄类动物(牛、羊等)，狗(家养的和野生的狗)、猫科动物(家养的和野生的，如狮、老虎、猎豹)、兔子、仓鼠、沙鼠、松鼠、豚鼠、山羊、大象、熊猫(包括大熊猫)、猪、浣熊、马、斑马、海洋哺乳动物(海豚、鲸等)等。在某些实施方案中，所述物种是濒危物种。在某些实施方案中，所述物种是目前已灭绝的物种。
同样，iPS细胞可以来自任何物种。已经成功利用小鼠和人类细胞产生了iPS细胞。此外，已经使用胚胎、胎儿、新生儿和成体组织成功产生了iPS细胞。因此，人们可以很容易地应用任何物种的供体细胞产生iPS细胞。因此，人们可以从任何物种产生iPS细胞，包括但不限于人类、非人类的灵长类动物、啮齿类动物(小鼠、大鼠)、有蹄类动物(牛，羊等)、狗(家养的和野生的狗)、猫科动物(家养的和野生的猫科动物，如狮、虎、猎豹)、兔子、仓鼠、山羊、大象、熊猫(包括大熊猫)、猪、浣熊、马、斑马、海洋哺乳动物(海豚、鲸等)等。在某些实施方案中，所述物种是濒危物种。在某些实施方案中，所述物种是目前已灭绝的物种。
诱导的多能干细胞可以使用几乎任何发育阶段的任何体细胞作为起点制备。例如，所述细胞可来自胚胎、胎儿、新生儿、幼年或成年供体。可以使用的示例性体细胞包括成纤维细胞，如由皮肤样品或活检获得的皮肤成纤维细胞、来自滑膜组织的滑膜细胞、包皮细胞、面颊细胞或肺成纤维细胞。虽然皮肤和脸颊提供了容易获得的、易于实现的合适细胞来源，但几乎所有的细胞都可以使用。在某些实施方案中，体细胞不是成纤维细胞。
诱导的多能干细胞可通过在体细胞中表达或诱导表达一种或多种重编程因子而制备。体细胞可能是成纤维细胞，如皮肤成纤维细胞、滑膜成纤维细胞、或肺成纤维细胞、或非成纤维细胞的体细胞。体细胞可以通过使表达(如通过病毒转导、整合或非整合载体等)和/或接触(例如，使用蛋白质转导结构域、电穿孔、显微注射、阳离子两亲物、与脂质双分子层融合、去污剂透化等)至少1、2、3、4、5种重编程因子而被重新编程。重编程因子可以选自Oct3/4、SOX2、NANOG、Lin28、cmyc和Klf4。可以通过将体细胞与至少一种能诱导重编程因子表达的试剂如有机小分子试剂接触来诱导重编程因子的表达。
进一步的示例性多能干细胞包括诱导的多能干细胞，其通过表达或诱导表达因子(“重编程因子”)组合而重新编程体细胞来产生。iPS细胞可以从细胞库获得。iPS细胞的制备可以是制备分化细胞的第一步。iPS细胞可以使用来自特定患者或匹配的供体的材料特别产生，目的是产生组织匹配的巨核细胞和血小板。iPS细胞可以从在预期的接受者中无明显的免疫原性的细胞制备，例如，从自体细胞或与预期的接受者组织相容的细胞制备。
也可以使用表达重编程因子(例如，使用病毒载体、质粒等)和诱导表达重编程因子(例如，使用小的有机分子)的组合方法重编程体细胞。例如，可利用病毒载体的感染，如逆转录病毒载体或慢病毒载体，在体细胞中表达重编程因子。同时，可以使用非整合载体，如游离质粒，在体细胞中表达重编程因子。参见，例如，Yuetal.,Science.2009May8；324(5928):797-801，其整体在此引入作为参考。当使用非整合性的载体表达重编程因子时，可以使用载体电穿孔、转染或转化体细胞而在细胞中表达所述因子。例如，在小鼠细胞中，使用整合性病毒载体表达四种因子(Oct3/4、SOX2、c-myc、KLF4)足以重编程体细胞。在人类细胞中，使用整合性病毒载体表达四种因子(Oct3/4、SOX2、NANOG和Lin28)足以重编程体细胞。
一旦重编程因子在细胞内表达，则可以培养该细胞。随着时间的推移，具有ES特征的细胞出现在培养皿中。可基于例如ES形态或基于可选择的或可检测的标记物的表达来选择细胞和传代培养。可培养细胞以产生类似于ES细胞的细胞培养物－这些是推定的iPS细胞。
为证实iPS细胞的多能性，可以用一种或多种多能性的测试方法测试所述细胞。例如，可以测试细胞中ES细胞标记的表达；可评估细胞在移植入SCID小鼠时产生畸胎瘤的能力；可以评估细胞分化产生所有三个胚层的细胞类型的能力。一旦获得多能性iPSC，其可被用来产生巨核细胞和血小板。
此处使用的术语“生血内皮细胞(PVE-HE)是指能分化产生造血细胞或内皮细胞类型的细胞，其可表达PECAM-1、VE-钙粘蛋白和/或Endoglin(例如，PECAM1+VE-Cad+Endoglin+造血性PVE-HE)，并可选地来源于多能干细胞。可以基于许多结构和功能特性来描述这些细胞，包括但不限于表达(RNA或蛋白质)或缺乏表达(RNA或蛋白质)一种或多种标记。PVE-HE细胞的特征是标记CD31(PECAM1)的表达。例如，至少大约90％、至少大约95％，或至少约9。另外，免疫荧光和透射电子显微镜结果进一步证明群体中9％的PVE-HE细胞可能是CD31+。PVE-HE细胞也可表达标记CD105(endoglin)和CD144(VE-钙粘蛋白)。例如，群体中至少大约70％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％或者至少大约99％的PVE-HE细胞可能是CD105+、CD144+和CD31+。在某些实施方案中，PVE-HE细胞彼此松散粘附。CD31，血小板内皮细胞粘附分子-1(PECAM-1)，已被作为内皮细胞祖细胞发展形成、血管发生和血管生成的标记。CD31组成型表达在成体和胚胎内皮细胞表面，是内皮细胞间连接的主要成分(其中集中了多达106个PECAM-1分子)并弱表达于许多外周白细胞和血小板上。
在示例性实施方案中，PVE-HE可能具有一个或多个、优选全部、以下特点：(1)早在PVE-HE分化开始后72小时可检测到显著量的CD31+PVE-HE细胞。(2)PVE-HE分化开始后大约120至146小时将达到峰值。(3)CD31+PVE-HE细胞群体可以分离和冷藏保存。(3)他们表达几乎所有的内皮祖细胞表面标记如CD31、CD105(Endoglin)、CD144(VE-钙粘蛋白)。它们也可以表达CD34、CD309(KDR)和CD146。(4)CD31+PVE-HE细胞亚群也表达CXCR4(CD184)。(5)内皮谱系能力可以通过在内皮细胞(EC)特异性培养基(如EGM-2或EndoGro)纤连蛋白中培养CD31+PVE-HE细胞以获得具有典型内皮细胞形态的单层细胞而得到证实。(6)PVE-HE来源的内皮细胞(PVE-HE-EC)不仅表达CD31(定位在细胞-细胞连接处)，也表达血管性血友病因子因子(vWF)，能进行LDL摄取。(7)在Matrigel之上培养时，PVE-HE-EC能够形成三维网络结构。(8)当以极低密度铺于EC特异性培养基的纤连蛋白时，CD31+PVE-HE细胞能形成具有典型的内皮细胞形态的集落，证实了它们的集落形成能力。(9)当铺于甲基纤维素培养基上进行原集落(blast-colony)生长时，原集落只能从CD31+部分产生。与CD31-细胞不同，CD34-和CD105-能够产生原集落，提示造血能力仅维持在CD31部分。(10)新产生的PVE-HE-EC维持造血潜能，并且如果在有利于造血谱系的条件下培养将产生造血细胞。
此处所用的术语“巨核细胞谱系特异性祖细胞”(“MLP”)是指至少定向于巨核细胞谱系的单个核的造血干细胞，并且包括、但不限于在脐带血、骨髓和外周血中的细胞以及造血干细胞、来源于人胚胎干细胞的细胞、和来源于诱导的多能干细胞的细胞。这些细胞可以基于许多结构和功能特性来描述，包括、但不限于表达(RNA或蛋白质)或缺乏表达(RNA或蛋白质)一种或多种标记。本发明公开的MLP可以是未成熟和成熟的细胞的混合物。可能基于在MLP衍生和扩增培养基(MLP-DEM，此处也称为APEL)中培养时间的长度，成熟与未成熟MLP的百分比会发生变化(例2中所描述的)。未成熟MLP的特征是表达标记CD41a、CD31、CD34、CD13和缺乏表达标记CD14和CD42b。本发明公开的示范性方法提供了检测和/或纯化MLP的方法，包括检测CD13的表达和/或富集或纯化CD13阳性细胞。可选地，这些方法中，可以检测CD13的表达和/或与此处所述的未成熟或成熟MLP的一种或多种其它标记结合用作细胞纯化的基础。成熟MLP的特征是表达标记CD41a、CD31、CD34、CD13、CD42b和缺乏表达标记CD14。在某些实施方案中，在无饲养细胞培养中产生的MLP可能是半脱离或完全脱离的，并可能漂浮在培养基中。例如，当它们开始漂浮在悬液中时，可以从PVE-HE收集MLP。优选地，不允许MLP铺板和粘附，这可能使其分化成MK以外的谱系或非MK谱系(如内皮细胞)。MLP优选悬浮培养以生产MK。可选地，MLP可低温保存。
此处所用术语“巨核细胞”(MK)是指产生血小板的大的多倍体的造血细胞，以及较小的MK(可由本方法生产)，后者可能是二倍体但完全能够产生血小板。成熟的MK的一个主要形态特征是大的多倍体核的产生。成熟的MK停止增殖，但继续通过核内有丝分裂而增加他们的DNA含量；同时细胞的大小增加。MK的大多倍体核、大细胞体积、丰富的细胞质使得每个细胞可以产生数千个血小板。可以基于这些和其它许多结构和功能特性来描述MK，包括、但不限于表达(RNA或蛋白质)或缺乏表达(RNA或蛋白质)一种或多种标记。成熟的MK表示标记CD41a和CD42b。成熟的MK也可表达CD61和CD29。例如，本发明公开的MK优选具有能够产生血小板的功能，例如当在此处所描述的条件下培养时。示范性实施方案提供了检测成熟MK的方法，包括检测CD29表达和鉴定CD29阳性细胞为成熟MK。另外的示范性实施方案提供了纯化MK的方法，包括从细胞群体中纯化CD29阳性细胞，例如使用磁珠减法、FACS、其他基于免疫亲和性的方法等。可选地，在这些方法中，可以检测CD29的表达和/或与成熟MK的一种或多种其它标记的表达结合用作细胞纯化的基础，比如表1中所示的那些标记(其提供了成熟的MK的更多示范性细胞表面标记的表达)。
在体内，MK来自骨髓中造血干细胞的前体细胞。这些多潜能干细胞位于骨髓窦状小管，并根据它们收到的信号，能够生产所有类型的血细胞。MK生成的主要信号是TPO。TPO诱导骨髓中的祖细胞向最终的MK表型分化。MK的发展经历以下谱系：CFU-ME(多能造血干细胞或成血细胞)、成巨核细胞、前巨核细胞、巨核细胞。细胞最终达到成巨核细胞阶段并失去分裂的能力。然而，它仍然能够复制自己的DNA和继续发育，成为多倍体。细胞质继续扩大，其DNA互补物可提高到64N以上。
一旦细胞完成分化并成为成熟的巨核细胞，便开始产生血小板的过程。TPO在诱导MK以形成小的前血小板的进程中发挥作用。血小板被保持在MK细胞质内的这些内部膜内。提出了两种血小板的释放机制。在一个情形下，这些前血小板过程爆发性破裂成为血小板。或者，细胞可能会形成血小板带进入血管中。所述的血小板带是通过伪足形成，它们能够持续释放血小板进入循环中。在任一种情况下，每一个这些前血小板过程破裂可以产生2000-5000个新的血小板。总的来说，75％以上的这些新产生的血小板会保持在循环中，而其余部分将滞留在脾脏。
此处所用术语“血小板”是指无核细胞质体，其来自参与导致血块形成的主要止血细胞机制的细胞。血小板(凝血细胞)是很小的、直径2-3pm的形状不规则的透明细胞碎片，其在体内是由前体巨核细胞(MK)破碎产生的。可以基于许多结构和功能特性来鉴定血小板，包括，但不限于，表达(RNA或蛋白质)或缺乏表达(RNA或蛋白质)一种或多种标记。血小板表达标记CD41a和CD42b。血小板响应于血管损伤而粘附于组织以及互相粘附。
此处所用术语“功能性血小板”或“具有功能性的血小板”是指可以被凝血酶激活、并参与血凝块回缩的血小板。在示范性实施方案中，血小板是否是功能性血小板可以用动物模型来确定，例如，如实施例4(图12)所描述，例如通过与可以是同一物种的自然产生的血小板比较。此外，活化的血小板可以通过CD62p及αIIbβⅢ的表达来鉴定，功能性血小板可以通过活化时比如由凝血酶活化时这些标记的表达来鉴定(可选地定量鉴定)。术语“基本上所有的血小板都是功能性的”是指包含血小板的组合物或制剂，其中例如，至少60％的血小板是功能性血小板，或至少65％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的血小板是功能性血小板。功能性血小板在22-37℃保存时可能至少5天是有活性的。
PECAM-1(CD31)是免疫球蛋白(Ig)超家族的一个成员，在循环血小板、单核细胞、嗜中性粒细胞、特别是T细胞亚群的表面上表达。它也是内皮细胞间连接的一个主要组成部分，其中集中了高达大约一百万个分子。因为这种细胞表达模式，PECAM-1涉及几个功能，包括白细胞经内皮的迁移，血管生成和整合素的活化。免疫球蛋白超家族介导细胞粘附(例如，NCAM1，ICAM1和VCAM1)或抗原识别(例如，免疫球蛋白，T细胞受体与MHC分子)。此外，还确认了包含30个成员的一个亚组，成员的特征是在其胞质结构域内1个或更多的免疫受体基于酪氨酸的抑制性基序(ITIM)的存在。在其胞质结构域内具有6个ITIM的PECAM-1是这个亚家族的一员。
Endoglin(ENG)，也被称为CD105，是一个同型二聚体膜糖蛋白，主要与人类血管内皮相关。它在儿童白血病的骨髓前成红细胞、活化的单核细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和淋巴母细胞上也有发现。Endoglin是转化生长因子β(TGFB)受体复合物的一个组成部分，以高亲和力结合TGFB1。Endoglin参与影响细胞形态和迁移的细胞骨架组织、如心血管系统发育和血管重塑的过程。在心脏发育过程中，其表达受到调节。没有Endoglin基因的实验小鼠死于心血管异常。
VE-钙粘蛋白(CD144)是来自钙粘蛋白超家族的一种典型的钙粘蛋白。VE-钙粘蛋白通过控制共粘附和细胞间连接的组织，由此维持内皮的完整性，从而在内皮细胞生物学中发挥重要的作用。VE-钙粘蛋白是正常的血管发育不可缺少的。转基因小鼠模型的研究证实，VE-钙粘蛋白的缺乏因血管缺陷而是胚胎致死性的。VE-钙粘蛋白发挥维护新生血管的目的。
此处所用术语“ROCK抑制剂”是指抑制或降低细胞内Rho-关联激酶功能或其信号通路的任何物质，比如小分子、siRNA、miRNA、反义RNA等诸如此类。此处所用“ROCK信号通路”可包括参与ROCK相关的信号通路的任何信号处理器，比如细胞内Rho-ROCK-MyosinII信号通路、其上游信号通路或其下游信号通路。可是使用的示范性ROCK抑制剂是Stemgent'sStemoleculeY27632，rho-关联蛋白激酶(ROCK)抑制剂(参见Watanabe等人,NatBiotechnol.2007Jun；25(6):681-6)。其它ROCK抑制剂包括，例如，H-1152、Y-30141、Wf-536、HA-1077、羟基-HA-1077、GSK269962A和SB-772077-B。Doeetal.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,32:89-98,2007；Ishizaki,etal.,Mol.Pharmacol.,57:976-983,2000；Nakajimaetal.,CancerChemother.Pharmacol.,52:319-324,2003；和Sasakietal.,Pharmacol.Ther.,93:225-232,2002，每一个在此整体引入作为参考。可以现有技术已知的浓度和/或培养条件使用ROCK抑制剂，例如如USPGPubNo.2012/0276063所述，其在此整体引入作为参考。例如，ROCK抑制剂的浓度可以是大约0.05至大约50μM,例如，至少或大约0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1、1.5、2、2.5、5、7.5、10、15、20、25、30、35、40、45或50μM，包括其中可推论出的任何范围，或任何有效促进细胞生长或存活的浓度。
例如，多能干细胞的存活可以通过加入ROCK抑制剂得到改善。在一个具体实施方案中，可将多能干细胞保持在无饲养细胞的条件下。在另一实施例中，巨核细胞谱系特异祖细胞的存活可以通过加入ROCK抑制剂得到改善。在另一实施例中，巨核细胞的存活可以通过加入ROCK抑制剂得到改善。在另一具体实施方案中，可将巨核细胞谱系特异性祖细胞保持在无饲养细胞的条件下。
缩写词
iPS:诱导的多能干
iPSC:诱导的多能干细胞
hiPSC:诱导的人多能干细胞
hES:人胚胎干
hESC:人胚胎干细胞
MK:巨核细胞
MLP:巨核细胞谱系特异性祖细胞，也称为巨核细胞祖细胞(MKP)
PVE-HE:生血内皮细胞，其可选地为PECAM1+VE-钙粘蛋白+Endoglin+，并可选地衍生自多能干细胞，
iPS-PVE-HE:iPS细胞衍生的生血内皮细胞(比如PECAM1+VE-钙粘蛋白+Endoglin+细胞)
hES-PVE-HE:hES细胞衍生的生血内皮细胞(比如PECAM1+VE-钙粘蛋白+Endoglin+细胞)
PVE-HE-MLP:由生血内皮细胞制备的巨核细胞谱系特异性祖细胞
iPS-PVE-HE-MLP:由iPS细胞制备的PVE-HE-MLP
hES-PVE-HE-MLP:由hES细胞制备的PVE-HE-MLP
PVE-HE-MLP-MK:由巨核细胞谱系特异性祖细胞制备的巨核细胞，所述的祖细胞由生血内皮细胞制备
iPS-PVE-HE-MLP-MK:由iPS细胞制备的PVE-HE-MLP-MK
hES-PVE-HE-MLP-MK:由hES细胞制备的PVE-HE-MLP-MK
PLT:血小板
hiPSC-PLT:由诱导的人多能干细胞制备的血小板或血小板样颗粒
hESC-PLT:由人胚胎干细胞制备的血小板或血小板样颗粒
ADM:高度分化形态学。
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所有出版物在此以同等程度引入作为参考，正如每一单独的出版物或专利申请被各自明确指明引入作为参考。下列描述包括可有助于理解本发明的信息。不认为此处提供的任何信息是现有技术或与本发明相关，或明确或暗示参考的任何出版物是现有技术。
实施例
为更好地阐明本发明提供了下列实施例，其不应被理解为是对本发明范围的限制。对于所提到的具体物质的范围，只是为了说明目的，而不意欲限制本发明。本领域技术人员无需创造性劳动和无需背离本发明范围，可开发出等同的方法或反应物。
实施例1-多能衍生生血内皮细胞(PVE-HE)的产生。
由诱导的多能干细胞(iPS细胞)产生多能生血内皮细胞(PVE-HE)。
第一，在不含饲养细胞的多能干细胞培养基mTeSR1中的Matrigel(一种来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的可溶性制剂)上培养扩增iPS细胞。简而言之，通过使用以EDTA作为唯一活性成分的化学确定的细胞解离缓冲液(CDB)解离收获人iPS细胞。在培养基或CDB中不使用酶或任何其他动物产品。对于具有本领域普通技术的研究人员应能够理解，可能使用其他化学确定的基质，比如重组玻连蛋白或SyntheMaxII，或培养基，比如mTeSR2，或其他相容性细胞解离试剂。
第二，准备将收获的人iPS细胞进行分化成PECAM1+VE-钙粘蛋白+Endoglin+的多能PVE-HE。不需要形成胚状体(EB)。简而言之，将收获的细胞重悬于mTeSR1，并将细胞铺板到细胞外基质人胶原蛋白IV(AdvancedBioMatrix,cat#5022)之上。在培养中加入10μM的小分子ROCK抑制剂Y27632，认为这将有助于收获的iPS细胞贴壁到胶原蛋白IV包被表面上。使iPS细胞在37℃、5％CO2的条件下贴壁12-48小时。如图2A所示，在无饲养细胞的条件下，48小时后贴壁细胞显示典型的多能干细胞形态。
第三，将制备的人iPS细胞分化成PVE-HE细胞。简而言之，移除含有Y27632的mTeSR1培养基，加入分化起始培养液(DIM)。DIM是不含动物成分的培养基(ACF)，其由Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium(IMDM)作为基质培养基、人血清白蛋白、铁饱和的转铁蛋白、胰岛素、b-巯基乙醇、可溶性低密度脂蛋白(LDL)、胆固醇、50ng/ml骨形态生成蛋白4(BMP4)、50ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)组成。37℃、5％CO2保温48小时后，观察到所希望的PVE-HE分化的早期形态。在图2B中可见基本完成的从多能干细胞向分散的小细胞团的转化。在PVE-HE分化起始96-146小时后，观察到显示单细胞层之上生长的小的紧密细胞团的晚期分化形态(图2C)。
第四，在PVE-HE分化起始120小时后，对晚期分化形态(ADM)细胞的形态改变(图3B)和成功的PVE-HE分化进行了分析。简而言之，对少量细胞样品进行谱系特异性标记CD31(PECAM)、CD105(内皮联蛋白)、CD144(VE-钙粘蛋白)的流式细胞术分析。在该分化阶段，ADM细胞显示PVE-HE表型CD31+CD144+CD105+(图3A)。
实施例2-由人iPS衍生的PVE-HE细胞产生非贴壁巨核细胞谱系特 异性祖细胞(MLP)。
第一，在PVE-HE分化起始120小时之后起始MLP分化。简而言之，移除含有50ng/mlBMP4、50ng/mlbFGF和50ng/mlVEGF的培养基，替换为MLP衍生和扩增培养基(MLP-DEM,也称为APEL或StemlineII，如图1所示)，其由Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium(IMDM)、Ham’sF-12营养混合物、Albucult(重组人白蛋白)、聚乙烯醇(PVA)、亚油酸、SyntheChol(合成胆固醇)、硫代甘油(a-MTG)、重组人胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺溶液、无蛋白质的杂交瘤混合物II(PFHMII)、抗坏血酸2磷酸盐、GlutamaxI(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)、青霉素/链霉素、25ng/ml干细胞因子(SCF)、25ng/ml促血小板生成素(TPO)、25ng/mlFms-相关酪氨酸激酶3配体(FL)、10ng/ml白细胞介素-3(IL-3)、10ng/ml白细胞介素-6(IL-6)和5单位/ml肝素组成。然后细胞在37℃、5％CO2条件下保温多达8天。维持MLP分化8天。
表1显示了成熟MLP和成熟MK细胞的标记表达的流式细胞术比较分析。该分析表征了低温保存前PVE-HE衍生的MLP细胞的表型以及随后分化为确定表型的MK细胞。
第二，使用血清移液管通过温和冲洗收集在贴壁细胞群上面的漂浮和半脱离的MLP。将含有MLP的培养基转到锥形管中，300xg离心5分钟，收集MLP。丢弃培养基，将MLP沉淀重悬于磷酸缓冲盐水中，进行形态分析(图5)，以及使用表1所示的标记进行流式细胞术分析。选择的结果参见图4。结果证实在该阶段收集的MLP主要(超过90％)由两种群体组成：一种特征为相对不成熟的MLP群体，表现为CD41a+CD31+CD34+CD14-CD13+CD42b-，以及一种比较成熟的MLP群体，表现为CD41a+CD31+CD34+CD14-CD13+CD42b+。
第三，低温保存MLP。简而言之，使用含有10％DMSO的细胞冻存培养基CS10(Sigma)进行MLP的低温保存。
实施例3-由人iPS-PVE-HE-MLP衍生的巨核细胞(MK)制备成熟 血小板
第一，如上所述，使用人iPS-PVE-HE衍生的MLP细胞进行血小板分化的起始。将MLP接种到MK培养基(MK-M)的非粘附表面上，所述的MK培养基由Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium(IMDM)作为基质培养基、人血清白蛋白、铁饱和的转铁蛋白、胰岛素、b-巯基乙醇、可溶性低密度脂蛋白(LDL)、胆固醇、30ng/ml的TPO、1ng/ml的SCF、7.5ng/ml的IL-6、13.5ng/ml的IL-9、5μM的Y27632和5-25单位/ml的肝素组成。然后细胞在37℃、5％CO2条件下保温3天。
在一些情况下，将MLP接种到培养基的非粘附表面上，所述的培养基由Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium(IMDM)、Ham’sF-12营养混合物、Albucult(重组人白蛋白)、聚乙烯醇(PVA)、亚油酸、亚麻酸、SyntheChol(合成胆固醇)、硫代甘油(a-MTG)、重组人胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺溶液、无蛋白质的杂交瘤混合物II(PFHMII)、抗坏血酸2磷酸盐、GlutamaxI(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)、青霉素/链霉素、30ng/ml的TPO、1ng/ml的SCF、7.5ng/ml的IL-6、13.5ng/ml的IL-9、5μM的Y27632和5-25单位/ml的肝素组成。然后细胞在37℃、5％CO2条件下保温3天。
第二，分析iPS-PVE-HE-MLP衍生的成熟MK细胞。在血小板分化起始72小时后，随着成熟的的进展，非常巨大的多倍体MK(50μM)变得非常丰富(图5A&B.5A中的刻度尺是100μM，5B中的N指示MK内的细胞核)。从72－96小时之间，具有细长伪足的前血小板形成细胞显微镜下容易可见。(图5A&5C,箭头所示)，通过流式细胞术分析检测到CD41a+CD42b+血小板颗粒的出现(图6)。在图6中，“A”中的细胞是循环中的人血小板，“B”中的细胞是hES-PVE-HE-MLP，“C”中的细胞是外周血来源的人血小板，“D”中的细胞是iPS-PVE-HE-MLP，“E”中的细胞是hES-PVE-HE-MLP)。起始后84小时，CD41a+CD42b+血小板的量显著增加，达到高达70％的水平(图6D)。
第三，不损害培养物中成熟的MK，收集高质量的血小板至少连续5天或可能更长，以提高从MLP产生血小板的产量至少3－5倍。为了从含有血小板的培养基中分离大的MK，将细胞悬浮液50xg离心10分钟，去除上清液，用新鲜MK-M重悬MK细胞沉淀，使它们在以后产生更多的血小板。为了将血小板与前血小板、大的细胞碎片和小的MK分离，使用BSA/HAS梯度沉淀方法，从50xg的离心上清中获得更纯的血小板群。纯化的血小板悬浮于MK-M中，并保持室温。通过FACS分析，并与外周血来源的人血小板比较，鉴定有关粒度、透明度、大小和细胞表面标记表达的血小板的质量。(图6A-E)。将纯化的血小板室温保存于非粘附表面内的MK-M培养基中，确保功能性血小板的损失最小。
实施例4-来自iPS-PVE-HE-MLP衍生的巨核细胞(MK)的成熟血 小板的分析。
第一，分析iPS-PVE-HE-MLP衍生的血小板(hiPSC-PLT)的形态。根据先前所述方法进行免疫荧光和透射电子显微术分析(CellResearch201121:530-45)。发现hiPSC-PLT是圆盘状的，并且超微结构与循环人PLT基本相同(如透射电子显微术所证实，图7)。如DIC和β1-微管蛋白IF显微术所证实，hiPSC-PLT与循环人PLT的平均大小类似(2.38μm±0.85μm与2.27μm±0.49μm)(图8)。hiPSC-PLT在玻璃上伸展－形成丝状伪足和板状伪足(如图9中所示的DIC活细胞显微成像所证实)。hiPSC-PLT无细胞核，与循环中人PLT类似(如Hoechst染色所证实，图8)。发现hiPSC-PLT具有相对于循环人PLT正常的微管蛋白细胞骨架(如β1-微管蛋白标记所证实，图8)。发现hiPSC-PLT具有相对循环人PLT正常的丝状肌动蛋白(如鬼笔环肽标记所证实，图8)。发现hiPSC-PLT具有相对循环人PLT正常的α-颗粒表达(如图10A&10B中TSP4和PF4标记所证实)。
第二，通过体外活化测定测量活化的血小板上细胞粘附分子表达来分析hiPSC-PLT的功能性。简而言之，使用抗CD62p抗体和PAC-1抗体，分析两种粘附分子。PAC-1识别αIIbβIII整合素。CD62p和αIIbβIII都在活化的血小板表面表达。根据先前所述方法进行所述的实验(CellResearch201121:530-45)。受到凝血酶作用，PAC-1和P-选择素的结合都增加(图11)。
第三，使用体内测定体系测量巨噬细胞耗尽的NOD/SCID的小鼠中血栓形成分析hiPSC-PLT的功能性。简而言之，如先前所述进行提睾肌小动脉活体显微术(CellResearch201121:530-45)。巨噬细胞耗尽的NOD/SCID小鼠腹腔注射氯胺酮(125mg/kg)和甲苯噻嗪(25mg/kg)进行麻醉。插入气管导管，将小鼠放在温度控制的毯子上。阴囊切开后，从腹中取出提睾肌放到活体显微镜托盘上。在整个实验中，使用温度控制的(37℃)和充气(95％N2，5％CO2)的碳酸氢盐缓冲盐水浇注所述的肌肉制备物。使用微点激光系统(PhotonicsInstruments)的微点激光烧蚀损伤提睾肌小动脉壁。通过颈静脉环面注入Dylight649缀合的抗小鼠CD42c抗体(EmfretAnalytics,0.05μg/g体重)可以看见发展的小鼠血小板血栓的形成。也将3x106钙黄绿素AM-标记的hPLT、iPSC-PLT和ESC-PLT与或不与ReoPro一起以100xg输注入到小鼠中。一只小鼠中形成2到4个血栓。使用具有60x/1.0NA水浸物镜的OlympusBX61W显微镜和高速照相机(HamamatsuC9300)通过增感器(VideoScopeInternational)记录荧光和亮视野图像。收集血管壁损伤之后5分钟的数据，并使用Slidebookv5.0(IntelligentImagingInnovations)进行分析。图12A中所示结果表明hiPSC-PLT在体内环境中有助于凝块形成。也确定了hiPSC-PLT功能性是由αIIbβIII介导的。具体地用ReoPro，ReoPro是特异性结合αIIbβIII并抑制血小板功能的人-鼠嵌合性单克隆抗体的Fab片段，预处理hiPSC-PLT(图12B)。星号是指相对于未经ReoPRO处理的对照，具有统计学显著性差异(相对于对照p<0.01，Student’st-检验)。
第四，确定hiPSC-PLT输注后在巨噬细胞耗尽的NOD/SCID小鼠中的动力学。为确定体内hiPSC-PLT和ESC-PLT的动力学是否与hPLT的动力学相似，将iPSC-或ESC-PLT输注入巨噬细胞耗尽的NOD/SCID小鼠中，通过流式细胞术分析各个时间点收集的血液。简而言之，如先前所述，通过静脉注射脂质体包裹的氯膦酸盐耗尽巨噬细胞。在第0天(100μl)和第2天(50μl)将氯膦酸盐脂质体通过尾静脉注射到小鼠中。第3天，通过200xg离心柠檬酸钠处理的血液25分钟获得血小板富集的人血浆，以及在0.5μMPGE1和10％柠檬酸盐缓冲液存在下800xg离心10分钟。沉淀重悬于含有0.5μMPGE1和10％柠檬酸盐缓冲液的HEPES-Tyrode缓冲液，800xg离心5分钟。血小板重悬于含有0.1％无脂肪酸的BSA的HEPES-Tyrode缓冲液。将分离的人血小板(hPLT,1.5x107)、本发明公开的诱导的多能干细胞衍生的血小板(hiPSC-PLT,1.5x107)以及本发明公开的胚胎干细胞衍生的血小板(ESC-PLT,1.0x107)静脉输注到巨噬细胞耗尽的小鼠中。在不同时间点(10、30、60、120、240、360和480分钟)通过颈静脉收集30μl小鼠血液，使用APC-缀合的抗人CD41和Dylight488-缀合的抗小鼠CD42c抗体通过流式细胞术分析。结果证实hiPSC-PLT在巨噬细胞耗尽的NOD/SCID小鼠中循环几个小时(图13)。
实施例5.由多能细胞制备血小板。
本实施例提供进一步的从多能干细胞制备血小板的范例方法。
如上所述，hESC-PLT和hiPSC-PLT是从人胚胎和诱导的多能干细胞离体制备的人血小板。如上所述的最初的体外和体内鉴定已经证实hESC-PLT和hiPSC-PLT在形态和功能上都与人供体血小板类似。例如，hiPSC-PLT能在玻璃基底上伸展。
从解冻来自被批准的hiPSC或hESC总细胞库(MCB)的样品瓶开始大量中间产物(MK祖细胞)的制备。制备大量中间产物的过程流程图示于图14A-E中。将含有1-2百万hiPSC或hESC的总或工作细胞库的冻存管从cGMP液氮贮存汽相中取出，并转移到洁净室(ISO7级)中。所有操作在认证的生物安全操作台(ISO5级BSC)中进行。解冻后洗涤去除DMSO；将细胞接种到带有Matrigel包被的器皿中的mTeSR1的确定培养基中。小心保持细胞为聚集体。培养板标记日期、批号和传代数，每个孔的盖子标记唯一的号码(例如1-6)。将接种的培养板放置于37℃、5％CO2的孵箱中。使用立体显微镜和倒置显微镜每天观察培养物。在工作表格中记录有关集落大小、细胞形态的观察结果；包括分化程度和培养基颜色。通常每1-2天更换mTeSR1培养基，直至培养物达到60-90％的汇合度。当形态和汇合度评估表明培养物需要细胞传代时，使用细胞解离缓冲液收获细胞集落。再次小心保持细胞为聚集体。将培养物重新接种到Matrigel包被的容器的mTeSR1的培养基中。基于每cm2收获的和每cm2要接种的细胞数，根据所需的干细胞产量，通常以1:4至1:8的比例每3-7天分一次细胞。将接种的培养物放回37℃、5％CO2的孵箱中。根据所需的批量大小，在诱导造血分化前可以将干细胞传代1-6次。
为造血细胞分化接种后三天，检测培养物以确定细胞贴壁和突起。该阶段的培养物通常具有较低密度的贴壁细胞，占不足10％的总表面积。贴壁很好的细胞应该显示具有从多能干细胞形态向分化的细胞的显著转变的突起：较大的细胞，相对核的大小具有明显较多的细胞质，没有明确的集落边界的更弥漫性生长。
当估计干细胞扩增阶段已经满足细胞产量需要时，起始造血分化。损失一个代表容器，收获并制备单细胞悬液。定量细胞浓度来建立培养接种参数，放弃剩余细胞。使用细胞解离缓冲液小心收获集落，并以5,000个细胞/cm2的密度，重新接种到胶原蛋白原IV包被容器中补充有10uMY27632(ROCK抑制剂)的mTeSR1培养基中。将接种的容器置于37℃、5％CO2的孵箱中。
第二天去除培养基，小心尽量少的去除任何漂浮的细胞团，并更换为补充有50ng/ml重组人(rh)BMP-4、50ng/mlrhVEGF和50ng/mlrhbFGF的StemSpanACF(StemCellTechnologiesInc.)。将培养物转到低O2(～5％)、37℃、5％CO2的环境中，使其2天不被打扰。2天后对培养物的细胞贴壁和突起物进行形态学评价。去除培养基，小心尽量少的去除任何漂浮的细胞团，更换为新鲜培养基。将培养物再放回低O2(～5％)、37℃、5％CO2的环境中2天。这段时间之后，再更换一次培养基，将培养物置于常氧培养条件。2天的常氧培养之后，移出培养基，小心尽量少的移出任何漂浮的细胞团，并置换为含有STEMdiffAPEL(StemCellTechnologiesInc.)以及补充了5单位/ml肝素、25ng/mlrhTPO、25ng/mlrhSCF、25/ngrhFL、rhIL-6和rhIL-3的MLP培养基。在接下来的2-6天维持这些条件。每天对培养物进行形态学评价以确定漂浮MK祖细胞的质量。不更换培养基，但如果培养物开始显示培养基耗尽(培养基显示黄色)，则另外加入培养基。对培养物定期取样并通过FACS测定CD41a、CD42b的表达。当培养物形态学和CD41a、CD42b的表达适当时(～≥15％双阳性)，收获培养物，然后在10％二甲亚砜、90％的胎牛血清的冻存培养基(Hyclone)中，以3-5百万活MLP/mL/冻存管低温保存细胞。如下完成低温保存：将冻存管放在冷冻器(Nalgene)中，然后储存在-80℃冰箱1-3天，接着转移到cGMP液氮储存系统的汽相。
解冻批准的大量中间产物开始最终产物hESC-PLT或hiPSC-PLT的制备过程。从含有已经通过大量中间产物质量测试的3-5百万MLP的冻存管从cGMP液氮贮存汽相中取出，并转移到洁净室中。以大约2.3x105/cm2将细胞接种到超低粘附(ULA)容器中补充有30ng/mlrhTPO、1ng/mlrhSCF、7.5ng/mlrhIL-6、13.5ng/mlrhIL-9和5uMY27632(ROCK抑制剂)的StemSpanACF培养基中。将培养容器标记日期和批号，并在每个容器的盖子上标记唯一的号码(例如1-6)。将培养物维持在39℃潮湿的10％CO2气氛中。通常在此培养阶段没有明显的细胞扩增。培养大概3到4天，较大的成熟巨核细胞(MK)将开始出现。定期取样监测培养物并进行CD41a、CD42b表达的FACS分析。通常最初在培养5天后观察到前血小板形成。随着前血小板形成的进展以及CD41a、CD42b表达增加至大约30％-70％，可以收获培养物(第6－7天)。
在50xg离心收获培养基以去除巨核细胞浆液。移出上清并在1000xg离心浓缩血小板。重悬血小板，然后上样至不连续白蛋白(人)(HSA)梯度上(12％、10％、7％、5％和2％)以进一步分离血小板。80xg离心血小板HSA梯度15分钟。从梯度中收获血小板，并在悬浮液中加入PGE1防止活化。1000g离心10分钟浓缩血小板。当前hESC和hiPSC血小板保存在培养基中。为了计划的研究目的，将对48－72小时的目标产物的稳定性进行研究。初步的研究表明，保存前后PAC1结合结果确定最少24小时的稳定性。
对大量中间产物中MLP细胞群体的FACS分析(CD31和CD43)已经显示大约98％的细胞形成了生血内皮细胞系或造血谱系，并因此已经分化超越了多能性。
在该过程的更下游，已经对制备的MK分化以及PLT收获阶段期间存在的细胞通过vWF(血管性血友病因子)的表达进行了测试。在该制备阶段的细胞大约100％vWF+。高度分化细胞群体的维持表明培养没有经历非分化祖细胞的克隆性扩增。
初步的研究表明，通过OCT4、NANOG、TRA-1-60、TRA-1-81SSE3、SSE4和碱性磷酸酶的IFA染色分析在hiPS衍生的MK细胞群中完全不含有多能细胞。进一步使用IFA染色多能标记的研究将检查hES衍生的和hiPS衍生的MLP和MK，以及从MK衍生的纯化的PLT群体，以筛选多能细胞的存在。将进行示踪(spiking)研究，以确定这种测定方法的LOD，来检测各种细胞群体中的干细胞。
已经通过FACS分析多能标记(SSEA4和TRA-1-60)对表征MK群体进行了初步研究。已经进行了示踪研究，其中将1％和0.1％浓度的hES细胞与MK混合。结果表明检测极限是0.1％。对表征MK的SSEA4和TRA-1-60初始研究结果显示，MK群体中<0.1％(低于该测定方法的检测水平)的SSEA4/TRA-1-60阳性细胞。
参考图14的步骤2-3，因为用解离缓冲液收获的干细胞形成细胞团块，所以不能进行准确的细胞计数。由于这个原因，使用胰蛋白酶-EDTA收获代表培养容器以确保形成单细胞悬液。在血清计数器中计数该悬液，并对收获的细胞数按照cm2进行标准化。然后丢弃用于计数的细胞。其它培养产物使用解离缓冲液收获，根据并基于标准化的细胞数/cm2乘以所收获的cm2计算细胞产量。所计算的细胞产量用于设定诱导造血细胞分化时接种容器所需的细胞密度/cm2。
参考图14，步骤10，从在MLP培养基中2天开始到MLP培养基中6天结束，从代表培养容器进行细胞取样，合并并通过FACS分析确定CD41a和CD42b双阳性细胞百分比。CD41a是纤维蛋白原受体(αIIbβIII)的亚基，CD42b是血管性血友病因子受体(GPIb-V-IX)的亚基。两种受体的表达是MK谱系特异性的，并且二者都是血小板功能所必需的。早期谱系生血内皮细胞是CD41a阴性的，在造血祖细胞晚期造血分化过程表达CD41a。CD42b只表达于成熟MK。在这一点上，培养物是异质的，具有高百分比的CD41+细胞和低百分比的CD42+细胞(Pineault,et.Al.,Megakaryocyteandplateletproductionfromhumancordbloodstemcells.MethodsMolBiol.2012；788:219-47)。
如下进行样品制备和FACS分析。简而言之，收集并合并漂浮细胞。使用血清移液管对培养物表面使用温和的生长培养基流，使任何松散粘附的MLP分离，并与自由漂浮的细胞合并。收集合并的很好悬浮的细胞样品(100-200μL)，并离心(160xg，5分钟)。细胞沉淀重悬于DPBS，再离心，重悬于添加了含有CD41a-APC-缀合的(别藻蓝蛋白)和CD42b-PE-缀合的(藻红蛋白)(BDBioscience,SanJose,CA)的3％FBS(FACS缓冲液)的DPBS中。荧光缀合的抗体和适当的同型对照(小鼠IgG1k-APC和小鼠IgG1k-PE)在室温存在15分钟。然后将标记的细胞稀释到FACS缓冲液中，离心并重悬于FACS缓冲液中。进行FACS分析，监测10,000个事件。收获具有可接受百分比的表达双阳性(CD41a+CD42b+)MLP细胞的培养物，并低温保存。暂定最低规格是10％双阳性。图15显示的是源于hiPSC的MLP的代表性二维点图。在该图中，细胞群是86.4％CD41a+；31.2％CD42b+，以及群体的29.9％染色双阳性。
在收获进行低温保存前，对MLP培养物中贴壁细胞的大约百分比和具有低的核与细胞质比的分化的大细胞的程度进行测定。贴壁细胞应呈现无清晰集落边界的分散的集落。应该有大量的漂浮MLP静止在贴壁细胞群之上。活的漂浮MLP应该显现清晰、具有最低限度的双折射、被光滑的细胞膜所区分。典型地，1cm2的表面积每天可以产生5,000至15,000MLP。图16显示了hiPSC细胞系MA-iPS-01衍生的代表性MLP群的显微照片(HoffmanModulationContrast,x400)。
在低温保存MLP之前，通过台盼蓝拒染法使用血球计数器进行活细胞计数。根据活细胞数和存活百分比评价细胞。对代表样品瓶进行支原体和无菌性测试。
另外，如下所述对代表性冻存管中低温保存的MLP的CD31和CD43表达进行了测定。CD31是生血内皮细胞标记，在内皮细胞谱系和造血细胞谱系上都有表达。CD43的表达证实造血功能。将低温保存的MLP样品管冲洗解冻，重悬于添加3％FBS(FACS缓冲液)的DPBS中，离心(160xg5分钟)。细胞沉淀重悬于添加了含有CD31-APC-缀合的(别藻蓝蛋白))和CD43-FITC-缀合的(藻红蛋白)(BDBioscience,SanJose,CA)的3％FBS(FACS缓冲液)的DPBS中。解冻的MLP样品与荧光缀合的抗体和适当的同型对照(小鼠IgG-APC和小鼠IgG-FITC)一起室温温育15分钟。然后将标记的细胞稀释到FACS缓冲液中，离心并重悬于FACS缓冲液中。进行FACS分析，监测10000个事件。可接受的MLP库具有>/＝50％CD31阳性细胞和>/＝50％CD43阳性细胞。图17显示的是源自hiPSC系MA-iPS-01的MLP的代表性二维点图。在所示实施例中，细胞群为99.8％CD31+；98.5％CD43+，以及群体的98.4％染色双阳性。
另外，使用多能标记如SSEA4、TRA-1-60对代表性冻存管中低温保存的MLP进行了FACS分析，证实了不存在多能细胞。
解冻低温保存的MLP的样品冻存管，对其进行解冻后活性和恢复的测定。MLP进一步加工到前血小板形成点，并进行MK成熟过程中的MK形态学测定和CD41a+和CD42b+的FACS分析。监测培养物的前血小板形成和血小板形成，以及FACS分析鉴定双染色(CD41a+和CD42b+)细胞。可接受的标准包括：无菌性(<USP21>浸入测试阴性)、支原体阴性(通过直接(琼脂&肉汤)测试或间接测试(细胞培养)进行测试)、FACS中至少90％CD31和CD43阳性、台盼蓝染色至少70％的存活以及多能细胞标记表达阴性。
参考图14，步骤13-14，解冻后2-3天，测定接种MLP的培养物中MK谱系自由漂浮细胞的出现。此时细胞是异质的，大小在直径10－50微米范围内。对显示明亮细胞质和光滑细胞膜的健康MK前体细胞和MK使用倒置光学显微镜通过肉眼观察测定活细胞的大致比例。图18显示了源自hESC产生的代表性MK群体的显微照片(HoffmanModulationContrast，x400)。
参考图14，步骤13-14，MLP解冻2-3天后，从代表性培养容器中取出细胞样品，合并，加工，用CD41a和CD41b的荧光缀合的抗体标记，进行FACS分析。具有可接受百分比的表达CD41a+和CD42b+MLP细胞进行进一步加工(优选地至少10％的双阳性细胞)。
参考图14，步骤15，在MLP解冻后的3天开始到5天结束，对MK培养物的前血小板出现进行测定。图19中的箭头指示前血小板形态。具有前血小板的MK呈现出延伸自细胞的长的突起，显示了一些串珠和分支，然后破碎。
参考图14，步骤15-16，一旦证实前血小板的出现，在MLP解冻后3天开始到8天结束，从代表性培养物收集前血小板和血小板样品。简而言之，使用10mL血清移液管，将样品转移到50mL锥形管中，反复吹吸至少5次，以产生足以断裂前血小板的剪切力。将样品放回充有10％CO2的39℃孵箱并使其静置30分钟。大约250μL的含有悬浮血小板的上清被染色，并进行FACS分析CD41a和CD42b。当检测到血小板峰值时，，典型地当30-70％的血小板为双阳性染色时(CD41a+CD42b+)开始收获和随后加工血小板。
鉴定了hiPSC-PLT和hESC-PLT的pH、血小板计数和身份(由CD61、CD41a、CD42b的表达确定)、血小板活化标记的表达(CD62P、PAC1、血小板因子4)、生理反应(凝集(微孔板法)、TEG(凝血弹性描记法(thromboelastography))和伸展)，并通过电子显微镜术以及β1微管蛋白染色的DIC显微镜术对其进行了形态学评价。
进一步检测了细胞的无菌性(<USP21>浸入测试结果阴性)、内毒素(凝胶法USP<85>小于5EU/ml)、支原体(欧洲药典测试和美国药典测试阴性)、身份(通过FACS，至少70％CD41a+，CD42b+)、PLT计数/mpPLT(FACS分析CD61)、形态学(β1微管蛋白染色的DIC显微镜术)和PAC1结合效力(活化的)。
用CD41a和CD41b的荧光缀合的抗体对纯化的血小板进行染色，然后如上所述进行FACS分析。下面显示的是源自iPS-01的PLT的代表性二维点图。在图20显示的实施例中，群体是81.8％CD41a+；69.2％CD42b+以及68.2％的群体染色双阳性。
结合图20中进行的CD41a+、CD42b+FACS，在CD染色过程中，在样品中加入碘化丙啶(PI)，用以测定存活。如先前所述，进行FACS分析，计数10,000个事件，在液流通路3中收集额外的事件来检测PI阳性事件(非活性血小板)。分析数据给出CD41a+/CD41b+血小板的百分比和存活百分比(检测的总血小板－PI+血小板/检测的总血小板)。
对每一最终血小板产物批次，通过流式细胞术分析检测CD61阳性事件，测定血小板数和血小板微粒数。该测定使用已知数目的荧光珠对数据进行标准化，获得PLTs/μL和mpPLT/μL的绝对数目。简而言之，将5-10μL的血小板样品稀释到0.9％的盐水中，并分置到两只试管的每一只中：
1)一只TruCount(BDCat#340334)管，含有具有已知数目的荧光珠的冻干沉淀和藻红蛋白缀合的抗CD61IgG,最终反应体积是60μL/管，以及
2)一只同型对照管，含有PE-缀合的小鼠IgG用于非特异的第一抗体结合，最终反应体积是60μL/管。
温和地混合试管，在20-24℃保温20分钟，然后加入400μL冷的(2-8℃)1％甲醛，寒冷避光保存两小时。在分析固定的血小板样品之前，通过从新鲜超声处理的稀释在0.9％盐水中具有1μM均一直径的乳胶珠(CMLCat#C37483)样品中采集最少10,00个事件来确定FACS仪器的数据采集适当的峰值通路、门限、轴、象限位置和区域标记边界的设置。应用这些设置后，对于同型对照和CD61染色样品，最少需要100,000个事件。从CD61样品获得的计数将记录事件为CD-61阳性荧光染色PLT、CD-61阳性mpPLT和检测的Trucount荧光珠数。在血小板大小2-4微米范围内和在针对在同型对照中检测的非特异性结合进行校正的mpPLT象限内分析在预定区域中所计数的事件。使用下列公式，根据制造商提供的每管中Trucount珠子的已知数目相对检测的Trucount珠子的有效性对数据进行标准化。
计数的事件#/计数的珠子#X每管中TruCount珠子#/样品体积＝mpPLT/μL或PLT/μL。
另外，采用显微观察测定hESC-PLT和hiPSC-PLT的形态。通过差示干涉差显微镜术(DIC)和确认血小板独特的特征微管圆周带β1-微管蛋白染色来进行形态学测定。简而言之，在4％的甲醛中固定血小板，并离心到1μg/ml多聚赖氨酸包被的盖玻片上，使用0.5％TritonX-100进行通透，在免疫荧光封闭缓冲液(50mlPBS中0.5gBSA，0.25ml10％叠氮钠和5mlFCS)中封闭最少两个小时，然后进行抗体标记。为区分通透的细胞，将样品与抗人β1-微管蛋白的兔多克隆第一抗体温育，所述的抗体是针对C-末端肽序列CKAVLEEDEEVTEEAEMEPEDKGH(GenemedSynthesis,Inc.)(SEQIDNO:1)产生的。然后用缀合了AlexaFluor568nm的羊抗兔第二抗体(Invitrogen；MolecularProbes)处理样品，在温育之间和之后用PBS充分洗涤。将盖玻片安装(AquaPolymount；Polysciences)在显微镜载玻片上。作为背景对照，载玻片与第二抗体单独温育，并调节图像作为抗体的非特异性结合。用配备油浸物镜或差示干涉差物镜的显微镜检查样品。使用电荷耦合装置照相机获得图像。使用MetaMorph图像分析软件(MolecularDevices)和ImageJ(NationalInstitutesofHealth)分析图像。测定静息血小板的特征如下：差示干涉差(DIC)显微镜术：圆盘状，直径大约2-3μM；β1-微管蛋白染色：显著的微管圆周带，与静息血小板相似的直径。参见图21。
对血小板(hESC-PLT和hiPSC-PLT)进一步测试以证实不含有多能细胞(例如通过PCR、免疫荧光和/或FACS以检测多能性标记)。为了提高灵敏度，检测方法可以与能浓缩潜在细胞污染物的过程配合，所述过程是通过滤器、基质或梯度结合对于沉淀细胞低速的离心进行捕获，而将血小板留在上清中。
根据浸入法USP<21>,CFR610.12进一步测试血小板(hESC-PLT和hiPSC-PLT)中微生物的存在。
进一步测试血小板(hESC-PLT和hiPSC-PLT)的内毒素。使用胶凝内毒素系统(AssociatesofCapeCod,Inc.)定量革兰氏-阴性细菌内毒素。制备适当的阴性、阳性和阳性产物对照。阳性产物对照是抑制性对照，由加入了标准内毒素的标本或标本稀释物组成。将样品直接加入到试剂并充分混合。将反应管在37℃±1℃温育60±2分钟。形成颠倒试管也不消退的凝胶则表示阳性测试。通过确定标本系列稀释的终点定量内毒素。在不含有内毒素的系列中，已知浓度的阳性对照可以包括在测试中。将使用内毒素测定验证PLT样品的使用，并以与1987FDA关于内毒素验证的指导一致的方式进行。
进一步测试血小板(hESC-PLT和hiPSC-PLT)的支原体。在进行HSA梯度前离心血小板后，收集并合并上清(例如由条件StemSpanACF培养基组成)。从最后的产物批次和条件培养基纯化的血小板样品被送样进行支原体测试。根据欧洲药典和US药典指南，通过指示细胞培养物上的间接培养以及在琼脂平板上和在肉汤中的直接接种进行支原体检测。
实施例6.血小板效力和PAC-1结合的测定。
可使用本实施例所述的方法评价本发明公开的血小板的效力和/或PAC-1结合。
体内血小板活化诱导αIIbβ3整合素构象的变化，激活GPIIb/IIIa复合物的纤维蛋白原受体功能，引起增强的配体结合。活化的血小板结合包括纤维蛋白原和血管性血友病因子的底物，在血管损伤位点刺激血栓形成。为了确定血小板活化时功能性αIIbβ3整合素表达的程度，hESC-PLT、iPSC-PLT和纯化的正常人血小板被活化，并与静止对照PLT比较，评价了其PAC-1结合程度。PAC-1是纤维蛋白原模拟物，其特异结合αIIbβ3整合素的活化构象。
计数PLT，最少取出100,000个PLT，用另外的培养基稀释成密度大约为20PLT/uL。将PAC1-FITC(BD,1:100稀释)和抗体(CD41a-APC-缀合的(别藻蓝蛋白)1:100和CD42b-PE-缀合的(藻红蛋白)1:100(BDBioscience,SanJose,CA))加入到PLT样品中。在两只5mLFACS管的每一只中分别加入一半样品(250uL)。向一只管中加入凝血酶(Sigma)至终浓度1U/mL。凝血酶处理的活化的PLT和对照样品室温保温15-20分钟。样品进行FACS分析，用人血液血小板作为对照确定前向与侧向散射门控(gating)。通过比较活化和未活化对照中CD41a和PAC-1阳性事件的数量定量PAC-1的结合(活化)。
实施例7.使用蛋白酶比如MMP抑制剂提高剪切力下产生的血小 板的产量或纯度。
本发明公开内容也涉及使用剪切力条件的血小板制备方法(例如培养基在培养过程中是流动的)。使用微观流体装置进行所述的培养，其中流速在几十微升/分钟的范围内，接近血细胞生成过程中骨髓腔中的剪切力。在一些情况下，流速在5-25微升/分钟的范围内。在剪切力下培养本发明公开的iPS细胞或ES细胞产生的巨核细胞时，发现其以更加有效的方式排出血小板。
用于培养MLP的装置必须能够使MLP固定而不贴壁。在一些情况下，这意味着MLP位于装置的一个区域或室中，在那里能够接触到流动的培养基，但自身不能明显移动。
本发明公开内容认为在这些培养体系中可以提高血小板的产量和纯度。一方面，可以通过在剪切力培养中使用一种或多种确定的蛋白酶抑制剂获得所述的提高。该实施例证实了在这些培养条件下加入基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂的好处。应该理解为MMP抑制剂是其它可以类似地用于这些方法的蛋白酶抑制剂的代表，比如但不限于纤溶酶原激活物抑制剂。
另一方面，可以通过增加剪切力的培养获得血小板产量和纯度的提高。所述的剪切力可以为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4或4.5达因/cm2。
使用源自HA-iPS和MA09hES系的成熟的MK。在含有或不含有20μMMMP抑制剂GM6001的情况下，将悬于MK特异性培养基中的相同数量的MK装载到微观流体装置中。在整个培养期间对MK应用恒定的剪切力。在6小时的过程中，每隔30分钟收集MK下游的MK培养基。通过流式细胞术测量收集的培养基中血小板的数目和纯度(即总细胞中CD41a+CD42b+的百分比)。
图22-24提供了源自HA-iPS产生的MK制备血小板的结果。在流速定为[请提供]μl/min的恒定剪切力下产生血小板。在培养开始时加入MMP抑制剂明显提高了新产生的血小板的纯度(图22)和产量(图24)。纯度表示为总收获细胞中CD41a+CD42b+细胞的百分比。加入8％葡聚糖增加了培养基的粘度，其对血小板的形成具有负面影响。
图23说明在剪切力培养中存在MMP抑制剂GM6001时，从MK产生明显多的血小板。
图24说明在剪切力培养中存在MMP抑制剂GM6001或DMSO、或在静止培养中血小板产量的差异。
图25说明当MA09(ES)衍生的MK用于制备血小板时获得了相似的结果。图25和26也说明剪切力的适度改变(反映为从12μl/min-16μl/min的流速变化)也可以提高血小板的纯度和产量。
实施例8.MMP特异性抑制剂作为保护性抑制剂有助于静止培养中 血小板的形成。
蛋白酶(如MMP，)参与CD42b(也被称为GPIbα，)的脱落。血小板CD42b是vWF的受体，其介导起始血小板参与伤口愈合。因此，CD42b的减少导致较差的血小板质量。广谱MMP抑制剂GM6001被报道可以抑制血小板的CD42b的脱落。
在使用几种特异性MMP抑制剂的比较研究中，确定MMP8抑制剂比GM6001具有更大的保护血小板功能的能力。如图26所示，在MK血小板产生峰值时加入MMP8特异性抑制剂，明显将iPS衍生的血小板的纯度从43.7％提高至65.5％，后者比从GM6001处理的培养物获得的纯度高出大约10％。与GM6001比较，在MMP8特异性抑制剂的存在下产生了明显更多的CD41a+CD42b+血小板。当MMP特异性抑制剂和GM6001组合使用时，纯度水平未受影响(图27)，但血小板产量提高(图28)。通过测量培养物中血小板含量来确定血小板产生的峰值，例如每天基础上的几天。其通常在MLP分化培养阶段开始后的4-7天，但是它可能延长或可能变换。
尽管使用iPS衍生的巨核细胞产生图27和28的数据，但是本发明公开内容提供了MMP8特异性抑制剂在培养血小板天然来源比如骨髓和脐带血CD34+祖细胞中的应用。
实施例9.升高温度下iPS血小板产生。
图29和30说明在温热条件下培养巨核细胞明显提高了血小板的纯度和产量。39℃培养时CD41a+CD42b+血小板的百分比明显高于37℃时的培养。最明显的效果是在达到血小板产生高峰之前。除了提高纯度外，较高的温度培养巨核细胞也有助于提高从相同起始数目的巨核细胞产生血小板的产量，表明升高的温度对本文提供的培养体系中的巨核细胞或血小板没有不利影响。
实施例10.iBET通过下调c-myc基因而促进巨核细胞的能力并 提高整体血小板产量。
在我们的巨核细胞谱系特异性分化的新方法中，最适于血小板产生的巨核细胞祖细胞的出现只能在从PVE-HE开始培养的3-4天的短期内收获。髓系CD14+细胞的逐渐增加似乎与巨核细胞质量和血小板产量的降低相关。在为了获得更高和更好的巨核细胞祖细胞产量的努力过程中，为了确定新的巨核细胞促进因子，发现c-myc基因是早期巨核细胞生成的重要的调节基因。
GSK1210151A(I-BET151)是一种口服有效、基于imidazolonoquinoline的BET家族布罗莫结构域(bromodomains)抑制剂。通过诱导早期细胞周期阻滞和凋亡，I-BET151具有极大的抗人和小鼠MLL融合白血病细胞系效力。该作用模式的部分原因是通过BRD3/4、PAFc和SEC组分在染色质间的移位对关键基因(BCL2、C-MYC和CDK6)转录的抑制。
尽管高剂量的i-BET-151引发严重的细胞凋亡，但是以微摩尔范围(或亚微摩尔范围)的低剂量处理正在进行体外巨核细胞生成的细胞导致MK祖细胞数量的增加。图31通过定量的mRNA分析说明i-BET-151对c-myc基因表达的剂量依赖性抑制。相反，i-BET-151上调了前-MK(pro-MK)基因GATA1(图32)。i-BET-151处理也导致了CD14+髓系细胞数量剂量依赖性降低。
因此，使用本文提供的体外制备iPS衍生的(或ES衍生的)巨核细胞和血小板的方法，进一步发现了在进行巨核细胞生成的细胞中抑制内源c-myc的基因表达可以改变有助于MK谱系的细胞分化的平衡。

Claims (73)

1.适用于人类患者的药物制剂，其包含至少108个血小板，其中所述的制剂基本上不含有白细胞，并且其中基本上所有的血小板都是有功能的。
2.权利要求1的药物制剂，其包含109-1014个血小板，任选109、1010、1011、1012、1013或1014个血小板。
3.权利要求1-2任一项中的药物制剂，其中所述的血小板具有下述特性中的一个或多个：平均血小板体积范围为9.7-12.8fL；所述的制剂中大小为单峰分布；和/或血小板体积对数分布，其中一个标准差小于2μm3(优选小于1.5μm3、1μm3或甚至0.5μm3)。
4.权利要求1-3任一项中的制剂，其中所述的血小板对至少一种下述标记呈阳性：CD41a和CD42b。
5.权利要求1-4任一项中的制剂，其中所述的血小板为人血小板。
6.权利要求1-5任一项中的制剂，其中至少50％、60％、70％、80％或90％的血小板在室温保存至少2、3或4天后是有功能的。
7.具有弱贴壁性或非贴壁性巨核细胞的生物反应器，其无需饲养细胞而产生功能性血小板。
8.一种组合物，其包含至少109个MLP。
9.一种低温保存的组合物，其包含MLP。
10.一种库，其包含低温保存的MLP。
11.权利要求9或10中的低温保存的组合物或库，其中所述的MLP具有确定的HLA型。
12.权利要求9中的低温保存的组合物，其与患者是HLA匹配的。
13.权利要求9-12任一项中的低温保存的组合物或库，其包含109-1014个MLP，任选109、1010、1011、1012、1013或1014个MLP。
14.由巨核细胞制备血小板的方法，其包含以下步骤：
a)提供巨核细胞的非贴壁培养物；
b)使所述巨核细胞与TPO或TPO激动剂接触，从而导致在培养物中形成前血小板，其中所述的前血小板释放血小板；以及
c)分离所述的血小板。
15.由巨核细胞制备血小板的方法，其包含以下步骤：
a)提供巨核细胞的非贴壁培养物；
b)使所述的巨核细胞与造血扩增培养基接触，并任选与(1)TPO或TPO激动剂、SCF、IL-6和IL-9或2)TPO或TPO激动剂、SCF和IL-11接触，从而导致在培养物中形成前血小板，其中所述的前血小板释放血小板；以及
c)分离所述的血小板。
16.权利要求14或15的方法，其中所述的TPO激动剂包含下列中的一种或多种：ADP、肾上腺素、凝血酶、胶原蛋白、TPO-R激动剂、TPO模拟物、第二代血小板生成剂、罗米司亭(romiplostim)、艾曲波帕(eltrombopag)(SB497115，Promacta)、重组人血小板生成素(TPO)、聚乙二醇化重组人巨核细胞生长和发育因子(PEGrHuMGDF)、Fab59、AMG531、Peg-TPOmp、TPO非肽模拟物、AKR-501、单克隆TPO激动剂抗体、多克隆TPO激动剂抗体、TPO微抗体(minibody)、VB22Bsc(Fv)2、结构域亚类转换的TPO激动剂抗体、MA01G4G344、重组人血小板生成素、重组TPO融合蛋白或TPO非肽模拟物。
17.权利要求14-16任一项中的方法，其中基本上所有所分离的血小板都是有功能的。
18.权利要求14-17任一项中的方法，其中所述的巨核细胞的非贴壁培养物是不含饲养细胞的培养物。
19.权利要求14－18任一项中的方法，其中步骤(b)的培养物是在包含一种或多种下列物质的培养基中：0.5-100ng/ml的干细胞因子(SCF)，10-100ng/ml的血小板生成素(TPO)，和10-100ng/ml的白细胞介素－11(IL-11)，至少一种ROCK抑制剂，和/或2.5-25单位/ml的肝素。
20.权利要求14－18任一项中的方法，其中步骤(b)的培养物是在包含一种或多种下列物质的培养基中：10-100ng/ml的TPO，0.5-100ng/ml的SCF，5-25ng/ml的IL-6，5-25ng/ml的IL-9，至少一种ROCK抑制剂，和/或2.5-25单位/ml的肝素。
21.权利要求19或20的方法，其中所述的至少一种ROCK抑制剂包含Y27632。
22.权利要求21的方法，其中所述的Y27632的浓度为2-20μM、大约3-10μM、大约4-6μM或大约5μM。
23.权利要求14－22任一项中的方法，进一步包括对所述的巨核细胞使用剪切力。
24.权利要求14－23任一项中的方法，其中每个巨核细胞产生至少2、3、4、或5个血小板。
25.权利要求24的方法，其中每个巨核细胞产生至少50个血小板。
26.权利要求25的方法，其中每个巨核细胞产生至少100、500、1000、2000、5000或10000个血小板。
27.权利要求14－26任一项中的方法，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的所述血小板为CD41a+和CD42b+。
28.权利要求14－27任一项中的方法，其中所述的血小板在不存在饲养细胞或基质饲养细胞的条件下制备。
29.权利要求14－28任一项中的方法，其中所述的血小板在不存在任何异种细胞的条件下制备。
30.权利要求14－29任一项中的方法，其中所述的血小板为人血小板。
31.权利要求14－30任一项中的方法，其中所述的巨核细胞在外加蛋白酶抑制剂存在的条件下培养。
32.权利要求14－30任一项中的方法，其中所述的巨核细胞在外加MMP抑制剂存在的条件下培养。
33.权利要求14－30任一项中的方法，其中所述的巨核细胞在外加MMP8抑制剂存在的条件下培养。
34.权利要求14－30任一项中的方法，其中所述的巨核细胞在外加MMP特异性抑制剂和泛MMP抑制剂存在的条件下培养。
35.权利要求14－34任一项中的方法，其中所述的巨核细胞在大约39℃的温度下培养。
36.权利要求14－35任一项中的方法，其中所述的巨核细胞是通过包括下列的步骤制备的：
(a)培养多能干细胞形成生血内皮细胞(PVE-HE)；
(b)培养所述的生血内皮细胞形成MLP；以及
(c)培养所述的MLP形成巨核细胞。
37.权利要求36的方法，其中在步骤(b)的培养物中加入BET抑制剂。
38.权利要求37的方法，其中所述的BET抑制剂是IBET151。
39.权利要求36－38任一项中的方法，其中多能干细胞为人多能干细胞。
40.权利要求36－39任一项中的方法，其中所述的生血内皮细胞在没有胚状体形成的情况下衍生。
41.权利要求36－40任一项中的方法，其中所述的多能干细胞是诱导的多能干细胞(iPSC)。
42.权利要求41的方法，其中所述的iPSC是人iPSC。
43.权利要求41或42的方法，其中所述的生血内皮细胞在没有胚状体形成的情况下衍生。
44.权利要求36－43任一项中的方法，其中所述的生血内皮细胞由所述的多能干细胞在包含1％－10％的氧、2％－8％的氧、3％－7％的氧、4％－6％的氧或大约5％的氧的低氧条件下分化而来。
45.权利要求36－44任一项中的方法，其中所述的MLP在38－40℃或大约39℃的温度下培养以形成巨核细胞。
46.一种药物制剂，其包含由权利要求14－45任一项中的方法制备的血小板。
47.权利要求46的制剂，其适用于人类患者，并包含至少108个血小板。
48.权利要求46的制剂，其适用于人类患者，并基本上没有白细胞。
49.前述任一项权利要求的组合物或由前述任一项权利要求的方法制备的组合物在制备治疗有此需要的患者或患有影响凝血的疾病或障碍的患者或可借此治疗的疾病或障碍的患者的药物中的用途。
50.权利要求49的用途，其中所述的疾病或障碍包含血小板减少症、创伤、血源性寄生虫或疟疾。
51.治疗需要血小板输注的患者的方法，包括给所述患者施用任一项前述权利要求的组合物或由任一项前述权利要求的方法制备的组合物。
52.权利要求51的方法，其中所述的方法对治疗包含血小板减少症、创伤、血源性寄生虫或疟疾的疾病或障碍有效。
53.由巨核细胞或MLP制备血小板的方法，其包括
在蛋白酶抑制剂存在的剪切力条件下培养巨核细胞或MLP的非贴壁群，以及
从培养物收获并任选地分离血小板。
54.权利要求53的方法，其中所述的蛋白酶抑制剂是MMP抑制剂。
55.权利要求53或54的方法，其中所述的剪切力条件是恒定的剪切力条件。
56.权利要求53－55任一项中的方法，其中剪切力条件包含1-4.1达因/cm2的剪切力。
57.权利要求53－56任一项中的方法，其中所述的巨核细胞或MLP在微观流体装置中培养。
58.权利要求53－57任一项中的方法，其中所述的巨核细胞或MLP源自iPS细胞、ES细胞或自然发生的CD34+细胞，任选骨髓或脐带血CD34+细胞。
59.权利要求53－58任一项中的方法，其中所述的蛋白酶抑制剂是GM6001。
60.权利要求53－58中任一项的方法，其中所述的蛋白酶抑制剂是MMP8特异性抑制剂。
61.权利要求60的方法，其中所述的MMP8特异性抑制剂是MMP8-I((3R)-(+)-[2-(4-甲氧基苯磺酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-氧肟酸盐])。
62.权利要求53－61任一项中的方法，其中使用两种或多种蛋白酶抑制剂。
63.权利要求62的方法，其中所述的两种蛋白酶抑制剂是MMP通用抑制剂和MMP8特异性抑制剂。
64.权利要求53－63任一项中的方法，其中所述的蛋白酶抑制剂在培养物中的血小板产生峰值时加入。
65.权利要求53－64任一项中的方法，其中所述的巨核细胞或MPL在TPO或TPO激动剂存在下进行培养以导致形成前血小板，其中所述的前血小板释放血小板。
66.权利要求53－65任一项中的方法，其中所述的巨核细胞或MPL在造血扩增培养基中培养，并且任选在
(1)TPO或TPO激动剂、SCF、IL-6和IL-9或
(2)TPO或TPO激动剂、SCF和IL-11中培养，以在培养物中形成前血小板，其中所述的前血小板释放血小板。
67.权利要求53－66任一项中的方法，其中所述的巨核细胞或MPL在高于37℃和等于或低于40℃的温度下培养。
68.权利要求67的方法，其中所述的巨核细胞或MPL在大约39℃的温度下培养。
69.由巨核细胞或MPL制备血小板的方法，其包括
在高于37℃和等于或低于40℃的温度下培养源自iPS细胞或ES细胞的巨核细胞或MPL的非贴壁群，以及
从培养物中收获和任选分离血小板。
70.权利要求69的方法，其中所述的巨核细胞或MPL在大约39℃的温度下培养。
71.由PVE-HE细胞制备MPL的方法，其包括
在BET的抑制剂存在下培养源自iPS细胞或ES细胞的PVE-HE细胞群，以及
从培养物收获并任选分离MPL。
72.权利要求71的方法，其中所述的BET抑制剂是I-BET151。
73.由PVE-HE细胞制备MPL的方法，其包括
在c-myc阻抑蛋白存在下培养源自iPS细胞或ES细胞的PVE-HE细胞群，以及
从培养物收获并任选分离MPL。
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