CN115372233A - 一种脂肪干细胞细胞周期的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞检测相关技术领域，更具体地，本发明提供了一种脂肪干细胞细胞周期的检测方法，包括细胞接种；所述细胞接种是取复苏的细胞，接种于培养瓶中，融合，收集细胞，洗涤，离心，去上清，得接种细胞；所述培养瓶中的培养基包括基础培养基和助剂。
Description
技术领域
本发明涉及细胞检测相关技术领域，更具体地，本发明提供了一种脂肪干细胞细胞周期的检测方法。
背景技术
干细胞(stem cells，SC)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。胚胎、婴儿或成人都具有持久或终身自我更新能力的干细胞，具有产生特异的细胞类型、形成人体组织和器官的潜能。而对于细胞周期的检测有利于干细胞的多方面应用。
目前关于细胞的周期检测方面也有一些研究，比如CN107219196A公开了一种细胞周期的检测方法，其是基于光散射测量的思路展开的，来判断病毒细胞的生理周期，从而实现疾病较好的治疗；而CN108866146A公开了一种细胞周期的检测试剂盒，通过流式细胞技术实现不同阶段的细胞分离。
然而人脂肪间充质干细胞的细胞周期检测方法目前没有高效简便的测试方法，并且其在分离培养组织干细胞的培养基中易出现增殖活性损伤以及老化，为提高脂肪干细胞细胞周期检测的准确性，其培养基的选择尤为关键。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种脂肪干细胞细胞周期的检测方法，包括细胞接种；所述细胞接种是取复苏的细胞，接种于培养瓶中，融合，收集细胞，洗涤，离心，去上清，得接种细胞；所述培养瓶中的培养基包括基础培养基和助剂。
在一种实施方式中，所述基础培养基选自DMEM、M199、UltraMEM、HBSS、F12、BME、RPMI1640、MCDB104、MCDB153中的任一种。
在一种优选的实施方式中，所述基础培养基选自DMEM、UltraMEM、F12中的任一种。
在一种优选的实施方式中，所述基础培养基为DMEM。
所述DMEM是dulbecco's modified eagle medium的缩写，所以其特点主要包括以下：（1）氨基酸含量为依格尔培养基的2倍，且含有非必需氨基酸，如甘氨酸等；（2）维生素含量为依格尔培养基的4倍；（3）含有糖酵解途径中的重要物质--丙酮酸；（4）含有微量的铁离子。
所述DMEM基础培养基是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，可为脂肪干细胞的新陈代谢提供能量来源。
在一种实施方式中，所述助剂包括转铁蛋白、血清白蛋白、β-巯基乙醇、C-藻蓝素、β-蜕皮甾酮、茶多酚。
所述转铁蛋白为脂肪干细胞的增殖培养提供铁源，是血浆中主要的含铁蛋白质，转铁蛋白能结合铁离子，减少其毒性并被细胞利用。
所述血清白蛋白能够提供细胞生长所需大量的营养物质，维持培养基正常的渗透压；可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。
所述β-巯基乙醇和β-蜕皮甾酮具有抗氧化的作用，避免蛋白质因氧化而失活。
所述C-藻蓝素可促进脂肪干细胞的分裂增殖以及起到细胞修复的作用。
所述茶多酚有助于维持脂肪干细胞的幼稚状态和细胞干性，防止脂肪干细胞的老化。
在一种实施方式中，所述转铁蛋白的浓度为20~40μg/mL、血清白蛋白的浓度为0.4~3mg/mL、β-巯基乙醇的浓度为2~10μg/mL、C-藻蓝素的浓度为2.1~2.6μg/mL、β-蜕皮甾酮的浓度为12~18μg/mL、茶多酚的浓度为5~20μg/mL。
在一种优选的实施方式中，所述转铁蛋白的浓度为25~35μg/mL、血清白蛋白的浓度为1~2.4mg/mL、β-巯基乙醇的浓度为4~8μg/mL、C-藻蓝素的浓度为2.1~2.6μg/mL、β-蜕皮甾酮的浓度为14~16μg/mL、茶多酚的浓度为10~14μg/mL。
在一种更优选的实施方式中，所述转铁蛋白的浓度为30μg/mL、血清白蛋白的浓度为1.7mg/mL、β-巯基乙醇的浓度为6μg/mL、C-藻蓝素的浓度为2.3μg/mL、β-蜕皮甾酮的浓度为15μg/mL、茶多酚的浓度为12μg/mL。
申请人发现在基础培养基中加入包括转铁蛋白、血清白蛋白、β-巯基乙醇、C-藻蓝素、β-蜕皮甾酮、茶多酚的助剂，并控制转铁蛋白的浓度为20~40μg/mL、血清白蛋白的浓度为0.4~3mg/mL、β-巯基乙醇的浓度为2~10μg/mL、C-藻蓝素的浓度为2.1~2.6μg/mL、β-蜕皮甾酮的浓度为12~18μg/mL、茶多酚的浓度为5~20μg/mL，各组分间相互作用能清除过氧化物以及自由基、抑制自由基生成、抑制氧化应激反应及活性代谢物生成等，可通过多种途径降低自由基和脂质过氧化对脂肪干细胞造成的增殖活性损伤，提高脂肪干细胞的增殖活性以及防止脂肪干细胞的老化，使得测得的细胞周期准确性更高。
在一种实施方式中，所述脂肪干细胞接种的密度为5500~6500个/cm2。
在一种优选的实施方式中，所述脂肪干细胞接种的密度为6000个/cm2。
在一种实施方式中，所述融合是指细胞的融合度达75~85%。
在一种优选的实施方式中，所述融合是指细胞的融合度达80%。
在一种更优选的实施方式中，所述细胞接种是取2.0×106复苏的细胞，按6000个/cm2接种于175cm2培养瓶中，融合达80%，收集细胞，取2.0×106用PBS洗涤2~3次，400g离心5min，去上清，得接种细胞。
在一种实施方式中，所述细胞接种前包括细胞融解；所述细胞融解是将冻存的细胞融解后转移到培养基中，离心洗去冻存液，沉淀，用培养基重悬计数，得复苏细胞。
在一种优选的实施方式中，所述培养基为MM3完全培养基。
在一种更优选的实施方式中，所述细胞融解是将冻存的细胞在37℃水浴锅中水浴1~3min融解后转移到含MM3完全培养基的离心管中，离心洗去冻存液，沉淀，用5mL MM3完全培养基重悬计数，得复苏细胞。
在一种实施方式中，所述细胞接种后包括细胞固定、细胞收集、酶解、染色、流式检测。
在一种实施方式中，所述细胞固定是用预冷的70%乙醇固定细胞，过夜。
在一种优选的实施方式中，所述细胞固定是用-20℃预冷的70%乙醇固定细胞，在4℃过夜。
在一种实施方式中，所述细胞收集是将过夜固定后的细胞离心，去乙醇上清，洗涤，离心，去上清，取PBS重悬细胞沉淀，得细胞悬液。
在一种优选的实施方式中，所述细胞收集是将过夜固定后的细胞在1200g离心10min，去乙醇上清，用PBS洗涤，在1200g离心10min，去上清，取100ul PBS重悬细胞沉淀，得细胞悬液。
在一种实施方式中，所述酶解是向细胞悬液中加入酶溶液，混匀，避光，得酶解液。
在一种优选的实施方式中，所述酶解是向细胞悬液中加入3uL RNase酶溶液，混匀，室温避光作用30min，得酶解液。
在一种实施方式中，所述染色是向酶解液中加入染液，混匀，避光孵育，得染色液。
在一种优选的实施方式中，所述染色是向酶解液中加入200uL 25ug/mL的PI染液，混匀，室温避光孵育15min，得染色液。
在一种实施方式中，所述流式检测的方法为：
S1打开流式细胞分析仪，新建实验方法，进行仪器清洗预热；
S2设置参数，打开两个伪彩色图和一个直方图；
S3将染液后混匀的样本管放入上样槽中并命名，运行；
S3依次上样，进行检测；
S4检测完成后，利用Flowjo分析软件进行分析。
在一种优选的实施方式中，所述流式检测的方法为：
S1打开流式细胞分析仪，新建实验方法，进行仪器清洗预热；
S2设置参数，打开两个伪彩色图和一个直方图，将第二个伪彩色图的纵坐标改为FSC-H，将直方图中的横坐标改为PE-A；
S3将染液后混匀的样本管放入上样槽中并命名，运行；第一个伪彩色图设门P1，圈主体细胞群；调整第二个伪彩色图显示P1门内的细胞并设门P2，去黏连细胞，调整直方图显示P2门内的细胞，并调整直方图参数，点击记录；
S3依次上样，进行检测；
S4检测完成后，利用Flowjo分析软件进行分析。
在一种优选的实施方式中，所述步骤S4中设置流式PE通道，将横坐标FLZ-A：PE-A范围设为0~400K。
流式细胞分析仪是以激光技术、光电测量技术、计算机技术、流动力学技术、电子物理、细胞免疫荧光化学技术以及单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。它可以在单细胞水平上进行定性、定量分析及分选，主要应用于血液学、免疫学、肿瘤学、分子生物学和细胞生物学等学科的基础研究及临床试验中。在本发明中通过调控流式细胞分析仪的参数，有利于获取到准确性较高的结果。
有益效果：本发明提供了一种脂肪干细胞细胞周期的检测方法，包括细胞接种，细胞接种中的培养基包括基础培养基和助剂，助剂包括转铁蛋白、血清白蛋白、β-巯基乙醇、C-藻蓝素、β-蜕皮甾酮、茶多酚，各组分间相互作用能清除过氧化物以及自由基、抑制自由基生成、抑制氧化应激反应及活性代谢物生成等，可通过多种途径降低自由基和脂质过氧化对脂肪干细胞造成的增殖活性损伤，提高脂肪干细胞的增殖活性以及防止脂肪干细胞的老化，使得测得的细胞周期准确性更高。
具体实施方式
实施例1
本发明的实施例1提供一种脂肪干细胞细胞周期的检测方法，包括细胞接种；所述细胞接种是取复苏的细胞，接种于培养瓶中，融合，收集细胞，洗涤，离心，去上清，得接种细胞；所述培养瓶中的培养基包括基础培养基和助剂。
所述基础培养基为DMEM。
所述助剂包括转铁蛋白、血清白蛋白、β-巯基乙醇、C-藻蓝素、β-蜕皮甾酮、茶多酚。
所述转铁蛋白的浓度为25μg/mL、血清白蛋白的浓度为1mg/mL、β-巯基乙醇的浓度为4μg/mL、C-藻蓝素的浓度为2.1μg/mL、β-蜕皮甾酮的浓度为14μg/mL、茶多酚的浓度为10μg/mL。
所述细胞接种是取2.0×106复苏的细胞，按6000个/cm2接种于175cm2培养瓶中，融合达80%，收集细胞，取2.0×106用PBS洗涤2次，400g离心5min，去上清，得接种细胞。
所述细胞融解是将冻存的细胞在37℃水浴锅中水浴2min融解后转移到含MM3完全培养基的离心管中，离心洗去冻存液，沉淀，用5mL MM3完全培养基重悬计数，得复苏细胞。
所述细胞固定是用-20℃预冷的70%乙醇固定细胞，在4℃过夜。
所述细胞收集是将过夜固定后的细胞在1200g离心10min，去乙醇上清，用PBS洗涤，在1200g离心10min，去上清，取100ul PBS重悬细胞沉淀，得细胞悬液。
所述酶解是向细胞悬液中加入3uL RNase酶溶液，混匀，室温避光作用30min，得酶解液。
所述染色是向酶解液中加入200uL 25ug/mL的PI染液，混匀，室温避光孵育15min，得染色液。
所述流式检测的方法为：
S1打开流式细胞分析仪，新建实验方法，进行仪器清洗预热；
S2设置参数，打开两个伪彩色图和一个直方图，将第二个伪彩色图的纵坐标改为FSC-H，将直方图中的横坐标改为PE-A；
S3将染液后混匀的样本管放入上样槽中并命名，运行；第一个伪彩色图设门P1，圈主体细胞群；调整第二个伪彩色图显示P1门内的细胞并设门P2，去黏连细胞，调整直方图显示P2门内的细胞，并调整直方图参数，点击记录；
S3依次上样，进行检测；
S4检测完成后，利用Flowjo分析软件进行分析。
所述步骤S4中设置流式PE通道，将横坐标FLZ-A：PE-A范围设为0~400K。
实施例2
本发明的实施例2提供一种脂肪干细胞细胞周期的检测方法，包括细胞接种；所述细胞接种是取复苏的细胞，接种于培养瓶中，融合，收集细胞，洗涤，离心，去上清，得接种细胞；所述培养瓶中的培养基包括基础培养基和助剂。
所述基础培养基为DMEM。
所述助剂包括转铁蛋白、血清白蛋白、β-巯基乙醇、C-藻蓝素、β-蜕皮甾酮、茶多酚。
所述转铁蛋白的浓度为35μg/mL、血清白蛋白的浓度为2.4mg/mL、β-巯基乙醇的浓度为8μg/mL、C-藻蓝素的浓度为2.6μg/mL、β-蜕皮甾酮的浓度为16μg/mL、茶多酚的浓度为14μg/mL。
所述细胞接种是取2.0×106复苏的细胞，按6000个/cm2接种于175cm2培养瓶中，融合达80%，收集细胞，取2.0×106用PBS洗涤2次，400g离心5min，去上清，得接种细胞。
所述细胞融解是将冻存的细胞在37℃水浴锅中水浴2min融解后转移到含MM3完全培养基的离心管中，离心洗去冻存液，沉淀，用5mL MM3完全培养基重悬计数，得复苏细胞。
所述细胞固定是用-20℃预冷的70%乙醇固定细胞，在4℃过夜。
所述细胞收集是将过夜固定后的细胞在1200g离心10min，去乙醇上清，用PBS洗涤，在1200g离心10min，去上清，取100ul PBS重悬细胞沉淀，得细胞悬液。
所述酶解是向细胞悬液中加入3uL RNase酶溶液，混匀，室温避光作用30min，得酶解液。
所述染色是向酶解液中加入200uL 25ug/mL的PI染液，混匀，室温避光孵育15min，得染色液。
所述流式检测的方法为：
S1打开流式细胞分析仪，新建实验方法，进行仪器清洗预热；
S2设置参数，打开两个伪彩色图和一个直方图，将第二个伪彩色图的纵坐标改为FSC-H，将直方图中的横坐标改为PE-A；
S3将染液后混匀的样本管放入上样槽中并命名，运行；第一个伪彩色图设门P1，圈主体细胞群；调整第二个伪彩色图显示P1门内的细胞并设门P2，去黏连细胞，调整直方图显示P2门内的细胞，并调整直方图参数，点击记录；
S3依次上样，进行检测；
S4检测完成后，利用Flowjo分析软件进行分析。
所述步骤S4中设置流式PE通道，将横坐标FLZ-A：PE-A范围设为0~400K。
实施例3
本发明的实施例3提供一种脂肪干细胞细胞周期的检测方法，包括细胞接种；所述细胞接种是取复苏的细胞，接种于培养瓶中，融合，收集细胞，洗涤，离心，去上清，得接种细胞；所述培养瓶中的培养基包括基础培养基和助剂。
所述基础培养基为DMEM。
所述助剂包括转铁蛋白、血清白蛋白、β-巯基乙醇、C-藻蓝素、β-蜕皮甾酮、茶多酚。
所述转铁蛋白的浓度为30μg/mL、血清白蛋白的浓度为1.7mg/mL、β-巯基乙醇的浓度为6μg/mL、C-藻蓝素的浓度为2.3μg/mL、β-蜕皮甾酮的浓度为15μg/mL、茶多酚的浓度为12μg/mL。
所述细胞接种是取2.0×106复苏的细胞，按6000个/cm2接种于175cm2培养瓶中，融合达80%，收集细胞，取2.0×106用PBS洗涤2次，400g离心5min，去上清，得接种细胞。
所述细胞融解是将冻存的细胞在37℃水浴锅中水浴2min融解后转移到含MM3完全培养基的离心管中，离心洗去冻存液，沉淀，用5mL MM3完全培养基重悬计数，得复苏细胞。
所述细胞固定是用-20℃预冷的70%乙醇固定细胞，在4℃过夜。
所述细胞收集是将过夜固定后的细胞在1200g离心10min，去乙醇上清，用PBS洗涤，在1200g离心10min，去上清，取100ul PBS重悬细胞沉淀，得细胞悬液。
所述酶解是向细胞悬液中加入3uL RNase酶溶液，混匀，室温避光作用30min，得酶解液。
所述染色是向酶解液中加入200uL 25ug/mL的PI染液，混匀，室温避光孵育15min，得染色液。
所述流式检测的方法为：
S1打开流式细胞分析仪，新建实验方法，进行仪器清洗预热；
S2设置参数，打开两个伪彩色图和一个直方图，将第二个伪彩色图的纵坐标改为FSC-H，将直方图中的横坐标改为PE-A；
S3将染液后混匀的样本管放入上样槽中并命名，运行；第一个伪彩色图设门P1，圈主体细胞群；调整第二个伪彩色图显示P1门内的细胞并设门P2，去黏连细胞，调整直方图显示P2门内的细胞，并调整直方图参数，点击记录；
S3依次上样，进行检测；
S4检测完成后，利用Flowjo分析软件进行分析。
所述步骤S4中设置流式PE通道，将横坐标FLZ-A：PE-A范围设为0~400K。
对比例1
本发明的对比例1提供一种脂肪干细胞细胞周期的检测方法，包括细胞接种；所述细胞接种是取复苏的细胞，接种于培养瓶中，融合，收集细胞，洗涤，离心，去上清，得接种细胞；所述培养瓶中的培养基包括基础培养基和助剂。
所述基础培养基为DMEM。
所述助剂包括转铁蛋白、血清白蛋白、β-巯基乙醇、C-藻蓝素、β-蜕皮甾酮、茶多酚。
所述转铁蛋白的浓度为20μg/mL、血清白蛋白的浓度为0.4mg/mL、β-巯基乙醇的浓度为2μg/mL、C-藻蓝素的浓度为2.1μg/mL、β-蜕皮甾酮的浓度为12μg/mL、茶多酚的浓度为5μg/mL。
所述细胞接种是取2.0×106复苏的细胞，按6000个/cm2接种于175cm2培养瓶中，融合达80%，收集细胞，取2.0×106用PBS洗涤2次，400g离心5min，去上清，得接种细胞。
所述细胞融解是将冻存的细胞在37℃水浴锅中水浴2min融解后转移到含MM3完全培养基的离心管中，离心洗去冻存液，沉淀，用5mL MM3完全培养基重悬计数，得复苏细胞。
所述细胞固定是用-20℃预冷的70%乙醇固定细胞，在4℃过夜。
所述细胞收集是将过夜固定后的细胞在1200g离心10min，去乙醇上清，用PBS洗涤，在1200g离心10min，去上清，取100ul PBS重悬细胞沉淀，得细胞悬液。
所述酶解是向细胞悬液中加入3uL RNase酶溶液，混匀，室温避光作用30min，得酶解液。
所述染色是向酶解液中加入200uL 25ug/mL的PI染液，混匀，室温避光孵育15min，得染色液。
所述流式检测的方法为：
S1打开流式细胞分析仪，新建实验方法，进行仪器清洗预热；
S2设置参数，打开两个伪彩色图和一个直方图，将第二个伪彩色图的纵坐标改为FSC-H，将直方图中的横坐标改为PE-A；
S3将染液后混匀的样本管放入上样槽中并命名，运行；第一个伪彩色图设门P1，圈主体细胞群；调整第二个伪彩色图显示P1门内的细胞并设门P2，去黏连细胞，调整直方图显示P2门内的细胞，并调整直方图参数，点击记录；
S3依次上样，进行检测；
S4检测完成后，利用Flowjo分析软件进行分析。
所述步骤S4中设置流式PE通道，将横坐标FLZ-A：PE-A范围设为0~400K。
对比例2
本发明的对比例2提供一种脂肪干细胞细胞周期的检测方法，包括细胞接种；所述细胞接种是取复苏的细胞，接种于培养瓶中，融合，收集细胞，洗涤，离心，去上清，得接种细胞；所述培养瓶中的培养基包括基础培养基和助剂。
所述基础培养基为DMEM。
所述助剂包括转铁蛋白、血清白蛋白、β-巯基乙醇、C-藻蓝素、β-蜕皮甾酮、茶多酚。
所述转铁蛋白的浓度为40μg/mL、血清白蛋白的浓度为3mg/mL、β-巯基乙醇的浓度为10μg/mL、C-藻蓝素的浓度为2.6μg/mL、β-蜕皮甾酮的浓度为18μg/mL、茶多酚的浓度为20μg/mL。
所述细胞接种是取2.0×106复苏的细胞，按6000个/cm2接种于175cm2培养瓶中，融合达80%，收集细胞，取2.0×106用PBS洗涤2次，400g离心5min，去上清，得接种细胞。
所述细胞融解是将冻存的细胞在37℃水浴锅中水浴2min融解后转移到含MM3完全培养基的离心管中，离心洗去冻存液，沉淀，用5mL MM3完全培养基重悬计数，得复苏细胞。
所述细胞固定是用-20℃预冷的70%乙醇固定细胞，在4℃过夜。
所述细胞收集是将过夜固定后的细胞在1200g离心10min，去乙醇上清，用PBS洗涤，在1200g离心10min，去上清，取100ul PBS重悬细胞沉淀，得细胞悬液。
所述酶解是向细胞悬液中加入3uL RNase酶溶液，混匀，室温避光作用30min，得酶解液。
所述染色是向酶解液中加入200uL 25ug/mL的PI染液，混匀，室温避光孵育15min，得染色液。
所述流式检测的方法为：
S1打开流式细胞分析仪，新建实验方法，进行仪器清洗预热；
S2设置参数，打开两个伪彩色图和一个直方图，将第二个伪彩色图的纵坐标改为FSC-H，将直方图中的横坐标改为PE-A；
S3将染液后混匀的样本管放入上样槽中并命名，运行；第一个伪彩色图设门P1，圈主体细胞群；调整第二个伪彩色图显示P1门内的细胞并设门P2，去黏连细胞，调整直方图显示P2门内的细胞，并调整直方图参数，点击记录；
S3依次上样，进行检测；
S4检测完成后，利用Flowjo分析软件进行分析。
所述步骤S4中设置流式PE通道，将横坐标FLZ-A：PE-A范围设为0~400K。
对比例3
本发明的对比例3提供一种脂肪干细胞细胞周期的检测方法，包括细胞接种；所述细胞接种是取复苏的细胞，接种于培养瓶中，融合，收集细胞，洗涤，离心，去上清，得接种细胞；所述培养瓶中的培养基为DMEM。
所述细胞接种是取2.0×106复苏的细胞，按6000个/cm2接种于175cm2培养瓶中，融合达80%，收集细胞，取2.0×106用PBS洗涤2次，400g离心5min，去上清，得接种细胞。
所述细胞融解是将冻存的细胞在37℃水浴锅中水浴2min融解后转移到含MM3完全培养基的离心管中，离心洗去冻存液，沉淀，用5mL MM3完全培养基重悬计数，得复苏细胞。
所述细胞固定是用-20℃预冷的70%乙醇固定细胞，在4℃过夜。
所述细胞收集是将过夜固定后的细胞在1200g离心10min，去乙醇上清，用PBS洗涤，在1200g离心10min，去上清，取100ul PBS重悬细胞沉淀，得细胞悬液。
所述酶解是向细胞悬液中加入3uL RNase酶溶液，混匀，室温避光作用30min，得酶解液。
所述染色是向酶解液中加入200uL 25ug/mL的PI染液，混匀，室温避光孵育15min，得染色液。
所述流式检测的方法为：
S1打开流式细胞分析仪，新建实验方法，进行仪器清洗预热；
S2设置参数，打开两个伪彩色图和一个直方图，将第二个伪彩色图的纵坐标改为FSC-H，将直方图中的横坐标改为PE-A；
S3将染液后混匀的样本管放入上样槽中并命名，运行；第一个伪彩色图设门P1，圈主体细胞群；调整第二个伪彩色图显示P1门内的细胞并设门P2，去黏连细胞，调整直方图显示P2门内的细胞，并调整直方图参数，点击记录；
S3依次上样，进行检测；
S4检测完成后，利用Flowjo分析软件进行分析。
所述步骤S4中设置流式PE通道，将横坐标FLZ-A：PE-A范围设为0~400K。
实施例1~3和对比例1~3的测试结果如下表所示：
表1
Claims (7)
1.一种脂肪干细胞细胞周期的检测方法，包括细胞接种，其特征在于，所述细胞接种是取复苏的细胞，接种于培养瓶中，融合，收集细胞，洗涤，离心，去上清，得接种细胞；所述培养瓶中的培养基包括基础培养基和助剂；所述助剂包括转铁蛋白、血清白蛋白、β-巯基乙醇、C-藻蓝素、β-蜕皮甾酮、茶多酚；所述转铁蛋白的浓度为25~35μg/mL、血清白蛋白的浓度为1~2.4mg/mL、β-巯基乙醇的浓度为4~8μg/mL、C-藻蓝素的浓度为2.1~2.6μg/mL、β-蜕皮甾酮的浓度为14~16μg/mL、茶多酚的浓度为10~14μg/mL。
2.根据权利要求1所述脂肪干细胞细胞周期的检测方法，其特征在于，所述基础培养基选自DMEM、M199、UltraMEM、HBSS、F12、BME、RPMI1640、MCDB104、MCDB153中的任一种。
3.根据权利要求1所述脂肪干细胞细胞周期的检测方法，其特征在于，所述脂肪干细胞接种的密度为5500~6500个/cm2。
4.根据权利要求3所述脂肪干细胞细胞周期的检测方法，其特征在于，所述融合是指细胞的融合度达75~85%。
5.根据权利要求1所述脂肪干细胞细胞周期的检测方法，其特征在于，所述细胞接种前包括细胞融解；所述细胞融解是将冻存的细胞融解后转移到培养基中，离心洗去冻存液，沉淀，用培养基重悬计数，得复苏细胞。
6.根据权利要求5所述脂肪干细胞细胞周期的检测方法，其特征在于，所述培养基为MM3完全培养基。
7.根据权利要求1所述脂肪干细胞细胞周期的检测方法，其特征在于，所述细胞接种后包括细胞固定、细胞收集、酶解、染色、流式检测。
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| GR01 | Patent grant | ||
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