CN114540273B - 一种诱导间充质干细胞向胰岛β细胞分化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种诱导间充质干细胞向胰岛β细胞分化的方法。本发明提供的方法，包括预诱导和正式诱导，所述方法通过获得特定的细胞外囊泡(EV)，可以实现微囊泡(MV)诱导间充质干细胞(MSC)出现胰岛样细胞形态学变化。具体地，本发明提供的诱导方法，使得MV在胰岛β细胞诱导分化中起主导作用。本发明提供的诱导方法，是一种EV介导的细胞间通讯真正用于干细胞诱导分化领域的新方式。本发明所述诱导方法的诱导效率非常高，有望将体外诱导的胰岛β细胞应用于临床。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种诱导间充质干细胞向胰岛β细胞分化的方法。
背景技术
在糖尿病的自然病程中，胰岛β细胞功能的持续恶化是一个不可逆的过程。众所周知，胰岛素由胰岛β细胞产生，而无论是1型糖尿病或是2型糖尿病都存在胰岛β细胞的衰竭问题，区别仅仅在于前者发病时即表现为需要外源性胰岛素维持生存，而2型糖尿病的β细胞功能衰竭则发生在疾病的晚期。
因此，恢复胰岛β细胞功能一直是医学界和糖尿病患者追求的目标。目前人们寄希望于大量胰腺或胰岛β细胞移植来达到这一目标，细胞治疗为代表的糖尿病治疗替代策略被广泛研究。其中干细胞疗法是研究的重点领域之一，目前多集中于使用化学小分子诱导某种干细胞向特定体细胞分化。
细胞外囊泡EV包括凋亡小体，微囊泡(MV)，和外泌体(EXO)，富含蛋白质，DNA(基因组和线粒体)和RNA，特别是小的非编码RNA，包扩microRNA，小核RNA，金库RNA和Y RNA。由于EV装载过程中施加的高选择性，其中RNA代表了细胞RNA的严重偏向亚群。
间充质干细胞(MSC)是一种多能干细胞，来源方便，细胞数量充足，易于分离、培养、扩增和纯化，无伦理学问题，不会产生免疫排斥反应，且自身具有免疫调节功能。目前临床已经证实该细胞能够治疗心脑血管系统疾病，糖尿病，肝肾损伤，脑及脊髓神经损伤等疾病。胎盘来源MSC是一种实用的组织修复种子细胞。
在糖尿病长期治疗过程中，需要大量胰腺或胰岛β细胞移植，这远远超过供给量，而且费用高昂，存在移植物排异反应等难题；使用化学小分子诱导某种干细胞向特定体细胞诱导分化这种传统的干细胞疗法步骤普遍繁琐，诱导时间大多超过20天，且其中很多化学小分子都有毒性，对人体应用的影响未知；目前细胞外囊泡(EV)用于诱导分化效率很低，仍是使用大量化学小分子完成诱导，EV用于诱导处于探索阶段，还不能满足临床需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种诱导间充质干细胞向胰岛β细胞分化的方法。本发明成功实现了单用微囊泡(MV)将干细胞诱导分化为胰岛β细胞。本发明实现了通过MV发挥主导作用，诱导干细胞分化为胰岛β细胞。
第一方面，本发明提供一种诱导干细胞分化为胰岛β细胞的方法，所述方法包括：预诱导和正式诱导；所述预诱导中MV工作浓度为35-40μg/mL，所述正式诱导中，MV工作浓度为70-80μg/mL；烟酰胺工作浓度为5-10mM、胰岛素转铁蛋白-硒工作浓度为0.5-1％。
本发明提供的诱导方法的示意图，如图1所示。
在本发明提供的方法中，为了保证良好的诱导效率，干细胞培养体系中，采用无EV的血清。
本发明所述MV的粒径范围为50nm-500nm；所述MV为具胰岛β细胞功能的细胞所产生的MV。
在本发明提供的方法中，所述MV来自大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)，大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)培养体系中，采用无EV的血清；分离得到MV的粒径范围为50nm-500nm。本发明应用的INS-1是目前公认的研究糖尿病以及胰岛β细胞的模式细胞，其他物种比如人、小鼠、牛、马、猪等等的胰岛β细胞产生的EV、EXO和MV，也在本发明保护之中。
在本发明提供的方法中，预诱导的诱导时间为2-4天；正式诱导的诱导时间为15-18天。
在本发明提供的方法中，所述干细胞为间充质干细胞。
在本发明提供的方法中，将间充质干细胞铺板后，待细胞汇合20％-40％时，加入MV工作浓度为35-40μg/mL的第一培养体系；培养2-4天，加入MV工作浓度为70-80μg/mL的第二培养体系；
优选地，所述第二培养体系中还含有工作浓度为8-10mM的烟酰胺和工作浓度为0.8-1％的胰岛素转铁蛋白-硒。
在本发明提供的方法中，在获得MV时，所用方法如下：培养大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)，每36-48h收集一次培养基，300-2000g离心去除死细胞和细胞碎片，12000g超速离心去除上清获得沉淀，用PBS重悬沉淀，将沉淀定量到150-190μg/mL，4℃保存备用。
第二方面，本发明提供一种诱导干细胞分化为胰岛β细胞的诱导剂，所述诱导剂为具有胰岛β细胞功能的细胞所产生的微囊泡、胰岛素转铁蛋白-硒和烟酰胺。
第三方面，本发明提供一种诱导干细胞分化为胰岛β细胞的培养基，所述培养基中，含有具胰岛β细胞功能的细胞所产生的微囊泡、DMEM和8-10％不含EV的血清、烟酰胺的工作浓度为5-10mM、胰岛素转铁蛋白-硒工作浓度为0.5-1％；所述培养基中具胰岛β细胞功能的细胞所产生的微囊泡的工作浓度为35-80μg/mL、粒径为50-500nm。
根据本领域技术人员的理解，本发明还请求保护上述的诱导剂或上述的培养基在提高干细胞诱导分化为胰岛β细胞的诱导效率中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的方法，可以更加高效和安全地获得胰岛β细胞，用于后期糖尿病治疗，以避免或解决胰腺或胰岛β细胞移植带来的供不应求、费用高昂，移植物排异反应等难题，并且，克服了传统的干细胞疗法存在步骤繁琐、诱导时间太长、化学小分子毒性等问题，以及目前EV用于诱导分化效率太低的问题。
本发明提供的方法可用于诱导取自糖尿病患者体内的MSC，或者诱导胎盘来源间充质干细胞这种组织修复种子细胞，在体外向胰岛β细胞分化，然后将诱导成功的胰岛β细胞移植到病人体内，不用依赖捐献或购买有限的异体胰腺或成体胰岛β细胞。这种方法使胰岛β细胞来源大大增加，甚至实现量产，使治疗费用大大降低，且没有了免疫排异反应。
由于本发明大幅提高了MV的诱导效率，使MV在胰岛β细胞诱导中真正的起到主导作用，实现了研究人员期望的EV介导细胞间通讯诱导分化这一新方式。与传统的干细胞疗法相比，本发明的诱导步骤简化到了只有预诱导与正式诱导2步。诱导时间缩短到18天。只用了少量的2个无毒且成本低廉的化学小分子，其中烟酰胺已证实对人体有诸多益处，ITS为胰岛素转铁蛋白-硒，也是一种药用产品。本发明仅通过MV+烟酰胺+ITS便将诱导效率提升到较高水平，诱导成本大大降低，而且更加安全高效。
附图说明
图1为本发明所提供诱导方法的示意图。
图2为本发明分离的MV鉴定图。A:NTA鉴定MV粒径-浓度；B:透射电镜观察MV形态；C：NTA鉴定EXO粒径-浓度；D:透射电镜观察EXO形态；E:Western Blot鉴定MV和EXO特异性Marker；F:WB条带灰度分析；
A和C中横坐标代表颗粒直径(nm)，纵坐标代表颗粒数/mL；F中横坐标代表蛋白标志物，纵坐标代表蛋白标志物灰度值/β-actin灰度值。
图3为本发明分离得到的间充质干细胞鉴定图。A:分离的细胞间充质标记物流式细胞术鉴定；B:右图为分离的细胞向成骨诱导分化，茜素红S染色见红色钙盐沉积；C:右图为分离的细胞向成脂诱导分化，油红O染色见红色脂滴。B和C左图为对照，也是MSC形态图；
A中，散点图横坐标代表前向散射光，纵坐标代表侧向散射光；峰值图中横坐标代表激发荧光色素，纵坐标代表细胞计数。
图4为本发明烟酰胺和ITS协助MV诱导MSC向胰岛β细胞分化鉴定图。A:PBS处理组；B:烟酰胺+ITS处理组；C:MV处理组；D:烟酰胺+ITS+MV处理组；E:β-ME+ITS+MV处理组；F:β-ME+烟酰胺+MV处理组；G:标准品的标准曲线，公式为y＝(a+bx)/(1+cx+dx^2)，a＝5.90673792637E-002，b＝4.24377738321E-002，c＝-1.21368362835E-001，d＝5.44302750309E-003；H:不同处理组胰岛β细胞Marker mRNA转录水平检测；I:ELISA检测各组在低糖5mM和高糖24mM刺激下胰岛素分泌水平。J-O:不同方法诱导MSC向类胰岛β细胞分化免疫荧光检测。J:PBS处理组；K:烟酰胺+ITS处理组；L:MV处理组；M:烟酰胺+ITS+MV处理组；N:烟酰胺+ITS+失活MV处理组；O:烟酰胺+ITS+MV+EIPA处理组；P-S:分别为烟酰胺+ITS+MV诱导第0天、第6天、第12天和第18天C-peptide流式细胞术阳性率检测；
G中横坐标代表胰岛素浓度(mU/L)，纵坐标代表吸光度值；H中横坐标代表胰岛β细胞特异性标志物，纵坐标代表胰岛β细胞特异性标志物mRNA转录水平/GAPDH mRNA转录水平；I中横坐标代表葡萄糖浓度(mM)，纵坐标代表每105个细胞胰岛素分泌量(mU/L)；P、Q、R、S横坐标代表激发荧光色素，纵坐标代表细胞计数。
图5为本发明分离的EV鉴定以及对MSC分化的影响。A:WB检测EV特异性Marker,lysate和EV先用brandford蛋白定量为100μg/mL；B:NTA检测EV粒径-浓度范围；C:q-PCR检测胰岛相关Marker转录水平；D:从胰岛β细胞相关Marker转录水平分析，INS-1培养基、BJ细胞EV对MSC向胰岛β细胞分化没有明显影响；
B中横坐标代表颗粒直径(nm)，纵坐标代表颗粒数/mL；C和D中横坐标代表胰岛β细胞特异性标志物，纵坐标代表胰岛β细胞特异性标志物mRNA转录水平/GAPDH mRNA转录水平。
图6为本发明不同EV浓度和诱导时间对MSC分化的影响探究。A和B：使用EV分别诱导MSC 9天和18天，q-PCR检测胰岛β细胞相关Marker转录水平；C:EV不同浓度处理组观察对MSC分化的影响；q-PCR检测胰岛β细胞相关Marker转录水平；
A、B和C中横坐标代表胰岛β细胞特异性标志物，纵坐标代表胰岛β细胞特异性标志物mRNA转录水平/GAPDH mRNA转录水平。
图7为本发明MV和EXO对MSC向胰岛β细胞分化的影响探究。40μg/mL MV或EXO处理MSC 18天，A:40μg/mL，9天和B:20μg/mL，18天设置为对照，q-PCR分析胰岛β细胞分化相关的Marker的mRNA转录水平。C:40μg/mL MV处理MSC 18天双硫腙染色后细胞形态观察；D:70μg/mL MV处理MSC 18天双硫腙染色后细胞形态观察；E:胰蛋白酶失活MV后对MSC分化的影响。
图8为本发明PKH67标记示踪探究MV诱导MSC向胰岛β细胞分化的机制。A-C:PKH67标记的MV，以及加入DMSO或巨胞饮抑制剂EIPA分别与MSC孵育3小时、24小时和48小时，荧光显微镜下观察荧光强度；D:Image J分析各组的荧光强度；
D中横坐标代表孵育时间(小时)，纵坐标代表平均荧光强度。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明实施例的图中n.s.＝non-significant，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。用paired,two-tailed t-testing计算统计学差异。显示的数据代表三个独立实验的mean±SD。
将本发明中所用培养基或图表中的英文解释如下：
INS-1：大鼠胰岛素瘤细胞；
FBS：胎牛血清；
EV：细胞外囊泡；MV：微囊泡；
MSC：间充质干细胞。
实施例1 MV的分离、鉴定
本实施例提供MV的分离和鉴定的方法，步骤如下：
配置大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)培养基的FBS使用Beckman Coulter的超速离心机和Type 70Ti转子35000RPM，18h离心去除EV。
大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)培养基体系为RPMI 1640+10％FBS+1mM丙酮酸钠+50μMβ-ME+10mM HEPES+2mM L-谷氨酰胺+1％青链霉素，大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)接种到10cm皿，密度约4×106个/皿，接种10皿以上，每皿视细胞数量加8-12mL培养基，37℃，5％CO2，饱和湿度培养，每36-48h收集一次培养基。
收集200mL培养基后300×g，5min离心去除死细胞，2000×g，15min离心去除细胞碎片。将培养基转入Beckman超速离心管(355618)，使用Type 70Ti转头12000×g，1h离心，去上清。用PBS重悬，把沉淀转移到一个超离管中，12000×g，1h清洗沉淀。去上清，加入300ul PBS重悬沉淀，将重悬在PBS中的沉淀物转移到1.5mL EP管中，在这个超离管中再加入200μL PBS，重悬沉淀，收集剩余的MV，转移到刚才的EP管中，共500μL。使用Brandford法，Life Real超微量分光光度计测定MV的蛋白浓度为372.4μg/mL，PBS稀释定量到186.2μg/mL，4℃保存。
采用Nanoparticle Tracking Analysis(NTA)鉴定MV粒径-浓度范围，如图2的A所示，平均值为199.3，峰值为175.5；MV粒径范围为50-500nm。采用透射电镜观察MV形态，如图2的B，呈现明显的双模结构；采用Western Blot鉴定以及灰度分析发现MV表达其MarkerCD40，Annexin 5(抗体购自CST)，如图2的E，F。
实施例2间充质干细胞功能检测
本实施例分离得到的间充质干细胞(MSC)，细胞呈纺锤形，饱满，具有很强的折射感和立体感，这是典型MSC的细胞形态(图3的B、C的左图)。这些细胞在接种后增殖较快，大约每2天传代一次，目前可以传到15代。通过流式细胞术，分离的细胞表达间充质细胞标记物CD105、CD73、CD90，不表达造血细胞标记物CD34、CD45、巨噬细胞标记物CD14、HLA-DR和淋巴细胞标记物CD19(图3的A)。然后探索本实施例分离得到的细胞的多能性，分离的细胞向成骨细胞诱导分化，茜素红S染色出现红色钙盐沉积，证实所分离的细胞具备分化为成骨细胞的潜力(图3的B的右图)。分离的细胞向成脂细胞诱导分化，油红O染色观察到脂滴(图3的C的右图)，证实所分离的细胞具备分化为脂肪细胞的潜力。
因此，本实施例分离得到的MSC具备多潜能，选择本实施例分离得到的细胞作为诱导的受体细胞。
实施例3 MV+烟酰胺+ITS诱导MSC向胰岛β细胞分化
本实施例中所用MV为实施例1分离得到的MV，本实施例中受体细胞为实施例2中分离得到的MSC。
本实施例中，预诱导阶段，MV的工作浓度为35μg/mL，烟酰胺工作浓度为5mM，ITS工作浓度为0.5％；诱导阶段，MV的工作浓度为70μg/mL，烟酰胺工作浓度为10mM，ITS工作浓度为1％。
本实施例所用诱导培养基中含有2个化学小分子，烟酰胺和ITS。诱导基础培养基为DMEM+10％FBS，诱导培养基在诱导基础培养基中配置。
具体地，本实施例提供的诱导方法，步骤如下：
(1)受体细胞培养：将MSC在430μL的MSC培养基中进行培养，培养条件是MSC培养基体系为D/F12+10％FBS+10ng/mL bFGF+10ng/mL EGF，37℃，5％CO2，饱和湿度培养。
(2)预诱导：MSC生长至20-40％汇合后，向MSC加入135μL MSC培养基+135μL诱导培养基+80μL PBS+80μL MV的培养体系，培养3天。
(3)正式诱导：预诱导结束后的细胞接着使用270μL诱导培养基+160μL MV培养，每隔2天换一次液，共15天。
对本实施例的诱导结果，和探究过程中其他处理组的诱导结果进行检测。其他处理组包括：
PBS处理组：270μL MSC培养基+160μL PBS。
烟酰胺+ITS处理组：270μL诱导基础培养基+10mM烟酰胺+1％ITS+160μL PBS。
MV处理组：270μL MSC培养基+160μL MV。
检测结果为：
(1)胰岛β细胞形态学鉴定。诱导第18天，配置10mg/mL双硫腙(Sigma)，与培养基1：200混合，37度孵育20min，Nikon倒置显微镜观察到MV处理组，尤其是MV+烟酰胺+ITS处理组，出现红色的胰岛β样细胞，如图4的C和D，而PBS处理组和烟酰胺+ITS处理组未出现该细胞形态，如图4的A和B。因此后续将MV+烟酰胺+ITS处理组，作为最优组合进行探究。
(2)胰岛β细胞Marker mRNA转录水平检测。Trizol法提取4个处理组的RNA，使用PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒反转录为cDNA，设计GAPDH、INS、GLP-1、IAPP和PDX1的引物，如表1。使用Step One Plus Real-Time PCR System跑q-PCR。MV+烟酰胺+ITS处理组胰岛β细胞Marker表达量显著高于PBS处理组和烟酰胺+ITS处理组，如图4的H。
表1 q-PCR所用引物
(3)ELISA检测胰岛素分泌水平。选取各组诱导18天的细胞，5mM和24mM葡萄糖先后刺激各处理组细胞，孵育后分别收集2个糖刺激组的上清，使用ELISA试剂盒(Sigma)测定上清中胰岛素含量。首先稀释标准品，加到酶标包被板中。再经过加样、温育、配液、洗涤、酶孵育、温育、洗涤、显色、终止后上酶标仪，450nm波长测定各孔吸光度(OD值)。先测定标准品的OD值，绘制标准曲线(图4的G)，各样品组OD值代入标准曲线计算样品胰岛素浓度。本发明中MV处理组胰岛素分泌水平显著高于PBS和烟酰胺+ITS处理组，MV+烟酰胺+ITS处理组在5mM或24mM葡萄糖刺激下胰岛素分泌水平呈现显著差异，如图4的I，说明MV+烟酰胺+ITS诱导分化的细胞能够一定程度上行使胰岛β细胞功能。
(4)胰岛β细胞表面标记物免疫荧光检测。细胞在多聚赖氨酸包被的玻璃片上诱导。主要步骤包括PBS清洗细胞、4％多聚甲醛固定、0.25％Triton X-100通透、山羊血清封闭、兔来源INS和C-peptide一抗(博奥森)分别4℃孵育过夜，山羊抗兔二抗孵育、DAPI核染和制片。使用Nikon的共聚焦显微镜拍照。MV处理组，尤其是MV+烟酰胺+ITS处理组的INS和C-peptide表达量远高于PBS组和烟酰胺+ITS处理组，如图4的J-M。
(5)胰岛β细胞表面标记物流式细胞术检测。分别收集MV+烟酰胺+ITS处理组诱导第0、6、12、18天的细胞，4％多聚甲醛固定、0.1％Triton X-100通透、山羊血清封闭、兔来源C-peptide一抗(博奥森)4℃过夜孵育、山羊抗兔二抗孵育，过200目细胞筛后转入流式管，上机(Beckman coulter FC500)。观察到随着诱导天数增加，C-peptide阳性率逐渐增加，第18天时达到99％以上，如图4的P-S。
本发明克服了现有技术中，不能单用EV诱导干细胞向胰岛β细胞分化的缺陷。并且，本发明提供的MV+化学小分子(MV+烟酰胺+ITS)处理组，可以显著提高MV的诱导效率。
本发明在探究MV诱导干细胞向胰岛β细胞转化的过程中，经过了复杂的探究过程，将探究过程简要记载如下。
1、EV与间充质干细胞的获得
本发明尝试获取间充质干细胞(MSC)作为受体细胞，如实施例2所述，本发明获得了性状稳定且多潜能的胎盘间充质干细胞。如背景中描述，胎盘来源MSC是一种实用的组织修复种子细胞，所以本发明选择该细胞作为本发明的受体细胞。
本发明选择大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)的EV作为研究对象，因为大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)易于获得和培养，普通胰岛β细胞目前难以体外扩增，因此不适合研究。本发明应用的INS-1是目前公认的研究糖尿病以及胰岛β细胞的模式细胞，所以INS-1产生的EV、EXO和MV在本发明中只是一种研究工具，其他物种比如人、小鼠、牛、马、猪等等的胰岛β细胞产生的EV、EXO和MV，也在本发明保护之中。超速离心法是一种获得大量EV的简单方法，但需要确定EV的存在。通过使用蛋白质印迹(WB)检测特异性Marker TSG101、CD81和Alix来分析EV的特征，表明EV成分的存在，如图5的A。Nanoparticle Tracking Analysis(NTA)显示EV粒径范围为30nm-500nm，平均值为189.5，如图5的B。
2、EV对MSC的诱导
本发明为了克服之前的诱导方法存在的问题，尝试提高EV的诱导效率，使EV能够单独诱导干细胞分化。在MSC培养基中加入40ug/mL EV，18天后用q-PCR检测胰岛相关Marker INS、IAR、LRP-16和IA-2mRNA转录水平，所用引物如表1。发现EV处理组转录水平显著提高，如图5的C。
3、其他EV对MSC的诱导
本发明探讨INS-1培养基和BJ细胞的EV是否类似于大鼠胰岛素瘤细胞EV，也影响MSC向胰岛β细胞的分化。本发明发现INS-1培养基和BJ细胞的EV对MSC向胰岛β细胞的分化没有显著影响，如图5的D。因此得出结论，MSC分化为胰岛β细胞完全是由大鼠胰岛素瘤细胞EV影响的。
4、不同EV浓度和诱导时间
接下来使用EV分别诱导MSC 9天和18天，筛选了一些其他胰岛β细胞的Marker，所用引物如表1。从中选取性状稳定的Marker进行研究。发现18天处理组的差异远大于9天处理组，如图6的A和B，这说明EV对MSC分化的影响需要一定的时间。在对不同Maker的检测中，十二指肠神经内分泌细胞标记NKX6-1在诱导过程中变化不大，胰岛β相关Marker INS、IAPP、GLP-1R和PDX1表达相对稳定，将用于下一步研究。本发明设置了4个EV浓度处理组来观察不同浓度EV对MSC分化的影响，结果表明，低于40μg/mL的浓度对MSC几乎没有影响，如图6的C。所以EV对MSC有显影响需要一定的浓度。
5、EV中的何种成分起到诱导效果
EV含有多种成分，已经发现EV的大部分生物学功能是由MV和EXO来完成的，所以本发明采用超速离心分别从EV中提取MV和EXO，然后确定MV和EXO的生物学特性。WB及灰度分析显示MV表达特异性标记CD40、Annexin 5，然而，EXO表达CD81、TSG101和Alix(图2的E和F)。NTA揭示MV粒径范围为50nm-500nm，平均值为199.3,如图2的A；EXO粒径范围为30nm-300nm，平均值为158.8(图2的C)。透射电子显微镜(TEM)形态学观察展示了MV和EXO的完整性和双膜结构，还可以观察到MV比EXO稍大(图2的B和D)。MV和EXO的特异性蛋白质标志物、粒径-浓度和形态结构符合文献描述(Favaro，2014，Diabetologia 57，1664–1673；Agrahari，2019，Trend in Biotechnology 7，707-729)。因此，MV和EXO的生物学特性不同，这可能表明它们的生物学功能也可能不同。
本发明探讨EV的哪个成分诱导MSC分化为胰岛β细胞。本发明从不同处理天数和不同浓度两个角度研究MV和EXO对MSC的影响，用q-PCR检测与胰岛分化相关的Markers INS、IAPP、GLP-1R和PDX1的mRNA转录水平，MV对MSC分化有显著影响，而EXO对MSC分化几乎没有影响(图7的A和B)。在同样浓度下EV对INS和PDX1转录水平的影响超过MV，可能是EXO对MSC分化还是能起到微弱作用，但是总体来看远不及MV，所以本发明在接下来的研究中以MV为主要研究对象。MV对MSC分化的影响仍依赖于处理时间和处理浓度，MV 18天处理组的现象比9天处理组更明显；40μg/mL处理组比20μg/mL处理组更显著(图7的A和B)，但是没有出现胰岛β样细胞形态(图7的C)，说明文献中常用的40μg/mL左右的浓度仍然是不够的。于是本发明提高MV浓度到70μg/mL，观察到了一些细胞形态学变化(图7的D)，说明提高浓度是有效的，但这是远远不够的。所以本发明接着从其他方面寻找提高MV诱导效率的方法；用胰蛋白酶失活MV后，MV对MSC分化的影响消失，说明MV必须有活性才能作用于MSC(图7的E)。
6、MV诱导机制研究
EV介导细胞间通讯有多种方式，如EV膜蛋白可以与靶细胞膜蛋白结合，进而激活靶细胞细胞内的信号通路。或者，在细胞外基质中，EV膜蛋白可以被蛋白酶剪切，剪切的碎片可以作为配体与细胞膜上的受体结合，从而激活细胞内的信号通路。
为了探究本发明中MV对MSC分化的机制，本发明将PKH67标记的MV和MSC分别孵育3h、24h、48h，培养3h的MSC开始出现绿色荧光，24h荧光非常普遍，48h荧光开始减弱(图8的A-C)。这一现象表明MV需要被MSC内吞才能发挥作用。MV随着时间的推移被细胞分解和利用，这表明MV通过进入干细胞内部，有效地将其遗传信息传递给了MSC。巨胞饮抑制剂EIPA可以抑制MV的内化，而DMSO不能抑制MV的内化(图8的D)，说明MV通过巨胞饮作用进入细胞。
传统文献中受体细胞培养基和诱导培养基使用的血清不去除EV，本发明认为血清中大量EV与INS-1MV在进入MSC时产生竞争关系。所以本发明使用去掉血清中EV的培养体系后70μg/mL MV的诱导效率大大提升，MSC出现了较明显的胰岛β样细胞形态(图4的C)。本发明单独使用MV诱导MSC向胰岛β细胞分化，部分细胞出现胰岛样细胞形态，这是以往研究中不曾出现的，说明MV的诱导效率大大提高。但是该成果对临床应用来说仍然是不够的。
7、筛选少量化学小分子协助MV提高对MSC的诱导效率
本发明尝试加入少量化学小分子提高诱导效率。通过查阅文献本发明选择了烟酰胺(niacinamide)、ITS和β-巯基乙醇(β-ME)与MV一起加入到培养基中摸索提高诱导效率的方法。
各组处理方式如下：
(1)PBS处理组：270μL MSC培养基+160μL PBS。
(2)烟酰胺+ITS处理组：270μL诱导基础培养基+10mM烟酰胺+1％ITS+160μL PBS。
(3)MV处理组：270μL MSC培养基+160μL MV。
(4)MV+烟酰胺+ITS处理组：270μL诱导基础培养基+10mM烟酰胺+1％ITS+160μLMV。
(5)MV+烟酰胺+β-巯基乙醇处理组：270μL诱导基础培养基+10mM烟酰胺+50μMβ-ME+160μL MV。
(6)MV+ITS+β-巯基乙醇处理组：270μL诱导基础培养基+1％ITS+50μMβ-ME+160μLMV。
在各处理组中，均进行两步诱导，前3天为预诱导阶段，正式诱导阶段为15天，正式诱导阶段，所有处理组每隔2天换一次培养体系，观察诱导情况。
含有MV的处理组中，预诱导阶段MV工作浓度为35μg/mL；正式诱导阶段，MV的工作浓度为70μg/mL。
含有烟酰胺的处理组中，预诱导阶段，烟酰胺的工作浓度为5mM；正式诱导阶段，烟酰胺的工作浓度为10mM。
含有ITS的处理组中，预诱导阶段，ITS的工作浓度为0.5％；正式诱导阶段，ITS的工作浓度为1％。
含有β-巯基乙醇的处理组中，预诱导阶段，β-巯基乙醇的工作浓度为25μM；正式诱导阶段，β-巯基乙醇的工作浓度为50μM。
本发明发现烟酰胺+ITS与MV一起使用，胰岛β样细胞最为明显(图4的D)，也说明加一个化学小分子诱导效率不高。本发明设置PBS处理组即处理组(1)；化学小分子(烟酰胺+ITS)处理组即处理组(2)；MV+烟酰胺+β-巯基乙醇处理组即处理组(5)；MV+ITS+β-巯基乙醇处理组即处理组(6)；单独MV处理组即处理组(3)和MV+烟酰胺+ITS处理组即处理组(4)。
本发明通过双硫腙染色检测到处理组(3)的MV诱导的细胞呈现出典型的胰岛样细胞形态，处理组(4)的MV+烟酰胺+ITS又显著提升这一现象，而单用烟酰胺+ITS或PBS处理组没有观察到该现象，或远不如MV+烟酰胺+ITS现象明显(图4的E和F)；q-PCR检测到第18天单独MV处理组胰岛β细胞Marker INS、GLP-1、IAPP和PDX1 mRNA转录水平比第(1)、(2)处理组的转录水平高很多，转录水平最高的是MV+烟酰胺+ITS处理组(图4的H)；ELISA检测MV处理组胰岛素分泌水平显著高于PBS和化学小分子处理组，MV+烟酰胺+ITS处理组在低糖或高糖刺激下胰岛素分泌水平呈现显著差异(图4的I)，说明MV+烟酰胺+ITS诱导分化的细胞能够行使胰岛β细胞功能；免疫荧光显示单独MV处理组较高表达胰岛β细胞Marker INS和C-peptide，MV+烟酰胺+ITS处理组的表达更加明显(图4的L和M)。加入EIPA或失活MV后诱导效率显著下降，说明MV必须进入细胞且有活性才能对MSC起作用(图4的N和O)；流式细胞术显示MV+烟酰胺+ITS诱导18天，C-peptide阳性率达到99％以上(图4的S)。
综上所述，本发明采用MV单独诱导MSC便出现胰岛样细胞形态学变化，这是现有技术均不能达到的，说明本发明中MV的诱导效率大大提高。通过不同技术手段验证了MV诱导比化学小分子诱导的诱导效率高，说明MV+烟酰胺+ITS处理组具有较高诱导效率的原因是烟酰胺和ITS协助MV进入干细胞内部，即MV在胰岛β细胞诱导分化中起主导作用。本发明提供的诱导方法，使得EV介导的细胞间通讯真正成为诱导分化领域的新方式。并且，所述诱导方法的诱导效率非常高，有望应用于临床。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 南京师范大学
<120> 一种诱导间充质干细胞向胰岛β细胞分化的方法
<130> KHP211123576.8
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctggagaac tactgcaact a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<211> 23
<212> DNA
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<400> 3
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<210> 4
<211> 22
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<210> 5
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<400> 5
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
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Claims (7)
1.一种诱导间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：预诱导和正式诱导；所述预诱导中微囊泡MV工作浓度为35-40μg/mL，烟酰胺工作浓度为5mM，胰岛素转铁蛋白-硒ITS工作浓度为0.5％；所述正式诱导中，微囊泡MV工作浓度为70-80μg/mL，烟酰胺工作浓度为5-10mM，胰岛素转铁蛋白-硒ITS工作浓度为0.5-1％；
干细胞培养体系中，采用无细胞外囊泡EV的血清；
所述微囊泡MV来源于大鼠胰岛素瘤细胞，所述微囊泡MV的获得，包括：培养大鼠胰岛素瘤细胞，每36-48h收集一次培养基，300-2000g离心去除死细胞和细胞碎片，12000g超速离心去除上清获得沉淀，用PBS重悬沉淀，将沉淀定量到150-190μg/mL，4℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微囊泡MV的粒径范围为50nm-500nm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预诱导的诱导时间为2-4天；所述正式诱导的诱导时间为15-18天。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：将间充质干细胞铺板后，待细胞汇合20％-40％时，加入微囊泡MV工作浓度为35-40μg/mL的预诱导体系；培养2-4天，加入微囊泡MV工作浓度为70-80μg/mL的正式诱导体系。
5.一种诱导间充质干细胞分化为胰岛β细胞的诱导剂，其特征在于，所述诱导剂包括：预诱导剂和正式诱导剂；
所述预诱导剂中，微囊泡MV工作浓度为35-40μg/mL，烟酰胺工作浓度为5mM，胰岛素转铁蛋白-硒ITS工作浓度为0.5％；
所述正式诱导剂中，微囊泡MV工作浓度为70-80μg/mL，烟酰胺工作浓度为5-10mM，胰岛素转铁蛋白-硒ITS工作浓度为0.5-1％；
所述微囊泡MV为具胰岛β细胞功能的细胞所产生的微囊泡，所述微囊泡MV来源于大鼠胰岛素瘤细胞，所述微囊泡MV的获得包括：培养大鼠胰岛素瘤细胞，每36-48h收集一次培养基，300-2000g离心去除死细胞和细胞碎片，12000g超速离心去除上清获得沉淀，用PBS重悬沉淀，将沉淀定量到150-190μg/mL，4℃保存备用。
6.一种诱导间充质干细胞分化为胰岛β细胞的培养基，其特征在于，包括：预诱导培养基和正式诱导培养基；所述培养基中，均含有具胰岛β细胞功能的细胞所产生的微囊泡MV、DMEM、8-10％不含EV的血清、烟酰胺和胰岛素转铁蛋白-硒ITS；
所述微囊泡MV来源于大鼠胰岛素瘤细胞，所述微囊泡MV的获得包括：培养大鼠胰岛素瘤细胞，每36-48h收集一次培养基，300-2000g离心去除死细胞和细胞碎片，12000g超速离心去除上清获得沉淀，用PBS重悬沉淀，将沉淀定量到150-190μg/mL，4℃保存备用；
所述微囊泡MV的粒径为50-500nm；
所述预诱导培养基中，微囊泡MV工作浓度为35-40μg/mL，烟酰胺工作浓度为5mM，胰岛素转铁蛋白-硒ITS工作浓度为0.5％；
所述正式诱导培养基中，微囊泡MV工作浓度为70-80μg/mL，烟酰胺工作浓度为5-10mM，胰岛素转铁蛋白-硒ITS工作浓度为0.5-1％。
7.权利要求5所述的诱导剂或权利要求6所述的培养基在提高间充质干细胞诱导分化为胰岛β细胞的诱导效率中的应用。
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