CN105132360A - 一种诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，利用人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、地塞米松、β-巯基乙醇等细胞因子诱导胎盘间充质干细胞向胰岛样细胞分化及其鉴定。在于进一步探讨胎盘间充质干细胞的分化潜能，探讨和研究胎盘间充质干细胞体外分离、培养、分化的最佳条件，研究诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的可能性和可行性，寻找体外诱导分化的最佳诱导体系，进而找到一种诱导胎盘间充质干细胞向胰岛素分泌细胞(insulin-producing？cells,IPCs)分化的方法。从而为胎盘间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的临床应用提供了基础研究依据。

Description

一种诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法。

背景技术

近年来，许多学者正在积极寻找能够分化为胰岛素分泌细胞的干细胞来源。目前用于胰岛细胞来源研究的干细胞主要有胚胎干细胞和成体干细胞。从理论上讲，胚胎干细胞(embryonicstemcells,ESCs)是一群较原始的细胞，具有全能干细胞的特点，但其易引起肿瘤的发生，并存在伦理问题的争议；骨髓间充质干细胞也是干细胞研究的热点，是目前应用最广泛的干细胞，但骨髓干细胞的数量会因个体的衰老而逐渐减少，分化功能也会随着年龄的增长而减低，并且取材较困难，所以寻找新的干细胞来源迫在眉睫。

骨髓中间充质干细胞含量很低，一般问0.001％-0.01％，直接取材分析根本满足不了要求；胚胎干细胞(embryonicstemcells,ESCs)是一群较原始的细胞，具有全能干细胞的特点，但其易引起肿瘤的发生，并存在伦理问题的争议。而胎盘间充质干细胞可贴壁生长，而且增殖迅速，可以在6周内增加2*10⁹倍，能满足移植的需要。胎盘间充质干细胞扩增10代以上和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，且保持正常核型和端粒酶活性及其它原有的生物学活性。因此我们选择诱导胎盘间充质干细胞向胰岛样细胞分化。

国内外均有体外诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的报道，其所使用的方法不一，其中典型的方式如下：

(1)用高浓度的葡萄糖培养液(25mmol/L)培养液DMEM(含质量浓度为10％的FBS)以及bFGF(basicFibroblastGrowthFactor)和尼克酰胺诱导剂静脉间充质干细胞向胰岛样细胞分化。

(2)一种将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的诱导剂，由以下组分组成：大株红景天注射液、烟酰胺、牛磺酸和GLP-1。含有上述诱导剂的诱导培养基，每1000ml所述诱导培养基中含有大株红景天注射液20～40g、烟酰胺0.97～1.47g、牛磺酸0.25～0.50g、GLP-126.84～40.27mg，余量为人间充质干细胞无血清培养基，混匀过滤除菌即可。

(3)一种诱导培养基及其诱导人脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法。所述诱导培养基包含下述含量的以下组分：葡萄糖10mM-20mM；维生素B55mM-15mM；活化素A10nM-30nM；唾液素45nM-15nM；肝细胞生长因子50pM-150pM；五肽胃泌素5nM-15nM。

(4)一种体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，包括四步诱导法把人骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞，其中主要的诱导液中首次采用胎猪胰腺提取液和醋酸锌的诱导成分，分化为胰岛样细胞的胰岛素分泌量显著提高。

发明内容

本发明的目的提供一种诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，利用人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、地塞米松、β-巯基乙醇等细胞因子诱导胎盘间充质干细胞向胰岛样细胞分化及其鉴定。在于进一步探讨胎盘间充质干细胞的分化潜能，探讨和研究胎盘间充质干细胞体外分离、培养、分化的最佳条件，研究诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的可能性和可行性，寻找体外诱导分化的最佳诱导体系，进而找到一种诱导胎盘间充质干细胞向胰岛素分泌细胞(insulin-producingcells,IPCs)分化的方法。进而为胎盘间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的临床应用提供了基础研究依据。

为了克服现有技术中的不足，本发明提供了一种诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法的处理方案，具体如下：

一种诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，步骤如下：

步骤1：胎盘间充质干细胞的体外分离培养阶段，具体如下：

选择足月剖宫产的胎盘，胎盘组织以Ⅰ型胶原酶消化60分钟，以1800r/min离心5min，获得消化后的细胞沉淀，细胞沉淀清洗2-3遍，接种于普通培养基中，培养条件为37℃、设定浓度的CO2、95％饱和湿度，72小时后开始换液，2-3天换液一次，显微镜下观察细胞的生长情况；

步骤2：胎盘间充质干细胞的表型测定阶段，具体如下：

取第3代生长旺盛的细胞以胰蛋白酶消化后，PBS冲洗2遍，调整细胞密度，分装于6个离心管中，分别加入鼠抗人单克隆抗体CD29、CD34、CD44、CD45，流式细胞仪检测其表型，结果表明，所取得的细胞表面表达CD44、CD29，不表达CD34、CD45，因此，可以确定本发明所提取的细胞为胎盘间充质干细胞；

步骤3：细胞因子诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞，具体如下：

取第三代胎盘间充质干细胞，质量浓度为0.25％的胰蛋白酶+0.02％EDTA消化细胞，以2*105/mL密度接种于6平板中，24h后，待细胞铺满60％，去除旧培养基，用PBS缓冲液清洗细胞3次，每孔加3mL诱导液，诱导培养2天后，去除旧培养基，继续每孔加入3mL诱导液培养，以此类推，继续诱导培养14天，并在倒置显微镜下观察细胞的形态变化，对照组单纯的采用含质量浓度为10％的FBS的α-MEM。

所述的步骤1中的CO2的质量浓度为5％。

所述的步骤1中培养基内含质量浓度为10％胎牛血清和α-MEM。

所述的步骤1中Ⅰ型胶原酶的质量浓度为0.1％。

所述的步骤2中调整细胞密度为10⁶/100uL。

所述步骤3中的诱导液包括β-巯基乙醇、人碱性成纤维细胞生长因子、地塞米松及含FBS的α-MEM。

所述的β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L。

所述的人碱性成纤维细胞生长因子浓度为5ug/L。

所述的地塞米松浓度为10mmol/L。

所述的FBS质量浓度为10％。

本发明还具有如下优点：

1、胎盘来源广泛，不引起供者不适以及不涉及伦理道德问题，其分离培养后的胎盘间充质干细胞扩增能力较强，具有多向分化潜能、造血支持及免疫抑制效应。此与捐献骨髓或采集动员外周血相比，供者无痛苦，感染机会少，扩增能力强。

2、本发明所用到的诱导体系安全、无副作用，诱导体系容易获取，进而为胎盘间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的临床应用提供了基础研究依据，同时提供一种获得大量胰岛样细胞团以用于糖尿病细胞治疗的方法。

附图说明

图1为本发明的实施例的步骤1的观察结果图。

图2为本发明的实施例的步骤2的一组表达结果。

图3为本发明的实施例的步骤2的另一组表达结果。

具体实施方式

胎盘间充质干细胞(placenta-derivedmesenchymalstemcells,PMSCs)是利用间充质干细胞易贴壁生长的特性从胎盘组织中分离培养出来的细胞，在体外可被培养、传代,并具有定向分化为神经细胞、脂肪细胞、成骨细胞的潜能，与骨髓间充质干细胞具有相似的生物学特性，已被作为研究细胞定向分化、多向诱导的“种子细胞”，是未来临床替代治疗和基因治疗的新的干细胞来源，已受到广泛的关注。本发明试图探讨胎盘间充质干细胞在特定的诱导条件下分化为胰岛素分泌细胞，从而起到治疗糖尿病的作用。

下面结合实施例对本发明做进一步说明：

实施例1

诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，步骤如下：

步骤1：胎盘间充质干细胞的体外分离培养阶段，具体如下：

选择足月剖宫产的胎盘，胎盘组织以质量浓度为0.1％的Ⅰ型胶原酶消化60分钟，以1800r/min离心5min，获得消化后的细胞沉淀，细胞沉淀清洗2遍，接种于普通培养基中，培养基内含质量浓度为10％胎牛血清和α-MEM，培养条件为37℃、质量浓度为5％的CO2、95％饱和湿度，72小时后开始换液，2天换液一次，显微镜下观察细胞的生长情况；观察情况如图1所示。

步骤2：胎盘间充质干细胞的表型测定阶段，具体如下：

取第3代生长旺盛的细胞以胰蛋白酶消化后，PBS冲洗2遍，调整细胞密度为106/100uL，分装于6个离心管中，分别加入鼠抗人单克隆抗体CD29、CD34、CD44、CD45，流式细胞仪检测其表型，结果表明，如图2至图3所示，所取得的细胞表面表达CD44、CD29，不表达CD34、CD45，因此，可以确定本发明所提取的细胞为胎盘间充质干细胞；

步骤3：细胞因子诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞，具体如下：

取第三代胎盘间充质干细胞，质量浓度为0.25％的胰蛋白酶+0.02％EDTA消化细胞，以2*105/mL密度接种于6平板中，24h后，待细胞铺满60％，去除旧培养基，用PBS缓冲液清洗细胞3次，每孔加3mL诱导液，所述的诱导液包括0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、5ug/L人碱性成纤维细胞生长因子、10mmol/L地塞米松及含质量浓度为10％的FBS的α-MEM，诱导培养2天后，去除旧培养基，继续每孔加入3mL诱导液培养，以此类推，继续诱导培养14天，并在倒置显微镜下观察细胞的形态变化，对照组单纯的采用含质量浓度为10％的FBS的α-MEM。

对本实施例做胎盘间充质干细胞向胰岛样细胞分化的鉴定：

未经诱导的胎盘间充质干细胞呈长梭形贴壁生长，诱导后的细胞逐渐变圆，并聚集成团。

(1)双硫腙染色反应

取诱导14天后获得的胰岛样细胞，移出原培养基，PBS洗3次，各加入1mLPBS和50uL双硫腙工作液，37℃孵育10min，移出染色液，PBS洗涤2次，观察细胞着色情况并拍照。诱导组双硫腙染色后呈红色，为阳性反应，对照组为阴性；

(2)化学发光免疫分析法检测胰岛素水平

收集诱导14天后细胞培养的上清，检测胰岛素的含量。诱导组的细胞分泌胰岛素浓度为396mU/L，而空白对照组检测胰岛素浓度为零。说明本发明的诱导体系可以显著提高诱导效率。

(3)ELISA试剂盒检测用本发明的诱导剂诱导获得的胰岛样细胞是否具有胰岛细胞的功能：

这一检测过程直接按照Mercodia公司所提供的“C-peptideELISAassays”标准过程操作。最终结果检测出C-肽，说明本发明的诱导体系诱导的胰岛样细胞能够分泌胰岛素。

(4)葡萄糖刺激实验

挑取50个本发明诱导剂诱导14天的胰岛样细胞团(50-100um)至1.5mL离心管中，用PBS清洗2遍，加入1mL无糖DMEM预培养4h，然后以400uL含有6.0mmol/L葡萄糖、18mmol/L葡萄糖的DMEM依次培养2h，收集上清液，用ELISA法检测上清中不同浓度葡萄糖刺激下胰岛素的分泌量。结果显示，对照组细胞上清中几乎检测不到胰岛素，而经诱导的胰岛样细胞团在6.0mmol/L葡萄糖刺激下有少量分泌，经18mmol/L葡萄糖孵育2h后，胰岛素分泌量明显升高(P<0.01)，约为低糖条件下的2倍。由此结果可知，诱导后的胰岛样细胞团对葡萄糖刺激敏感，其胰岛素的分泌受外界环境的调控。

实施例2

诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，步骤如下：

步骤1：胎盘间充质干细胞的体外分离培养阶段，具体如下：

选择足月剖宫产的胎盘，胎盘组织以质量浓度为0.1％的Ⅰ型胶原酶消化60分钟，以1800r/min离心5min，获得消化后的细胞沉淀，细胞沉淀清洗2遍，接种于普通培养基中，培养基内含质量浓度为10％胎牛血清和α-MEM，培养条件为37℃、质量浓度为5％的CO2、95％饱和湿度，72小时后开始换液，2.5天换液一次，显微镜下观察细胞的生长情况；观察情况如图1所示。

步骤2：胎盘间充质干细胞的表型测定阶段，具体如下：

取第3代生长旺盛的细胞以胰蛋白酶消化后，PBS冲洗2遍，调整细胞密度为106/100uL，分装于6个离心管中，分别加入鼠抗人单克隆抗体CD29、CD34、CD44、CD45，流式细胞仪检测其表型，结果表明，如图2至图3所示，所取得的细胞表面表达CD44、CD29，不表达CD34、CD45，因此，可以确定本发明所提取的细胞为胎盘间充质干细胞；

步骤3：细胞因子诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞，具体如下：

取第三代胎盘间充质干细胞，质量浓度为0.25％的胰蛋白酶+0.02％EDTA消化细胞，以2*105/mL密度接种于6平板中，24h后，待细胞铺满60％，去除旧培养基，用PBS缓冲液清洗细胞3次，每孔加3mL诱导液，所述的诱导液包括0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、5ug/L人碱性成纤维细胞生长因子、10mmol/L地塞米松及含质量浓度为10％的FBS的α-MEM，诱导培养2天后，去除旧培养基，继续每孔加入3mL诱导液培养，以此类推，继续诱导培养14天，并在倒置显微镜下观察细胞的形态变化，对照组单纯的采用含质量浓度为10％的FBS的α-MEM。

对本实施例做胎盘间充质干细胞向胰岛样细胞分化的鉴定：

未经诱导的胎盘间充质干细胞呈长梭形贴壁生长，诱导后的细胞逐渐变圆，并聚集成团。

(1)双硫腙染色反应

取诱导14天后获得的胰岛样细胞，移出原培养基，PBS洗3次，各加入1mLPBS和50uL双硫腙工作液，37℃孵育10min，移出染色液，PBS洗涤2次，观察细胞着色情况并拍照。诱导组双硫腙染色后呈红色，为阳性反应，对照组为阴性；

(2)化学发光免疫分析法检测胰岛素水平

收集诱导14天后细胞培养的上清，检测胰岛素的含量。诱导组的细胞分泌胰岛素浓度为396mU/L，而空白对照组检测胰岛素浓度为零。说明本发明的诱导体系可以显著提高诱导效率。

(3)ELISA试剂盒检测用本发明的诱导剂诱导获得的胰岛样细胞是否具有胰岛细胞的功能：

这一检测过程直接按照Mercodia公司所提供的“C-peptideELISAassays”标准过程操作。最终结果检测出C-肽，说明本发明的诱导体系诱导的胰岛样细胞能够分泌胰岛素。

(4)葡萄糖刺激实验

挑取50个本发明诱导剂诱导14天的胰岛样细胞团(50-100um)至1.5mL离心管中，用PBS清洗2遍，加入1mL无糖DMEM预培养4h，然后以400uL含有6.0mmol/L葡萄糖、18mmol/L葡萄糖的DMEM依次培养2h，收集上清液，用ELISA法检测上清中不同浓度葡萄糖刺激下胰岛素的分泌量。结果显示，对照组细胞上清中几乎检测不到胰岛素，而经诱导的胰岛样细胞团在6.0mmol/L葡萄糖刺激下有少量分泌，经18mmol/L葡萄糖孵育2h后，胰岛素分泌量明显升高(P<0.01)，约为低糖条件下的2.2倍。由此结果可知，诱导后的胰岛样细胞团对葡萄糖刺激敏感，其胰岛素的分泌受外界环境的调控。

实施例3

诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，步骤如下：

步骤1：胎盘间充质干细胞的体外分离培养阶段，具体如下：

选择足月剖宫产的胎盘，胎盘组织以质量浓度为0.1％的Ⅰ型胶原酶消化60分钟，以1800r/min离心5min，获得消化后的细胞沉淀，细胞沉淀清洗3遍，接种于普通培养基中，培养基内含质量浓度为10％胎牛血清和α-MEM，培养条件为37℃、质量浓度为5％的CO2、95％饱和湿度，72小时后开始换液，3天换液一次，显微镜下观察细胞的生长情况；观察情况如图1所示。

步骤2：胎盘间充质干细胞的表型测定阶段，具体如下：

取第3代生长旺盛的细胞以胰蛋白酶消化后，PBS冲洗2遍，调整细胞密度为106/100uL，分装于6个离心管中，分别加入鼠抗人单克隆抗体CD29、CD34、CD44、CD45，流式细胞仪检测其表型，结果表明，如图2至图3所示，所取得的细胞表面表达CD44、CD29，不表达CD34、CD45，因此，可以确定本发明所提取的细胞为胎盘间充质干细胞；

步骤3：细胞因子诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞，具体如下：

取第三代胎盘间充质干细胞，质量浓度为0.25％的胰蛋白酶+0.02％EDTA消化细胞，以2*105/mL密度接种于6平板中，24h后，待细胞铺满60％，去除旧培养基，用PBS缓冲液清洗细胞3次，每孔加3mL诱导液，所述的诱导液包括0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、5ug/L人碱性成纤维细胞生长因子、10mmol/L地塞米松及含质量浓度为10％的FBS的α-MEM，诱导培养2天后，去除旧培养基，继续每孔加入3mL诱导液培养，以此类推，继续诱导培养14天，并在倒置显微镜下观察细胞的形态变化，对照组单纯的采用含质量浓度为10％的FBS的α-MEM。

对本实施例做胎盘间充质干细胞向胰岛样细胞分化的鉴定：

未经诱导的胎盘间充质干细胞呈长梭形贴壁生长，诱导后的细胞逐渐变圆，并聚集成团。

(1)双硫腙染色反应

取诱导14天后获得的胰岛样细胞，移出原培养基，PBS洗3次，各加入1mLPBS和50uL双硫腙工作液，37℃孵育10min，移出染色液，PBS洗涤2次，观察细胞着色情况并拍照。诱导组双硫腙染色后呈红色，为阳性反应，对照组为阴性；

(2)化学发光免疫分析法检测胰岛素水平

收集诱导14天后细胞培养的上清，检测胰岛素的含量。诱导组的细胞分泌胰岛素浓度为396mU/L，而空白对照组检测胰岛素浓度为零。说明本发明的诱导体系可以显著提高诱导效率。

(3)ELISA试剂盒检测用本发明的诱导剂诱导获得的胰岛样细胞是否具有胰岛细胞的功能：

这一检测过程直接按照Mercodia公司所提供的“C-peptideELISAassays”标准过程操作。最终结果检测出C-肽，说明本发明的诱导体系诱导的胰岛样细胞能够分泌胰岛素。

(4)葡萄糖刺激实验

挑取50个本发明诱导剂诱导14天的胰岛样细胞团(50-100um)至1.5mL离心管中，用PBS清洗2遍，加入1mL无糖DMEM预培养4h，然后以400uL含有6.0mmol/L葡萄糖、18mmol/L葡萄糖的DMEM依次培养2h，收集上清液，用ELISA法检测上清中不同浓度葡萄糖刺激下胰岛素的分泌量。结果显示，对照组细胞上清中几乎检测不到胰岛素，而经诱导的胰岛样细胞团在6.0mmol/L葡萄糖刺激下有少量分泌，经18mmol/L葡萄糖孵育2h后，胰岛素分泌量明显升高(P<0.01)，约为低糖条件下的2.5倍。由此结果可知，诱导后的胰岛样细胞团对葡萄糖刺激敏感，其胰岛素的分泌受外界环境的调控。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质，在本发明的精神和原则之内，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于，步骤如下：

步骤1：胎盘间充质干细胞的体外分离培养阶段，具体如下：

选择足月剖宫产的胎盘，胎盘组织以Ⅰ型胶原酶消化60分钟，以1800r/min离心5min，获得消化后的细胞沉淀，细胞沉淀清洗2-3遍，接种于普通培养基中，培养条件为37℃、设定浓度的CO2、95％饱和湿度，72小时后开始换液，2-3天换液一次，显微镜下观察细胞的生长情况；

步骤2：胎盘间充质干细胞的表型测定阶段，具体如下：

取第3代生长旺盛的细胞以胰蛋白酶消化后，PBS冲洗2遍，调整细胞密度，分装于6个离心管中，分别加入鼠抗人单克隆抗体CD29、CD34、CD44、CD45，流式细胞仪检测其表型，结果表明，所取得的细胞表面表达CD44、CD29，不表达CD34、CD45；

步骤3：细胞因子诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞，具体如下：

取第三代胎盘间充质干细胞，质量浓度为0.25％的胰蛋白酶+0.02％EDTA消化细胞，以2*105/mL密度接种于6平板中，24h后，待细胞铺满60％，去除旧培养基，用PBS缓冲液清洗细胞3次，每孔加3mL诱导液，诱导培养2天后，去除旧培养基，继续每孔加入3mL诱导液培养，以此类推，继续诱导培养14天，并在倒置显微镜下观察细胞的形态变化，对照组单纯的采用含质量浓度为10％的FBS的α-MEM。

2.根据权利要求1所述的诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于所述的步骤1中的CO2的质量浓度为5％。

3.根据权利要求1所述的诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于所述的步骤1中培养基内含质量浓度为10％胎牛血清和α-MEM。

4.根据权利要求1所述的诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于所述的步骤1中Ⅰ型胶原酶的质量浓度为0.1％。

5.根据权利要求1所述的诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于所述的步骤2中调整细胞密度为10⁶/100uL。

6.根据权利要求1所述的诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于所述步骤3中的诱导液包括β-巯基乙醇、人碱性成纤维细胞生长因子、地塞米松及含FBS的α-MEM。

7.根据权利要求6所述的诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L。

8.根据权利要求6所述的诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于人碱性成纤维细胞生长因子浓度为5ug/L。

9.根据权利要求6所述的诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于地塞米松浓度为10mmol/L。

10.根据权利要求6所述的诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于FBS质量浓度为10％。