CN113481146A - 一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞转化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞转化的方法，包括以下步骤：S1、取间充质干细胞，对其进行培养，使间充质干细胞纯化扩增，当细胞达到40‑50％融合时，进行清洗，并采用预诱导液抑制细胞增殖，保证细胞的融合低于70％；S2、将扩增后的细胞放入高糖DMEM培养液，并在高糖DMEM培养液中添加10mmol/L尼可酰胺、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子、15μg/L胰岛细胞生长因子、2％B27及0.1mmol/Lβ‑巯基乙醇。本发明将间充质干细胞纯化扩增，增加间充质干细胞的数量，并且通过纯化扩增，提高间充质干细胞的活性，从而保证在将其转化为胰岛样细胞时，存活的几率进一步提升，在高糖DMEM的环境下，加入血清，使得转化所需的环境与人体内实际转化的环境更加契合，从而能够实现更好的转化效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞转化的方法。
背景技术
I型糖尿病是由于分泌胰岛素的β细胞因中毒或自体免疫攻击等情况下收到损伤，导致的胰岛素分泌不足而引起的。糖尿病人都承受着肥胖，高血糖，肢体运动失调，肾损伤和眼睛病变的痛苦。多年来，为根除糖尿病，人们一直寻找基于组织和细胞的再生替代治疗方法。其中，干细胞治疗近年来备受瞩目。人们认为，将干细胞诱导成为胰岛素分泌性细胞，并进行移植是干细胞治疗糖尿病的可靠途径。目前已经有很多方法诱导干细胞向胰岛β样细胞分化。但是绝大部分方法都面临了分化效率低，分化后细胞活性差的问题。这些问题阻碍了干细胞治疗糖尿病的应用。
干细胞在体外培养分化所面临的主要问题是，体外环境不能像体内环境一样提供干细胞正常生长所需要的全部必要条件。干细胞在体内的分化也是通过与其所在位置的信号分子相互作用以后，才能够正确的进行分化程序。干细胞的体内环境由各种细胞因子，糖蛋白、脂蛋白等多种细胞外基质成分，以及各种激素等调节分子构成，为此，我们提出一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞转化的方法来解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中糖尿病的治疗问题，而提出的一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞转化的方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞转化的方法，包括以下步骤：
S1、取间充质干细胞，对其进行培养，使间充质干细胞纯化扩增，当细胞达到40-50％融合时，进行清洗，并采用预诱导液抑制细胞增殖，保证细胞的融合低于70％；
S2、将扩增后的细胞放入高糖DMEM培养液，并在高糖DMEM培养液中添加10mmol/L尼可酰胺、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子、15μg/L胰岛细胞生长因子、2％B27及0.1mmol/Lβ-巯基乙醇，诱导的时间范围是20-50小时；
S3、加入血清，血清的浓度低于3％，诱导的时间范围为10-20小时，得到胰岛样细胞。
优选的，在S1中，对间充质干细胞进行培养时，包括两种培养方式，第一种，采用培养瓶或培养皿进行平面培养，第二种，使间充质干细胞附着在微载体上进行立体培养，微载体为球形颗粒，采用明胶、葡聚糖、聚苯乙烯和海藻酸盐制成。
优选的，在S1中，对间充质干细胞进行纯化扩增时，将间充质干细胞置于温度范围为17-20℃的环境中，纯化扩增的时间不超过24小时，培养过程中，逐步向间充质干细胞中加入青霉素G、硫酸链霉素α-MEM、β甘油磷酸酯和维生素C，所述青霉素G的浓度小于95U/ml，所述硫酸链霉素α-MEM的浓度小于95μg/ml，所述β甘油磷酸酯的浓度小于10mmol/L，所述维生素C的浓度小于0.5μg/ml。
优选的，在S1中采用的预诱导液为RA关节液，且RA关节液的浓度范围为20-50％，且采用预诱导液对干细胞进行抑制时，干细胞的环境设置为零重力环境。
优选的，在S3中，加入的血清为胎牛血清或者人体血清中的一种。
一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞转化的胰岛样细胞的用途，所述胰岛样细胞用于预防、缓解、治疗糖尿病。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、对于间充质干细胞转化胰岛样细胞成功率低的问题，先通过将间充质干细胞纯化扩增，增加间充质干细胞的数量，并且通过纯化扩增，提高间充质干细胞的活性，从而保证在将其转化为胰岛样细胞时，存活的几率进一步提升，提高转化的胰岛样细胞品质；
2、在间充质干细胞转化为胰岛样细胞时，采用尼克酰胺、纤维细胞生长因子等多种诱导剂进行诱导，并在高糖DMEM的环境下，加入血清，使得转化所需的环境与人体内实际转化的环境更加契合，从而能够实现更好的转化效果。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一
一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞转化的方法，包括：
S1、取间充质干细胞，对其进行培养，使间充质干细胞纯化扩增，当细胞达到40％融合时，进行清洗，并采用预诱导液抑制细胞增殖，保证细胞的融合低于70％；
S2、将扩增后的细胞放入高糖DMEM培养液，并在高糖DMEM培养液中添加10mmol/L尼可酰胺、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子、15μg/L胰岛细胞生长因子、2％B27及0.1mmol/Lβ-巯基乙醇，诱导的时间范围是20小时；
S3、加入血清，血清的浓度低于2.3％，诱导的时间范围为10小时，得到胰岛样细胞。
在S1中，对间充质干细胞进行培养时，包括两种培养方式，第一种，采用培养瓶或培养皿进行平面培养，第二种，使间充质干细胞附着在微载体上进行立体培养，微载体为球形颗粒，采用明胶、葡聚糖、聚苯乙烯和海藻酸盐制成。
在S1中，对间充质干细胞进行纯化扩增时，将间充质干细胞置于温度范围为17-20℃的环境中，纯化扩增的时间不超过24小时，培养过程中，逐步向间充质干细胞中加入青霉素G、硫酸链霉素α-MEM、β甘油磷酸酯和维生素C，青霉素G的浓度小于95U/ml，硫酸链霉素α-MEM的浓度小于95μg/ml，β甘油磷酸酯的浓度小于10mmol/L，维生素C的浓度小于0.5μg/ml。
在S1中采用的预诱导液为RA关节液，且RA关节液的浓度范围为20％；
且采用预诱导液对干细胞进行抑制时，干细胞的环境设置为零重力环境。
在S3中，加入的血清为胎牛血清或者人体血清中的一种。
一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞转化的胰岛样细胞的用途，胰岛样细胞用于预防、缓解、治疗糖尿病。
实施例二
S1、取间充质干细胞，对其进行培养，使间充质干细胞纯化扩增，当细胞达到45％融合时，进行清洗，并采用预诱导液抑制细胞增殖，保证细胞的融合低于70％；
S2、将扩增后的细胞放入高糖DMEM培养液，并在高糖DMEM培养液中添加10mmol/L尼可酰胺、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子、15μg/L胰岛细胞生长因子、2％B27及0.1mmol/Lβ-巯基乙醇，诱导的时间范围是35小时；
S3、加入血清，血清的浓度低于2.5％，诱导的时间范围为15小时，得到胰岛样细胞。
在S1中采用的预诱导液为RA关节液，且RA关节液的浓度范围为35％；
实施例三
S1、取间充质干细胞，对其进行培养，使间充质干细胞纯化扩增，当细胞达到50％融合时，进行清洗，并采用预诱导液抑制细胞增殖，保证细胞的融合低于70％；
S2、将扩增后的细胞放入高糖DMEM培养液，并在高糖DMEM培养液中添加10mmol/L尼可酰胺、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子、15μg/L胰岛细胞生长因子、2％B27及0.1mmol/Lβ-巯基乙醇，诱导的时间范围是50小时；
S3、加入血清，血清的浓度低于3％，诱导的时间范围为20小时，得到胰岛样细胞。
在S1中采用的预诱导液为RA关节液，且RA关节液的浓度范围为50％。
实施例四
S1、取间充质干细胞，对其进行培养，使间充质干细胞纯化扩增，当细胞达到47％融合时，进行清洗，并采用预诱导液抑制细胞增殖，保证细胞的融合低于70％；
S2、将扩增后的细胞放入高糖DMEM培养液，并在高糖DMEM培养液中添加10mmol/L尼可酰胺、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子、15μg/L胰岛细胞生长因子、2％B27及0.1mmol/Lβ-巯基乙醇，诱导的时间范围是45小时；
S3、加入血清，血清的浓度低于3％，诱导的时间范围为18小时，得到胰岛样细胞。
在S1中采用的预诱导液为RA关节液，且RA关节液的浓度范围为46％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取间充质干细胞，对其进行培养，使间充质干细胞纯化扩增，当细胞达到40-50％融合时，进行清洗，并采用预诱导液抑制细胞增殖，保证细胞的融合低于70％；
S2、将扩增后的细胞放入高糖DMEM培养液，并在高糖DMEM培养液中添加10mmol/L尼可酰胺、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子、15μg/L胰岛细胞生长因子、2％B27及0.1mmol/Lβ-巯基乙醇，诱导的时间范围是20-50小时；
S3、加入血清，血清的浓度低于3％，诱导的时间范围为10-20小时，得到胰岛样细胞。
2.根据权利要求1所述的一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞转化的方法，其特征在于，在S1中，对间充质干细胞进行培养时，包括两种培养方式，第一种，采用培养瓶或培养皿进行平面培养，第二种，使间充质干细胞附着在微载体上进行立体培养，微载体为球形颗粒，采用明胶、葡聚糖、聚苯乙烯和海藻酸盐制成。
3.根据权利要求1所述的一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞转化的方法，其特征在于，在S1中，对间充质干细胞进行纯化扩增时，将间充质干细胞置于温度范围为17-20℃的环境中，纯化扩增的时间不超过24小时，培养过程中，逐步向间充质干细胞中加入青霉素G、硫酸链霉素α-MEM、β甘油磷酸酯和维生素C，所述青霉素G的浓度小于95U/ml，所述硫酸链霉素α-MEM的浓度小于95μg/ml，所述β甘油磷酸酯的浓度小于10mmol/L，所述维生素C的浓度小于0.5μg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞转化的方法，其特征在于，在S1中采用的预诱导液为RA关节液，且RA关节液的浓度范围为20-50％，且采用预诱导液对干细胞进行抑制时，干细胞的环境设置为零重力环境。
5.根据权利要求1所述的一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞转化的方法，其特征在于，在S3中，加入的血清为胎牛血清或者人体血清中的一种。
6.一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞转化的胰岛样细胞的用途，其特征在于，所述胰岛样细胞用于预防、缓解、治疗糖尿病。
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