CN112195151B - 一种牙髓间充质干细胞复苏培养液、制备方法及复苏培养方法 - Google Patents

一种牙髓间充质干细胞复苏培养液、制备方法及复苏培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种牙髓间充质干细胞复苏培养液，包括以下原料：基础培养基，以终浓度计，添加在基础培养基中的表皮生长因子、转铁蛋白、胰岛素、α‑香附酮、N‑乙酰基‑5甲氧基色胺、玉米肽、酪蛋白磷酸肽、胆酸钠、香茅醇、柠檬酸锌。本发明提供一种牙髓间充质干细胞复苏培养液，针对冻存后的牙髓间充干细胞，通过成分间的协同作用，有助于恢复细胞活性。本发明还提供了一种牙髓间充质干细胞复苏培养液的制备方法，采用上述原料制备而成，制备过程易于操作，便于应用。本发明还提供了牙髓间充质干细胞的复苏培养方法，采用本发明的复苏培养液，经过短期的复苏培养即可使细胞恢复活性，细胞恢复活性后采用常规方法进行扩增培养，便于临床研究。

Description

一种牙髓间充质干细胞复苏培养液、制备方法及复苏培养 方法
技术领域
本发明涉及干细胞，尤其涉及一种牙髓间充质干细胞复苏培养液、制备方法及复苏培养方法。
背景技术
牙髓间充质干细胞(Dental Pulp Stem Cell，DPSCs)是来源于神经嵴的多能干细胞，与骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)相比较，两者在多个基因表达水平上是一致的，包括表达细胞外基质成分、细胞粘附分子、生长因子、转录调节因子等基因，并且具有相似的免疫表型，在形态上也很类似，但牙髓间充质干细胞与骨髓中提取的干细胞相比有明显的优势：(1)来源广泛，易于采集(乳牙自然脱落、智齿的拔除等)，并且不存在着对身体的伤害、无伦理争议；(2)自体应用，安全健康，且不产生免疫排斥反应；(3)分化能力和可塑性更强，可分化为更多种类的组织细胞，在适当条件下能被诱导分化为骨组织、软骨组织、脂肪组织、神经组织、肌组织、角膜等多种组织细胞，并能够被诱导为具有类胚胎干细胞特性的诱导多能干细胞，能够作为以后多种疾病临床转化研究中的种子细胞；(4)具有更强的增殖能力和自我更新能力。
DPSCs作为种子细胞应用于临床研究过程中，大多数时候并不是立即取用，而是事先建立有干细胞库，贮存DPSCs，等临床需要时及时进行细胞复苏和扩增，以达到临床治疗的需求。细胞复苏是将长期超低温冻存于液氮中的细胞，迅速解冻到常温过程，同时确保恢复细胞的活性与生物学特征。目前，通常采用普通商品化的完全培养基对牙髓干细胞进行复苏培养。但普通商品化的完全培养基在细胞的复苏过程中无法保证干细胞的活力，细胞成活率低，影响细胞的临床利用。因此，需要开发一种能够更好地维持牙髓间充质干细胞活力的复苏培养液。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于一种牙髓间充质干细胞复苏培养基，有助于冻存后的牙髓间充质干细胞恢复活性，提高细胞的成活率。
本发明的目的之二在于提供一种牙髓间充质干细胞复苏培养液的制备方法。
本发明的目的之三在于提供一种牙髓间充质干细胞的复苏培养方法。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种牙髓间充质干细胞复苏培养液，包括以下原料：基础培养基，以终浓度计，添加在基础培养基中的表皮生长因子10-15μg/mL、转铁蛋白25-35μg/mL、胰岛素1-5mg/mL、α-香附酮100-120ng/mL、N-乙酰基-5甲氧基色胺80-95ng/mL、玉米肽30-35μg/mL、酪蛋白磷酸肽40-45μg/mL、胆酸钠3-8μg/mL、香茅醇5-10μg/mL、柠檬酸锌15-25μg/mL。
进一步地，包括以下原料：基础培养基，以终浓度计，添加在基础培养基中的表皮生长因子12μg/mL、转铁蛋白30μg/mL、胰岛素3mg/mL、α-香附酮110ng/mL、N-乙酰基-5甲氧基色胺90ng/mL、玉米肽32μg/mL、酪蛋白磷酸肽43μg/mL、胆酸钠5μg/mL、香茅醇8μg/mL、柠檬酸锌20ng/mL。
进一步地，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
上述牙髓间充质干细胞复苏培养液的制备方法，包括以下过程：称取各组分加入基础培养基中，震荡搅拌至混合均匀，将混合物经过滤除菌即得复苏培养液。
进一步地，采用孔径为0.22μm的滤菌膜过滤除菌。
本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
一种牙髓间充质干细胞的复苏培养方法，采用上述复苏培养液进行复苏。
所述牙髓间充质干细胞的复苏培养方法，包括以下步骤：
(1)取冻存的牙髓间充质干细胞在37℃恒温水浴下解冻，加入基础培养基稀释后离心收集细胞；
(2)将离心后的细胞加入复苏培养液，放入37℃，5％CO2的培养箱中，培养24h，即完成复苏培养。此后可选择完全培养基采用常规方法进行扩增培养至获得所需的细胞。
进一步地，步骤(1)中冻存的牙髓间充质干细胞为传代培养的P3-P5代细胞。
进一步地，步骤(2)中复苏培养液中的细胞密度为1-3×105个/mL。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供一种牙髓间充质干细胞复苏培养液，针对冻存后的牙髓间充干细胞，有助于恢复细胞活性，提高细胞的复苏率。本发明的复苏培养液中添加α-香附酮、N-乙酰基-5甲氧基色胺，有助于细胞快速适应冻存后的复苏环境，提高复苏率。添加玉米肽、酪蛋白磷酸肽两种成分协同作用，促进细胞的代谢，避免细胞凋亡，提高细胞活率。本发明的复苏培养液中还添加胆酸钠、香茅醇和柠檬酸锌，胆酸钠和香茅醇可以保持细胞培养复苏环境的无菌性，避免细胞被杂菌污染，和柠檬酸锌协同作用，有助于细胞保持活性。本发明的复苏培养液在上述成分的配合作用下，无需添加动物血清，避免了动物病原的污染，安全性较高。
2、本发明还提供了一种牙髓间充质干细胞复苏培养液的制备方法，采用上述原料制备而成，制备过程易于操作，便于商业化生产、应用和推广。
3、本发明还提供了牙髓间充质干细胞的复苏培养方法，采用本发明的复苏培养液，经过短期的复苏培养即可使细胞恢复活性，细胞恢复活性后采用常规方法进行扩增培养，便于临床研究。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
一种牙髓间充质干细胞复苏培养液，由以下原料组成：DMEM/F12培养基，以终浓度计，添加在DMEM/F12培养基中的表皮生长因子12μg/mL、转铁蛋白30μg/mL、胰岛素3mg/mL、α-香附酮110ng/mL、N-乙酰基-5甲氧基色胺90ng/mL、玉米肽32μg/mL、酪蛋白磷酸肽43μg/mL、胆酸钠5μg/mL、香茅醇8μg/mL、柠檬酸锌20ng/mL。
上述牙髓间充质干细胞复苏培养液的制备方法，包括以下过程：称取各组分加入DMEM/F12培养基中，震荡搅拌至混合均匀，将混合物经0.22μm的滤菌膜过滤除菌，即得复苏培养液。
一种牙髓间充质干细胞的复苏培养方法，包括以下步骤：
(1)取液氮中冻存3个月的传代培养的P3代牙髓间充质干细胞在37℃恒温水浴下解冻，加入DMEM/F12培养基稀释后离心收集细胞；
(2)将离心后的细胞加入培养皿中的复苏培养液中，调整细胞浓度为1×105个/mL，放入37℃，5％CO2的培养箱中，培养24h，即完成复苏培养。
实施例2
一种牙髓间充质干细胞复苏培养液，由以下原料组成：DMEM/F12培养基，以终浓度计，添加在DMEM/F12培养基中的表皮生长因子10μg/mL、转铁蛋白25μg/mL、胰岛素1mg/mL、α-香附酮100ng/mL、N-乙酰基-5甲氧基色胺80ng/mL、玉米肽30μg/mL、酪蛋白磷酸肽40μg/mL、胆酸钠3μg/mL、香茅醇5μg/mL、柠檬酸锌15μg/mL。
上述牙髓间充质干细胞复苏培养液的制备方法，包括以下过程：称取各组分加入DMEM/F12培养基中，震荡搅拌至混合均匀，将混合物经0.22μm的滤菌膜过滤除菌，即得复苏培养液。
一种牙髓间充质干细胞的复苏培养方法，包括以下步骤：
(1)取液氮中冻存1个月的传代培养的P4代牙髓间充质干细胞在37℃恒温水浴下解冻，加入DMEM/F12培养基稀释后离心收集细胞；
(2)将离心后的细胞加入培养皿中的复苏培养液中，调整细胞浓度为2×105个/mL，放入37℃，5％CO2的培养箱中，培养24h，即完成复苏培养。
实施例3
一种牙髓间充质干细胞复苏培养液，由以下原料组成：DMEM/F12培养基，以终浓度计，添加在DMEM/F12培养基中的表皮生长因子15μg/mL、转铁蛋白35μg/mL、胰岛素5mg/mL、α-香附酮120ng/mL、N-乙酰基-5甲氧基色胺95ng/mL、玉米肽35μg/mL、酪蛋白磷酸肽45μg/mL、胆酸钠8μg/mL、香茅醇10μg/mL、柠檬酸锌25μg/mL。
上述牙髓间充质干细胞复苏培养液的制备方法，包括以下过程：称取各组分加入DMEM/F12培养基中，震荡搅拌至混合均匀，将混合物经0.22μm的滤菌膜过滤除菌，即得复苏培养液。
一种牙髓间充质干细胞的复苏培养方法，包括以下步骤：
(1)取液氮中冻存6个月的传代培养的P5代牙髓间充质干细胞在37℃恒温水浴下解冻，加入DMEM/F12培养基稀释后离心收集细胞；
(2)将离心后的细胞加入培养皿中的复苏培养液中，调整细胞浓度为3×105个/mL，放入37℃，5％CO2的培养箱中，培养24h，即完成复苏培养。
对比例1
对比例1提供一种牙髓间充质干细胞复苏培养液，和实施例1的区别为：省去α-香附酮，其余均和实施例1相同。
对比例2
对比例2提供一种牙髓间充质干细胞复苏培养液，和实施例1的区别为：省去α-香附酮，调整N-乙酰基-5甲氧基色胺的用量为200ng/mL，其余均和实施例1相同。
对比例3
对比例3提供一种牙髓间充质干细胞复苏培养液，和实施例1的区别为：省去N-乙酰基-5甲氧基色胺，其余均和实施例1相同。
对比例4
对比例4提供一种牙髓间充质干细胞复苏培养液，和实施例1的区别为：省去玉米肽，其余均和实施例1相同。
对比例5
对比例5提供一种牙髓间充质干细胞复苏培养液，和实施例1的区别为：省去酪蛋白磷酸肽，其余均和实施例1相同。
对比例6
对比例6提供一种牙髓间充质干细胞复苏培养液，和实施例1的区别为：省去玉米肽，将酪蛋白磷酸肽的用量调整为75μg/mL，其余均和实施例1相同。
对比例7
对比例7提供一种牙髓间充质干细胞复苏培养液，和实施例1的区别为：省去胆酸钠，其余均和实施例1相同。
对比例8
对比例8提供一种牙髓间充质干细胞复苏培养液，和实施例1的区别为：省去香茅醇，其余均和实施例1相同。
对比例9
对比例9提供一种牙髓间充质干细胞复苏培养液，和实施例1的区别为：省去柠檬酸锌，其余均和实施例1相同。
对比例10
对比例10提供一种牙髓间充质干细胞复苏培养液，该细胞培养液为DMEM/F12培养基。
用台盼兰染色进行细胞计数，分别统计实施例1至3和对比例1至10在牙髓间充质干细胞冻存前活细胞的总数，采用相同的常规方法冻存后，经复苏培养后活细胞的数量，计算实施例1至3，对比例1至10中经复苏培养后细胞的复苏率，细胞复苏率的计算公式如下：细胞复苏率＝复苏后活细胞的总数/冻存前活细胞总数×100％，结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002748232590000071
Figure BDA0002748232590000081
由表1可以看出：实施例1至3中细胞的复苏率高于对比例1至10。对比例1至10中调整了复苏培养液的成分，由此可知本发明的复苏培养液可以有效的提高冻存后细胞的复苏率，提高复苏后活细胞的数量。
对比例1至3中省去了α-香附酮和N-乙酰基-5甲氧基色胺中的一种成分后细胞的复苏率下降，由对比例2可知，在省去α-香附酮后，即使调整N-乙酰基-5甲氧基色胺的用量细胞的复苏率也没有明显的提升，说明在复苏培养液中添加α-香附酮和N-乙酰基-5甲氧基色胺，有助于细胞快速适应冻存后的复苏环境，提高复苏率。
对比例4至6中省去玉米肽和酪蛋白磷酸肽中的一种组分后细胞的复苏率下降，由对比例6可知，在省去玉米肽后，即使调整酪蛋白磷酸肽的用量细胞的复苏率也没有明显的提升，说明本发明添加玉米肽、酪蛋白磷酸肽两种成分协同作用，促进细胞的代谢，避免细胞凋亡，提高细胞活率。
对比例7至9中分别省去胆酸钠、香茅醇和柠檬酸锌中的一种后，细胞复苏率高于对比例1至6，但是和实施例1至3相比，还是有一定程度的下降，说明本发明的复苏培养液中添加胆酸钠、香茅醇和柠檬酸锌，胆酸钠和香茅醇可以保持细胞培养复苏环境的无菌性，避免细胞被杂菌污染，和柠檬酸锌协同作用，有助于细胞保持活性，从而提高细胞的复苏率。对比例10中仅采用基础培养基作为细胞复苏培养液，细胞的复苏率仅为67.12％，下降显著。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种牙髓间充质干细胞复苏培养液，其特征在于，包括以下原料：基础培养基，与以终浓度计，添加在基础培养基中的各组分：表皮生长因子10-15μg/mL、转铁蛋白25-35μg/mL、胰岛素1-5mg/mL、α-香附酮100-120ng/mL、N-乙酰基-5甲氧基色胺80-95ng/mL、玉米肽30-35μg/mL、酪蛋白磷酸肽40-45μg/mL、胆酸钠3-8μg/mL、香茅醇5-10μg/mL和柠檬酸锌15-25μg/mL。
2.根据权利要求1所述牙髓间充质干细胞复苏培养液，其特征在于，包括以下原料：基础培养基，与以终浓度计，添加在基础培养基中的各组分：表皮生长因子12μg/mL、转铁蛋白30μg/mL、胰岛素3mg/mL、α-香附酮110ng/mL、N-乙酰基-5甲氧基色胺90ng/mL、玉米肽32μg/mL、酪蛋白磷酸肽43μg/mL、胆酸钠5μg/mL、香茅醇8μg/mL和柠檬酸锌20μg/mL。
3.根据权利要求1或2任一项所述牙髓间充质干细胞复苏培养液，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
4.如权利要求1至3任一项所述牙髓间充质干细胞复苏培养液的制备方法，其特征在于，包括以下过程：称取各组分加入基础培养基中，震荡搅拌至混合均匀，将混合物经过滤除菌即得复苏培养液。
5.根据权利要求4所述牙髓间充质干细胞复苏培养液的制备方法，其特征在于，采用孔径为0.22μm的滤菌膜过滤除菌。
6.一种牙髓间充质干细胞的复苏培养方法，其特征在于，采用权利要求1至2任一项所述的复苏培养液进行复苏。
7.根据权利要求6所述牙髓间充质干细胞的复苏培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取冻存的牙髓间充质干细胞在37℃恒温水浴下解冻，加入基础培养基稀释后离心收集细胞；
(2)将离心后的细胞加入复苏培养液，放入37℃，5％CO2的培养箱中，培养24h，即完成复苏培养。
8.根据权利要求6所述牙髓间充质干细胞的复苏培养方法，其特征在于，步骤(1)中冻存的牙髓间充质干细胞为传代培养的P3-P5代细胞。
9.根据权利要求6牙髓间充质干细胞的复苏培养方法，其特征在于，步骤(2)中复苏培养液中的细胞密度为1-3×105个/mL。
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