JPWO2020130038A1 - 再生治療用組成物の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
前記歯髄由来幹細胞培養上清が含有するサイトカインである、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の濃度が150〜5000pg/mlであることを特徴とする。
当該歯髄由来幹細胞培養上清を歯髄由来幹細胞自体を含まないように処理して、
前記歯髄由来幹細胞培養上清が含有するサイトカインである、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の濃度が150〜5000pg/mlとなるようにすることを特徴とする。
前記したように、「歯髄由来幹細胞」とは、脱落または抜去した歯牙の中に存在する歯髄組織内に含まれる細胞のことを指す。採取した歯髄組織から歯髄由来幹細胞を得るには、歯髄細胞を培養等すればよく、例えば、以下の手順によって行うことができる。
脱落または抜去したヒトの乳歯や永久歯から採取した歯髄組織から、歯髄由来幹細胞を付着性細胞として選別することができる。
(1)で分離・回収して採取した歯髄組織をコラゲナーゼ等で処理を行い、処理を行った組織及び細胞を回収する。例えば、採取した歯髄組織を基本培地(例えば、10%ウシ血清・抗生物質含有ダルベッコ変法イーグル培地(Dulbecco’s M odified Eagle’s Medium、以下、「DMEM」とする場合もある。)等。)に懸濁し、例えば、2mg/mlのコラゲナーゼ及びディスパーゼで37℃、1時間処理するようにする。そして、例えば、5分間の遠心操作(例えば、600〜5000×g)により、酵素処理後の歯髄組織、歯髄細胞を回収する。
前記した処理を行い、回収した組織及び細胞を4ccの5体積%〜15体積%のウシ血清を含有した、例えば、50〜150ユニット/mlの抗生物質を含有するダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)あるいは間葉系幹細胞用培地に懸濁し、付着性細胞培養用ディッシュ、6ウェルへ播種する。
そして、例えば、トリプシン処理等で培養容器から細胞を剥離した後、所定の条件(例えば、600〜5000×gが好ましく、より好ましくは750〜5000×g)で遠心処理を施して細胞(付着性細胞)を採取して、歯髄由来幹細胞を回収することができる。
次に、歯髄由来幹細胞培養上清の製造の一例を説明する。まず、前記した方法で得られた歯髄由来幹細胞を、基本培地、例えば、血清として10体積%のFBS等の動物血清を加えた培地(前記したDMEM等。)を用いて、例えば、5体積%CO2雰囲気下、37℃の条件下に、例えば、24〜48時間培養するようにする。その後、血清を含まないDMEMへ置換し、さらに、例えば、一定の時間(例えば、24〜72時間等。)培養を行って、未処理の歯髄由来幹細胞培養上清を得る。
得られた未処理の歯髄由来幹細胞培養上清から歯髄由来幹細胞(歯髄由来幹細胞自体)を取り除くため、前記の一定の時間経過後、例えば、600〜5000×gで3〜7分間遠心処理を行うことにより、歯髄由来幹細胞(歯髄由来幹細胞自体)を含まない(歯髄由来幹細胞を取り除いた)、処理済みの歯髄由来幹細胞培養上清を得ることができる。他の処理としては、歯髄由来幹細胞を通過させない分離膜を通過させる等の処理により、歯髄由来幹細胞を含まない(歯髄由来幹細胞を取り除いた)、処理済みの歯髄由来幹細胞培養上清を得ることができる。
前記の方法で得られた、歯髄由来幹細胞を含まない(処理済みの)歯髄由来幹細胞培養上清は、種々の成長因子を含むが、回収後の成長因子の量(濃度)は均一でない。本発明にあっては、分泌するサイトカインのうち、少なくとも血管内皮細胞増殖因子(VEGF)を指標にし、濃度を測定し基準化のデータとし、再生治療に必要な血管の再生及び細胞増殖に関わる指標として用いるようにしている。
(ii)前記したAmicon Ultra Centrifugal Filter Units−10Kへ培養上清と同量の滅菌したリン酸緩衝生理食塩水(Phosp hate Buffered Saline、以下、「PBS」という)を投入し、再度4000×gで約60分間遠心し、ベース溶液をPBSへ置換する。
(iii)得られた溶液200μlをマイクロテストチューブへ回収し、濃縮した歯髄由来幹細胞培養上清とする。
(ii)4℃、15000×gで15分間遠心する。
(iii)上澄みを除去し、90%エタノール10mlを加え、よく攪拌する。
(iv)4℃、15000×gで5分間遠心する。
(v)上澄みを除去し、得られたペレットを滅菌水500μlに溶解し、マイクロテストチューブへ回収し、濃縮した歯髄由来幹細胞培養上清とする。
(ii)凍結後、サンプルチューブの蓋を開放し、凍結乾燥機へセットする。
(iii)1〜2日間凍結乾燥を行う。
(iv)凍結乾燥して得られたものを歯髄由来幹細胞培養上清の凍結乾燥物とする(−200℃〜−20℃で保存可能である。)。
その他、本発明の実施の際の具体的な構造及び形状等は、本発明の目的を達成できる範囲で他の構造等としてもよい。
歯髄由来幹細胞培養上清は前記した(A)〜(C)の方法により調製を行った。具体的には下記のとおりである。
下記(i)〜(iv)の方法を用いて、歯髄由来幹細胞を製造した。
脱落または抜去したヒトの乳歯から採取した歯髄細胞から、歯髄由来幹細胞を付着性細胞として選別した。採取した乳歯の歯牙をクロロヘキシジンやポビドンヨード液(イソジン(登録商標)液)で消毒した後、歯冠部を分割し歯科用リーマーにて歯髄組織を回収するようにした。
(i)で分離・回収して採取した歯髄組織を基本培地(10%ウシ血清・抗生物質含有ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)等。)に懸濁し、2mg/mlのコラゲナーゼ及びディスパーゼで37℃、1時間処理するようにした。そして、5分間の777×gの遠心操作により、酵素処理後の歯髄組織、歯髄細胞を回収した。
前記した処理を行い、回収した組織及び細胞を4ccの5体積%〜15体積%のウシ血清を含有した10000ユニット/mlのペニシリン、10000μg/mlのストレプトマイシン、及び25μg/mlのアンホテリシンBを含有するダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)に懸濁し、付着性細胞培養用ディッシュ、6ウェルへ播種した。
トリプシン処理等で培養容器から(iii)で培養した細胞を剥離した後、777×gで遠心処理を施すことによって、細胞(付着性細胞)を採取して、歯髄由来幹細胞を回収した。
(1−1)で得られた歯髄由来幹細胞を、基本培地、血清として10体積%のFBS等の動物血清を加えた培地(前記したDMEM等。)を用いて、5体積%CO2雰囲気下、37℃の条件下に、48時間培養するようにした。なお、歯髄由来幹細胞培養上清に用いる歯髄由来幹細胞の継代培養は、8回までとした。
得られた歯髄由来幹細胞培養上清について、サイトカインである血管内皮細胞増殖因子(VEGF)及びインシュリン様成長因子(IGF)の濃度を測定したところ、VEGFの濃度は987.8pg/ml、IGFの濃度は514.2pg/mlであった。また、カルシウムイオンの濃度は6.6mg/dlであった。
目的とする濃度まで、再生治療用組成物製造に用いたDMEM原液を用いて希釈を行った。
下記のスピンカラム法にて、目的とする濃度まで濃縮を行った。
(ii)前記したAmicon Ultra Centrifugal Filter Units−10Kへ培養上清と同量の滅菌したPBSを投入し、再度4000×gで約60分間遠心し、ベース溶液をPBSへ置換した。
(iii)得られた溶液200μlをマイクロテストチューブへ回収し、濃縮した歯髄由来幹細胞培養上清とした。
(iv)目的とした濃度より低かった場合、前記(i)〜(iii)の操作を繰り返した。
ヒト骨髄由来幹細胞(Bone Marrow Mesenchymal stem cells、骨髄間葉系幹細胞:BM)は、ロンザジャパン株式会社から購入し、同社の取扱説明書に従って培養した。
ヒト骨髄由来幹細胞の増殖能の確認:
(3)で得られたヒト骨髄由来幹細胞に対して、(2)で得られたサンプル1ないしサンプル6の再生治療用組成物を培養液として用いて、ヒト骨髄由来幹細胞の増殖を確認した。また、ヒト骨髄由来幹細胞に対して培養能があることで知られる10%FBS含有DMEMについても同様にしてヒト骨髄由来幹細胞の増殖を確認した。なお、サンプル1ないしサンプル6の評価は、n=3で行った。
ヒトの歯髄由来幹細胞自体を含まないヒトの歯髄由来幹細胞培養上清からなる再生治療用組成物の製造方法であって、
ヒトの歯髄由来幹細胞を培養してヒトの歯髄由来幹細胞培養上清を得て、
当該ヒトの歯髄由来幹細胞培養上清をヒトの歯髄由来幹細胞自体を含まないように処理して、
前記ヒトの歯髄由来幹細胞培養上清が含有するサイトカインである、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の濃度が150〜5000pg/ml、
前記ヒトの歯髄由来幹細胞培養上清が含有するサイトカインである、インシュリン様成長因子(IGF)の濃度が80〜1000pg/ml、
前記ヒトの歯髄由来幹細胞培養上清が含有するカルシウムイオン(Ca2+)の濃度が6.5〜8.0mg/dlとなるようにすることを特徴とする。
本発明に係る再生治療用組成物の製造方法は、前記した本発明において、製造される再生治療用組成物の増殖能が、10%FBS細胞による増殖能を1とした場合に0.6以上であることを特徴とする。
本発明に係る再生治療用組成物の製造方法は、前記した本発明において、前記濃度調整の操作が、濃縮、希釈、遠心処理、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、脱塩及び保存からなる群より選択される少なくとも1つの操作であることを特徴とする。
その他、本発明の実施の際の具体的な構造及び形状等は、本発明の目的を達成できる範囲で他の構造等としてもよい。
なお、本発明の参考形態の一例を以下に補記する。
本発明に係る再生治療用組成物は、歯髄由来幹細胞自体を含まない歯髄由来幹細胞培養上清を含んでなる再生治療用組成物であって、
前記歯髄由来幹細胞培養上清が含有するサイトカインである、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の濃度が150〜5000pg/mlであることを特徴とする。
本発明に係る再生治療用組成物は、前記した本発明において、前記歯髄由来幹細胞培養上清が含有するサイトカインである、インシュリン様成長因子(IGF)の濃度が80〜1000pg/mlであることを特徴とする。
本発明に係る再生治療用組成物は、前記した本発明において、前記歯髄由来幹細胞培養上清が含有するカルシウムイオン(Ca 2+ )の濃度が6.5〜8.0mg/dlであることを特徴とする。
本発明に係る再生治療用組成物は、前記した本発明において、癌、認知症、肝硬変、アルツハイマー病、パーキンソン病、関節リュウマチ、脳梗塞、心筋梗塞、アトピー性皮膚炎、花粉症、しわの増加、白髪、脱毛、老眼、近眼、ドライアイ、ドライマウス、歯周病、筋力低下、骨粗鬆症、糖尿病、更年期障害、不妊及び勃起不全から選ばれる少なくとも1つの症状の改善または予防に用いられることを特徴とする。
本発明に係る再生治療用組成物の製造方法は、歯髄由来幹細胞を培養して歯髄由来幹細胞培養上清を得て、
当該歯髄由来幹細胞培養上清を歯髄由来幹細胞自体を含まないように処理して、
前記歯髄由来幹細胞培養上清が含有するサイトカインである、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の濃度が150〜5000pg/mlとなるようにすることを特徴とする。
本発明に係る再生治療用組成物の製造方法は、前記した本発明において、前記歯髄由来幹細胞培養上清が含有するサイトカインである、インシュリン様成長因子(IGF)の濃度が80〜1000pg/mlとなるようにすることを特徴とする。
本発明に係る再生治療用組成物の製造方法は、前記した本発明において、前記歯髄由来幹細胞培養上清が含有するカルシウムイオン(Ca 2+ )の濃度が6.5〜8.0mg/dlとなるようにすることを特徴とする。
本発明に係る再生治療用組成物の製造方法は、前記した本発明において、前記血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、インシュリン様成長因子(IGF)、カルシウムイオン(Ca 2+ )の濃度のうち少なくとも1つを前記の濃度とするために、前記処理の後に濃度調整の操作を行うことを特徴とする。
本発明に係る再生治療用組成物の製造方法は、前記した本発明において、前記濃度調整の操作が、濃縮、希釈、遠心処理、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、脱塩及び保存からなる群より選択される少なくとも1つの操作であることを特徴とする。
Claims (9)
- 歯髄由来幹細胞自体を含まない歯髄由来幹細胞培養上清を含んでなる再生治療用組成物であって、
前記歯髄由来幹細胞培養上清が含有するサイトカインである、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の濃度が150〜5000pg/mlであることを特徴とする再生治療用組成物。 - 前記歯髄由来幹細胞培養上清が含有するサイトカインである、インシュリン様成長因子(IGF)の濃度が80〜1000pg/mlであることを特徴とする請求項1に記載の再生治療用組成物。
- 前記歯髄由来幹細胞培養上清が含有するカルシウムイオン(Ca2+)の濃度が6.5〜8.0mg/dlであることを特徴とする請求項1または請求項2に記載の再生治療用組成物。
- 癌、認知症、肝硬変、アルツハイマー病、パーキンソン病、関節リュウマチ、脳梗塞、心筋梗塞、アトピー性皮膚炎、花粉症、しわの増加、白髪、脱毛、老眼、近眼、ドライアイ、ドライマウス、歯周病、筋力低下、骨粗鬆症、糖尿病、更年期障害、不妊及び勃起不全から選ばれる少なくとも1つの症状の改善または予防に用いられることを特徴とする請求項1ないし請求項3のいずれかに記載の再生治療用組成物。
- 歯髄由来幹細胞を培養して歯髄由来幹細胞培養上清を得て、
当該歯髄由来幹細胞培養上清を歯髄由来幹細胞自体を含まないように処理して、
前記歯髄由来幹細胞培養上清が含有するサイトカインである、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の濃度が150〜5000pg/mlとなるようにすることを特徴とする再生治療用組成物の製造方法。 - 前記歯髄由来幹細胞培養上清が含有するサイトカインである、インシュリン様成長因子(IGF)の濃度が80〜1000pg/mlとなるようにすることを特徴とする請求項5に記載の再生治療用組成物の製造方法。
- 前記歯髄由来幹細胞培養上清が含有するカルシウムイオン(Ca2+)の濃度が6.5〜8.0mg/dlとなるようにすることを特徴とする請求項5または請求項6に記載の再生治療用組成物の製造方法。
- 前記血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、インシュリン様成長因子(IGF)、カルシウムイオン(Ca2+)の濃度のうち少なくとも1つを前記の濃度とするために、前記処理の後に濃度調整の操作を行うことを特徴とする請求項5ないし請求項7のいずれかに記載の再生治療用組成物の製造方法。
- 前記濃度調整の操作が、濃縮、希釈、遠心処理、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、脱塩及び保存からなる群より選択される少なくとも1つの操作であることを特徴とする請求項8に記載の再生治療用組成物の製造方法。
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