WO2010021412A1 - 脳梗塞治療材及び脳組織再生方法 - Google Patents

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WO2010021412A1
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dental pulp
cerebral infarction
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中島　美砂子
昌彦 杉山
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財団法人ヒューマンサイエンス振興財団
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Definitions

  • the present invention relates to a cerebral infarction treatment material and a brain tissue regeneration method using the cerebral infarction treatment material.
  • Cerebrovascular disease is the second leading cause of death in our country, and it is the largest cause of bedridden without death. Therefore, in the aging society, development of appropriate treatment for cerebrovascular disorder is urgently needed.
  • cerebrovascular disorders ischemic cerebrovascular disorders such as cerebral infarction and cerebral thrombosis are the most frequent, and the death rate from cerebral infarction is higher than the sum of myocardial infarction and ischemic heart disease.
  • the cause of paralysis is cerebral infarction, it is said that the latest treatment is effective within 3 hours after onset.
  • rtPa recombinant tissue plasminogen activator
  • instillation therapy can be expected to have reperfusion effect, and function recovery of about 30% of the brain function in which the disorder occurs.
  • rtPa instillation has the disadvantage that only about 2% can be used because of the side effects of intracerebral hemorrhage.
  • thrombolytic therapy using a catheter has been approved by the Ministry of Health and Welfare, there is currently no drug used for insurance. In adult brain, it is said that the place where neonatal neurons are produced exists in the subventricular zone and the granule cell layer of the hippocampal dentate gyrus.
  • new neurons generated after cerebral infarction are derived from the subventricular zone, migrate to the striatum parenchyma, form chain cell aggregates, differentiate into striatal nerves, and form synapses.
  • blood vessels are involved in the differentiation control of neural precursor cells, and it is said that induced nerve regeneration in the striatum is affected by blood vessels.
  • Therapeutic development by regenerative medicine has been advanced for cerebral infarction, and preclinical experiments using a rat or mouse cerebral infarction model have been conducted.
  • transplanted cells stem cells derived from bone marrow, peripheral blood, fat, cord blood or the like are used.
  • embryonic neural stem cells or ES cells are used. These cells are infused into the brain or intravenously.
  • Patent Document 1 describes a method for efficiently inducing proliferation of neural stem cells important for treatment of a nerve injury site caused by cerebral infarction, etc. in vitro or in vivo.
  • Patent Document 2 describes a medical drug at a cerebral infarction site obtained by combining mesenchymal stem cells and IGF-1.
  • the present invention has been made in view of such problems, and a therapeutic material for cerebral infarction that effectively recovers the vascular injury at the cerebral infarction site and improves the brain function, and such a therapeutic material for cerebral infarction It aims at providing a brain tissue regeneration method to be used.
  • the material for treating cerebral infarction is at least one of CD105 positive cells, SP cells, CD24 positive cells, CD133 positive cells, CD271 positive cells and CD150 positive cells. And / or at least one of the dental pulp stem cells and a secreted protein of the dental pulp stem cells.
  • the SP cells are any of CD31 negative, CD105 positive, CD24 positive, CD133 positive, CD271 positive or CD150 positive.
  • the dental pulp stem cells express a factor including at least one of a cell migration factor, a cell growth factor, an angiogenic factor, and a neurotrophic factor in the vicinity of cerebral infarction.
  • the cell migration factor is preferably at least one of SDF1, GCSF, MMP3, Slit and GMCSF.
  • the neurotrophic factor is preferably at least one of VEGF, NGF, GDNF, BDNF, LIF, MYC, Neurotrophin 3, TP53 and BAX.
  • the cell growth factor is preferably at least one of bFGF and PDGF.
  • the angiogenic factor is preferably at least one of PGF, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL10, ANPEP, NRP1, TGF ⁇ , ECGF1, ID1 and CSF3.
  • the concentration of the dental pulp stem cells is preferably 1 ⁇ 10 5 cells / ⁇ l or more and 1 ⁇ 10 7 cells / ⁇ l or less.
  • a brain tissue regeneration method is a method for regenerating a brain tissue according to the second aspect of the present invention, comprising: CD105 positive cells, SP cells, CD24 positive cells, CD133 positive cells; Brain central nervous tissue is regenerated and brain function is restored by injecting at least one of dental pulp stem cells containing at least one of positive cells and CD150 positive cells and secreted proteins of the dental pulp stem cells It is characterized by Preferably, the SP cells are any of CD31 negative, CD105 positive, CD24 positive, CD133 positive, CD271 positive or CD150 positive.
  • the dental pulp stem cells express a factor including at least one of a cell migration factor, a cell growth factor, an angiogenic factor and a neurotrophic factor in the vicinity of cerebral infarction.
  • concentration of the dental pulp stem cells is preferably 1 ⁇ 10 5 cells / ⁇ l or more and 1 ⁇ 10 7 cells / ⁇ l or less.
  • the dental pulp stem cells are preferably permanent dental pulp or dental pulp stem cells derived from primary teeth.
  • the material for treating cerebral infarction and the method for regenerating brain tissue according to the present invention are a novel and novel therapeutic material for cerebral infarction and a method for regenerating brain tissue which have not been hitherto available, and effectively recover the vascular injury at the cerebral infarction site.
  • brain damage symptoms such as stroke can be extremely effectively improved, greatly contributing to life saving in an aging society, and immeasurable benefits can be obtained.
  • FIG. 1A is a diagram illustrating cell transplantation into the brain striatum.
  • FIG. 1B is a macroscopic image of a fractured brain surface.
  • FIG. 2A is a confocal laser micrograph of a frozen section in the periphery of cerebral infarction immunofluorescently stained with DCX, which is 21 days after transplantation of porcine dental pulp tissue-derived CD31 negative SP cells 24 hours after cerebral infarction .
  • FIG. 2B is a confocal laser microscopic view in which a frozen section of a normal brain site opposite to a cerebral infarction site is immunofluorescently stained with DCX.
  • FIG. 2C is a confocal laser microscopic view of DCX immunofluorescently stained PBS control not implanted with cells at the periphery of cerebral infarction.
  • FIG. 3A is a confocal laser micrograph of a cryosection in the peripheral area of cerebral infarction immunofluorescently stained with a neurofilament, and on day 21 after transplantation of porcine dental pulp tissue-derived CD31 negative SP cells 24 hours after cerebral infarction is there.
  • FIG. 3B is a confocal laser micrograph of a frozen section of a normal brain site opposite to a cerebral infarction site, which is immunofluorescently stained with a neurofilament.
  • FIG. 3A is a confocal laser micrograph of a cryosection in the peripheral area of cerebral infarction immunofluorescently stained with a neurofilament, and on day 21 after transplantation of porcine dental pulp tissue-derived CD31 negative SP cells 24 hours after cerebral infarction is there.
  • FIG. 3C is a confocal laser microscopic view of a non-cell-implanted PBS control immunofluorescently stained with a neurofilament at the periphery of cerebral infarction.
  • FIG. 4A is a confocal laser micrograph of a cryosection in the periphery of cerebral infarction immunofluorescently stained with NeuN, which is 21 days after transplantation of porcine dental pulp tissue-derived CD31 negative SP cells 24 hours after cerebral infarction .
  • FIG. 4B is a confocal laser microscopic view in which a frozen section of a site of normal brain opposite to a cerebral infarction site is immunofluorescently stained with NeuN.
  • FIG. 4C is a confocal laser micrograph of the non-transplanted PBS control in the periphery of cerebral infarction, immunofluorescently stained with NeuN.
  • FIG. 5 shows statistical analysis of neural progenitor cell density on day 21 after transplantation of porcine dental pulp tissue-derived CD31 negative SP cells 24 hours after cerebral infarction.
  • FIG. 6 shows statistical analysis of neural cell density on day 21 after transplantation of porcine dental pulp tissue-derived CD31 negative SP cells 24 hours after cerebral infarction.
  • FIG. 7A is a diagram showing expression of VEGF mRNA when pig dental pulp tissue-derived CD31 negative SP cells are transplanted to a cerebral infarct.
  • FIG. 7B is a diagram showing the expression of GDNF mRNA in the case where pig dental pulp tissue-derived CD31 negative SP cells are transplanted to a cerebral infarct.
  • FIG. 7C is a diagram showing expression of BDNF mRNA in the case where pig dental pulp tissue-derived CD31 negative SP cells are transplanted to a cerebral infarct.
  • FIG. 7D is a diagram showing the expression of NGF mRNA when pig dental pulp tissue-derived CD31 negative SP cells are transplanted to a cerebral infarct.
  • FIG. 8A is a diagram showing an increase in VEGF mRNA expression of transplanted cells migrating to the periphery of cerebral infarction when transplanted with porcine dental pulp tissue-derived CD31 negative SP cells.
  • FIG. 8A is a diagram showing an increase in VEGF mRNA expression of transplanted cells migrating to the periphery of cerebral infarction when transplanted with porcine dental pulp tissue-derived CD31 negative SP
  • FIG. 8B shows the results of Real-time RT-PCR.
  • FIG. 9 shows the migration effect of the culture supernatant of pig dental pulp tissue-derived CD31 negative SP cells on neural progenitor cells.
  • FIG. 10 shows the proliferation effect of culture supernatant of pig dental pulp tissue-derived CD31 negative SP cells on neural progenitor cells.
  • FIG. 11 is a view showing an apoptosis inhibitory effect on neural progenitor cells of culture supernatant of pig dental pulp tissue-derived CD31 negative SP cells.
  • FIG. 12 shows statistical analysis of motor paralysis scores calculated over time when pig dental pulp tissue-derived CD31-negative SP cells are transplanted to cerebral infarction rats.
  • FIG. 13 shows the motor paralysis score over time when each of pig dental pulp tissue-derived CD31 negative SP cells, porcine bone marrow tissue derived CD31 negative SP cells, and porcine adipose tissue derived CD31 negative SP cells is transplanted to cerebral infarction rats.
  • FIG. 14A shows induction of differentiation of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells into blood vessels.
  • FIG. 14B shows induction of differentiation of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells into fat.
  • FIG. 14C is a diagram showing the results of control without induction of differentiation into fat.
  • FIG. 14D is a diagram showing measurement results of induction of differentiation into fat by Real-time RT-PCR.
  • FIG. 14A shows induction of differentiation of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells into blood vessels.
  • FIG. 14B shows induction of differentiation of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells into fat.
  • FIG. 14C is a diagram showing the results of control without induction of differentiation into fat.
  • FIG. 14D is
  • FIG. 14E shows induction of differentiation of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells into odontoblasts.
  • FIG. 14F is a diagram showing the results of control without induction of differentiation into odontoblasts.
  • FIG. 14G is a diagram showing measurement results of induction of differentiation into odontoblasts by Real-time RT-PCR.
  • FIG. 15A shows neurosphere formation of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells.
  • FIG. 15B shows the neural differentiation ability of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells.
  • FIG. 15C shows neurosphere formation of human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells.
  • FIG. 15D shows the neural differentiation ability of human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells.
  • FIG. 15A shows neurosphere formation of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells.
  • FIG. 15B shows the neural differentiation ability of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells.
  • FIG. 15C shows neurosphere formation of human dental
  • FIG. 16 is a diagram for explaining the migration effect of culture supernatants of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells and human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells on neural precursor cells.
  • FIG. 17 is a view for explaining the proliferative effect of culture supernatants of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells and human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells on neural precursor cells.
  • FIG. 18 is a diagram showing the apoptosis inhibitory effect of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells and human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells on neural precursor cells.
  • FIG. 17 is a view for explaining the proliferative effect of culture supernatants of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells and human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells on neural precursor cells.
  • FIG. 18 is a diagram showing the apoptosis inhibitory effect of human dental pulp tissue-derived CD105 +
  • FIG. 19 shows immunostaining with DCX on day 21 when human dental pulp tissue-derived CD105 + cells were transplanted into brain tissue inner striatum 24 hours after cerebral infarction, and statistics of density of neural precursor cells in peripheral area of cerebral infarction Analysis figure.
  • FIG. 20 shows immunofluorescent staining with NeuN on day 21 when human dental pulp tissue-derived CD105 + cells were transplanted into the striatum of brain tissue 24 hours after cerebral infarction, and statistical analysis of neural cell density in peripheral area of cerebral infarction Analysis figure.
  • FIG. 21 shows immunostaining with DCX on day 21 when human dental pulp tissue-derived CD105 + cells were transplanted into brain tissue inner striatum 24 hours after cerebral infarction, and statistics of density of neural precursor cells in peripheral area of cerebral infarction Analysis figure.
  • FIG. 22 shows immunostaining with NeuN on day 21 when human dental pulp tissue-derived CD105 + cells and human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells were transplanted into brain tissue striatum 24 hours after cerebral infarction It is the figure which analyzed the density of the nerve cell of the infarct peripheral part statistically.
  • FIG. 23 shows statistical analysis of motor paralysis scores calculated over time after transplantation of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells and human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells into cerebral infarction rats. is there.
  • the cerebral infarction treatment material contains dental pulp stem cells, secreted proteins of dental pulp stem cells, or a mixture thereof.
  • the present inventor conventionally contributes indirectly to promote differentiation of neural progenitor cells and neural stem cells around a cerebral infarction site by implanting dental pulp stem cells or a secreted protein of dental pulp stem cells at the cerebral infarction site, conventionally
  • the present invention has been completed on the basis of novel new findings that have not been seen at all.
  • Dental pulp stem cells are more advantageous than other stem cells such as bone marrow stem cells and adipose stem cells in that they eliminate cerebral infarction.
  • the dental pulp tissue has a high stem cell content and facilitates sorting of stem cells, for example, as compared to bone marrow tissue and fat tissue.
  • dental pulp stem cells are advantageous in that they have a higher proliferation rate than, for example, bone marrow stem cells.
  • pig dental pulp stem cells have about twice as much difference in SP cell passage time as pig bone marrow stem cells.
  • dental pulp stem cells are advantageous in that they express more vascular inducers such as G-CSF, GM-CSF, MMP3 and VEGF, as compared with, for example, bone marrow stem cells and adipose stem cells.
  • vascular inducers such as G-CSF, GM-CSF, MMP3 and VEGF
  • canine dental pulp stem cells are G-CSF, GM-CSF, and VEGF more than ⁇ times, 3.8 times, 3.6 times more than canine adipose stem cells, respectively. It is expressed.
  • dental pulp stem cells are more likely to form a tubular structure on in vitro Matrigel, for example, than bone marrow stem cells, aortic stem cells and adipose stem cells.
  • dental pulp stem cells have an advantage over bone marrow stem cells and adipose stem cells, for example, in that blood flow is significantly restored and angiogenesis is significantly promoted.
  • porcine dental pulp stem cells are significantly more vascularized than porcine bone marrow stem cells and porcine adipose stem cells.
  • dental pulp stem cells are advantageous in that they express more neural induction factors such as BDNF, NPY, TGFB1 and TGFB3 as compared to, for example, bone marrow stem cells and adipose stem cells.
  • dental pulp stem cells are expressed 19 times more than bone marrow stem cells and 2 times more expressed than adipose stem cells.
  • dental pulp stem cells are expressed 7 times more than bone marrow stem cells and 9 times more expressed than adipose stem cells.
  • bone marrow stem cells are disadvantageous in that the burden of bone marrow aspiration is large and the number of stem cells decreases with age. The collection efficiency of fat stem cells is large, so the collection efficiency is poor.
  • Umbilical cord blood stem cells are disadvantageous in that stem cells are low in frequency of occurrence, susceptible to the time from delivery to cell collection and cord blood volume, and stem cells can not be collected stably.
  • ES cells In addition to ethical and social problems, ES cells also have safety problems. In embryonic-derived neural stem cells, there are ethical and social problems as well as safety problems. On the other hand, dental pulp stem cells are less invasive to the human body at the time of collection, and since they are medical wastes, there are few ethical problems, and the acquisition time is not limited. It does not require any technology and is advantageous over other stem cells in that it has high proliferation ability and multipotency as shown herein. Dental pulp stem cells can be cryopreserved while maintaining their traits, and their immunosuppressive activity to suppress T cell alloreaction is much higher than bone marrow stem cells.
  • the dental pulp stem cells include at least one of CD105 positive cells, SP cells, CD31 negative and CD146 negative cells, CD24 positive cells, CD133 positive cells, CD271 positive cells and CD150 positive cells.
  • the SP cells are undifferentiated cells discovered by Goodell et al. (J. Exp. Med. Vol. 183, 1996), and the fluorescence dye Hoechst 33342 is incorporated into the cells by flow cytometry analysis to obtain UV.
  • the cell population that appears in SP cells are either CD31 negative, CD105 positive, CD31 negative and CD146 negative, CD24 positive, CD133 positive, CD271 positive or CD150 positive.
  • Dental pulp stem cells express cell migration factor, cell growth factor, angiogenic factor or neurotrophic factor around cerebral infarction.
  • the cell migration factor is at least one of SDF1, GCSF, MMP3, Slit and GMCSF.
  • the neurotrophic factor is at least one of VEGF, NGF, GDNF, BDNF, LIF, MYC, Neurotrophin 3, TP53 and BAX.
  • the cell growth factor is at least one of bFGF and PDGF.
  • the angiogenic factor is at least one of PGF, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL10, ANPEP, NRP1, TGF ⁇ , ECGF1, ID1 and CSF3.
  • concentration of dental pulp stem cells contained in the material for treating cerebral infarction is not particularly limited, but is preferably, for example, 1 ⁇ 10 5 cells / ⁇ l or more and 1 ⁇ 10 7 cells / ⁇ l or less.
  • the dental pulp stem cells may be cells (autologous cells) extracted from the subject animal treated for improvement in brain function (autologous cells), or cells extracted from animals other than the subject animal treated for improvement in brain function (allogeneic cells, xenogeneic cells) Cells).
  • Dental pulp stem cells can be derived from permanent teeth or primary teeth.
  • dental pulp cells derived from human primary teeth contain as much as about 30% of CD105 + (about 20% CD105 + in human permanent tooth-derived CD31 - SP cells), dental pulp stem cells or dental pulp cells derived from permanent teeth As in the case of dental pulp stem cells, it shows in vitro vascular induction, blood flow recovery in the lower limbs ischemic site, and angiogenesis promoting effect.
  • CD150 + is contained in 0.5% of the dental pulp dental pulp cells, which is more than 0.2% of permanent tooth CD31 ⁇ SP cells.
  • the dental pulp-derived dental pulp cells have higher in vitro vascular induction and blood flow recovery and angiogenesis promoting effects at the site of lower extremity ischemia than permanent dental pulp-derived dental pulp cells.
  • the cerebral infarction treatment material according to the present embodiment may contain not only dental pulp stem cells but also a secreted protein of dental pulp stem cells.
  • the secretory protein is a protein secreted extracellularly.
  • Secretory proteins have a sequence called secretory signal peptide at the N-terminus.
  • the brain tissue regeneration method according to the present embodiment regenerates brain central nervous tissue and restores brain function by injecting the above-mentioned cerebral infarction treatment material into the cerebral striatum after cerebral infarction. Injection into the brain striatum is not particularly limited, but can be performed, for example, by making a hole in a part of the parietal bone.
  • cerebral infarction means that blood vessels in the brain get clogged and become thin, resulting in poor blood flow and death of brain tissue.
  • the cerebral striatum is the subcortical structure of the telencephalon.
  • the cerebral striatum is deeply involved in motor function and decision making function, and is one of the main components of the basal ganglia.
  • the brain striatum may be either neo-striate or ventral striatum.
  • the new striatum, also called dorsal striatum is composed of a grain and a caudate nucleus.
  • the ventral striatum includes the nucleus accumbens, olfactory tubercle and the like.
  • the material for treating cerebral infarction is not particularly limited, but can be injected into the cerebral striatum within 24 hours after the onset of cerebral infarction, for example.
  • Example 1 The present example shows nerve regeneration after rat cerebral infarction by pig dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP transplantation.
  • Middle cerebral artery occlusion was performed using SD (Sprague-Dawley) rats, and cerebral infarction model rats were created.
  • cell transplantation was performed 24 hours after cerebral infarction to the injection site Pi of the brain striatum in brain tissue as shown in FIGS. 1A and 1B.
  • PBS As a control, one injected with PBS was used.
  • B indicates bregma, which is the intersection of the sagittal and coronal sutures of the skull.
  • L1 is 6.0 mm and L2 is 1.0 mm.
  • FIG. 1B is a coronal macro view.
  • L3 is 5.0 mm and L4 is 6.0 mm.
  • ML indicates a midline. Twenty-one days after cell transplantation, the cells were fixed by perfusion, and cryosections were prepared as usual, and immunostaining was performed using neural progenitor cell markers DCX, neural markers neurofilament and NeuN.
  • FIG. 2A is a confocal laser microscopic view in which CD31 negative SP cells were transplanted after cerebral infarction, and frozen sections were immunofluorescently stained with DCX.
  • FIG. 2B shows immunostaining with DCX of a site of normal brain opposite to the cerebral infarction site.
  • FIG. 2C shows PBS infused after cerebral infarction and immunostained with DCX.
  • FIG. 3A is a confocal laser microscopic view in which CD31 negative SP cells were transplanted after cerebral infarction, and frozen sections were immunofluorescently stained with neurofilament.
  • FIG. 3B shows immunostaining of a site of normal brain opposite to the cerebral infarction site with neurofilament.
  • FIG. 3C shows PBS infused after cerebral infarction and immunostained with neurofilament. Immunostaining with the neuronal marker neurofilament showed that the positive cells were in close proximity to the cells accumulating at the periphery of the cerebral infarct, but no duplication was seen. At the periphery of cerebral infarction where cells were not transplanted, only few neurofilament positive cells were found.
  • FIG. 4A is a confocal laser microscopic view in which CD31 negative SP cells were transplanted after cerebral infarction, and frozen sections were immunofluorescently stained with NeuN.
  • FIG. 4A is a confocal laser microscopic view in which CD31 negative SP cells were transplanted after cerebral infarction, and frozen sections were immunofluorescently stained with NeuN.
  • FIG. 4B shows the result of immunostaining with NeuN of a site of normal brain opposite to the cerebral infarction site.
  • FIG. 4C shows PBS infused after cerebral infarction and immunostained with NeuN. Also in NeuN, as in the case of neurofilament, positive cells were close to cells accumulated in the periphery of cerebral infarction, but duplications were not seen. Also, in the periphery of cerebral infarction where cells were not transplanted, only a few positive cells were found.
  • NeuN staining is a method of staining a neuronal cell nucleus-specific protein, and is used to distinguish undifferentiated neural stem cells from differentiated neural cells.
  • neural progenitor cells and neural stem cells derived from the lateral ventricular subventricular zone migrate to the striatum parenchyma and differentiate into nerves to form synapses.
  • neural progenitor cells migrate to the striatum due to cerebral infarction but the differentiation of the nerves is caused by PBS injection.
  • the transplanted cells do not directly differentiate into neural progenitor cells or neurons, but indirectly promote differentiation, because they do not appear and when they are transplanted, they do not overlap with DCX, neurofilament, and NeuN positive cells. It is conceivable that they are involved.
  • FIG. 5 shows a statistical analysis of the density of neural precursor cells in the case of transplantation of pig dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells.
  • FIG. 6 shows statistical analysis of neural cell density in the case of transplantation of porcine dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells.
  • neural progenitor cells around the cerebral infarct area were increased by cell transplantation about twice as compared to the PBS control.
  • neuronal cells around the cerebral infarct area were increased by cell transplantation by about 8-fold compared to PBS control.
  • CD31 negative SP cells at the cerebral infarction site neural precursor cells migrate to the peripheral area of cerebral infarction, proliferation is promoted, apoptosis is suppressed, and further differentiation into nerve cells is promoted. Is suggested.
  • expression of neurotrophic factor was examined by in situ hybridization.
  • FIG. 7A shows expression of VEGF mRNA around the cerebral infarction site.
  • FIG. 7B shows the expression of GDNF mRNA at the periphery of cerebral infarction.
  • FIG. 7C shows expression of BDNF mRNA in the periphery of cerebral infarction.
  • FIG. 7D shows the expression of NGF mRNA in the peripheral area of cerebral infarction.
  • the transplanted cells strongly expressed VEGF mRNA, GDNF mRNA, BDNF mRNA, and NGF mRNA at the periphery of cerebral infarction.
  • FIG. 8A is a diagram showing expression of VEGF in the cerebral infarction peripheral area transplanted with pig dental pulp tissue-derived CD31 negative SP cells
  • FIG. 8B is a diagram showing measurement results by Real-time RT-PCR. As shown in FIGS.
  • VEGF mRNA in the periphery of cerebral infarction, the expression of VEGF mRNA is increased 1000 times or more compared to that of the normal part of the pig brain, and when transplanted to a place where cerebral infarction is not generated About 28 times that of
  • CD31 negative SP cells neurotrophic factors including VEGF secreted from transplanted cells are considered to promote differentiation of neural progenitor cells and neural stem cells in the periphery of cerebral infarction.
  • the migration, proliferation and anti-apoptotic effect of culture supernatant of CD31 negative SP cells were examined using cultured neural precursor cells (SHSY5Y human neuroblastoma cells).
  • FIG. 9 shows the migration effect of culture supernatant of porcine dental pulp tissue-derived CD31 negative SP cells. As shown in FIG. 9, the migration effect of the culture supernatant of CD31 negative SP cells was excellent.
  • FIG. 10 shows the growth effect of culture supernatant of porcine dental pulp tissue-derived CD31 negative SP cells. As shown in FIG. 10, the growth effect of the culture supernatant of CD31 negative SP cells was particularly excellent. The anti-apoptotic effect caused apoptosis by 400 nM staurosporine, and the percentage of necrotic cells and apoptotic cells was measured by flow cytometry.
  • FIG. 11 is a view showing the apoptosis suppression effect of culture supernatant of pig dental pulp tissue-derived CD31 negative SP cells.
  • the apoptosis suppression effect of the culture supernatant of CD31 negative SP cells was excellent. Furthermore, after transplanting pig dental pulp tissue-derived CD31 negative SP cells to cerebral infarction rats, the motor paralysis score was calculated over time, and the recovery effect of the motor sensory function by cell transplantation was examined. The calculation of the motor paralysis score was based on the method shown below. 1 ... Do not hold the upper limbs on the paralyzed side when lifting with the tail. (1 point) 2 ... Pulling the lower leg on the paralyzed side does not withdraw the lower leg. (1 point) 3 ... When you knock your body to the side of paralysis, it leans to that side. (1 point) 4 ... I can not walk even if I walk.
  • FIG. 12 is a diagram showing statistical analysis by calculating a motor paralysis score over time. The number of days is the date after transplantation of the cells.
  • the recovery effect of the motor sensory function by the cell transplantation is almost the recovery of the motor paralysis on the 9th day when the cell transplantation is performed, but the recovery is hardly seen in the PBS control
  • the motor paralysis score was calculated over time and statistical analysis revealed that the cell transplantation group recovered the motor function significantly compared to the control group PBS injection after 6 days.
  • the pig dental pulp total cell is a cell in the state before sorting the pig dental pulp tissue-derived CD31 negative SP cells, and includes not only the pig dental pulp tissue derived CD31 negative SP cells but also other cells. .
  • Example 2 In this example, unlike Example 1, dental pulp cells derived from human dental pulp tissue are used. Table 1 shows the properties of human dental pulp tissue-derived CD31 - SP cells and porcine dental pulp tissue-derived CD31 - SP cells.
  • human dental pulp tissue-derived CD31 - SP cells highly expressed CD90 and CD150 as compared to porcine dental pulp tissue-derived CD31 - SP cells.
  • human dental pulp tissue-derived CD31 - SP cells highly expressed CD105 as compared to human total dental pulp cells.
  • This example shows nerve regeneration after rat cerebral infarction by transplantation of human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells and human dental pulp tissue-derived CD105 + cells.
  • Table 2 shows the properties of human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells and human dental pulp tissue-derived CD105 + cells.
  • human dental pulp tissue-derived CD105 + cells are neural stem cell markers CD24 and CD271 and more undifferentiated stem cell markers than human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells and human total dental pulp cells CD150 was highly expressed. Thus, it is suggested that CD105 + cells contain more neural stem cells and more undifferentiated stem cells than CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells and human total dental pulp cells.
  • pluripotency was examined. As shown in FIG. 14A, human dental pulp tissue-derived CD105 + cells were induced in blood vessels. Also, as shown in FIG. 14B, human dental pulp tissue-derived CD105 + cells were induced to fat.
  • FIG. 14C shows the measurement results by the PBS control.
  • FIG. 14D shows the measurement results by Real-time RT-PCR.
  • PPAR ⁇ is a adipocyte-specific differentiation marker.
  • FIG. 14E human dental pulp tissue-derived CD105 + cells were induced to odontoblasts.
  • FIG. 14F shows the measurement results by Real-time RT-PCR.
  • Dspp and Enamelysin are differentiation markers specific to odontoblasts. The primers shown in FIGS.
  • FIG. 15A human dental pulp tissue-derived CD105 + cells exhibited neurosphere formation.
  • FIG. 15B human dental pulp tissue-derived CD105 + cells were capable of neural differentiation.
  • FIG. 15C human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells exhibited neurosphere formation.
  • FIG. 15D human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells were capable of neural differentiation.
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • NGF nerve growth factor
  • human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells is about 4 times higher for BDNF and about 5.6 times higher for NGF mRNA than human dental pulp tissue-derived CD105 + cells.
  • the expression of VEGFA mRNA in both cell fractions was 4 to 5 times that of total dental pulp cells.
  • GDNF glial cell-derived neurotrophic factor
  • the expression of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells was increased about four times as compared to total dental pulp cells.
  • GDNF glial cell-derived neurotrophic factor
  • expression of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells was increased by about 10.2 times as compared to human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells . That is, it was revealed that human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells strongly express BDNF and NGF. In addition, it was revealed that human dental pulp tissue-derived CD105 + cells strongly express GDNF mRNA.
  • Stat3 mRNA a stem cell marker, human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells were expressed approximately 5.8 times as strongly as human dental pulp tissue-derived CD105 + cells.
  • human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells were approximately four times as expressed as human dental pulp tissue-derived CD105 + cells. From the above, the migration and growth promoting effect of human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells is mainly attributed to BDNF and NGF, and that of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells is considered to be mainly attributed to GDNF.
  • FIG. 16 is a diagram for explaining the promotion of migration of culture supernatants of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells and human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells. As shown in FIG. 16, the supernatants of human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells and human dental pulp tissue-derived CD105 + cells promoted migration significantly as compared with the control.
  • FIG. 16 is a diagram for explaining the promotion of migration of culture supernatants of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells and human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells.
  • FIG. 17 is a diagram illustrating growth promotion of culture supernatants of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells and human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells.
  • supernatants of human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells and human dental pulp tissue-derived CD105 + cells significantly promoted proliferation as compared with the control.
  • the culture supernatant of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells promotes proliferation with a significant difference after 24 hours than the culture supernatant of human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells, After 48 hours, the significant difference between the two was remarkable.
  • FIG. 17 is a diagram illustrating growth promotion of culture supernatants of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells and human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells.
  • FIG. 18 is a view showing the apoptosis inhibitory effect of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells and human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells.
  • the culture supernatant of human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells and human dental pulp tissue-derived CD105 + cells significantly suppressed apoptosis compared to the control.
  • the culture supernatant of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells suppressed apoptosis more significantly than the culture supernatant of human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells.
  • human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells and human dental pulp tissue-derived CD105 + cells are transplanted into the brain tissue inner striatum after cerebral infarction, and the motor paralysis score is calculated over time, We examined the recovery effect of motor function.
  • SD rats were used to create a cerebral infarction model.
  • Human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells and CD105 + cells were fluorescently labeled with DiI, and 24 hours after cerebral infarction, the cells were transplanted into the striatum of brain tissue.
  • PBS a control, one injected with PBS was used.
  • FIG. 19 is a diagram showing immunostaining with DCX on day 21 after cell transplantation of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells to cerebral tissue substriatal areas after cerebral infarction and statistical analysis of neural precursor cell density . As shown in FIG. 19, when human dental pulp tissue-derived CD105 + cells were transplanted, neural progenitor cells around the cerebral infarct area were increased about three times by cell transplantation.
  • FIG. 19 is a diagram showing immunostaining with DCX on day 21 after cell transplantation of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells to cerebral tissue substriatal areas after cerebral infarction and statistical analysis of neural precursor cell density . As shown in FIG. 19, when human dental pulp tissue-derived CD105 + cells were transplanted, neural progenitor cells around the cerebral infarct area were increased about three times by cell transplantation.
  • FIG. 20 shows the results of statistical analysis of neural cell density by immunofluorescence staining with NeuN on day 21 after cell transplantation of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells into cerebral tissue intrastriatum after cerebral infarction .
  • the nerve travel was disturbed compared to the opposite part of the normal brain, as shown in FIG. 20, a significant increase in nerve cells was observed around the cerebral infarction compared to PBS injection, as shown in FIG. .
  • FIG. 20 shows the results of statistical analysis of neural cell density by immunofluorescence staining with NeuN on day 21 after cell transplantation of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells into cerebral tissue intrastriatum after cerebral infarction .
  • FIG. 21 shows human dental pulp tissue-derived CD105 + cells and human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells in separate cerebral infarction SD rats at day 21 after cell transplantation into brain tissue inner striatum respectively It is a figure which compared immunostaining with DCX and analyzed the density of neural progenitor cells statistically.
  • human dental pulp tissue-derived CD105 + cells were more prominent in their ability to promote proliferation of neural precursor cells than human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells.
  • FIG. 22 shows human dental pulp tissue-derived CD105 + cells and human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells in separate cerebral infarction SD rats at day 21 after cell transplantation into brain tissue inner striatum respectively It is a figure which compared immunostaining with NeuN and analyzed the density of a nerve cell statistically.
  • human dental pulp tissue-derived CD105 + cells were more prominent in their ability to promote neuronal differentiation than human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells.
  • FIG. 23 is a graph showing statistical evaluation of motor paralysis scores over time after transplantation of human dental pulp tissue-derived CD105 + cells and human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells into separate cerebral infarction SD rats. It is a figure which compares various analysis. The number of days is the date after transplantation of the cells. As shown in FIG. 23, when the motor paralysis score is calculated, both human dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells and human dental pulp tissue-derived CD105 + cells recover significant motor paralysis compared to PBS injection. It was seen.
  • dental pulp tissue-derived CD105 + cells and dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells are excellent in cell migration ability, cell proliferation ability, and apoptosis suppression ability, and It has excellent ability to proliferate neural precursor cells and ability to promote differentiation of neural cells.
  • dental pulp tissue-derived CD105 + cells are superior to dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells in cell proliferation ability and apoptosis suppression ability.
  • the remarkable superiority of dental pulp tissue-derived CD105 + cells to dental pulp tissue-derived CD31 ⁇ ; CD146 ⁇ SP cells is not to be predicted and has become apparent for the first time by the present inventors' experiments.
  • dental pulp tissue-derived CD105 + cells are not particularly limited, and can be sorted, for example, by immunomagnetic bead method.
  • the immunomagnetic bead method is a method in which a sample and immunomagnetic beads (the one obtained by attaching magnetic beads to an antibody against the surface antigen of cells) are put into a tube and reacted, and the sample is adsorbed to the column and separated. There is no danger of National. Therefore, a cerebral infarction treatment material using dental pulp tissue-derived CD105 + cells has the great advantage that it can be used immediately in the clinic and can immediately provide an appropriate therapeutic measure for cerebrovascular disease.
  • the material for treating cerebral infarction according to the present invention is excellent in the ability to proliferate neural precursor cells and is also excellent in the ability to promote differentiation of neural cells.
  • the material for treating cerebral infarction according to the present invention can be used immediately in clinical practice, and can immediately provide an appropriate therapeutic means for cerebrovascular disease.

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Abstract

　脳梗塞部位の血管障害を回復して脳機能を改善させる脳梗塞治療材を提供する。本発明に係る脳梗塞治療材は、ＣＤ１０５陽性細胞、ＳＰ細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＣＤ２７１陽性細胞及びＣＤ１５０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含む歯髄幹細胞を含有する。歯髄幹細胞の分泌蛋白質を含有することも可能である。移植された歯髄幹細胞は、神経前駆細胞又は神経細胞に直接分化せず、間接的に分化促進に関与して、脳梗塞部位を解消させて正常部位に治癒させる。

Description

脳梗塞治療材及び脳組織再生方法
　本発明は、脳梗塞治療材、及び、その脳梗塞治療材を使用する脳組織再生方法に関する。
　脳血管障害は我が国の死亡原因の第２位を占め、死亡しなくても寝たきりになる最も大きな原因となる。そのため、高齢化社会において、脳血管障害に対する適切な治療法の開発は急務である。
　脳血管障害の中で脳梗塞・脳血栓等の虚血性脳血管障害は最も頻度が高く、脳梗塞で死亡する率は心筋梗塞と虚血性心疾患との合計より多い。
　現在のところ、麻痺した原因が脳梗塞であれば最新治療が有効なのは発症後３時間以内といわれる。
　そして、ｒｔＰａ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｔｉｓｓｕｅ　ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ）点滴静注治療は、再開通効果を期待でき、障害が発生した脳機能のうち約３０％まで機能回復する。
　しかしながら、ｒｔＰａ点滴静注治療は、脳内出血の副作用のため約２％しか使えないという欠点がある。
　また、カテーテルを用いた血栓溶解療法は厚生省に認可されたが、保険で通ったこれに用いる薬はないのが現状である。
　成体脳では新生ニューロンを産生する場所が、側脳室下帯と海馬歯状回の顆粒細胞層とに存在すると言われている。
　また、脳梗塞後に生じる新しいニューロンは側脳室下帯由来であり、線条体の実質へ遊走し、鎖状細胞凝集体を形成し、線条体の神経に分化しシナプスを形成する。
　また、血管は神経前駆細胞の分化制御に関わり、誘導される線条体の神経再生は血管に影響されると言われている。
　脳梗塞に対して再生医療による治療法開発が進められ、ラット又はマウス脳梗塞モデルを用いた前臨床実験が行われている。
　移植細胞としては骨髄、末梢血、脂肪又は臍帯血等に由来する幹細胞が使われている。また、胎生神経幹細胞又はＥＳ細胞等が使われている。これらの細胞は、脳内又は静脈内に注入している。
　その結果、神経に直接分化して、脳梗塞部を減少させ、脳機能が回復されることもあるし、また梗塞周辺部の血管新生を促進することもある。
　例えば、特許文献１には、脳梗塞により生じた神経損傷部位の治療等に重要な神経幹細胞を、インビトロ又はインビボで効率良く増殖誘導する方法が記載されている。
　また、例えば、特許文献２には、間葉系幹細胞とＩＧＦ−１とを組み合わせてなる脳梗塞部位の医療薬が記載されている。
　しかしながら、これらの技術では効率的な脳梗塞部位の機能回復は困難であり、脳梗塞部位の血管障害を回復して脳機能を改善させる実効的な手法が求められる。
特開２００７−１３００２６号公報 特開２００７−０１４７８０号公報
　本発明は、このような課題に鑑みなされたものであり、実効的に、脳梗塞部位の血管障害を回復して脳機能を改善させる脳梗塞治療材、及び、そのような脳梗塞治療材を用いる脳組織再生方法を提供することを目的とする。
　上記目的を達成するため、この発明の第１の観点に係る脳梗塞治療材は、ＣＤ１０５陽性細胞、ＳＰ細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＣＤ２７１陽性細胞及びＣＤ１５０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含む歯髄幹細胞並びに前記歯髄幹細胞の分泌蛋白質のうち少なくとも何れか一つを含むことを特徴とする。
　前記ＳＰ細胞が、ＣＤ３１陰性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１３３陽性、ＣＤ２７１陽性又はＣＤ１５０陽性の何れかであることが好ましい。
　前記歯髄幹細胞が、脳梗塞周囲部で、細胞遊走因子、細胞増殖因子、血管新生因子及び神経栄養因子のうち少なくとも何れか一つを含む因子を発現することが好ましい。
　前記細胞遊走因子が、ＳＤＦ１、ＧＣＳＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ及びＧＭＣＳＦのうち少なくとも何れか一つであることが好ましい。
　前記神経栄養因子が、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＬＩＦ、ＭＹＣ、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｅ３、ＴＰ５３及びＢＡＸのうち少なくとも何れか一つであることが好ましい。
　前記細胞増殖因子が、ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦの少なくとも何れか一つであることが好ましい。
　前記血管新生因子が、ＰＧＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、ＡＮＰＥＰ、ＮＲＰ１、ＴＧＦβ、ＥＣＧＦ１、ＩＤ１及びＣＳＦ３のうち少なくとも何れか一つであることが好ましい。
　前記歯髄幹細胞の濃度が、１×１０５セル／μｌ以上１×１０７セル／μｌ以下であることが好ましい。
　前記歯髄幹細胞は、永久歯又は乳歯由来の歯髄幹細胞であることが好ましい。
　また、上記目的を達成するため、この発明の第２の観点に係る脳組織再生方法は、脳梗塞後、脳線条体に、ＣＤ１０５陽性細胞、ＳＰ細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＣＤ２７１陽性細胞及びＣＤ１５０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含む歯髄幹細胞並びに前記歯髄幹細胞の分泌蛋白質のうち少なくとも何れか一つを注入することで、脳中枢神経組織を再生し、脳機能を回復させることを特徴とする。
　前記ＳＰ細胞が、ＣＤ３１陰性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１３３陽性、ＣＤ２７１陽性又はＣＤ１５０陽性の何れかであることが好ましい。
　前記歯髄幹細胞が、脳梗塞周囲部で、細胞遊走因子、細胞増殖因子、血管新生因子及び神経栄養因子のうち少なくとも何れか一つを含む因子を発現していることが好ましい。
　前記歯髄幹細胞の濃度が、１×１０５セル／μｌ以上１×１０７セル／μｌ以下であることが好ましい。
　前記歯髄幹細胞は、永久歯又は乳歯由来の歯髄幹細胞であることが好ましい。
　本発明に係る脳梗塞治療材及び脳組織再生方法は、従来にはなかった独創的で新規な脳梗塞治療材及び脳組織再生方法であり、実効的に、脳梗塞部位の血管障害を回復して脳機能を改善させる。これにより脳卒中等の脳障害症状を極めて実効的に改善することができ、高齢化社会における人命救助に大きく貢献し、計り知れない利益が得られる。
　図１Ａは、脳線条体への細胞移植を説明する図である。
　図１Ｂは、脳割断面のマクロ像である。
　図２Ａは、脳梗塞周辺部の凍結切片をＤＣＸで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図であり、脳梗塞２４時間後にブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植して２１日目のものである。
　図２Ｂは、脳梗塞部位の反対側である正常脳の部位の凍結切片をＤＣＸで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図である。
　図２Ｃは、脳梗塞周辺部の、細胞を移植していないＰＢＳコントロールをＤＣＸで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図である。
　図３Ａは、脳梗塞周辺部の凍結切片をニューロフィラメントで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図であり、脳梗塞２４時間後にブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植して２１日目のものである。
　図３Ｂは、脳梗塞部位の反対側である正常脳の部位の凍結切片をニューロフィラメントで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図である。
　図３Ｃは、脳梗塞周辺部の、細胞を移植していないＰＢＳコントロールをニューロフィラメントで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図である。
　図４Ａは、脳梗塞周辺部の凍結切片をＮｅｕＮで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図であり、脳梗塞２４時間後にブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植して２１日目のものである。
　図４Ｂは、脳梗塞部位の反対側である正常脳の部位の凍結切片をＮｅｕＮで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図である。
　図４Ｃは、脳梗塞周辺部の、細胞を移植していないＰＢＳコントロールをＮｅｕＮで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図である。
　図５は、脳梗塞２４時間後にブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植して２１日目における、神経前駆細胞の密度の統計学的解析を示す図である。
　図６は、脳梗塞２４時間後にブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植して２１日目における、神経細胞の密度の統計学的解析を示す図である。
　図７Ａは、脳梗塞部にブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植した場合における、ＶＥＧＦ　ｍＲＮＡの発現を示す図である。
　図７Ｂは、脳梗塞部にブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植した場合における、ＧＤＮＦ　ｍＲＮＡの発現を示す図である。
　図７Ｃは、脳梗塞部にブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植した場合における、ＢＤＮＦ　ｍＲＮＡの発現を示す図である。
　図７Ｄは、脳梗塞部にブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植した場合における、ＮＧＦ　ｍＲＮＡの発現を示す図である。
　図８Ａは、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植した場合における、脳梗塞周辺部に遊走してきた移植細胞のＶＥＧＦ　ｍＲＮＡ発現上昇を示す図である。
　図８Ｂは、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
　図９は、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞の培養上清の神経前駆細胞に対する遊走効果を示す図である。
　図１０は、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞の培養上清の神経前駆細胞に対する増殖効果を示す図である。
　図１１は、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞の培養上清の神経前駆細胞に対するアポトーシス抑制効果を示す図である。
　図１２は、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を脳梗塞ラットに移植した場合において、運動麻痺スコアを経時的に算定し、統計学的な解析を示す図である。
　図１３は、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞、ブタ骨髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞、及び、ブタ脂肪組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を、夫々、脳梗塞ラットに移植した場合において、運動麻痺スコアを経時的に算定し、統計学的な解析を示す図である。
　図１４Ａは、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の血管への分化誘導を示す図である。
　図１４Ｂは、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の脂肪への分化誘導を示す図である。
　図１４Ｃは、脂肪への分化誘導がないコントロールの結果を示す図である。
　図１４Ｄは、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　ＲＴ−ＰＣＲによる脂肪への分化誘導の測定結果を示す図である。
　図１４Ｅは、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の象牙芽細胞への分化誘導を示す図である。
　図１４Ｆは、象牙芽細胞への分化誘導がないコントロールの結果を示す図である。
　図１４Ｇは、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　ＲＴ−ＰＣＲによる象牙芽細胞への分化誘導の測定結果を示す図である。
　図１５Ａは、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞のｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ形成を示すものである。
　図１５Ｂは、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の神経分化能を示すものである。
　図１５Ｃは、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞のｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ形成を示すものである。
　図１５Ｄは、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の神経分化能を示すものである。
　図１６は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の培養上清の神経前駆細胞に対する遊走効果を説明する図である。
　図１７は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の培養上清の神経前駆細胞に対する増殖効果を説明する図である。
　図１８は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の神経前駆細胞に対するアポトーシス抑制効果を示す図である。
　図１９は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞を脳梗塞２４時間後に脳組織内線条体に細胞移植した２１日目において、ＤＣＸで免疫染色し、脳梗塞周辺部の神経前駆細胞の密度を統計学的解析した図である。
　図２０は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞を脳梗塞２４時間後に脳組織内線条体に細胞移植した２１日目において、ＮｅｕＮで免疫蛍光染色し、脳梗塞周辺部の神経細胞の密度を統計学的解析した図である。
　図２１は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を脳梗塞２４時間後に脳組織内線条体に細胞移植した２１日目において、ＤＣＸで免疫染色し、脳梗塞周辺部の神経前駆細胞の密度を統計学的解析した図である。
　図２２は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を脳梗塞２４時間後に脳組織内線条体に細胞移植した２１日目において、ＮｅｕＮで免疫染色し、脳梗塞周辺部の神経細胞の密度を統計学的解析した図である。
　図２３は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を脳梗塞ラットに移植後、運動麻痺スコアを経時的に算定し、統計学的な解析を示す図である。
　（脳梗塞治療材）
　本実施形態に係る脳梗塞治療材は、歯髄幹細胞、歯髄幹細胞の分泌蛋白質、又はこれらの混合物を含有する。
　本発明者は、歯髄幹細胞、又は、歯髄幹細胞の分泌蛋白質を脳梗塞部位に移植することにより、脳梗塞部位周辺の神経前駆細胞及び神経幹細胞の分化促進に間接的に寄与するという、従来には全く見られなかった独創的な新知見に基づいて、本発明を完成させた。
　歯髄幹細胞は、例えば骨髄幹細胞及び脂肪幹細胞等の他の幹細胞よりも、脳梗塞部位を解消させる点において有利である。
　歯髄組織は、例えば骨髄組織及び脂肪組織と比較して、幹細胞の含有率が高く、幹細胞の分取が容易である。例えば、ＳＰ細胞の比較では、ブタ歯髄組織：ブタ骨髄組織：ブタ脂肪組織＝３％：０．３％：１．３％である。また、ＶＥＧＦＲ２陽性細胞の比較では、ブタ歯髄組織：ブタ骨髄組織：ブタ脂肪組織＝８７％：４３％：４６％である。
　また、歯髄幹細胞は、例えば骨髄幹細胞よりも増殖率が高いという点において利点がある。例えば、ブタ歯髄幹細胞は、ブタ骨髄幹細胞よりも、ＳＰ細胞継代時間の差が約２倍である。
　また、歯髄幹細胞は、例えば骨髄幹細胞及び脂肪幹細胞と比較して、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＭＰ３、ＶＥＧＦ等の血管誘導因子を多く発現するという点において利点がある。例えば、ＣＤ１０５陽性のｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　ＲＴ−ＰＣＲでは、イヌ歯髄幹細胞は、イヌ脂肪幹細胞よりも、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦにおいて、夫々、∞倍、３．８倍、３．６倍多く発現する。
　また、歯髄幹細胞は、例えば骨髄幹細胞、大動脈幹細胞及び脂肪幹細胞よりも、試験管内マトリジェル上で管状構造を形成しやすい。
　また、歯髄幹細胞は、例えば骨髄幹細胞及び脂肪幹細胞よりも、血流を有意に回復し、血管新生を有意に促進する点において利点がある。例えば、下肢虚血マウスに移植すると、ブタ歯髄幹細胞は、ブタ骨髄幹細胞及びブタ脂肪幹細胞よりも、有意に血管を新生する。
　また、歯髄幹細胞は、例えば骨髄幹細胞及び脂肪幹細胞と比較して、ＢＤＮＦ、ＮＰＹ、ＴＧＦＢ１及びＴＧＦＢ３等の神経誘導因子を多く発現するという点において利点がある。例えば、ＢＤＮＦにおいて、歯髄幹細胞は、骨髄幹細胞より１９倍多く発現し、脂肪幹細胞より２倍多く発現する。また、ＮＰＹにおいて、歯髄幹細胞は、骨髄幹細胞より７倍多く発現し、脂肪幹細胞より９倍多く発現する。
　また、骨髄幹細胞は、骨髄穿刺の負担が大きいうえに、加齢に伴い幹細胞数が減少する点において不利である。脂肪幹細胞は、幹細胞を得るまでの採取量が多量であるため、採取効率が悪い。臍帯血幹細胞は、幹細胞の存在頻度が低いうえに、分娩から細胞採取までの時間及び臍帯血量に影響を受けやすく、安定して幹細胞を採取することができない点において不利である。ＥＳ細胞は、倫理的及び社会的問題があるうえに、安全性にも問題がある。胎生由来の神経幹細胞においても、倫理的及び社会的問題があるうえに、安全性にも問題がある。
　それに対して、歯髄幹細胞は、智歯及び乳歯は採取に際して人体への侵襲性が少なく、医療廃棄物であるため倫理的問題は少なく、入手時期が限定されることもなく、採取において特別な器具及び技術を必要とせず、本明細書において示されるように高い増殖能及び多分化能を有する点において、他の幹細胞よりも有利である。
　歯髄幹細胞は形質を維持したまま凍結保存が可能であり、骨髄幹細胞と比べて、Ｔ細胞の同種反応を抑制する免疫抑制活性が非常に高い。
　歯髄幹細胞は、ＣＤ１０５陽性細胞、ＳＰ細胞、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＣＤ２７１陽性細胞及びＣＤ１５０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含む。
　ＳＰ細胞とは、Ｇｏｏｄｅｌｌら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．ｖｏｌ．１８３，１９９６年）によって発見された未分化細胞であり、フローサイトメトリーでの解析でＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２という蛍光色素を細胞に取り込ませてＵＶで励起すると４０５ｎｍ及び６００ｎｍに蛍光を発する通常の細胞（未分化細胞以外の細胞）からサイトグラム上は異なった位置（左横下の蛍光の暗い部分、すなわち、“Ｈｏｅｃｈｓｔ　Ｂｌｕｅ弱陽性かつＨｏｅｃｈｓｔ　Ｒｅｄ弱陽性”）に出現する細胞集団のことである。
　ＳＰ細胞は、ＣＤ３１陰性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１３３陽性、ＣＤ２７１陽性又はＣＤ１５０陽性の何れかである。
　歯髄幹細胞は、脳梗塞周囲部で、細胞遊走因子、細胞増殖因子、血管新生因子又は神経栄養因子を発現する。
　細胞遊走因子は、ＳＤＦ１、ＧＣＳＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ及びＧＭＣＳＦのうち少なくとも何れか一つである。
　神経栄養因子は、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＬＩＦ、ＭＹＣ、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｅ３、ＴＰ５３及びＢＡＸのうち少なくとも何れか一つである。
　細胞増殖因子は、ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦのうち少なくとも何れか一つである。
　血管新生因子は、ＰＧＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、ＡＮＰＥＰ、ＮＲＰ１、ＴＧＦβ、ＥＣＧＦ１、ＩＤ１及びＣＳＦ３のうち少なくとも何れか一つである。
　脳梗塞治療材に含有される歯髄幹細胞の濃度は、特に限定されるものではないが、例えば１×１０５セル／μｌ以上１×１０７セル／μｌ以下とすることが好ましい。歯髄幹細胞の濃度が１×１０５セル／μｌより小さいと、神経前駆細胞及び神経細胞の分化促進に対する寄与が小さくなる可能性がありうる。一方、歯髄幹細胞の濃度が１×１０７セル／μｌより大きいと、不要な歯髄幹細胞を脳梗塞部位に移植する可能性があり得るからである。
　歯髄幹細胞は、脳機能改善の治療を受ける対象動物自身から抽出した細胞（自家細胞）でもよいし、また、脳機能改善の治療を受ける対象動物以外の動物から抽出した細胞（他家細胞、異種細胞）でもよい。
　歯髄幹細胞は、永久歯又は乳歯由来のものを使用することができる。特に、ヒト乳歯由来の歯髄細胞には、ＣＤ１０５＋が約３０％と多く含まれ、（ヒト永久歯由来ＣＤ３１−ＳＰ細胞ではＣＤ１０５＋は約２０％）、乳歯由来の歯髄幹細胞あるいは歯髄細胞は永久歯由来の歯髄幹細胞と同様に、試験管内血管誘導、下肢虚血部位での血流回復、血管新生促進効果を示す。また、ＣＤ１５０＋は乳歯歯髄細胞に０．５％含まれ、永久歯ＣＤ３１−ＳＰ細胞の０．２％より多い。乳歯由来の歯髄細胞は永久歯由来歯髄細胞よりも試験管内血管誘導、下肢虚血部位での血流回復・血管新生促進効果が高い。
　本実施形態に係る脳梗塞治療材は、歯髄幹細胞のみならず、歯髄幹細胞の分泌蛋白質を含むものでもよい。
　ここで、分泌蛋白質とは、細胞外に分泌される蛋白質である。分泌蛋白質は、Ｎ末端に分泌シグナルペプチドと呼ばれる配列を持っている。
　（脳組織再生方法）
　本実施形態に係る脳組織再生方法は、上述した脳梗塞治療材を、脳梗塞後、脳線条体に注入することで、脳中枢神経組織を再生し、脳機能を回復させる。
　脳線条体への注入は、特に限定されるものではないが、例えば、頭頂骨の一部に穴を開けて開口することにより、行うことができる。
　ここで、脳梗塞とは、脳の血管がつまったり、細くなったりして、血液の流れが悪くなり、脳の組織が死んでしまうことである。
　脳線条体とは、終脳の皮質下構造である。脳線条体は、運動機能及び意志決定機能等に深く関わり、大脳基底核の主要な構成要素の一つである。
　脳線条体は、新線条体又は腹側線条体のいずれでもよい。新線条体は、背側線条体とも呼ばれ、被穀と尾状核とから構成される。腹側線条体は、側坐核及び嗅結節等を含む。
　脳梗塞治療材は、特に限定されるものではないが、例えば、脳梗塞発生後２４時間以内に脳線条体に注入することができる。
（実施例１）
　本施例では、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ移植によるラット脳梗塞後の神経再生を示す。
　ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットを用いて、中大脳動脈閉鎖術を行い、脳梗塞モデルラットを作成した。
　ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞をＤｉＩにて蛍光ラベルした後、脳梗塞２４時間後に、図１Ａ及び図１Ｂに示されるように、脳組織内の脳線条体の注入部Ｐｉに細胞移植した。なお、コントロールとしては、ＰＢＳを注入したものを用いた。
　図１Ａにおいて、Ｂはｂｒｅｇｍａを示し、それは頭蓋の矢状縫合と冠状縫合との交点である。Ｌ１は６．０ｍｍであり、Ｌ２は１．０ｍｍである。
　図１Ｂは、冠状断マクロ像である。Ｌ３は５．０ｍｍであり、Ｌ４は６．０ｍｍである。ＭＬはミッドラインを示す。
　細胞移植後２１日目に灌流固定し、通法どおりに凍結切片を作製し、神経前駆細胞マーカーのＤＣＸ、神経マーカーのｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ及びＮｅｕＮを用いて、免疫染色を行った。
　図２Ａは、脳梗塞後にＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植し、凍結切片をＤＣＸで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図である。図２Ｂは、脳梗塞部位の反対側である正常脳の部位をＤＣＸで免疫染色したものである。図２Ｃは、脳梗塞後にＰＢＳを注入し、ＤＣＸで免疫染色したものである。
　この脳梗塞モデルラットでは、１か月後、大脳半球の１／４~１／３に梗塞が生じていた。神経前駆細胞のマーカーのＤＣＸで免疫染色（緑色）すると、梗塞部周囲にＤｉＩにて染色（赤色）された移植細胞が集積し、その細胞とＤＣＸ陽性細胞は近接しているものの、重複はみられなかった。脳梗塞部位の反対側及びＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植していない脳梗塞部周囲でも若干の陽性細胞がみられた。
　次に、図３Ａは、脳梗塞後にＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植し、凍結切片をｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図である。図３Ｂは、脳梗塞部位の反対側である正常脳の部位をｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔで免疫染色したものである。図３Ｃは、脳梗塞後にＰＢＳを注入し、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔで免疫染色したものである。
　神経細胞のマーカーのｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔで免疫染色すると、その陽性細胞は脳梗塞周辺部に集積している細胞と近接しているものの、重複はみられなかった。細胞を移植していない脳梗塞周辺部では、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ陽性細胞はごくわずかしかみられなかった。
　次に、図４Ａは、脳梗塞後にＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植し、凍結切片をＮｅｕＮで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図である。図４Ｂは、脳梗塞部位の反対側である正常脳の部位をＮｅｕＮで免疫染色したものである。図４Ｃは、脳梗塞後にＰＢＳを注入し、ＮｅｕＮで免疫染色したものである。
　ＮｅｕＮにおいても、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔと同様に、陽性細胞は脳梗塞周辺部に集積している細胞と近接しているものの重複はみられなかった。また、細胞を移植していない脳梗塞周辺部では陽性細胞はごくわずかしかみられなかった。なお、ＮｅｕＮ染色は、神経細胞核特異的な蛋白質を染色する方法で、未分化の神経幹細胞と分化した神経細胞とを区別する際等に使用される。
　これまで、脳梗塞後には、側脳室下帯由来の神経前駆細胞及び神経幹細胞が線条体の実質へ遊走し、神経に分化しシナプスを形成すると言われていた。ところが、図２Ａ~図２Ｃ、図３Ａ~図３Ｃ、及び、図４Ａ~図４Ｃの結果から明らかなように、ＰＢＳ注入では神経前駆細胞は脳梗塞により線条体に遊走するが神経の分化がみられないこと、また細胞移植した場合、ＤＣＸ、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ、及び、ＮｅｕＮ陽性細胞と重複がみられないことから、移植細胞は神経前駆細胞又は神経細胞に直接分化せず、間接的に分化促進に関与しているということが考えられる。
　次に、脳梗塞全体部を含む領域（幅６ｍｍ）において、１．２ｍｍごとに５枚の連続切片を免疫染色し、移植したＣＤ３１陰性ＳＰ細胞の遊走がみられる脳梗塞部周囲の典型部を２カ所ずつ、１サンプルにつき計１０カ所、ＫＥＹＥＮＣＥ蛍光顕微鏡にて撮影し、Ｄｙｎａｍｉｃ　ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔを用いてＤＣＸ及びＮｅｕＮの蛍光密度を測定することにより神経前駆細胞及び神経細胞密度を統計学的に分析した。
　図５に、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を移植した場合における、神経前駆細胞の密度の統計学的解析を示す。図６に、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を移植した場合における、神経細胞の密度の統計学的解析を示す。
　図５に示されるように、脳梗塞部周囲における神経前駆細胞は細胞移植により、ＰＢＳコントロールと比較して約２倍に増加した。
　また、図６に示されるように、脳梗塞部周囲における神経細胞は細胞移植により、ＰＢＳコントロールと比較して約８倍に増加した。
　このように、ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を脳梗塞部位に移植することにより、脳梗塞周辺部へ神経前駆細胞が遊走し、増殖が促進され、アポトーシスが抑制され、さらに神経細胞への分化が促進されていることが示唆される。
　次に、インサイチューハイブリダイゼーションにより神経栄養因子の発現を検討した。
　図７Ａは、脳梗塞部位周囲におけるＶＥＧＦ　ｍＲＮＡの発現を示す。図７Ｂは、脳梗塞周辺部におけるＧＤＮＦ　ｍＲＮＡの発現を示す。図７Ｃは、脳梗塞周辺部におけるＢＤＮＦ　ｍＲＮＡの発現を示す。図７Ｄは、脳梗塞周辺部におけるＮＧＦｍＲＮＡの発現を示す。図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、及び、図７Ｄに示されるように、移植細胞は脳梗塞周辺部においてＶＥＧＦ　ｍＲＮＡ、ＧＤＮＦ　ｍＲＮＡ、ＢＤＮＦ　ｍＲＮＡ、及び、ＮＧＦ　ｍＲＮＡを強く発現していた。
　また、特にＶＥＧＦに注目して、ブタに特異的に反応するプライマー
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
を用いたＲｅａｌ−ｔｉｍｅ　ＲＴ−ＰＣＲによるＶＥＧＦの発現を検討した。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　ＲＴ−ＰＣＲは、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化したリアルタイムＰＣＲ専用の装置を使用する。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　ＲＴ−ＰＣＲは、ＰＣＲの増幅量をリアルタイムモニターして解析するものであり、電気泳動が不要で迅速性と定量性に優れる。
　図８Ａは、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植した脳梗塞周辺部のＶＥＧＦの発現を示す図であり、図８Ｂは、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　ＲＴ−ＰＣＲによる測定結果を示す図である。図８Ａ及び図８Ｂに示されるように、脳梗塞周辺部では正常のブタの脳の相当部と比べて１０００倍以上のＶＥＧＦ　ｍＲＮＡ発現上昇がみられ、脳梗塞を生じていないところに移植した場合の約２８倍の上昇がみられた。
　このように、ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植することにより、移植細胞から分泌されるＶＥＧＦをはじめとする神経栄養因子により、脳梗塞周辺部の神経前駆細胞及び神経幹細胞の分化が促進されると考えられる。
　次に、培養神経前駆細胞（ＳＨＳＹ５Ｙ　ヒト神経芽腫細胞）を用いて、ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞の培養上清の遊走、増殖、及び、抗アポトーシス効果を検討した。
　図９は、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞の培養上清の遊走効果を示す図である。図９に示されるように、ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞の培養上清の遊走効果は優れていた。
　図１０は、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞の培養上清の増殖効果を示す図である。図１０に示されるように、ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞の培養上清の増殖効果は特に優れていた。
　抗アポトーシス効果は４００ｎＭ　ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅによりアポトーシスを生じさせ、フローサイトメトリーによる壊死細胞及びアポトーシス細胞の割合を測定した。
　図１１は、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞の培養上清のアポトーシス抑制効果を示す図である。図１１に示されるように、ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞の培養上清のアポトーシス抑制効果は優れていた。
　さらに、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を脳梗塞ラットに移植した後、経時的に運動麻痺スコアを算定し、細胞移植による運動感覚機能の回復効果を検討した。
　運動麻痺スコアの算出は、下記に示す方法によった。
１…尻尾を持って持ち上げたとき、麻痺側の上肢を突っ張らない。（１点）
２…麻痺側の下肢を引っ張ると下肢を引っ込めない。（１点）
３…体を麻痺側に倒すとそちらに傾く。（１点）
４…歩行させても歩けない。（１点）
５…直径５０ｃｍの円の中から１０秒以内に歩いて抜け出せない。（１点）　２０秒以内に歩いて抜け出せない。（２点）　３０秒以内に歩いて抜け出せない。（３点）
６−１…麻痺側の上肢に上方向の抵抗を加えると突っ張らない。（１点）
６−２…麻痺側の上肢に前方向の抵抗を加えると突っ張らない。（１点）
６−３…麻痺側の上肢に横方向の抵抗を加えると突っ張らない。（１点）
　図１２は、運動麻痺スコアを経時的に算定し、統計学的な解析を示す図である。日数は、細胞を移植してからの日付である。なお、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。
　図１２に示されるように、細胞移植による運動感覚機能の回復効果をみると、細胞移植をした場合は９日目で運動麻痺のほぼ回復がみられるが、ＰＢＳコントロールではほとんど回復はみられなかった。運動麻痺スコアを経時的に算定し、統計学的な解析を行うと、６日以降で細胞移植群はコントロール群のＰＢＳ注入に比べて有意に運動機能が回復することが明らかとなった。また、ブタ歯髄ｔｏｔａｌ細胞は、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を分取する前の状態の細胞であり、そこにはブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞のみならずその他の細胞も含まれている。ブタ歯髄ｔｏｔａｌ細胞を移植した場合は、ＰＢＳコントロールよりも運動機能は回復しているものの、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植した場合よりも、運動機能の回復は劣る。これより、運動機能の回復は、ブタ歯髄ｔｏｔａｌ細胞を移植するよりも、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞のみを選択して移植するほうが優れていることが判明した。
　また、本発明者は、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞、ブタ歯髄ｔｏｔａｌ細胞、ブタ骨髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞、及び、ブタ脂肪組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を、夫々、比較して、運動麻痺スコアを経時的に算定し、統計学的な解析を行った。図１３に示されるように、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞は、ブタ骨髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞及びブタ脂肪組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞よりも、有意に運動機能が回復することが明らかとなった。従って、歯髄幹細胞が骨髄幹細胞及び脂肪幹細胞よりも脳梗塞の機能改善に有利であることが示唆された。
（実施例２）
　本実施例では、実施例１と異なり、ヒト歯髄組織由来の歯髄細胞を使用する。表１は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−ＳＰ細胞及びブタ歯髄組織由来ＣＤ３１−ＳＰ細胞の性質を示すものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　表１に示すように、フローサイトメトリーにて、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−ＳＰ細胞は、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１−ＳＰ細胞と比較して、ＣＤ９０及びＣＤ１５０を高発現していた。また、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−ＳＰ細胞は、ヒトｔｏｔａｌ歯髄細胞と比較して、ＣＤ１０５を高発現していた。
　本施例では、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞移植による、ラット脳梗塞後の神経再生を示す。
　表２は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の性質を示すものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　表２に示すように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びヒトｔｏｔａｌ歯髄細胞よりも、神経幹細胞のマーカーＣＤ２４及びＣＤ２７１、並びにより未分化な幹細胞マーカーＣＤ１５０を高発現していた。よって、ＣＤ１０５＋細胞はＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びヒトｔｏｔａｌ歯髄細胞よりも神経幹細胞及びより未分化な幹細胞をより多く含むことが示唆される。
　次に、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の特徴を明らかにするために、多分化能を検討した。
　図１４Ａに示されるように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は、血管に誘導された。
　また、図１４Ｂに示されるように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は、脂肪に誘導された。一方、図１４Ｃに示されるように、ＰＢＳコントロールでは、脂肪への誘導は見られなかった。図１４Ｄは、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　ＲＴ−ＰＣＲによる測定結果である。なお、ＰＰＡＲγは脂肪細胞に特異的な分化マーカーである。
　また、図１４Ｅに示されるように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は、象牙芽細胞に誘導された。一方、図１４Ｆに示されるように、ＰＢＳコントロールでは、象牙芽細胞への誘導は見られなかった。図１４Ｇは、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　ＲＴ−ＰＣＲによる測定結果である。なお、Ｄｓｐｐ及びＥｎａｍｅｌｙｓｉｎは象牙芽細胞に特異的な分化マーカーである。
　図１４Ｄ及び図１４Ｇで示したプライマーである、ＰＰＡＲγ、β−アクチン、Ｄｓｐｐ、及び、Ｅｎａｍｅｌｙｓｉｎ（マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）２０）については、表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　次に、図１５Ａに示されるように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞はｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ形成を示した。また、図１５Ｂに示されるように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は神経分化能を有していた。
　また、図１５Ｃに示されるように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞はｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ形成を示した。また、図１５Ｄに示されるように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞は神経分化能を有していた。
　次に、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞につき、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　ＲＴ−ＰＣＲによる神経栄養因子及び幹細胞マーカーの発現を検討し、結果を下記表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　なお、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＧＤＮＦ、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ３、ＶＥＧＦＡ、Ｓｔａｔ３、及び、Ｂｍｉ１のプライマーについては、表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 　ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞はｔｏｔａｌの歯髄細胞に比べてｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ）及びｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＮＧＦ）　ｍＲＮＡの発現が４~５倍と高かった。ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞に比べ、ＢＤＮＦについては約４倍高い発現がみられ、ＮＧＦ　ｍＲＮＡについては約５．６倍の高い発現がみられた。両細胞画分のＶＥＧＦＡ　ｍＲＮＡはｔｏｔａｌの歯髄細胞に比べて４~５倍の発現がみられた。
　一方、ｇｌｉａｌ　ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ）　ｍＲＮＡについては、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞はｔｏｔａｌの歯髄細胞に比べて約４倍の発現の増加がみられた。また、ｇｌｉａｌ　ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ）　ｍＲＮＡにつき、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞に比べ、約１０．２倍の発現の増加がみられた。
　即ち、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞は、ＢＤＮＦ及びＮＧＦを強く発現していることが明らかとなった。また、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は、ＧＤＮＦ　ｍＲＮＡを強く発現していることが明らかとなった。
　幹細胞マーカーであるＳｔａｔ３　ｍＲＮＡについては、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞はヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の約５．８倍強く発現していた。幹細胞マーカーであるＢｍｉ１　ｍＲＮＡについては、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞はヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の約４倍強く発現していた。
　以上より、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の遊走及び増殖促進効果は主にＢＤＮＦ及びＮＧＦによるものであり、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞のそれは主にＧＤＮＦによるものと考えられる。
　次に、培養神経前駆細胞（ＳＨＳＹ５Ｙ　ヒト神経芽腫細胞）を用いて、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の培養上清の遊走、増殖効果、及び、アポトーシス抑制効果を検討した。
　図１６は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の培養上清の遊走促進を説明する図である。図１６に示すように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の上清は、コントロールに比べ有意に遊走を促進した。
　図１７は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の培養上清の増殖促進を説明する図である。図１７に示すように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の上清は、コントロールに比べ有意に増殖を促進した。また、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の培養上清は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の培養上清よりも、２４時間後において有意差を有して増殖を促進しており、更に４８時間後において両者の有意差は顕著なものであった。
　図１８は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞のアポトーシス抑制効果を示す図である。図１８に示すように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の培養上清は、コントロールに比べ有意にアポートシスを抑制した。また、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の培養上清は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の培養上清よりも、より顕著にアポートシスを抑制した。
　次に、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞を、脳梗塞後に脳組織内線条体に細胞移植し、経時的に運動麻痺スコアを算定し、細胞移植による運動機能の回復効果を検討した。
　実施例１と同様に、ＳＤラットを用いて、脳梗塞モデルを作成した。ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びＣＤ１０５＋細胞をＤｉＩにて蛍光ラベルした後、脳梗塞２４時間後に、脳組織内線条体に細胞移植した。
　コントロールとしては、ＰＢＳを注入したものを用いた。脳梗塞２１日後に灌流固定し、通法どおりに凍結切片を作製し、神経前駆細胞マーカーのＤＣＸ及び神経マーカーのＮｅｕＮを用いて免疫染色を行った。更に、細胞移植後、経時的に運動麻痺スコアを算定し、細胞移植による運動感覚機能の回復効果を検討した。
　図１９は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞を脳梗塞後に脳組織内線条体に細胞移植後、２１日目において、ＤＣＸで免疫染色し、神経前駆細胞の密度を統計学的解析した図である。図１９に示すように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞を移植すると、脳梗塞部周囲における神経前駆細胞は細胞移植により約３倍に増加した。
　図２０は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞を脳梗塞後に脳組織内線条体に細胞移植後、２１日目において、ＮｅｕＮで免疫蛍光染色し、神経細胞の密度を統計学的解析した図である。神経細胞は反対側の正常脳の相当部と比較して神経走行は乱れているものの、図２０に示すように、脳梗塞周囲に、ＰＢＳ注入に比べて有意に神経細胞の増加がみられた。
　図２１は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を、別々の脳梗塞ＳＤラットに対し、脳組織内線条体に夫々細胞移植後、２１日目において、ＤＣＸで免疫染色し、神経前駆細胞の密度を統計学的解析して比較した図である。図２１に示すように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞よりも、神経前駆細胞の増殖促進能が顕著であった。
　図２２は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を、別々の脳梗塞ＳＤラットに対し、脳組織内線条体に夫々細胞移植後、２１日目において、ＮｅｕＮで免疫染色し、神経細胞の密度を統計学的解析して比較した図である。図２２に示すように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞よりも、神経細胞の分化促進能が顕著であった。
　よって、ヒト歯髄組織由来の移植細胞は、ブタ歯髄組織由来の移植細胞と同様に、神経前駆細胞又は神経細胞に直接分化せず、間接的に分化促進に関与することが実証された。
　図２３は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を、別々の脳梗塞ＳＤラットに対して移植後、運動麻痺スコアを経時的に算定し、統計学的な解析を比較する図である。日数は、細胞を移植してからの日付である。図２３に示すように、運動麻痺スコアを算定すると、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は、ＰＢＳ注入に比べて、両者ともに、有意な運動麻痺の回復がみられた。
　上述の実施例にて示されたように、歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及び歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞は、細胞遊走能、細胞増殖能、及び、アポートシス抑制能に優れており、また、神経前駆細胞増殖能及び神経細胞の分化促進能に優れている。
　また、上述の実施例にて示されたように、歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は、歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞よりも、細胞増殖能、及び、アポートシス抑制能に優れている。歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞に対する顕著な優位は、予測できるものではなく、本発明者の実験により始めて明らかになったものである。
　更に、歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞は、分取するためにフローサイトメトリーを使用するところ、フローサイトメトリーは他個体に由来する細胞のコンタミネーションの可能性がある。そのため、フローサイトメトリーを使用する分取では、安全性の観点から、臨床では使用できない。一方、歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は、特に限定されるものではないが、例えば免疫磁気ビーズ法にて分取できる。免疫磁気ビーズ法は、チューブの中に試料と免疫磁気ビーズ（細胞の表面抗原に対する抗体に磁気ビーズがついたもの）を入れて反応させ、カラムにサンプルを吸着させ、分離する方法であり、コンタミネーションの危険性がない。そのため、歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞を使用する脳梗塞治療材は、臨床にて即座に使用でき、脳血管障害に対する適切な治療手段を直ちに提供できるという大きな利点を有する。
　本発明に係る脳梗塞治療材は、神経前駆細胞増殖能に優れており、神経細胞の分化促進能にも優れている。また、本発明に係る脳梗塞治療材は、臨床にて即座に使用でき、脳血管障害に対する適切な治療手段を直ちに提供できる。

Claims (14)

  1. ＣＤ１０５陽性細胞、ＳＰ細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＣＤ２７１陽性細胞及びＣＤ１５０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含む歯髄幹細胞並びに前記歯髄幹細胞の分泌蛋白質のうち少なくとも何れか一つを含むことを特徴とする脳梗塞治療材。
  2. 前記ＳＰ細胞が、ＣＤ３１陰性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１３３陽性、ＣＤ２７１陽性又はＣＤ１５０陽性の何れかであることを特徴とする請求項１記載の脳梗塞治療材。
  3. 前記歯髄幹細胞が、脳梗塞周囲部で、細胞遊走因子、細胞増殖因子、血管新生因子及び神経栄養因子のうち少なくとも何れか一つを含む因子を発現することを特徴とする請求項１記載の脳梗塞治療材。
  4. 前記細胞遊走因子が、ＳＤＦ１、ＧＣＳＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ及びＧＭＣＳＦのうち少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項３記載の脳梗塞治療材。
  5. 前記神経栄養因子が、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＬＩＦ、ＭＹＣ、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｅ３、ＴＰ５３及びＢＡＸのうち少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項３記載の脳梗塞治療材。
  6. 前記細胞増殖因子が、ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦの少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項３記載の脳梗塞治療材。
  7. 前記血管新生因子が、ＰＧＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、ＡＮＰＥＰ、ＮＲＰ１、ＴＧＦβ、ＥＣＧＦ１、ＩＤ１及びＣＳＦ３のうち少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項３記載の脳梗塞治療材。
  8. 前記歯髄幹細胞の濃度が、１×１０５セル／μｌ以上１×１０７セル／μｌ以下であることを特徴とする請求項１記載の脳梗塞治療材。
  9. 前記歯髄幹細胞は、永久歯又は乳歯由来の歯髄幹細胞であることを特徴とする請求項１記載の脳梗塞治療材。
  10. 脳梗塞後、脳線条体に、ＣＤ１０５陽性細胞、ＳＰ細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＣＤ２７１陽性細胞及びＣＤ１５０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含む歯髄幹細胞並びに前記歯髄幹細胞の分泌蛋白質のうち少なくとも何れか一つを注入することで、脳中枢神経組織を再生し、脳機能を回復させることを特徴とする脳組織再生方法。
  11. 前記ＳＰ細胞が、ＣＤ３１陰性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１３３陽性、ＣＤ２７１陽性又はＣＤ１５０陽性の何れかであることを特徴とする請求項１０記載の脳組織再生方法。
  12. 前記歯髄幹細胞が、脳梗塞周囲部で、細胞遊走因子、細胞増殖因子、血管新生因子及び神経栄養因子のうち少なくとも何れか一つを含む因子を発現していることを特徴とする請求項１０記載の脳組織再生方法。
  13. 前記歯髄幹細胞の濃度が、１×１０５セル／μｌ以上１×１０７セル／μｌ以下であることを特徴とする請求項１０記載の脳組織再生方法。
  14. 前記歯髄幹細胞は、永久歯又は乳歯由来の歯髄幹細胞であることを特徴とする請求項１０記載の脳組織再生方法。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011118795A1 (ja) * 2010-03-26 2011-09-29 国立大学法人名古屋大学 損傷部治療用組成物
JP2011219432A (ja) * 2010-04-13 2011-11-04 Nagoya Univ 歯髄幹細胞を用いた神経疾患治療用組成物
WO2013005053A3 (en) * 2011-07-06 2013-06-13 Cell Therapy Limited Progenitor cells of mesodermal lineage
JP2014516715A (ja) * 2011-06-03 2014-07-17 メゾブラスト，インコーポレーテッド 脳梗塞の影響を治療する方法
JP2015045612A (ja) * 2013-08-29 2015-03-12 日本メジフィジックス株式会社 線条体ファントム
WO2020130038A1 (ja) * 2018-12-20 2020-06-25 株式会社ジェネシス 再生治療用組成物及び再生治療用組成物の製造方法
WO2024075675A1 (ja) * 2022-10-03 2024-04-11 キッズウェル・バイオ株式会社 新規な歯髄幹細胞集団
WO2024075145A1 (ja) * 2022-10-03 2024-04-11 キッズウェル・バイオ株式会社 新規な歯髄幹細胞集団

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8470308B2 (en) * 2009-01-03 2013-06-25 Ray C. Wasielewski Enhanced medical implant comprising disrupted tooth pulp and tooth particles
US10328103B2 (en) 2009-01-03 2019-06-25 Ray C. Wasielewski Medical treatment composition comprising mammalian dental pulp stem cells
SG11201404603SA (en) * 2012-02-10 2014-10-30 Japanic Corp Cosmetic product or skin regeneration promoter comprising nonhuman stem cell culture supernatant as starting material, and method for ion introduction for protein
US11278574B2 (en) * 2013-03-15 2022-03-22 Avita International Ltd. Use of stem cells expressing mesenchymal and neuronal markers and compositions thereof to treat neurological disease
US20190167724A1 (en) * 2017-12-04 2019-06-06 Caire Medical-Biotechnology International Co. Neuroprotective composition, preparation process thereof and medical uses thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007130026A (ja) 2002-03-27 2007-05-31 Institute Of Gene & Brain Science 神経幹細胞の増殖誘導方法
ATE511753T1 (de) * 2003-04-19 2011-06-15 Us Gov Health & Human Serv Postnatale stammzellen und deren verwendungen
JP2007014780A (ja) 2005-07-07 2007-01-25 National Cardiovascular Center 間葉系幹細胞及びインスリン様成長因子−１（ｉｇｆ−１）を用いた新規疾患治療法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MASAHIKO SUGIYAMA ET AL.: "Shizui CD31 Insei SP Saibo no Shizui Oyobi No Soshiki ni Okeru Shinkei'Kekkan Saisei ni Taisuru Koka no Kento", NIPPON SHIKA HOZON GAKKAI GAKUJUTSU TAIKAI PROGRAM OYOBI KOEN SHOROKUSHU, NEN 5 GATSU, vol. 128, 2008, pages 49 *
MASAHIKO SUGIYAMA ET AL.: "Shizui Yurai CD31-SP Saibo no Nokyoketsu Shikkan Chiryo ni Taisuru Yukosei no Kento", REGENERATIVE MEDICINE, NEN 2 GATSU, vol. 7, 2008, pages 255 *

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103037872B (zh) * 2010-03-26 2015-12-02 国立大学法人名古屋大学 损伤部位治疗用组合物
CN103037872A (zh) * 2010-03-26 2013-04-10 国立大学法人名古屋大学 损伤部位治疗用组合物
US11135243B2 (en) 2010-03-26 2021-10-05 Shed Tech Corporation Composition for treatment of damaged part
JPWO2011118795A1 (ja) * 2010-03-26 2013-07-04 国立大学法人名古屋大学 損傷部治療用組成物
WO2011118795A1 (ja) * 2010-03-26 2011-09-29 国立大学法人名古屋大学 損傷部治療用組成物
JP2011219432A (ja) * 2010-04-13 2011-11-04 Nagoya Univ 歯髄幹細胞を用いた神経疾患治療用組成物
US20160361362A1 (en) * 2011-06-03 2016-12-15 Central Adelaide Local Health Network Inc Method of treating the effects of stroke
JP2014516715A (ja) * 2011-06-03 2014-07-17 メゾブラスト，インコーポレーテッド 脳梗塞の影響を治療する方法
EA029577B1 (ru) * 2011-07-06 2018-04-30 Селл Терапи Лимитед Клетки-предшественники мезодермальной линии
US10472609B2 (en) 2011-07-06 2019-11-12 Cell Therapy Limited Progenitor cells of mesodermal lineage
US10829739B2 (en) 2011-07-06 2020-11-10 Cell Therapy Limited Progenitor cells of mesodermal lineage
WO2013005053A3 (en) * 2011-07-06 2013-06-13 Cell Therapy Limited Progenitor cells of mesodermal lineage
US11873513B2 (en) 2011-07-06 2024-01-16 Cell Therapy Limited Progenitor cells of mesodermal lineage
JP2015045612A (ja) * 2013-08-29 2015-03-12 日本メジフィジックス株式会社 線条体ファントム
WO2020130038A1 (ja) * 2018-12-20 2020-06-25 株式会社ジェネシス 再生治療用組成物及び再生治療用組成物の製造方法
JPWO2020130038A1 (ja) * 2018-12-20 2021-02-15 株式会社ジェネシス 再生治療用組成物の製造方法
WO2024075675A1 (ja) * 2022-10-03 2024-04-11 キッズウェル・バイオ株式会社 新規な歯髄幹細胞集団
WO2024075145A1 (ja) * 2022-10-03 2024-04-11 キッズウェル・バイオ株式会社 新規な歯髄幹細胞集団

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