CN112708598A - 无血清成分的神经前体细胞培养基及其配制方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种无血清成分的神经前体细胞培养基及其配制方法和应用，所述无血清成分的神经前体细胞培养基包括DMEM/F12培养基、非必需氨基酸、人碱性成纤维细胞生长因子、肝素、胰岛素、全铁转铁蛋白、黄体酮和腐胺。使用所述的无血清成分的神经前体细胞培养基对间充质干细胞(MSC)进行培养，可以提高间充质干细胞分化成神经前体细胞的效率，提高神经前体细胞的产量。

Description

无血清成分的神经前体细胞培养基及其配制方法和应用
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种无血清成分的神经前体细胞培养基及其配制方法和应用。
背景技术
中枢神经系统损伤或发育不良会引起神经细胞凋亡、神经组织缺损、运动及思维等能力缺陷，最终导致终身残疾甚至寿命缩短。中枢神经系统自我修复能力极低，治疗此类疾病需要使用细胞替代疗法，对凋亡缺损的神经细胞和组织进行补充，进而恢复神经系统的功能。
神经前体细胞(Neural precursor cells，NPCs)在神经系统发育和神经损伤修复过程中起重要作用，成体神经损伤修复困难与NPCs缺乏或沉默有关。既往的研究表明，移植同种异体NPCs能缓解帕金森、多发性硬化、脑胶质瘤等疾病，能促进神经退行性疾病、外伤等轴突损伤髓鞘新生和修复，缓解临床症状，但存在免疫排斥反应，嵌合率低，自体NPCs移植的医疗前景更令人期待。成体NPCs的分离依赖于组织学部位，一般成年人体内很难取材，而流产胎儿脑组织分离NPCs又受到伦理学限制，样本资源成为限制NPCs研究和应用的瓶颈。近些年来，对干细胞分化机制的研究取得了很大进展，发现胚胎干细胞和多种成体干细胞有神经前体细胞分化潜能，为神经前体细胞制备提供了新的思路。间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)是样本资源最丰富的成体干细胞，是基于干细胞再生医学的最有前景的种子细胞。脂肪、脐带、骨髓等多种组织来源的间充质干细胞能分化成Netstin阳性神经前体细胞，具有神经元、神经胶质细胞等的分化潜能。
目前促进间充质干细胞分化为神经前体细胞主要通过在细胞培养基中添加一些刺激分化的物质。向培养基中添加的物质按照类别主要分为以下几种：(1)化学诱导剂，如β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚、3-叔丁基-4-羟基茴香醚、维甲酸等；(2)细胞生长因子，如NGF、EGF、bFGF、低浓度TNF-α等；(3)同时添加化学诱导剂与生长因子；(4)其他，如创伤性脑组织匀浆、脑组织上清液、脱细胞神经移植物、传统中药(如黄芩苷、红景天苷、川芎嗪、丹参、天麻、人参)等。理想的用来做移植用的神经前体细胞应具有创伤小、易于获得、易于体外扩增、不涉及免疫排斥致瘤性及伦理学问题的特点。而使用添加了化学诱导剂的培养基虽可以快速诱导生成神经样细胞，但存在细胞活力差，平均4天出现死亡或凋亡。使用添加了细胞生长因子的培养基存在诱导效率低下，诱导周期长，且存活时间短等缺陷，甚至有些文献认为神经因子诱导法生成的神经样细胞，仅仅形态上像神经细胞，而不具备神经细胞的功能；使用同时添加化学诱导剂与生长因子的培养基仍不能避免上述缺陷。使用添加各种细胞和脑组织液的培养基存在细胞采集复杂或异体异种蛋白产生免疫排斥及传播疾病的缺点。
综上，使用上述培养基均存在一些缺点，包括效率低、耗时长、系统重复性较差或者细胞诱导后活性不良、所得细胞不纯等，最终不能获得功能细胞。因此，本领域还有必要开发改进的神经前体细胞培养基，来提高分化效率、提高神经前体细胞的产量。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种无血清成分的神经前体细胞培养基及其配制方法和应用，所述无血清成分的神经前体细胞培养基包括DMEM/F12培养基、非必需氨基酸、人碱性成纤维细胞生长因子、肝素、胰岛素、全铁转铁蛋白、黄体酮和腐胺。使用所述的无血清成分的神经前体细胞培养基对间充质干细胞进行培养，可以提高间充质干细胞分化成神经前体细胞的效率，提高神经前体细胞的产量。
本发明提供一种无血清成分的神经前体细胞培养基，包括以下成分：DMEM/F12培养基，非必需氨基酸，人碱性成纤维细胞生长因子，肝素，胰岛素，全铁转铁蛋白，黄体酮，腐胺。
进一步的，所述非必需氨基酸的含量为0.1～5％(体积比)，即占总容量的0.1～5％；所述人碱性成纤维细胞生长因子的浓度为0.5～50ng/mL；所述肝素的浓度为20～200ng/mL；所述胰岛素的浓度为0.1～10μg/mL；所述全铁转铁蛋白的浓度为2～100μg/mL；所述黄体酮的浓度为1～10ng/mL；所述腐胺的浓度为5～200μg/mL。
本发明还提供所述的无血清成分的神经前体细胞培养基的配制方法，包括如下步骤：
(1)向DMEM/F12培养基中加入非必需氨基酸和腐胺，得到第一储液；
(2)向第一储液中加入肝素、胰岛素、全铁转铁蛋白和黄体酮，得到第二储液；
(3)向第二储液中加入人碱性成纤维细胞生长因子，进行无菌过滤，得到所述无血清成分的神经前体细胞培养基。
本发明还提供一种诱导神经前体细胞的方法，包括如下步骤：
(1)分离间充质干细胞，原代培养；
(2)将原代培养后的间充质干细胞置于细胞培养器皿中，添加细胞培养基，进行第一次传代培养，所述细胞培养基为间充质干细胞基础培养基；所述基础培养基成分为MEM-α中添加10％胎牛血清；
(3)将第一次传代培养后的间充质干细胞置于细胞培养器皿中，添加所述的无血清成分的神经前体细胞培养基进行第二次传代培养；
(4)静置培养，分离得到神经前体细胞。
进一步的，所述步骤(1)中所述的间充质干细胞来源于人类。来源于人类的间充质干细胞用于获得人神经前体细胞，可应用于人神经性疾病的治疗。
进一步的，所述间充质干细胞来源包括骨髓、脐血、脐带、胎盘和脂肪组织。所述组织都是人体容易获取间充质干细胞的组织。
进一步的，所述步骤(3)中所述的间充质干细胞起始密度为0.5×104/cm2～3.0×104/cm2。
进一步的，所述步骤(3)所述的间充质干细胞起始密度为2×104/cm2。此起始密度获得的神经前体细胞产量更高。
进一步的，所述步骤(4)中所述的静置培养的时间为18～54小时。
进一步的，所述步骤(4)中所述的静置培养的时间为48小时。此培养时间获得的神经前体细胞产量更高。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
1.使用本发明的无血清成分的神经前体细胞培养基获得的神经前体细胞的阳性率更高，产量更高。
2.本发明的无血清成分的神经前体细胞培养基中不添加化学诱导剂，使得产物更纯，且无有毒物质的掺入，安全性更高。
3.本发明的无血清成分的神经前体细胞培养基不含任何动物源性或人血液源性成分，避免了动物病原体或血液来源病原体的污染风险。
4.本发明的无血清成分的神经前体细胞培养基的化学成分完全清晰，确保了每批次培养基质量高度均一可控，大大提升了细胞培养结果的稳定性和可预见性。
5.经过了配方的对比摸索，选定了“肝素+人碱性成纤维细胞生长因子”的组合，显著降低了人碱性成纤维细胞生长因子的所需浓度，在维持培养基效力的同时，显著降低了成本。
6.本发明的无血清成分的神经前体细胞培养基的使用方法得到的神经前体细胞可以用于治疗各类神经损伤性疾病。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为4种培养基在4种培养条件下神经前体细胞收获量对比。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
使用含血清的培养基培养MSC细胞，Nestin阳性的神经前体细胞比例较低，但本发明使用无血清成分的培养基培养MSC细胞，Nestin阳性神经前体细胞比例显著提升。Nestin是一种中间丝类型的蛋白，能够特异性的表达在神经上皮干细胞上一种分子标记物，可能对神经元的分化有作用。Nestin仅在胚胎发育早期的神经上皮表达，出生后表达就停止，一般被视为神经干细胞的特征性标志物。故使用无血清成分的培养基培养MSC细胞获得的神经前体细胞Nestin阳性率显著增加说明本发明的方法通过改变细胞培养基的成分，采用无血清成分、无动物源性的神经前体细胞培养基能够提高间充质干细胞分化成神经前体细胞的效率，提高神经前体细胞的产量。
血清中(如胎牛血清)含有骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)、转化生长因子-β(Transforming growth factor-beta，TGF-β)等蛋白组分，这些组分具有抑制干细胞神经分化的特性，常规MSC培养手段往往使用10％或更高浓度的胎牛血清，很可能抑制了Nestin阳性神经前体细胞的产生。而本发明使用无血清成分的培养基，去除了血清成分，完全避免了MSC暴露在BMP和TGF-β的影响之下，同时无血清培养基添加了人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，有助于神经前体细胞的增殖维护，这些因素共同促进了MSC分化为神经前体细胞，并提高神经前体细胞的产量。
本发明的无血清成分的神经前体细胞培养基的配制方法，包括如下步骤：
(1)准备适量的DMEM/F12培养基，并加入非必需氨基酸和腐胺，得到第一储液，在2～8℃有效期为45天。
(2)在开始细胞培养前，向适量的第一储液中加入肝素、胰岛素、全铁转铁蛋白和黄体酮，得到第二储液，在2～8℃有效期为15天。
(3)在开始细胞培养前，向适量的第二储液加入人碱性成纤维细胞生长因子，并使用0.22μm过滤薄膜进行无菌过滤，得到完整培养基，可用于细胞培养，在2～8℃有效期为3天。
本发明的无血清成分的神经前体细胞培养基的使用方法，包括如下步骤：
培养时，以100mm培养皿和6孔板为例，100mm培养皿使用10mL培养基，每48小时更换一次，6孔板每孔使用2mL培养基，每48小时更换一次。
实施例1无血清成分的神经前体细胞培养基在诱导神经前体细胞中的应用
包括如下步骤：
(1)原代MSC培养
1mL健康成人骨髓原液以9mL MSC基础培养基稀释后，MSC也可以取自人的脐血、脐带、胎盘和脂肪组织，在100mm直径圆形培养皿培养3天后，移除所有培养基，换入10mL新的MSC基础培养基。此阶段MSC定义为P0。P0 MSC以MSC基础培养基再培养10天，每2天换液一次，每次10mL。MSC基础培养基成分为MEM-α(Minimum Essential Medium AlphaModification)+10％胎牛血清。
(2)第一次传代培养
P0 MSC培养10天后，以TrypLE Express消化、收集，再以1:3比例传代至100mm直径圆形培养皿。这些MSC定义为P1，以10mL MSC基础培养基培养2天。
(3)第二次传代培养
P1 MSC培养2天后，以TrypLE Express消化、收集，再以2×104个细胞/cm2的接种密度，传代至聚苯乙烯6孔细胞培养板，这些MSC定义为P2，每孔分别加入2mL不同的对照组和实验组培养基。对照组培养基为添加了胎牛血清的基础培养基，培养基配方如表1所示；实验组共3组，均为无血清培养基，培养基配方分别如表2、3、4所示。对照组和3组实验组的每一组又分别设置MSC起始浓度不同的组别，起始浓度为0.5×104/cm2～3.0×104/cm2，分别选择1×104/cm2和2×104/cm2的起始浓度进行数据统计，对照组和3组实验组的每一组的培养时间为18～54小时，分别选择24小时和48小时进行数据统计。本实施例的参数变量包括培养基成分、MSC起始密度和培养时间。
表1含胎牛血清的培养基配方
序号 成分 浓度范围
1 MEM-α /
2 胎牛血清 10％
表2无血清培养基配方1
Figure BDA0002898755080000071
Figure BDA0002898755080000081
表3无血清培养基配方2
序号 成分 浓度范围
1 DMEM/F12 /
2 非必需氨基酸(100x) 0.1～5x，即0.1～5％(体积比)
3 人碱性成纤维细胞生长因子 10～75ng/ml
4 表皮细胞生长因子 0.5～50ng/ml
5 胰岛素 0.1～10μg/ml
6 全铁转铁蛋白 2～100μg/ml
7 黄体酮 1～10ng/ml
8 腐胺 5～200μg/ml
表4无血清培养基配方3
序号 成分 浓度范围
1 DMEM/F12 /
2 非必需氨基酸(100x) 0.1～5x，即0.1～5％(体积比)
3 人碱性成纤维细胞生长因子 0.5～50ng/ml
4 肝素 20～200ng/ml
5 胰岛素 0.1～10μg/ml
6 全铁转铁蛋白 2～100μg/ml
7 黄体酮 1～10ng/ml
8 腐胺 5～200μg/ml
其中，DMEM/F12培养基是在DMEM培养基的基础上，添加F12培养基中更为丰富的营养成分，含有多种微量元素，广泛应用于多种哺乳类细胞的培养。同时，DMEM/F12培养基常作为开发无血清培养基的基础，也适用于低血清含量下哺乳动物细胞的培养以及克隆密度培养。
(4)Nestin阳性神经前体细胞分离
P2 MSC分别按步骤(3)中的起始密度和培养时间静置培养后，以TrypLE Express消化、收集，再以mRNA Flow Cytometry技术，提取Nestin阳性神经前体细胞。分别统计对照组和3组实验组不同起始MSC密度和培养时间的Nestin阳性细胞产量和Nestin阳性率。表5所示为使用表1含胎牛血清培养基的结果，其中采用了不同的起始MSC密度和培养时间。表6所示为使用表2无血清培养基配方1的结果，其中采用了不同的起始MSC密度和培养时间。表7所示为使用表3无血清培养基配方2的结果，其中采用了不同的起始MSC密度和培养时间。表8所示为使用表4无血清培养基配方3的结果，其中采用了不同的起始MSC密度和培养时间。表5～8中的培养条件1～4分别如下所示：
培养条件1＝1×104个细胞/cm2起始密度+培养24小时。
培养条件2＝1×104个细胞/cm2起始密度+培养48小时。
培养条件3＝2×104个细胞/cm2起始密度+培养24小时。
培养条件4＝2×104个细胞/cm2起始密度+培养48小时。
表5 MSC神经前体细胞标志物阳性率检测(含胎牛血清培养基对照组)
Figure BDA0002898755080000091
表6 MSC神经前体细胞标志物阳性率检测(无血清培养基配方1)
Figure BDA0002898755080000092
Figure BDA0002898755080000101
表7 MSC神经前体细胞标志物阳性率检测(无血清培养基配方2)
Figure BDA0002898755080000102
表8 MSC神经前体细胞标志物阳性率检测(无血清培养基配方3)
Figure BDA0002898755080000103
以上述表5～8中的Nestin阳性细胞产量结果绘图，如图1所示，含FBS的培养基为含有胎牛血清的对照组，结果显示不论使用哪种培养基，培养条件4都可以获得最多的神经前体细胞，(*表示使用相同培养基情况下，培养条件4收获细胞数量显著高于另外3种培养条件，P≤0.001)，而在使用培养条件4的情况下，无血清培养基配方3所收获的细胞数量为24804±1067/cm2，是最多的。(&表示使用培养条件4的情况下，无血清配方3的收获细胞数量显著高于另外3种培养基配方，P≤0.001)。综合以上结果，无血清培养基配方3配合培养条件4，可获得最多的神经前体细胞。培养条件4的MSC细胞起始密度为2×104个细胞/cm2，培养时间为48小时。故使用无血清培养基配方3，采用2×104个细胞/cm2的MSC起始密度、培养48小时可以获得最高产量的神经前体细胞。
以上结果表明，使用无血清成分的神经前体细胞培养基比使用含血清的神经前体细胞培养基获得的神经前体细胞的Nestin阳性率显著增加，说明本发明的无血清培养基能够提高间充质干细胞分化成神经前体细胞的效率，提高神经前体细胞的产量。且MSC的起始密度和培养时间也是最终神经前体细胞产量的影响因素。
实施例2利用本发明的培养基制备的神经前体细胞可以应用于神经性疾病的治疗
一、针对脑白质营养不良
以脑白质营养不良小鼠为疾病模型，在左右脑的胼胝体分别微创注射Nestin阳性神经前体细胞，细胞移植数量为每侧5×105个细胞，可以再生脑白质、恢复脑功能、延长动物寿命。
二、针对脑卒中
以大脑中动脉闭塞法在SD大鼠造脑卒中疾病模型，在卒中区域附近进行微创注射Nestin阳性神经前体细胞，细胞移植数量为2×106个细胞，可以减轻炎症、修复神经、恢复脑功能。
神经前体细胞由健康供体收集获得，神经前体细胞是一种具有泛用性的细胞，可针对多种疾病发挥疗效。故本发明的培养基制备的Nestin阳性神经前体细胞还可以用于治疗包括帕金森、多发性硬化、脑胶质瘤等多种神经性疾病。
综上，本发明的方法通过使用无血清成分的神经前体细胞培养基，去除了血清成分，完全避免了MSC暴露在BMP和TGF-β的影响之下，同时无血清培养基添加了人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，有助于神经前体细胞的增殖维护，这些因素共同促进了MSC分化为神经前体细胞，并提高神经前体细胞的产量，且间充质干细胞的起始密度和培养时间也是最终神经前体细胞产量的影响因素。本发明的无血清成分的神经前体细胞培养基中不添加化学诱导剂，使得产物更纯，且无有毒物质的掺入，安全性更高。无血清培养基不含任何动物源性或人血液源性成分，避免了动物病原体或血液来源病原体的污染风险；无血清培养基化学成分完全清晰，确保了每批次培养基质量高度均一可控，大大提升了细胞培养结果的稳定性和可预见性，经过了3个配方的对比摸索(表2～4)，选定了“肝素+人碱性成纤维细胞生长因子”的组合，显著降低了人碱性成纤维细胞生长因子的所需浓度，在维持培养基效力的同时，显著降低了成本。使用本发明的培养基得到的神经前体细胞可以用于治疗各类神经损伤性疾病。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种无血清成分的神经前体细胞培养基，其特征在于，包括以下成分：
DMEM/F12培养基，非必需氨基酸，人碱性成纤维细胞生长因子，肝素，胰岛素，全铁转铁蛋白，黄体酮，腐胺。
2.根据权利要求1所述的无血清成分的神经前体细胞培养基，其特征在于，所述非必需氨基酸的含量为0.1～5％，所述含量为体积比；所述人碱性成纤维细胞生长因子的浓度为0.5～50ng/mL；所述肝素的浓度为20～200ng/mL；所述胰岛素的浓度为0.1～10μg/mL；所述全铁转铁蛋白的浓度为2～100μg/mL；所述黄体酮的浓度为1～10ng/mL；所述腐胺的浓度为5～200μg/mL。
3.如权利要求1-2任一项所述的无血清成分的神经前体细胞培养基的配制方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)向DMEM/F12培养基中加入非必需氨基酸和腐胺，得到第一储液；
(2)向第一储液中加入肝素、胰岛素、全铁转铁蛋白和黄体酮，得到第二储液；
(3)向第二储液中加入人碱性成纤维细胞生长因子，进行无菌过滤，得到所述无血清成分的神经前体细胞培养基。
4.一种诱导神经前体细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)分离间充质干细胞，原代培养；
(2)将原代培养后的间充质干细胞置于细胞培养器皿中，添加细胞培养基，进行第一次传代培养，所述细胞培养基为间充质干细胞基础培养基；所述基础培养基成分为MEM-α中添加10％胎牛血清；
(3)将第一次传代培养后的间充质干细胞置于细胞培养器皿中，添加权利要求1-2任一项所述的无血清成分的神经前体细胞培养基进行第二次传代培养；
(4)静置培养，分离得到神经前体细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的间充质干细胞来源于人类。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞来源包括骨髓、脐血、脐带、胎盘和脂肪组织。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述的间充质干细胞起始密度为0.5×104/cm2～3.0×104/cm2。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)所述的间充质干细胞起始密度为2×104/cm2。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述的静置培养的时间为18～54小时。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述的静置培养的时间为48小时。
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