CN112852737A - 一种提高msc分化为神经前体细胞产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种提高间充质干细胞(MSC)分化为神经前体细胞产量的方法，通过改变细胞培养基质表面环境，使用未经过“促进细胞贴壁”处理的细胞培养基质，对间充质干细胞进行培养。所述方法可以提高间充质干细胞分化成神经前体细胞的效率，提高神经前体细胞的产量。

Description

一种提高MSC分化为神经前体细胞产量的方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种提高间充质干细胞(MSC)分化为神经前体细胞产量的方法。
背景技术
中枢神经系统损伤或发育不良会引起神经细胞凋亡、神经组织缺损、运动及思维等能力缺陷，最终导致终身残疾甚至寿命缩短。中枢神经系统自我修复能力极低，治疗此类疾病需要使用细胞替代疗法，对凋亡缺损的神经细胞和组织进行补充，进而恢复神经系统的功能。
神经前体细胞(Neural progenitor cells，NPCs)在神经系统发育和神经损伤修复过程中起重要作用，成体神经损伤修复困难与NPCs缺乏或沉默有关。既往的研究表明，移植同种异体NPCs能缓解帕金森、多发性硬化、脑胶质瘤等疾病，能促进神经退行性疾病、外伤等轴突损伤髓鞘新生和修复，缓解临床症状，但NPC来源极为有限，限制了其临床应用。成体NPCs的分离依赖于组织学部位，一般成年人体内很难取材，而流产胎儿脑组织分离NPCs又受到伦理学限制，样本资源成为限制NPCs研究和应用的瓶颈。近些年来，对干细胞分化机制的研究取得了很大进展，发现胚胎干细胞和多种成体干细胞有神经前体细胞分化潜能，为神经前体细胞制备提供了新的思路。间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)是样本资源最丰富的成体干细胞，是基于干细胞再生医学的最有前景的种子细胞。脂肪、脐带、骨髓等多种组织来源的间充质干细胞能分化成Netstin+神经前体细胞，具有神经元、神经胶质细胞等的分化潜能。
目前应用于间充质干细胞分化为神经前体细胞的方法主要有：(1)化学诱导剂法：添加化学诱导剂如β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚、3-叔丁基-4-羟基茴香醚、维甲酸等；(2)细胞生长因子法：添加生长因子如NGF、EGF、bFGF、低浓度TNF-α等；(3)化学诱导剂与生长因子联合的方法；(4)其他：添加创伤性脑组织匀浆，脑组织上清液，脱细胞神经移植物，与神经细胞、神经干细胞或视网膜色素上皮细胞共培养或用接近生理状态的条件培养基，基因转染，传统中药(如黄芩苷、红景天苷、川芎嗪、丹参、天麻、人参)等。理想的移植细胞应具有创伤小，易于获得，易于体外扩增，不涉及免疫排斥致瘤性及伦理学问题等。而常用的化学诱导剂虽可以快速诱导生成神经样细胞，但存在细胞纯度低、质量参差不齐，并且活力差，平均4天出现死亡或凋亡等问题。细胞生长因子诱导法存在诱导效率低下，诱导周期长，且存活时间短等缺陷，甚至有些文献认为神经因子诱导法生成的神经样细胞，仅仅形态上像神经细胞，而不具备神经细胞的功能；化学诱导剂与生长因子联合的方法仍不能避免上述缺陷。与各种细胞和脑组织液共培养的方法存在细胞采集复杂或异体异种蛋白产生免疫排斥及传播疾病的缺点。
综上，上述方法均存在一些缺点，包括效率低、耗时长、系统重复性较差或者细胞诱导后活性不良、所得细胞不纯等，最终不能获得功能细胞。因此，本领域还有必要开发改进的技术，来提高分化效率、提高神经前体细胞的产量。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种通过改变细胞培养基质表面环境，使用未经过“促进细胞贴壁”处理的细胞培养基质，对间充质干细胞进行培养的方法，所述方法可以提高间充质干细胞分化成神经前体细胞的效率，提高神经前体细胞的产量。
本发明提供一种提高间充质干细胞分化为神经前体细胞产量的方法，包括如下步骤：
(1)分离间充质干细胞，原代培养；
(2)将原代培养后的间充质干细胞传代接种于细胞培养基质表面，添加细胞培养基，进行第一次传代培养，所述细胞培养基质经过“促进细胞贴壁”处理；
(3)将第一次传代培养后的间充质干细胞再次传代接种于细胞培养基质表面，添加细胞培养基，进行第二次传代培养，所述细胞培养基质未经过“促进细胞贴壁”处理；
(4)静置培养，收获神经前体细胞。
进一步的，所述步骤(1)中所述的间充质干细胞来源于人类。来源于人类的间充质干细胞用于获得人神经前体细胞，可应用于人神经性疾病的治疗。
进一步的，所述间充质干细胞来源包括骨髓、脐血、脐带、胎盘和脂肪组织。所述组织都是人体容易获取间充质干细胞的组织。
进一步的，所述步骤(2)和所述步骤(3)中的所述细胞培养基质为细胞培养皿或细胞培养板。
进一步的，所述步骤(3)中所述的间充质干细胞起始密度为0.5×104/cm2～3.0×104/cm2。
进一步的，所述步骤(3)所述的间充质干细胞起始密度为2×104/cm2。此起始密度获得的神经前体细胞产量更高。
进一步的，所述步骤(4)中所述的静置培养的时间为18-54小时。
进一步的，所述步骤(4)中所述的静置培养的时间为48小时。此培养时间获得的神经前体细胞产量更高。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
1.本发明的方法效率高，耗时短，仅需18～54小时即可得到产量丰富的神经前体细胞。
2.本发明的方法不添加化学诱导剂或细胞因子，使得产物更纯，且无有毒物质的掺入，安全性更高。
3.本发明的方法获得的神经前体细胞的阳性率更高，产量更高。
4.本发明的制备方法得到的神经前体细胞可以用于治疗各类神经损伤性疾病。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为MSC神经前体细胞标志物Nestin荧光成像检测图；
图2为MSC神经前体细胞标志物Nestin流式检测；
图3为MSC神经前体细胞标志物Nestin阳性率流式检测(MSC起始密度2×104/cm2、培养48小时，5次独立实验)。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
常规细胞培养所使用的细胞培养器皿，往往经过“Gas Plasma”等方法处理(例如Corning的
Figure BDA0002898754020000041
)，促进细胞贴壁。细胞培养基质主要由聚苯乙烯制成，聚苯乙烯由碳氢分子组成，其表面主要由烷基组成，亲水性较低；而哺乳类动物细胞表面带电荷，亲水性高，故哺乳类动物细胞在未经处理的聚苯乙烯表面往往粘附力较低。聚苯乙烯表面经过气体等离子处理后，会产生大量的羟基(-OH)，亲水性显著提升，使哺乳类动物细胞更容易粘附生长。
经促进细胞贴壁处理(Tc-Treated，简称TCT)和未经促进细胞贴壁处理(Non Tc-Treated，简称nTCT)细胞培养基质如细胞培养皿和细胞培养板等，都以聚苯乙烯制成，最大分别是TCT基质表面经过气体等离子(Gas Plasma)处理。
本发明公开了MSC在经过气体等离子处理的聚苯乙烯培养皿表面(即TCT)生长，Nestin阳性的神经前体细胞比例较低，但在未经气体等离子处理的聚苯乙烯培养皿表面(即nTCT)生长，Nestin阳性神经前体细胞比例显著提升。Nestin是一种中间丝类型的蛋白，能够特异性的表达在神经上皮干细胞上一种分子标记物，可能对神经元的分化有作用。Nestin仅在胚胎发育早期的神经上皮表达，出生后表达就停止，一般被视为神经干细胞的特征性标志物。故使用未经过“促进细胞贴壁”处理的细胞培养皿比使用经过“促进细胞贴壁”处理的细胞培养皿的Nestin阳性率显著增加说明本发明的方法通过改变细胞培养基质表面环境，能够提高间充质干细胞分化成神经前体细胞的效率，提高神经前体细胞的产量。
MSC生长环境的硬度对其分化潜力有显著影响，而硬度较低的环境更有利神经特性的展现。聚苯乙烯是一种硬度较高的表面，气体等离子(TCT表面)加强MSC与聚苯乙烯的黏附接触，可能会降低神经特性的展现。相反，MSC在nTCT表面黏附较弱，与硬度高的聚苯乙烯接触较少，提升了神经特性的展现，导致Nestin阳性神经前体细胞的产量显著增加。
实施例1
(1)原代MSC培养
1mL健康成人骨髓原液以9mL MSC基础培养基稀释后，MSC也可以取自人的脐血、脐带、胎盘和脂肪组织，在TCT表面100mm直径圆形培养皿培养3天后，移除所有培养基，换入10mL新的MSC基础培养基。此阶段MSC定义为P0。P0MSC以MSC基础培养基再培养10天，每2天换液一次，每次10mL。MSC基础培养基成分为MEM-α(Minimum Essential Medium AlphaModification)+10％胎牛血清。
(2)第一次传代培养
P0 MSC培养10天后，以TrypLE Express消化、收集，再以1:3比例传代至TCT表面100mm直径圆形培养皿。这些MSC定义为P1，以10mL MSC基础培养基培养2天。
(3)第二次传代培养
P1 MSC培养2天后，以TrypLE Express消化、收集，再以2×104个细胞/cm2的接种密度，分别传代至“经促进细胞贴壁处理(Tc-Treated，简称TCT)”和“未经促进细胞贴壁处理(Non Tc-Treated，简称nTCT)”的聚苯乙烯6孔细胞培养板，每孔2mL培养基。这些MSC定义为P2，以MSC基础培养基培养2天。以上2个实验组的每一组又分别设置MSC起始浓度不同的组别，起始浓度为0.5×104/cm2～3.0×104/cm2，分别选择1×104/cm2和2×104/cm2的起始浓度进行数据统计，加入MSC基础培养基，在培养基中加入胎牛血清，对上述的培养皿进行静置培养，培养时间为18-54小时，分别选择24小时和48小时进行数据统计。本实施例的参数变量包括细胞贴壁处理、MSC起始密度和培养时间。
(4)Nestin阳性神经前体细胞分离
P2 MSC培养2天后，以TrypLE Express消化、收集，再以mRNA Flow Cytometry技术，提取Nestin阳性神经前体细胞。分别统计不同起始MSC密度和培养时间以及TCT和nTCT实验组的Nestin阳性细胞产量和Nestin阳性率。表1所示为使用“经促进细胞贴壁处理(Tc-Treated，简称TCT)”的聚苯乙烯细胞培养器皿培养的结果，其中采用了不同的起始MSC密度和培养时间。表2所示为使用“未经促进细胞贴壁处理(Tc-Treated，简称TCT)”的聚苯乙烯细胞培养器皿培养的结果，其中采用了不同的起始MSC密度和培养时间。
表1 MSC神经前体细胞标志物阳性率检测(TCT)
Figure BDA0002898754020000071
表2 MSC神经前体细胞标志物阳性率检测(nTCT)
Figure BDA0002898754020000072
结果发现，在不同起始密度的不同培养时间点，使用nTCT均可获得更多的Nestin阳性细胞，使用nTCT获得的Nestin阳性细胞产量最高可达34542±1561/cm2，而使用TCT获得的Nestin阳性细胞产量最高可达6053±268/cm2。
此外，对比表1和表2可见，相同条件下，培养48小时比培养24小时的Nestin阳性细胞产量高，起始MSC密度为2×104/cm2比1×104/cm2时Nestin阳性细胞产量高，在nTCT以1×104/cm2或2×104/cm2起始密度，培养24或48小时的MSC，其Nestin阳性率平均值比在TCT培养的MSC明显更高，最终Nestin阳性细胞产量更高。
以上结果表明，使用未经过“促进细胞贴壁”处理的细胞培养皿比使用经过“促进细胞贴壁”处理的细胞培养皿的Nestin阳性率显著增加，说明本发明的方法能够提高间充质干细胞分化成神经前体细胞的效率，提高神经前体细胞的产量。且MSC的起始密度和培养时间也是最终神经前体细胞产量的影响因素。
分别对TCT和nTCT情况下Nestin阳性细胞进行荧光检测，结果如图1所示，图1A为未经促进细胞贴壁处理的组别，图1B为经促进细胞贴壁处理的组别，MSC起始密度均为2×104/cm2，接种在“TCT”48小时的MSC，Nestin阳性细胞明显较少(图1A)，接种在“nTCT”48小时的MSC，Nestin阳性细胞明显较多(图1B)。且图中可以明显的看到细胞核等细胞结构，说明制备得到的神经前体细胞是有功能的细胞。
通过流式细胞仪分别检测TCT和nTCT情况下Nestin阳性细胞的数量，结果如图2所示，图2A为未经促进细胞贴壁处理的组别，图2B为经促进细胞贴壁处理的组别，MSC起始密度均为2×104/cm2，纵坐标为细胞数量。结果表明，接种在“TCT”48小时的MSC，Nestin阳性细胞仅为6.68％(图2A)，接种在“nTCT”48小时的MSC，Nestin阳性细胞高达45.38％(图2B)。数据统计结果如图3所示，在nTCT培养48小时的MSC，其Nestin阳性率平均为42.75±4.83％，在TCT培养48小时的MSC，其Nestin阳性率平均为7.69±2.29％，nTCT培养的Nestin阳性率要比TCT高出接近6倍，并且P<0.0001，具有明显统计学差异。以上结果从另一个角度说明说明本发明的方法能够提高间充质干细胞分化成神经前体细胞的效率，提高神经前体细胞的产量。
实施例2利用本发明的方法制备的神经前体细胞可以应用于神经性疾病的治疗
一、针对脑白质营养不良
以脑白质营养不良小鼠为疾病模型，在左右脑的胼胝体分别微创注射Nestin阳性神经前体细胞，细胞移植数量为每侧5×105个细胞，可以再生脑白质、恢复脑功能、延长动物寿命。
二、针对脑卒中
以大脑中动脉闭塞法在SD大鼠造脑卒中疾病模型，在卒中区域附近进行微创注射Nestin阳性神经前体细胞，细胞移植数量为2×106个细胞，可以减轻炎症、修复神经、恢复脑功能。
神经前体细胞由健康供体收集获得，神经前体细胞是一种具有泛用性的细胞，可针对多种疾病发挥疗效。故本发明的方法制备的Nestin阳性神经前体细胞还可以用于治疗包括帕金森、多发性硬化等多种神经性疾病。
综上，本发明的方法通过改变细胞培养基质表面环境，利用MSC在nTCT表面黏附较弱，与硬度高的聚苯乙烯接触较少，提升了神经特性的展现，所以使用未经过“促进细胞贴壁”处理的细胞培养基质比使用经过“促进细胞贴壁”处理的细胞培养基质的Nestin阳性率显著增加，说明本发明的方法能够提高间充质干细胞分化成神经前体细胞的效率，提高神经前体细胞的产量，且间充质干细胞的起始密度和培养时间也是最终神经前体细胞产量的影响因素。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种提高间充质干细胞分化为神经前体细胞产量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)分离间充质干细胞，原代培养；
(2)将原代培养后的间充质干细胞传代接种于细胞培养基质表面，添加细胞培养基，进行第一次传代培养，所述细胞培养基质经过“促进细胞贴壁”处理；
(3)将第一次传代培养后的间充质干细胞再次传代接种于细胞培养基质表面，添加细胞培养基，进行第二次传代培养，所述细胞培养基质未经过“促进细胞贴壁”处理；
(4)静置培养，收获神经前体细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的间充质干细胞来源于人类。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞来源包括骨髓、脐血、脐带、胎盘和脂肪组织。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)和所述步骤(3)中的所述细胞培养基质为细胞培养皿或细胞培养板。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述的间充质干细胞起始密度为0.5×104/cm2～3.0×104/cm2。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)所述的间充质干细胞起始密度为2×104/cm2。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述的静置培养的时间为18～54小时。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述的静置培养的时间为48小时。
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