CN110305838A - 一种提升人体脂肪含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提升人体脂肪含量的方法，包括以下步骤：S1、无菌条件下取人体皮下脂肪组织，将其移入预先盛有D‑Hanks液的平皿，漂洗5～8次，用眼科剪去除脂肪组织中可见的血管和结缔组织；S2、然后剪切组织块至8～10mm三小块，用组织匀浆机180～200r/min匀浆至乳糜状；继而加入0.1％胶原酶I培养基消化30min，其间每5min振荡1次，S3、经200目不锈钢细胞筛过滤去除未消化组织块及大体积的脂肪细胞，将细胞悬液移入离心管，2000r/min离心5min；弃去离心后的上清液。该提升人体脂肪含量的方法，通过通过无菌膜稳定试剂以及PRP和重组人VEGF‑C处理后的脂肪细胞群，在递送或给予受试者之前、期间或之后，能增加脂肪细胞群的移植物的存活率，从而极大的增加了人体脂肪的含量。

Description

一种提升人体脂肪含量的方法
技术领域
本发明涉及脂肪细胞培养技术领域，具体为一种提升人体脂肪含量的方法。
背景技术
在血管生成过程中依赖多种生长因子的活性，例如，血管内皮生长因子(VEGF)，碱性成纤维生长因子(bFGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)。
血管内皮生长因子(VEGF)是一种分泌性糖蛋白，起着维持原有血管密度及维持血管对运输营养物质所必需的通透性的作用。VEGF的生物学作用包括：促进内皮细胞增殖，VEGF可以诱导内皮细胞表达蛋白水解酶、间质胶原酶和组织因子，降解细胞外基质，使得血管内皮细胞向内生长，从而诱导血管形成。提高血管的通透性，Roberts等发现，VEGF作用致内皮细胞之间的间隙增大，同时导致内皮细胞上出现穿孔。此作用发生于毛细血管后微静脉及毛细血管和肌肉静脉水平。血管生成是脂肪移植存活率提高的关键，而在此过程中的各个阶段均有VEGF表达的增强，作为血管生成的关键调节因子，VEGF在血管再生过程中发挥着重要作用。
VEGF表达的调节受到一些血清来源和旁分泌的生长因子与细胞因子的影响，包括血小板源生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、转移生长因子(TGF)等都能使许多培养皮肤细胞中的VEGF表达高3-20倍，而创伤修复各阶段均有上述生长因子的表达。其中，bFGF对其有直接的调节作用，因为bFGF可以上调VEGF的产生，二者具有协同作用。
富血小板血浆(PRP)是通过离心自体全血而获得的血小板浓缩物。因PRP可来源于自体，其获取简便，无免疫排斥反应，并发症少，研究证实，PRP还具有使脂肪间充质干细胞增殖和分化的作用。国内外已有将PRP应用于颅面及皮肤软组织修复等的研究报道。Willemsen等做了24例富血小板血浆自体脂肪的双侧臀部移植，结果证实臀部的PRP脂肪注入术是安全有效的，其具有低并发症和持续稳定性。总之PRP混合自体颗粒脂肪组织移植能加速移植组织早期血管重建，避免纤维化和脂肪细胞凋亡。
由于外伤和老化，自体脂肪移植是用于软组织增添和填充软组织缺损的普遍和理想的技术。最新证据表明由于其吸收和脂肪的低存活率，脂肪移植物的早期和足够的血管化是必不可少的。然而，由于移植后脂肪细胞死亡增加，脂肪移植物的相对较高的再吸收率降低了该技术的效力。虽然血管生成因子(Kuramochi等，2008)，以及VEGF基因治疗(Lei等，2008)已被单独用于在脂肪移植物中刺激血管生成，以提高脂肪细胞的存活率和生存能力，但是临床结果却不尽人意。因此，降低移植脂肪的再吸收率是临床上的一个挑战。
已经尝试各种促进移植的方法，以下总结其中的一些。
PCT公布NO.2005/018549公开了用于组织修复(如骨、软骨)的方法和组合物。根据其教导，组织移植物(如脂肪组织、肌肉组织)可离体与一种或更多种的生物活性剂(如促红细胞生成素)接触，从而刺激组织中的至少一部分细胞分化成所需类型的细胞(如骨细胞)，然后将该组织植入受试者中。
美国专利NO.7459152公开了通过给予促红细胞生成素，提高移植物存活率。根据其教导，在递送或给予受试者之前、期间或之后，借助促红细胞生成素处理组织移植物的细胞(例如神经或神经旁来源的细胞，如肾上腺嗜铬细胞)，以便治疗神经学疾病(如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、脊髓损伤)。
美国专利NO.5,681,561公开了用于促进自体脂肪移植的方法和组合物。根据美国专利NO.5,681,561的内容，自体脂肪细胞连同非甾体类合成代谢激素(如胰岛素或三碘甲状腺原氨酸/甲状腺素或二者)一起注入患者体内。自体脂肪细胞可进一步与生长激素，如上皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)一起注入受试者中。另外，激素与营养培养基相结合。
PCT公布NO.2008/019434公开了利用试剂，增强脂肪形成并提高脂肪移植物的存活率。根据其教导，生长因子如，血小板衍生生长因子(PDGF)、和成纤维细胞生长因子(FDF)通过局部或持续给药递送至受试者，从而增强血管生成和脂肪形成并提高脂肪移植物存活率。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种提升人体脂肪含量的方法，通过通过无菌膜稳定试剂以及PRP和重组人VEGF-C处理后的脂肪细胞群，在递送或给予受试者之前、期间或之后，能增加脂肪细胞群的移植物的存活率，从而极大的增加了人体脂肪的含量，以解决上述的问题。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种提升人体脂肪含量的方法，包括以下步骤：
S1、无菌条件下取人体皮下脂肪组织，将其移入预先盛有D-Hanks液的平皿，漂洗5～8次，用眼科剪去除脂肪组织中可见的血管和结缔组织；
S2、然后剪切组织块至8～10mm三小块，用组织匀浆机180～200r/min匀浆至乳糜状；继而加入0.1％胶原酶I培养基消化30min，其间每5min振荡1次；
S3、经200目不锈钢细胞筛过滤去除未消化组织块及大体积的脂肪细胞，将细胞悬液移入离心管，2000r/min离心5min；弃去离心后的上清液，加入细胞培养液清洗1次，2000r/min离心10min，制成细胞悬液，显微镜下计数，以5×104cells/mL接种细胞至培养皿或培养瓶，置入37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养；
S4、将S3中得到的的脂肪细胞群取100份放置在无菌恒压环境下的培养皿中并在培养皿中加入5份0.5％浓度的稳定试剂；
S5、向脂肪细胞群添加自体高浓度血小板血浆PRP和重组人血管内皮生长因子VEGF-C；
S6、将经过步骤S4和步骤S6处理后的脂肪细胞群植入受试者中。
优选的，所述S2中的0.1％胶原酶I培养基为：将100mg胶原酶I溶解于100毫升D-Hanks液中，用5.6％NaHCO3溶液调节PH值至7.2～7.4，经0.22微米过滤器过滤、分装，零下20℃保存备用。
优选的，所述S3中的中细胞培养液为：在DMEM/F12液中添加其体积10％的胎牛血清，经0.22微米过滤器过滤、分装，4℃保存备用。
优选的，所述无菌膜稳定试剂包括氯化钠、氯化钙、氯化钾、EDTA和蒸馏水。
优选的，所述脂肪细胞群和自体高浓度血小板血浆PRP的体积比为3：1。
优选的，所述重组人VEGF-C的剂量为每注入十六个脂肪细胞，对应加入1500IU重组人VEGF-C。
优选的，所述脂肪细胞群包括自体细胞和非自体细胞，且非自体细胞包括同种异体细胞和异种细胞，所述非自体细胞取自哺乳动物。
(三)有益效果
本发明提供了一种提升人体脂肪含量的方法，具备以下有益效果：
(1)该提升人体脂肪含量的方法，通过无菌膜稳定试剂以及PRP和重组人VEGF-C处理后的脂肪细胞群，在递送或给予受试者之前、期间或之后，能增加脂肪细胞群的移植物的存活率，从而极大的增加了人体脂肪的含量。
(2)该提升人体脂肪含量的方法，体外改良消化法培养人的脂肪细胞，成功建立了人体脂肪细胞体外培养的新模型，极大的缩短了试验样品处理的时间，且获得细胞形态最好，培养及提取RNA效率最高，是一种更为便捷、长期高效的前体脂肪细胞培养方法。
具体实施方式
基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种提升人体脂肪含量的方法，包括以下步骤：
S1、无菌条件下取人体皮下脂肪组织，将其移入预先盛有D-Hanks液的平皿，漂洗5～8次，用眼科剪去除脂肪组织中可见的血管和结缔组织；
S2、然后剪切组织块至8～10mm三小块，用组织匀浆机180～200r/min匀浆至乳糜状；继而加入0.1％胶原酶I培养基消化30min，其间每5min振荡1次；
S3、经200目不锈钢细胞筛过滤去除未消化组织块及大体积的脂肪细胞，将细胞悬液移入离心管，2000r/min离心5min；弃去离心后的上清液，加入细胞培养液清洗1次，2000r/min离心10min，制成细胞悬液，显微镜下计数，以5×104cells/mL接种细胞至培养皿或培养瓶，置入37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养；
S4、将S3中得到的的脂肪细胞群取100份放置在无菌恒压环境下的培养皿中并在培养皿中加入5份0.5％浓度的稳定试剂；
S5、向脂肪细胞群添加自体高浓度血小板血浆PRP和重组人血管内皮生长因子VEGF-C；
S6、将经过步骤S4和步骤S6处理后的脂肪细胞群植入受试者中。
所述S2中的0.1％胶原酶I培养基为：将100mg胶原酶I溶解于100毫升D-Hanks液中，用5.6％NaHCO3溶液调节PH值至7.2～7.4，经0.22微米过滤器过滤、分装，零下20℃保存备用。
所述S3中的中细胞培养液为：在DMEM/F12液中添加其体积10％的胎牛血清，经0.22微米过滤器过滤、分装，4℃保存备用。
所述无菌膜稳定试剂包括氯化钠、氯化钙、氯化钾、EDTA和蒸馏水。
所述脂肪细胞群和自体高浓度血小板血浆PRP的体积比为3：1。
所述重组人VEGF-C的剂量为每注入十六个脂肪细胞，对应加入1500IU重组人VEGF-C。
所述脂肪细胞群包括自体细胞和非自体细胞，且非自体细胞包括同种异体细胞和异种细胞，所述非自体细胞取自哺乳动物。
具体实施方式：通过无菌膜稳定试剂以及PRP和重组人VEGF-C处理后的脂肪细胞群，在递送或给予受试者之前、期间或之后，能增加脂肪细胞群的移植物的存活率，从而极大的增加了人体脂肪的含量，体外改良消化法培养人的脂肪细胞，成功建立了人体脂肪细胞体外培养的新模型，极大的缩短了试验样品处理的时间，且获得细胞形态最好，培养及提取RNA效率最高，是一种更为便捷、长期高效的前体脂肪细胞培养方法。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种提升人体脂肪含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、无菌条件下取人体皮下脂肪组织，将其移入预先盛有D-Hanks液的平皿，漂洗5～8次，用眼科剪去除脂肪组织中可见的血管和结缔组织；
S2、然后剪切组织块至8～10mm三小块，用组织匀浆机180～200r/min匀浆至乳糜状；继而加入0.1％胶原酶I培养基消化30min，其间每5min振荡1次；
S3、经200目不锈钢细胞筛过滤去除未消化组织块及大体积的脂肪细胞，将细胞悬液移入离心管，2000r/min离心5min；弃去离心后的上清液，加入细胞培养液清洗1次，2000r/min离心10min，制成细胞悬液，显微镜下计数，以5×104cells/mL接种细胞至培养皿或培养瓶，置入37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养；
S4、将S3中得到的的脂肪细胞群取100份放置在无菌恒压环境下的培养皿中并在培养皿中加入5份0.5％浓度的稳定试剂；
S5、向脂肪细胞群添加自体高浓度血小板血浆PRP和重组人血管内皮生长因子VEGF-C；
S6、将经过步骤S4和步骤S6处理后的脂肪细胞群植入受试者中。
2.根据权利要求1所述的一种提升人体脂肪含量的方法，其特征在于：所述S2中的0.1％胶原酶I培养基为：将100mg胶原酶I溶解于100毫升D-Hanks液中，用5.6％NaHCO3溶液调节PH值至7.2～7.4，经0.22微米过滤器过滤、分装，零下20℃保存备用。
3.根据权利要求1所述的一种提升人体脂肪含量的方法，其特征在于：所述S3中的中细胞培养液为：在DMEM/F12液中添加其体积10％的胎牛血清，经0.22微米过滤器过滤、分装，4℃保存备用。
4.根据权利要求1所述的一种提升人体脂肪含量的方法，其特征在于：所述无菌膜稳定试剂包括氯化钠、氯化钙、氯化钾、EDTA和蒸馏水。
5.根据权利要求1所述的一种提升人体脂肪含量的方法，其特征在于：所述脂肪细胞群和自体高浓度血小板血浆PRP的体积比为3：1。
6.根据权利要求1所述的一种提升人体脂肪含量的方法，其特征在于：所述重组人VEGF-C的剂量为每注入十六个脂肪细胞，对应加入1500IU重组人VEGF-C。
7.根据权利要求1所述的一种提升人体脂肪含量的方法，其特征在于：所述脂肪细胞群包括自体细胞和非自体细胞，且非自体细胞包括同种异体细胞和异种细胞，所述非自体细胞取自哺乳动物。
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