CN109691435B - 一种造血干细胞的冻存保护剂和简易冻存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种造血干细胞的冻存保护剂和简易冻存方法。在现有技术基础上将DMSO含量降到3％后，造血干细胞的冻存存活率显著降低，而本发明发现，在冻存保护剂中添加野甘草醇可以抵消DMSO含量降低带来的冻存损伤，野甘草醇对造血干细胞具有冻存保护作用，抑制Caspase‑3表达可能是野甘草醇发挥对造血干细胞冻存保护作用的一个机制。

Description

一种造血干细胞的冻存保护剂和简易冻存方法
技术领域
本发明属于生物领域，涉及造血干细胞冻存，具体涉及一种造血干细胞的冻存保护剂和简易冻存方法。
背景技术
造血干细胞(HSCs)以极低数量存在于哺乳动物的骨髓、胎肝、外周血及脐带血中，是一种具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞，是所有成熟血细胞的前体细胞。造血干细胞移植是治疗恶性血液病、遗传性疾病及免疫缺陷疾病的重要手段。
传统的以10％DMSO作为冷冻保护剂、程序降温、液氮冷冻保存人造血干细胞的方法以其能够长期保存且细胞损失少而为人们所推崇，在临床上普遍应用。其缺点是操作复杂，费用昂贵，解冻后常会出现细胞凝聚现象。为了获得简单理想的冷冻保存人造血干细胞的方法，从80年代起人们开始将传统方法从冷冻保护剂、细胞冷冻方法和保存温度方面进行了改进，形成了以5％DMSO和6％羟乙基淀粉(HES)为冷冻保护剂、非程控降温、-80℃直接冷冻保存造血干细胞的简化方法。但是，DMSO是一种穿透性保护剂，常温下对造血干细胞等组织细胞有一定毒性，有报告在向患者输入含≥5％DMSO的冻存干细胞时，可引起不同程度的高血压/低血压、心慌胸闷、心率失常等副作用。
研究表明，将DMSO含量降到3％后，副作用基本可以忽略。但是3％DMSO对造血干细胞的冻存效果不及5％～10％DMSO。
发明内容
本发明旨在克服现有技术不足，提供一种造血干细胞的冻存保护剂和冻存方法，用于造血干细胞6个月内的-80℃直接冻存，在将DMSO含量降到3％后不明显降低冻存保护效果。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种造血干细胞的冻存保护剂，含有野甘草醇。
进一步地，由DMSO、羟乙基淀粉和野甘草醇经生理盐水溶解配制而成。
更进一步地，DMSO体积百分浓度为15％。
更进一步地，羟乙基淀粉质量体积浓度为40％。
更进一步地，野甘草醇浓度为100μM。
更进一步地，DMSO体积百分浓度为15％，羟乙基淀粉质量体积浓度为40％，野甘草醇浓度为100μM。
上述冻存保护剂的使用方法：冻存保护剂与造血干细胞悬液按照体积比1:4混合使用。
上述冻存保护剂在造血干细胞-80℃直接冷冻方面的应用。
一种造血干细胞的简易冻存方法，使用上述冻存保护剂将造血干细胞于-80℃直接冻存。
野甘草醇在造血干细胞冻存保护方面的应用。
有益效果：
在现有技术基础上将DMSO含量降到3％后，造血干细胞的冻存存活率显著降低，而本发明发现，在冻存保护剂中添加野甘草醇可以抵消DMSO含量降低带来的冻存损伤，野甘草醇对造血干细胞具有冻存保护作用，抑制Caspase-3表达可能是野甘草醇发挥对造血干细胞冻存保护作用的一个机制。
附图说明
图1为流式细胞仪检测分选后CD34+HSCs阳性率的结果图；
图2为细胞回收率检测结果；
图3为细胞存活率检测结果；
图4为冻存前后CD34+HSCs阳性率检测结果；
图5为Caspase-3蛋白表达检测结果。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来介绍本发明的实质性内容，但不能以此限定本发明保护范围。
一、实验材料
小鼠为10周龄健康雄性C57BL/6小鼠；PBS缓冲液购自上海莼试生物；Ficoll淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物；Anti-CD34-PE、Anti-PE MicroBeads、MS分选柱购自德国Miltenyi； IMDM培养液和胎牛血清购自Hyclone公司；BCA试剂盒购自碧云天；Caspase-3小鼠单抗购自Abbkine，HRP标记的二抗购自Solarbio。野甘草醇(Scopadulciol)纯度不低于95％。
二、实验方法
1、小鼠骨髓单个核细胞(BMNCs)的制备
无菌条件下脱颈椎处死小鼠，迅速取出双侧股骨，用PBS溶液冲洗骨髓腔3次，收集冲洗液，150目铜网过滤，得细胞悬液，然后缓慢加入到Ficoll淋巴细胞分离液上方，4℃、2000r/min离心20min，吸取中间环状乳白色细胞层至新离心管中，PBS洗涤3次，4℃备用。
2、造血干细胞(HSCs)的分离纯化、培养
取BMNCs加入90μLPBS和10μLAnti-CD34-PE抗体标记细胞，4℃孵育10min，800r/min 离心5min弃上清，加入80μL PBS和20μLAnti-PE Micro Beads，4℃孵育20min，800r/min 离心5min后弃上清，以0.5mLPBS重悬细胞，加入MS分选柱内，流出道收集CD34-细胞，0.5mLPBS洗柱3次。取下分选柱，加入0.5mLPBS冲出CD34+HSCs，收集CD34+HSCs，流式细胞仪检测分选前后CD34+HSCs阳性率，即可获知HSCs的分离纯化效果。
流式测定CD34+HSCs阳性率的方法为：取适量收集的细胞用PBS洗涤后，用IMDM培养基配制成细胞悬液，每100μL细胞悬液加入2mL氯化氨溶血素，室温下放置10min，用PBS洗涤后，分成2管，1管为阴性对照，另1管加新鲜稀释的PE标记的CD34单抗，混匀，在 4℃避光条件下孵育30min，加PBS 0.5mL，上机分析。
HSCs洗涤后用含10％胎牛血清的IMDM培养基(含双抗：100U/mL青霉素、100g/L链霉素)调细胞浓度为1×106个/mL接种培养瓶，于37℃、5％CO2培养、传代，取第4代对数生长期HSCs进行后续实验。
3、冻存保护剂的配制和使用方法
5％DMSO+6％HES：取适量DMSO和HES用生理盐水溶解，配制成DMSO浓度为25％ (V/V)、HES浓度为30％(W/V)的母液，与造血干细胞悬液按照体积比1:4混合使用；
3％DMSO+8％HES：取适量DMSO和HES用生理盐水溶解，配制成DMSO浓度为15％ (V/V)、HES浓度为40％(W/V)的母液，与造血干细胞悬液按照体积比1:4混合使用；
3％DMSO+8％HES+20μM野甘草醇：取适量DMSO、HES和野甘草醇用生理盐水溶解，配制成DMSO浓度为15％(V/V)、HES浓度为40％(W/V)、野甘草醇浓度为100μM的母液，与造血干细胞悬液按照体积比1:4混合使用。
冻存保护剂配制好后置于4℃保存备用。
4、实验分组、冻存
对照组：在终浓度5％DMSO+6％HES保护条件下进行冻存；
实验A组：在终浓度3％DMSO+8％HES保护条件下进行冻存；
实验B组：在终浓度3％DMSO+8％HES+20μM野甘草醇保护条件下进行冻存。
冻存方法：将浓度2×107/ml的细胞悬液和冷冻保护剂母液分别装入两支试管中，置冰水中预冷，待温度平衡后，将冷冻保护剂母液缓慢加入细胞悬液中，冰水浴条件下边加边混匀，待冷冻保护剂母液全部加完并充分混匀后，分装入容积为2ml的低温冷冻管中，每管装 1.8ml，旋紧管帽，置冰水中平衡孵育4h，随后直接放入-80℃保存。
5、冻存后复苏
冻存6个月后，从-80℃冰箱中取出冻存的细胞，在40℃水浴中快速解冻，离心后弃上清液，加入含10％胎牛血清的IMDM培养基培养4h进行检测。
6、细胞回收率检测
离心收集细胞，用3％醋酸作细胞稀释液，在低倍镜下计数细胞总数，按照如下公式计算细胞回收率：细胞回收率(％)＝每管冻存后细胞总数/每管冻存前细胞总数×100％。
7、细胞存活率检测
采用台盼蓝拒染法进行活细胞计数，具体方法如下：
离心收集细胞，用PBS制成细胞悬液，取0.5ml细胞悬液置于EP管，再加入约0.1ml0.5％台盼蓝染液，混合2min后制片，镜检，计数视野中排斥台盼蓝的存活细胞数和被染色的死亡细胞数，计算台盼蓝拒染率，得出细胞存活率。
8、造血干细胞干性检测
计数CD34+HSCs阳性率是检验造血干细胞活性的公认方法之一。流式测定CD34+HSCs 阳性率的方法为：取适量收集的细胞用PBS洗涤后，用IMDM培养基配制成细胞悬液，每100μL细胞悬液加入2mL氯化铵 溶血素，室温下放置10min，用PBS洗涤后，分成2管，1 管为阴性对照，另1管加新鲜稀释的PE标记的CD34单抗，混匀，在4℃避光条件下孵育30min，加PBS 0.5mL，上机分析。
9、Caspase-3蛋白表达检测
从-80℃冰箱中取出冻存的细胞，在40℃水浴中快速解冻，离心后弃上清液，加入含10％胎牛血清的IMDM培养基，调节细胞浓度为1×106个/mL接种于6孔板，每孔3mL，培养4h 后，离心收集细胞。用冷PBS洗细胞3次，以总蛋白提取试剂提取细胞总蛋白，置于-70℃冰箱中保存待用，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。取总蛋白50μg，加入50μL的5×蛋白上样缓冲液，沸水浴5min，冷却后取40μL蛋白样本加入加样孔，用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移至硝酸纤维膜，用封闭液室温封闭1h，加入小鼠一抗Caspase-3，于4℃孵育过夜，洗膜15min×3次，加入HRP标记的二抗室温孵育1h，洗膜15min×3次，ECL发光，胶片显影、定影，扫描定影胶片，Image J软件测得各条带的灰度值，以β-actin为内参，比较各组Caspase-3蛋白表达量差异。
10、统计学处理
实验数据均以平均值±标准偏差表示，组间差异比较采用t检验。
三、实验结果
1、HSCs的分离纯化结果
纯化前CD34+细胞为4.2％，而纯化后CD34+细胞高达93.2％，纯化后CD34+HSCs阳性率显著升高。该结果表明，纯化效果明显，HSCs纯度大幅度提高。图1为纯化后流式图。
2、细胞回收率检测结果
结果如表1和图2所示，该结果表明，与现有技术(对照组)相比，实验A组和实验B组冻存保护剂对细胞回收率无明显影响。
表1细胞回收率检测结果
Figure BDA0001990115690000051
3、细胞存活率检测结果
结果如表2和图3所示，该结果表明，与现有技术(对照组)相比，实验A组细胞存活率显著降低，实验B组细胞存活率差异不明显，说明当将现有技术中DMSO降低到3％后，细胞冻存损伤明显，不过添加野甘草醇可以基本抵消DMSO降低造成的细胞冻存损伤。
表2细胞存活率检测结果
Figure BDA0001990115690000052
4、造血干细胞干性检测结果
结果如表3和图4所示，该结果表明，与现有技术(对照组)相比，实验B组冻存保护剂对造血干细胞干性无明显影响，实验A组冻存保护剂对造血干细胞干性存在一定影响。
表3冻存前后CD34+HSCs阳性率检测结果
Figure BDA0001990115690000061
5、Caspase-3蛋白表达检测结果
结果如图5所示。Caspase-3为半胱氨酸蛋白酶家族的一个重要成员，在细胞凋亡的信号转导通路中起着至关重要的作用，它是死亡受体介导的细胞凋亡途径中的关键启动子，其活性增强一般说明细胞即将向凋亡进展。该研究表明，与对照组相比，实验A组Caspase-3表达明显增强，这可能解释为了为什么实验A组细胞存活率比对照组明显降低；与实验A组相比，实验B组Caspase-3表达明显减弱，这可能是实验B组冻存保护剂中野甘草醇发挥对造血干细胞冻存保护作用的一个机制。
综上，在现有技术基础上将DMSO含量降到3％后，造血干细胞的冻存存活率显著降低，而本发明发现，在冻存保护剂中添加野甘草醇可以抵消DMSO含量降低带来的冻存损伤，野甘草醇对造血干细胞具有冻存保护作用，抑制Caspase-3表达可能是野甘草醇发挥对造血干细胞冻存保护作用的一个机制。
上述实施例用来介绍本发明的实质性内容，但不能以此限定本发明保护范围。

Claims (1)

1.一种冻存保护剂在造血干细胞-80℃直接冻存方面的应用，用于提高造血干细胞冻存存活率且不降低造血干细胞的干细胞干性；所述冻存保护剂由DMSO、羟乙基淀粉和野甘草醇经生理盐水溶解配制而成，其中：DMSO体积百分浓度为15%，羟乙基淀粉质量体积浓度为40%，野甘草醇浓度为100μM；将该冻存保护剂与造血干细胞悬液按照体积比1:4混合使用。
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