CN105230604A

CN105230604A - 骨髓间充质干细胞保存液及其应用

Info

Publication number: CN105230604A
Application number: CN201510601214.9A
Authority: CN
Inventors: 曾宪卓; 鲁菲
Original assignee: Shenzhen Huayu Hematopoietic Stem Cell Research Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Huayu Hematopoietic Stem Cell Research Co Ltd
Priority date: 2015-09-21
Filing date: 2015-09-21
Publication date: 2016-01-13

Abstract

本发明提供了一种骨髓间充质干细胞保存液，该骨髓间充质干细胞保存液为含有1.5～3WT％肝素、0.5～1.5WT％透明质酸和1～3WT％海藻糖的基础液；其中，基础液为包括1.5～2.5mmol/L的L-谷氨酰胺、20～30mmol/L的HEPES、0.6～1.4mmol/L的丙酮酸钠以及90～110mg/L的硫酸庆大霉素的水溶液。采用本发明的保存液进行保存的过程中，使骨髓间充质干细胞维持在比较稳定的代谢状态，且能尽量降低或者减缓在保存过程中出现的细胞损伤的程度，并且能抑制低水平代谢容易引发的休眠和凋亡的倾向，最终在保存之后能得到活性更好的细胞。

Description

骨髓间充质干细胞保存液及其应用

技术领域

本发明属于细胞保存液技术领域，具体涉及一种骨髓间充质干细胞保存液及其应用。

背景技术

干细胞治疗是将具有不断自我繁殖能力和多向化潜能的干细胞在体外培养后，再将其移植入患者受损或缺损组织，从而实现对损伤组织的补充和修复。而目前能实现人骨髓间充质干细胞分离并大规模培养的细胞很少，在细胞培养完成之后，同时还需要对细胞进行表型检测、细胞形状分析等等，之后将细胞保存在保存液中，待需要时再进行输注。在人骨髓间充质干细胞培养后进行保存的阶段中，既要维持细胞的基本生命代谢以防止其死亡，同时又要避免其代谢量过大而继续大量增殖产生的大量形状变异。所以细胞保存中，都采用0.9WT％氯化钠注射液、5WT％葡萄糖注射液、复方电解质注射液(PlasmalyteA)、1～5WT％人血白蛋白溶液等作为细胞的保存介质来进行。

但是细胞保存的过程中，采用上述骨髓间充质干细胞的保存液进行保存，在需要保存时间较短时(4h内)细胞的性质和变化还能维持在比较正常的水平，细胞活性降低的程度还不会大幅降低治疗的品质。但是如果保存的时间上进一步增加，进行稍长时间的保存时，首先细胞具有表型异变、活性降低、聚集成团等倾向和性状变化更加明显，这些都会降低细胞的品质影响治疗的效果，而上述保存液本身不具有缓解或者降低这些保存过程中问题的能力；并且上述保存液本身营养配比不适当、成分比较单一、细胞外环境渗透压维持不够力度，也不太能满足稍长时间保存的要求；同时保存液还不具有抵抗外界污染的能力，遇到污染时骨髓间充质干细胞不具有良好的竞争性抑制能力。

发明内容

本发明实施的目的在于克服现有通常骨髓间充质干细胞保存液的缺陷，提供一种能较好地保持细胞活性，并减缓和修复细胞损伤的骨髓间充质干细胞保存液。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种骨髓间充质干细胞保存液，该骨髓间充质干细胞保存液为含有1.5～3WT％肝素、0.5～1.5WT％透明质酸和1～3WT％海藻糖的基础液；

其中，所述基础液为包括1.5～2.5mmol/L的L-谷氨酰胺、20～30mmol/LHEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、0.6～1.4mmol/L丙酮酸钠以及90～110mg/L硫酸庆大霉素的水溶液。

本发明的上述骨髓间充质干细胞保存液，以基础液作为保存液的基础，提供基本的必要营养成分以维持细胞基本的生命代谢，使细胞的代谢程度处于基本的稳定状态；并且基础液多用非离子性缓冲维持稳定的渗透压和电荷强度，从而进一步降低细胞性状变化的可能。之后再采用添加的肝素、海藻糖和透明质酸的添加成分，进一步对细胞在保存中产生的损伤或者是表型异变等进行修复、以及抑制细胞的成团，用以减少细胞损伤并加强细胞活性的维持效果，从而实现在细胞性状和活性良好保持下进行保存。

在上述骨髓间充质干细胞保存液的基础上，本发明进一步还提出将其进行骨髓间充质干细胞保存的应用。采用本发明的保存液进行保存的过程中，使骨髓间充质干细胞维持在比较稳定的代谢状态，且能尽量降低或者减缓在保存过程中出现的细胞损伤的程度，并且能抑制低水平代谢容易引发的休眠和凋亡的倾向，最终在保存之后能得到活性更好的细胞。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实例提出一种骨髓间充质干细胞保存液，其成分为含有1.5～3WT％肝素、0.5～1.5WT％透明质酸和1～3WT％海藻糖的基础液；

其中，基础液为包括1.5～2.5mmol/L的L-谷氨酰胺、20～30mmol/LHEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、0.6～1.4mmol/L丙酮酸钠以及90～110mg/L硫酸庆大霉素的水溶液。

在本发明的上述基础上，基础液中的成分根据细胞保存过程中所需的细胞的基本生命代谢的营养要求以及保存过程能利于细胞性状维持的功能需要进行成分选定。首先，L-谷氨酰胺(L-glutamine)在氨基酸组分中的有重要作用，谷氨酰胺可以合成核酸和蛋白质，是细胞生长必需成分，而谷氨酷胺缺乏会使细胞生长不良甚至导致细胞死亡。所以本发明在保存液中添加一定浓度的L-谷氨酰胺，在保存中满足细胞基本代谢所需的谷氨酷胺，维持代谢活动处于相对较低的水平，避免胁迫式的进行大量代谢，反而会大大缩短组织细胞的寿命和活性。同时，本发明中添加L-谷氨酰胺的目的还在于，其在机体内能参与消化道黏膜黏蛋白构成成分氨基葡萄糖的生物合成，从而促进黏膜上皮组织的修复；对其功能跟踪发现用于体外之后其可以有助于细胞膜结构的补充和修复功能，避免细胞的裂解死亡；所以，在本发明保存液中使用还能借助其进行细胞膜的修复功能。

进一步，基础液中的丙酮酸钠作为维持基本的能量物质，是一种糖代谢的底物。原本对于人骨髓间充质干细胞来说，一般情况下培养或者保存时给定的能源物质一般都是葡萄糖，相比细胞保存的要求，保存过程中所需的细胞代谢途径尽量不要过于复杂，以免容易导致诱发细胞产生性状变异；所以，在实验对比之后，采用丙酮酸钠进行基础能源物质来维持细胞的基本代谢要求。

同时，基础液中的硫酸庆大霉素是一种碱性的氨基糖苷类广谱抗生素，对多种革兰阴性菌及阳性菌都具有抑菌和杀菌作用。对绿脓杆菌、产气杆菌、肺炎杆菌、沙门氏菌属、大肠杆菌及变形杆菌等革兰阴性菌和金葡菌等作用较强。本发明在基础液中添加硫酸庆大霉素可以防止在保存下中极有可能发生的细菌污染，提升干细胞在受到污染时的竞争性优势。并且，本发明中采用硫酸庆大霉素作为抗生素的原因还在于其是氨基糖苷类物质，是常用的静态抗菌素，相比双抗的青霉素和链霉素，其稳定性更强；添加双抗之后，青霉素在4度温度下1～2天后基本就完全降解失效了，而且抗生素种类越多越容易引起细胞的形态改变，这对于本发明提升骨髓间充质干细胞的保存品质是不利的，所以，在机理对比和反复试验考量之后，本发明采用添加90～110mg/L的硫酸庆大霉素进行。

同时，在上述三种基础液成分确定之后，基础液中进一步添加20～30mmol/LHEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，HEPES是一种非离子两性缓冲液，相比离子型的磷酸盐缓冲液，缓冲效果更加稳定一些；自身有利于保持保存液渗透压的持久稳定。

整体上，由于细胞一般比较通常所最适的渗透压耐受范围260～320mmol/L，同时结合本发明中细胞保存中各成分所起的功能，所以调整各成分的浓度为上述描述的浓度。

进一步在基础液的基础上，其中还添加有三种细胞功能成分，其中，肝素具有抗炎生物活性，可以使之能够对抗细胞保存过程中引起细胞损伤的炎性因子的作用，一方面可以抑制细胞损伤的进一步加深、另一方面利于修复。同时，肝素本身也是一种糖胺聚糖，其分子表面丰富的电荷可能使其与细胞膜表面产生相互作用而起到一定的稳定作用，减少细胞损伤。而海藻糖是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，其能在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征，在细胞的保存过程中，可以抑制细胞在非大量代谢情形下的退化和凋亡。最终，透明质酸增加溶液黏性，使保存液溶液胶体渗透压也增加，从而防止细胞易出现的破裂状态，为细胞的活性状态的维持也提供了基础。所以，这三种细胞功能成分，结合基础液得到的本发明上述骨髓间充质干细胞保存液，具有更强的细胞生命活性保持能力，同时保存液自身的渗透压等等参数的稳定保持上能更加长久，避免了保存液自身环境易于改变而引起的细胞性状变化缺陷。

基于上述保存液的成分，在实施的过程中，虽然骨髓间充质干细胞的代谢状态基本维持在基础生命代谢程度，而不存在其他的功能代谢，但是由于本身营养成分种类和量都较低，保存的过程中半饥饿状态的细胞会慢慢向休眠或者凋亡进行转变；所以在实施的过程中可以在基础液中添加0.08～0.12mmol/L非必需氨基酸；非必需氨基酸的添加可以有助于完善基本营养成分，补充代谢过程，抑制细胞休眠或者凋亡。当然，对于人骨髓间充质干细胞的基本代谢来说，非必需氨基酸的种类比较多(有十多种)，种类越多越容易诱发细胞产生多样性变化，选择少数几种即可。本发明实施例优选选择半胱氨酸和/或酪氨酸等半必需氨基酸，这些非必须氨基酸中的半必需氨基酸，在有补充的情况下，可以降低细胞自身对必须氨基酸的代谢压力。

进一步在上述实施方式的基础上，在用作能源底物的丙酮酸钠的基础上，还可以辅助搭配乳酸钠，控制添加浓度为0.2～0.8mmol/L。乳酸钠可以辅助完善细胞的基本营养成分。

本发明在上述骨髓间充质干细胞保存液的基础上，进一步还提出将该骨髓间充质干细胞保存液进行骨髓间充质干细胞保存的应用。采用本发明的保存液进行保存的过程中，使骨髓间充质干细胞维持在比较稳定的代谢状态，且能尽量降低或者减缓在保存过程中出现的细胞损伤的程度，并且能抑制低水平代谢容易引发的休眠和凋亡的倾向，最终在保存之后能得到活性更好的细胞。

为使本发明的上述实施的技术细节和过程方法能更易于本领域技术人员的理解和实施参考，同时凸显出本发明骨髓间充质干细胞保存液的性能和品质，以下通过具体的实施例进行举例说明。

实施例1

在实施之前，按照下述物质成分获取各物料，用注射用水配置成5L保存液备用，同时各物料成分的浓度按照如下进行：2mmol/L的L-谷氨酰胺、0.1mmol/L的酪氨酸、30mmol/L的HEPES、0.8mmol/L丙酮酸钠、0.3mmol/L的乳酸钠、100mg/L硫酸庆大霉素制成基础液；然后向基础液中按照终浓度2WT％肝素、1WT％透明质酸和2WT％海藻糖的加入肝素、透明质酸和海藻糖，充分溶解后定容至5L，冰箱保存备用。

S10，获取骨髓间充质干细胞：

取人髋关节手术或下肢骨开放性手术时收集用于原代MSCs分离和培养的骨髓标本，肝素抗凝；

每份骨髓标本按1:2的比例加在密度为1.073g/ml的percoll分离液上2300rpm离心30min，取中层单核细胞，加入消毒PBS缓冲液，1000rpm离心10min，洗涤3次，弃上清液后得到的细胞即为MSCs。

所得MSCs在光学显微镜下计数，调整至1×10⁷/培养瓶(25ml)密度用于细胞原代培养，培养的方式采用血清培养体系培养，具体培养基为含10％胎牛血清、氢化可的松(10^-6mol/L)、青霉素(100U/ml)及链霉素(100mg/ml)的低糖DMEM(L-DMEM)。

S20，MSCs传代与体外扩增：

当步骤S10的细胞生长到几乎完全融合时，倾去旧培养基，用PBS液漂洗2～3次，倾去PBS液，加入0.25％的胰蛋白酶(内含0.02％EDTA)，加入量以使胰蛋白酶可以完全覆盖瓶底的细胞为准。

将培养瓶置于倒置显微镜下观察，见胞质回缩，细胞间隙增大后，立即加入含10％胎牛血清的低糖DMEM培养终止消化，吸管顺序轻轻吹打瓶底，倒置显微镜下观察细胞完全脱壁后，按1:2～1:3比例传代接种于25ml培养瓶(培养基与步骤S10采用相同)，放置于37℃、5％CO₂、95％湿度的培养箱中培养，直至细胞生长到几乎完全融合时，再次进行传代；每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。

S30，将步骤S20的细胞培养至P3代完成时，获取P3代的骨髓间充质干细胞用于保存试验：用0.25％胰酶消化后，细胞悬液进行细胞计数，约1×10⁶个/m1，以每孔1×10⁴个接种于96孔培养板中，于CO₂培养箱37℃静置培养30h后，吸取剩余培养液后，用相应保存液洗涤2遍后加入3ml现有保存液(0.9WT％氯化钠注射液、5WT％葡萄糖注射液、复方电解质注射液(PlasmalyteA)、1WT％人血白蛋白溶液或5WT％人血白蛋白溶液作为对照)及本发明保存液，各组设3个相同复孔；换液后于4℃放置5h后进行活性评价。

上述步骤S30用不同的保存液保存之后的细胞的活性评价的方式中，首先检测保存之后的细胞存活率，方法采用台盼蓝染色法检测：

将用不同保存液(即现有的几种保存液和)保存后的MSCs经过对应保存时间点离心，l000rpm、5min弃去上清；PBS重悬细胞沉淀，充分混匀，取18μl细胞悬液与2μl的0.4％苔盼蓝染液充分混匀；取适量悬液滴加到血球计数板计数腔内，加盖玻片，显微镜下观察；分别计数活细胞与死细胞，计数过程在3min内完成，未着色的细胞为活细胞，染成蓝色的细胞为死细胞。

细胞存活率(％)＝活细胞数/总细胞数×100％。

氯化钠注射液	葡萄糖注射液	人白蛋白溶液	复方电解质注射液	本发明
					72.37±10.32％	78.54±9.64％	80.62±8.45％	65.24±8.67％	83.93±7.28％

从上表的各种保存液保存5h后的细胞存活率的计算结果，可以看出，除了复方电解质注射液存活率稍低之外，其他的几种保存之后细胞存活率相差的不大，虽然本发明的存活率稍高一些，但是幅度差异却并不非常大。一方面原因是因为时间比较短，保存的时间为5h，还无法有非常大的体现的效果。所以在上述基础上，延长保存时间至10h后再次进行上述细胞存活率的检测，其结果如下：

氯化钠注射液	葡萄糖注射液	人白蛋白溶液	复方电解质注射液	本发明
					52.15±8.44％	53.34±6.12％	60.61±9.65％	48.36±8.26％	76.47±8.21％

从上表的结果可以看出，延长保存时间之后可以体现出各保存液的优劣，首先常规的人白蛋白溶液是稍微均衡的细胞生命物质，所以比其他的基中保存液的保存后的细胞存活率高，本发明中营养更加均衡，在长时间保存后还能具有较高的存活率80％左右。

在上述基础存活率检测的基础上，继续进一步进行细胞贴壁率测定，骨髓间充干细胞是一种贴壁型细胞，其存活的一项指标就是细胞能够贴壁、增殖,因此骨髓间充干贴壁性能的差异即反映了细胞活力的差异；检测贴壁率用来反映其存活细胞的细胞表型变化程度和细胞的活性能力：

将上述培养的P3代细胞消化后用PBS制成细胞悬液，以2×l0⁶/组保存在相应保存介质与保存温度下；按时间点保存4h结束后，离心l000rpm、5min，弃上清；用正常完全培养基轻轻漂洗细胞一次；再用完全培养基重悬细胞，每组以2×10⁴/孔接种于24孔板中，放置于细胞培养箱中培养24h；待细胞贴壁后，微量移液器移除培养液，用PBS轻轻漂洗2次，去除未贴壁细胞；70％乙醇固定20min后PBS轻轻漂洗1～2次；结晶紫染液染色15min(100μl，没过孔板底部)；去离子水轻轻漂洗2～3次，尽可能去除背景颜色；置于显微镜下观察、计数、拍照；细胞贴壁率＝已贴壁细胞总数/接种细胞数×l00％。

氯化钠注射液	葡萄糖注射液	人白蛋白溶液	复方电解质注射液	本发明
					52.76±7.63	48.79±13.23	46.72±5.12	56.14±7.32	78.96±12.37

从上述保存4h后的细胞贴壁率的结构对比可以看出，虽然没有重复延长保存时间至10h等更长，但这一贴壁率的对比已经比较明显，在现有的常规的保存液中，复方电解质注射液相比对细胞的损伤或者引起其细胞表型改变的情况少一些，而，其他的几种现有的保存液相比对细胞的损伤或者引起其细胞表型改变的情况可能更大一些，且这些现有的常规保存液保存的细胞与本发明的保存液保存的细胞相比，应当是贴壁能力弱化至半贴壁程度，所以结构的差异在这一方面即可体现。说明本发明的保存液在维持细胞的活性、防止细胞凋亡和转向休眠的问题上有明显的优势。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种骨髓间充质干细胞保存液，其特征在于，该骨髓间充质干细胞保存液为含有1.5～3WT％肝素、0.5～1.5WT％透明质酸和1～3WT％海藻糖的基础液；

其中，所述基础液为含有1.5～2.5mmol/L的L-谷氨酰胺、20～30mmol/L的HEPES、0.6～1.4mmol/L的丙酮酸钠以及90～110mg/L的硫酸庆大霉素的水溶液。

2.如权利要求1所述的骨髓间充质干细胞保存液，其特征在于，所述基础液中还包括0.2～0.8mmol/L的乳酸钠。

3.如权利要求1或2所述的骨髓间充质干细胞保存液，其特征在于，所述基础液中还包括有0.08～0.12mmol/L的非必需氨基酸。

4.如权利要求3所述的骨髓间充质干细胞保存液，其特征在于，所述非必需氨基酸为半胱氨酸和/或酪氨酸。

5.如权利要求1至4任一项所述的骨髓间充质干细胞保存液在骨髓间充质干细胞保存中的应用。