CN105394027A - 一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，属于干细胞冻存领域。本发明的一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法包括抽取骨髓，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2．16g/L的β-磷酸甘油钠和37.5mg/L的2-磷酸抗坏血酸的培养液中，5%CO₂的培养箱中，37℃的温度下培养8d；用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培养液进行第1次传代；以1.6×10⁴/cm²的细胞密度接种，培养至P2代等四个步骤。本发明具有在冷冻过程中对冻存细胞低细胞毒性损伤，低保护剂渗透性损伤，同时避免形成冰晶引起机械损伤，提高冻存细胞复苏率的特点。

Description

一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法

技术领域

本发明涉及一种干细胞冻存方法，特别是一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法。

背景技术

骨髓间充质干细胞是构建组织工程化骨重要的种子细胞，实现骨髓间充质干细胞的深低温保存对骨组织工程具有重要的意义。玻璃化冻存是使细胞及其保护剂溶液以足够快的降温速率过冷到其玻璃化转变温度，而被固化为完全的玻璃态并以这种玻璃态在低温下长期保存的方法，在这一过程中细胞内外完全避免了结晶，从而得以避免由于结冰而引起的各种损伤。程序化冻存的复苏率只有5%~10%，而玻璃化冻存的复苏率>75%，因此玻璃化冻存是目前保存早期干细胞的重要方法。

但是玻璃化冻存存在着局限性。现有技术中玻璃化冻存剂通常采用DMSO，DMSO存在细胞毒性，在冷冻过程中可能引起从而引起细胞毒性损伤，保护剂的渗透性损伤，同时形成冰晶引起机械损伤，这些冷冻损伤都会大大降低冻存细胞的复苏率。

发明内容

本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种在冷冻过程中对冻存细胞低细胞毒性损伤，低保护剂渗透性损伤，同时避免形成冰晶引起机械损伤，提高冻存细胞复苏率的一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法。

本发明采用的技术方案如下：

本发明的一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，包括以下几个步骤:

步骤一：抽取骨髓，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2．16g/L的β-磷酸甘油钠和37.5mg/L的2-磷酸抗坏血酸的培养液中，5%CO₂的培养箱中，37℃的温度下培养8d；用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培养液进行第1次传代；以1.6×10⁴/cm²的细胞密度接种，培养至P2代。

当细胞分散成单个时容易受到损伤并凋亡，由于采用了上述技术方案，将干细胞克隆成团后再进行保存，可以降低细胞所受到的损伤，提高细胞的存活率，从而提高复苏率。

步骤二：将P2代骨髓间充质干细胞团完全浸泡在0.85%~0.9%的盐水中，维持温度在3.2~3.9℃的条件下，在次声波振荡条件下加入8.2%~8.6%的渗透性保护液，0.8%~1%的单糖，20%的人血清白蛋白，2.1%~2.3%的Rho抑制剂，继续在次声波条件下振荡30~45s，加入玻璃化液；

由于采用了上述技术方案，温度在3.9℃的条件下DMSO对细胞毒性最小，但是温度过低，冻存液中可能形成小冰晶，从而对细胞造成机械损伤，因此将温度控制在3.2~3.9℃。

现有技术通常采用20%的DMSO作为保护液，由于采用了上述技术方案，降低了渗透性保护液的含量，从而降低了保护剂的细胞毒性，减小了在冷冻过程中保护剂对冻存细胞造成的细胞毒性损伤。

单糖不仅可以为细胞代谢提供一定的营养，同时可以作为非渗透性保护剂，保证降低了渗透性保护剂含量，对冻存效果不会造成影响。

Rho抑制剂能够抑制Rho激酶的细胞活动，从而抑制细胞骨架重组、细胞黏附和移动、胞质分裂和基因表达等细胞活动，提高冻存效果。

生理盐水降低了保护剂的渗透压，减小了在冻存过程中引起保护剂的渗透性损伤，从而提高了复苏率。

将细胞克隆成团再进行冻存虽然提高了细胞的存活率，但是克隆团块限制了克隆内部细胞暴露于冷冻保护剂，因此在次声波振荡条件下，可以将冷冻保护剂迅速扩散开，深入克隆内部细胞，从而将克隆团块内部的细胞也暴露在冷冻保护剂中。

步骤三：将步骤二中制得的混合液在真空状态下，直接投入液氮中，按照平均600℃/min的降温速率迅速降温至-196℃；

由于采用了上述技术方案，在真空状态下，阻隔空气热交换，提高冷冻效率，能够迅速降温，从而避免在冷冻过程中出现小冰晶，使得包含干细胞的冷冻液直接形成玻璃体，提高冻存效率。

步骤四：存入液氮罐中保存。

由于采用了上述技术方案，在液氮温度下，细胞、组织内各种酶的活力及代谢很低，几乎为零，声明处于所谓的“停滞”状态。在此温度下冻存的细胞，理论上可以无限期保存。

本发明的一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，所述次声波的频率为8~13Hz。

由于采用了上述技术方案，该频率与人体器官震动频率相接近，从而使得干细胞更好的适应冻存液环境，提高保护剂渗透效果。

本发明的一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，所述渗透性保护液为DMSO和聚乙二醇的混合溶液。

由于采用了上述技术方案，聚乙二醇也可以做为渗透性保护剂，聚乙二醇的效果略低于DMSO，但是细胞毒性远远低于DMSO，因此采用二者的混合溶液，虽然比使用DMSO效果略差，但是细胞毒性小于使用DMSO，总体上复苏率略高于单独使用DMSO。

本发明的一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，所述渗透性保护液为40%的DMSO和60%的聚乙二醇。

本发明的一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，所述单糖为葡萄糖和果糖的混合溶液。

本发明的一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，所述单糖包括0.3%~0.5%的葡萄糖和0.5%~0.7%的果糖。

本发明的一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，所述Rho抑制剂为Y-27632、法苏地尔和羟基法苏地尔中的一种或几种。

由于采用了上述技术方案，上述三种Rho抑制剂均能够很好的抑制Rho激酶活动，三者平行比较对复苏率的影响无太大的影响。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、降低了保护剂中细胞毒性保护剂的含量，减小了在冷冻过程中保护剂对冻存细胞造成的细胞毒性损伤，抑制Rho激酶的细胞活动，从而抑制细胞骨架重组、细胞黏附和移动、胞质分裂和基因表达等细胞活动，整体上提高了冻存的复苏率。

2、将干细胞克隆成团后再进行保存，可以降低细胞所受到的损伤，提高细胞的存活率，避免在冻存液中形成小冰晶，从而避免对细胞造成机械损伤，从而提高了冻存的复苏率。

附图说明

图1为未冻存细胞和冻存后复苏细胞显微镜观测图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明作详细的说明。

为了使发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

如图1所示，一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，包括以下几个步骤:

步骤一：抽取骨髓，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2．16g/L的β-磷酸甘油钠和37.5mg/L的2-磷酸抗坏血酸的培养液中，5%CO₂的培养箱中，37℃的温度下培养8d；用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培养液进行第1次传代；以1.6×10⁴/cm²的细胞密度接种，培养至P2代；

步骤二：将P2代骨髓间充质干细胞团完全浸泡在0.6%NaCl和67.9%去离子水的混合溶液中，维持温度在3.2℃的条件下，在次声波振荡频率为8Hz的条件下加入3.4%的DMSO，5.2%的聚乙二醇，0.3%的葡萄糖，0.5%的果糖，20%的人血清白蛋白，2.1%的Rho抑制剂，其中Rho抑制剂为Y-27632，继续在次声波条件下振荡30s，加入玻璃化液；

步骤三：将步骤二中制得的混合液在真空状态下，直接投入液氮中，按照平均600℃/min的降温速率迅速降温至-196℃；

步骤四：存入液氮罐中保存。

实验冻存材料：动物，2岁龄比格犬，雄性，体重为22.7kg。

实验方法：

按上述四个步骤冻存干细胞24h后，

步骤五：将冻存液从液氮中取出，投入LNG中升温1min；

步骤六：将冻存液从LNG中取出，在真空状态下投入冰浴中，按照平均560℃/min的升温速率迅速降温至3.2~3.9℃；

步骤七：将冻存液倒入0.9%的盐水中，维持温度在3.2~3.9℃的条件下，在次声波（频率为8~13Hz）振荡条件下加入20%的人血清白蛋白，0.8%~1%的单糖，0.8%~1.2%的非必需氨基酸，0.08%~0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%~0.04%的β-巯基乙醇，调节体系的pH为6.8~7.6，加入1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，继续在次声波条件下振荡30~45s；

步骤八：将稀释后的冻存液在400r/min的条件下离心5min，去除上清液，向细胞沉淀中加入0.21%~0.23%的细胞生长因子，重新悬浮细胞。

测定细胞的复苏率：将3×10⁵个复苏冻存干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式：复苏率=培养后细胞总数÷（3×10⁵×增值率），得到冻存细胞的复苏率；同时将3×10⁵个P2代干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式：增值率=培养后细胞总数÷（3×10⁵）。

实验结果：测得复苏率为97.6%（图1上图为未冻存的干细胞，下图为冻存24h后复苏的干细胞）

实施例2

一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，包括以下几个步骤:

步骤一：抽取骨髓，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2．16g/L的β-磷酸甘油钠和37.5mg/L的2-磷酸抗坏血酸的培养液中，5%CO₂的培养箱中，37℃的温度下培养8d；用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培养液进行第1次传代；以1.6×10⁴/cm²的细胞密度接种，培养至P2代；

步骤二：将P2代骨髓间充质干细胞团完全浸泡在0.6%NaCl和67.9%去离子水的混合溶液中，维持温度在3.9℃的条件下，在次声波振荡频率为13Hz的条件下加入3.2%的DMSO，5%的聚乙二醇，0.5%的葡萄糖，0.7%的果糖，20%的人血清白蛋白，2.3%的Rho抑制剂，其中Rho抑制剂为Y-27632、法苏地尔和羟基法苏地尔1:1:1的混合物，继续在次声波条件下振荡45s，加入玻璃化液；

步骤三：将步骤二中制得的混合液在真空状态下，直接投入液氮中，按照平均600℃/min的降温速率迅速降温至-196℃；

步骤四：存入液氮罐中保存。

实验冻存材料：动物，2岁龄比格犬，雄性，体重为22.7kg。

实验方法：

按上述四个步骤冻存干细胞24h后，

步骤五：将冻存液从液氮中取出，投入LNG中升温1min；

步骤六：将冻存液从LNG中取出，在真空状态下投入冰浴中，按照平均560℃/min的升温速率迅速降温至3.2~3.9℃；

步骤七：将冻存液倒入0.9%的盐水中，维持温度在3.2~3.9℃的条件下，在次声波（频率为8~13Hz）振荡条件下加入20%的人血清白蛋白，0.8%~1%的单糖，0.8%~1.2%的非必需氨基酸，0.08%~0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%~0.04%的β-巯基乙醇，调节体系的pH为6.8~7.6，加入1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，继续在次声波条件下振荡30~45s；

步骤八：将稀释后的冻存液在400r/min的条件下离心5min，去除上清液，向细胞沉淀中加入0.21%~0.23%的细胞生长因子，重新悬浮细胞。

测定细胞的复苏率：将3×10⁵个复苏冻存干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式：复苏率=培养后细胞总数÷（3×10⁵×增值率），得到冻存细胞的复苏率；同时将3×10⁵个P2代干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式：增值率=培养后细胞总数÷（3×10⁵）。

实验结果：测得复苏率为96.9%

实施例3

一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，包括以下几个步骤:

步骤一：抽取骨髓，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2．16g/L的β-磷酸甘油钠和37.5mg/L的2-磷酸抗坏血酸的培养液中，5%CO₂的培养箱中，37℃的温度下培养8d；用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培养液进行第1次传代；以1.6×10⁴/cm²的细胞密度接种，培养至P2代；

步骤二：将P2代骨髓间充质干细胞团完全浸泡在0.6%NaCl和67.9%去离子水的混合溶液中，维持温度在3.5℃的条件下，在次声波振荡频率为10Hz的条件下加入8.4%的渗透性保护液，0.35%的葡萄糖，0.55%的果糖，20%的人血清白蛋白，2.2%的Rho抑制剂，其中渗透性保护液为40%的DMSO和60%的聚乙二醇，Rho抑制剂为法苏地尔和羟基法苏地尔的混合溶液，继续在次声波条件下振荡45s，加入玻璃化液；

步骤三：将步骤二中制得的混合液在真空状态下，直接投入液氮中，按照平均600℃/min的降温速率迅速降温至-196℃；

步骤四：存入液氮罐中保存。

实验冻存材料：动物，2岁龄比格犬，雄性，体重为22.7kg。

实验方法：

按上述四个步骤冻存干细胞24h后，

步骤五：将冻存液从液氮中取出，投入LNG中升温1min；

步骤六：将冻存液从LNG中取出，在真空状态下投入冰浴中，按照平均560℃/min的升温速率迅速降温至3.2~3.9℃；

步骤七：将冻存液倒入0.9%的盐水中，维持温度在3.2~3.9℃的条件下，在次声波（频率为8~13Hz）振荡条件下加入20%的人血清白蛋白，0.8%~1%的单糖，0.8%~1.2%的非必需氨基酸，0.08%~0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%~0.04%的β-巯基乙醇，调节体系的pH为6.8~7.6，加入1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，继续在次声波条件下振荡30~45s；

步骤八：将稀释后的冻存液在400r/min的条件下离心5min，去除上清液，向细胞沉淀中加入0.21%~0.23%的细胞生长因子，重新悬浮细胞。

测定细胞的复苏率：将3×10⁵个复苏冻存干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式：复苏率=培养后细胞总数÷（3×10⁵×增值率），得到冻存细胞的复苏率；同时将3×10⁵个P2代干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式：增值率=培养后细胞总数÷（3×10⁵）。

实验结果：测得复苏率为97.4%

实施例4

一种低冷冻损伤的干细胞冻存方法，包括以下几个步骤:

步骤一：抽取脐带血，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2．16g/L的β-磷酸甘油钠和37.5mg/L的2-磷酸抗坏血酸的培养液中，5%CO₂的培养箱中，37℃的温度下培养8d；用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培养液进行第1次传代；以1.6×10⁴/cm²的细胞密度接种，培养至P2代；

步骤二：将P2代脐带血干细胞团完全浸泡在0.6%NaCl和67.9%去离子水的混合溶液中，维持温度在3.5℃的条件下，在次声波振荡频率为10Hz的条件下加入8.5%的渗透性保护液，1%的单糖，20%的人血清白蛋白，2.1%的Rho抑制剂，其余组分为生理盐水，Rho抑制剂为Y-27632、法苏地尔和羟基法苏地尔1:1:1的混合物，继续在次声波条件下振荡45s，加入玻璃化液；

步骤三：将步骤二中制得的混合液在真空状态下，直接投入液氮中，按照平均600℃/min的降温速率迅速降温至-196℃；

步骤四：存入液氮罐中保存。

实验冻存材料：脐带血干细胞

实验方法：

按上述四个步骤冻存干细胞24h后，

步骤五：将冻存液从液氮中取出，投入LNG中升温1min；

步骤六：将冻存液从LNG中取出，在真空状态下投入冰浴中，按照平均560℃/min的升温速率迅速降温至3.2~3.9℃；

步骤七：将冻存液倒入0.9%的盐水中，维持温度在3.2~3.9℃的条件下，在次声波（频率为8~13Hz）振荡条件下加入20%的人血清白蛋白，0.8%~1%的单糖，0.8%~1.2%的非必需氨基酸，0.08%~0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%~0.04%的β-巯基乙醇，调节体系的pH为6.8~7.6，加入1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，继续在次声波条件下振荡30~45s；

步骤八：将稀释后的冻存液在400r/min的条件下离心5min，去除上清液，向细胞沉淀中加入0.21%~0.23%的细胞生长因子，重新悬浮细胞。

测定细胞的复苏率：将3×10⁵个复苏冻存干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式：复苏率=培养后细胞总数÷（3×10⁵×增值率），得到冻存细胞的复苏率；同时将3×10⁵个P2代干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式：增值率=培养后细胞总数÷（3×10⁵）。

实验结果：测得复苏率为94.3%

实施例5

一种低冷冻损伤的干细胞冻存方法，包括以下几个步骤:

步骤一：抽取脐带血，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2．16g/L的β-磷酸甘油钠和37.5mg/L的2-磷酸抗坏血酸的培养液中，5%CO₂的培养箱中，37℃的温度下培养8d；用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培养液进行第1次传代；以1.6×10⁴/cm²的细胞密度接种，培养至P2代；

步骤二：将P2代脐带血干细胞团完全浸泡在8.4%的渗透性保护液，0.9%的单糖，20%的人血清白蛋白，2.3%的Rho抑制剂，其余组分为生理盐水，Rho抑制剂为Y-27632和羟基法苏地尔2:1的混合物，继续在次声波条件下振荡45s，加入玻璃化液；

步骤三：将步骤二中制得的混合液在真空状态下，直接投入液氮中，按照平均600℃/min的降温速率迅速降温至-196℃；

步骤四：存入液氮罐中保存。

实验冻存材料：脐带血干细胞

实验方法：

按上述四个步骤冻存干细胞24h后，

步骤五：将冻存液从液氮中取出，投入LNG中升温1min；

步骤六：将冻存液从LNG中取出，在真空状态下投入冰浴中，按照平均560℃/min的升温速率迅速降温至3.2~3.9℃；

步骤七：将冻存液倒入0.9%的盐水中，维持温度在3.2~3.9℃的条件下，在次声波（频率为8~13Hz）振荡条件下加入20%的人血清白蛋白，0.8%~1%的单糖，0.8%~1.2%的非必需氨基酸，0.08%~0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%~0.04%的β-巯基乙醇，调节体系的pH为6.8~7.6，加入1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，继续在次声波条件下振荡30~45s；

步骤八：将稀释后的冻存液在400r/min的条件下离心5min，去除上清液，向细胞沉淀中加入0.21%~0.23%的细胞生长因子，重新悬浮细胞。

测定细胞的复苏率：将3×10⁵个复苏冻存干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式：复苏率=培养后细胞总数÷（3×10⁵×增值率），得到冻存细胞的复苏率；同时将3×10⁵个P2代干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式：增值率=培养后细胞总数÷（3×10⁵）。

实验结果：测得复苏率为94.9%

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，其特征在于包括以下几个步骤:

步骤一：抽取骨髓，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2．16g/L的β-磷酸甘油钠和37.5mg/L的2-磷酸抗坏血酸的培养液中，5%CO₂的培养箱中，37℃的温度下培养8d；用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培养液进行第1次传代；以1.6×10⁴/cm²的细胞密度接种，培养至P2代；

步骤二：将P2代骨髓间充质干细胞团完全浸泡在0.85%~0.9%的盐水中，维持温度在3.2~3.9℃的条件下，在次声波振荡条件下加入8.2%~8.6%的渗透性保护液，0.8%~1%的单糖，20%的人血清白蛋白，2.1%~2.3%的Rho抑制剂，继续在次声波条件下振荡30~45s，加入玻璃化液；

步骤三：将步骤二中制得的混合液在真空状态下，直接投入液氮中，按照平均600℃/min的降温速率迅速降温至-196℃；

步骤四：存入液氮罐中保存。

2.如权利要求1所述的一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，其特征在于：所述次声波的频率为8~13Hz。

3.如权利要求1所述的一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，其特征在于：所述渗透性保护液为DMSO和聚乙二醇的混合溶液。

4.如权利要求1或3所述的一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，其特征在于：所述渗透性保护液为40%的DMSO和60%的聚乙二醇。

5.如权利要求1所述的一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，其特征在于：所述单糖为葡萄糖和果糖的混合溶液。

6.如权利要求5所述的一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，其特征在于：所述单糖包括0.3%~0.5%的葡萄糖和0.5%~0.7%的果糖。

7.如权利要求5所述的一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，其特征在于：所述Rho抑制剂为Y-27632、法苏地尔和羟基法苏地尔中的一种或几种。