CN112715533A

CN112715533A - 一种间充质干细胞的冻存液及冻存方法

Info

Publication number: CN112715533A
Application number: CN202110218373.6A
Authority: CN
Inventors: 刘彦彦; 雷童; 李晓梅; 王治世; 李颖娴; 杜宏武
Original assignee: Kangyanbao Beijing Stem Cell Technology Co ltd
Current assignee: Kangyanbao Beijing Stem Cell Technology Co ltd
Priority date: 2021-02-26
Filing date: 2021-02-26
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2041-02-26
Also published as: CN112715533B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种间充质干细胞的冻存液及冻存方法，该冻存液在避免添加动物血清和二甲基亚砜同时，还能使冻存的间充质干细胞有良好的复苏后活率，使该冻存液在临床实际应用方面更具价值；冻存液的配方包括：甘油的体积百分含量为10‑20%，条件培养基的体积百分含量为18‑40%，人血白蛋白的体积百分含量为40‑65%,海藻糖的体积百分含量为1‑5%,甘氨酸的体积百分含量为1‑2%。

Description

一种间充质干细胞的冻存液及冻存方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种间充质干细胞的冻存液及冻存方法。

背景技术

间充质干细胞（MSC）是一种可以高度增殖和多谱系分化的多能干细胞，是潜在的再生医学的临床材料。MSC具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力,目前在临床应用也很多，如与造血干细胞联合应用时，可以有效提高移植的成功率，加速造血重建。当患者接受大剂量化疗后，将间充质干细胞与造血干细胞一同输入，可明显加速患者血细胞恢复时间，且安全无不良反应。

间充质干细胞不仅存在于骨髓中，也存在于脂肪，脐带等不同来源，包括近年来临床应用显示良好前景的脱落乳牙牙髓干细胞（SHED），也被鉴定认为是新的间充质干细胞来源。

在细胞培养上,MSC一般具有高度增殖的活性，可以在原代提取后的很短代次内扩增出大量的细胞。但是，尽管在工艺上已经有了很多的经验，但是MSC的大规模扩增和培养，始终要经过冻存和复苏过程，这个过程会导致难以避免的细胞损伤和死亡。目前，临床上对MSC干细胞的需求增加，对干细胞冻存与复苏方面的研究引起了越来越多的关注。作为组织工程学研究和潜在临床应用的种子细胞，MSC过度传代会表现明显衰老或凋亡，且长期体外培养易发生自发分化，失去多分化潜能，增殖、黏附能力下降，细胞凋亡率增加，所以冻存MSC是目前应用研究的重要环节。

为了保护干细胞，目前常用的细胞冻存液或市售的细胞冻存液中通常是由二甲基亚砜(dimathylsulfoxide，DMSO)和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)混合组成。尽管常规配方可以保证细胞在冻存前后具有较高的存活率，但是动物来源的血清和DMSO在临床上都有着极大的限制。作为一种动物源的高营养成分，FBS是天然的培养基成分，属于异源性物质，成分复杂，并存在引入污染和过敏原的风险，不适合于临床应用。另外，不同产地和批次的FBS存在较大差异，这对于细胞的稳定培养和扩增是不利的。DMSO的作用机制是在降温过程中透过细胞膜进入细胞内，降低细胞内、外未结冰溶液中电解质浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质损伤，同时细胞内水分不会过度外渗，避免细胞过度脱水皱缩。然而，DMSO是一种细胞高毒性的化学试剂，会导致人体产生恶心，头痛，呕吐甚至休克的反应，在常规细胞培养中被严格控制在1%以下。但是，为了保护细胞，冻存液中的DMSO比例高达10%，虽然在低温冻存条件下DMSO可以起到保护作用，但是复苏过程中，一旦细胞复温则会遭受不良环境，这也是细胞冻存和复苏过程中细胞死亡的一个主要原因。所以，开发新的无FBS和DMSO的新的冻存液是非常必要的。

在细胞冻存过程中，冻存液只需要满足2个条件即可：一个是冻存液的组分要在环境温度从37℃到液氮保存中的-196℃时，可以不形成冰晶破损细胞；另一个条件是提供细胞所需的营养。于是，只需要寻找满足上述条件的材料即可开发新的冻存液。甘油，在低温环境下可以防止水分形成冰晶，在菌种保藏中被使用。提供营养，除了条件培养基可以提供基础的无机盐，水分，氨基酸，脂类及细胞生存必需的生长因子等以外，人血清白蛋白也可以为细胞提供营养，并可以维持细胞正常渗透压，保持细胞膜完整性。在低温保护剂中，糖类和氨基酸类里最常见的分别是海藻糖和甘氨酸。海藻糖可以在低温环境下与蛋白质形成足够的空隙或者氢键，形成局部疏水环境，进而抵抗在冻存过程中的细胞所遭受的力。甘氨酸在冻存过程中起到维持溶液pH的功能，在温度变化时可以抑制pH的变化从而保护蛋白质。联合甘油，条件培养基，人血清白蛋白，海藻糖和甘氨酸形成新的冻存保护液，配方中各个物质发挥协同作用，不仅可以防止冻存液在低温下形成冰晶损伤细胞，还可以提供营养、维持pH并保护蛋白，从而让细胞在低温环境中保持很高的存活率。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的一个目的在于提供一种间充质干细胞的冻存液，该冻存液可以使冻存的干细胞有很高的冻存复活率，同时避免在冻存液中引入动物血清和二甲基亚砜，使该冻存液在临床上更具有使用价值。

本发明的另一个目的在于提供一种间充质干细胞的冻存方法，具有复苏率高的特点，经过冻存的干细胞复苏后的细胞存活率在90%以上。

本发明的一种间充质干细胞的冻存液，所述冻存液的配方包括：甘油的体积百分含量为10-20%，条件培养基的体积百分含量为18-40%，人血白蛋白的体积百分含量为40-65%,海藻糖的体积百分含量为1-5%,甘氨酸的体积百分含量为1-2%。

本发明的一种间充质干细胞的冻存液，所述条件培养基的获取方法：取正常培养的细胞的上清液， 2000 rpm 离心15分钟，离心后取上清，过0.22微米滤膜即可获得条件培养基，放4℃备用。

本发明的一种间充质干细胞的冻存液，所述冻存液的配方包括：甘油的体积百分含量为10%，条件培养基的体积百分含量为38%，人血白蛋白的体积百分含量为50%,海藻糖的体积百分含量为1%，甘氨酸的体积百分含量为1%。

本发明的一种间充质干细胞的冻存方法，向间充质干细胞中加入所述冻存液，混匀后冻存。

本发明的一种间充质干细胞的冻存方法，冻存具体方法为：所述冻存液与所述干细胞混匀后分装到冻存管中，并转移至提前恢复至室温的程序降温盒中，在-80℃超低温冰箱中过夜降温稳定后，转移至液氮长期保存。

与现有技术相比本发明的有益效果为：本发明提供了一种间充质干细胞的冻存液和冻存方法，具有复苏率高的特点，经过冻存的干细胞复苏后的细胞存活率在90%以上；本发明适合临床应用，所述配方没有FBS和DMSO，对细胞无毒害也无热源物质；本发明成分简单，成本低廉，配方全都是常见的试剂，不需要昂贵的成本即可完成配方；本发明为间充质干细胞的扩大培养和临床应用提供了高效的冻存液配方，适合推广应用。

附图说明

图1是采用对比例1、实施例1～9的冻存液冻存复苏后，干细胞的生长状态；

图2是采用对比例1的干细胞表面标志物表达率图；

图3是采用实施例2的干细胞表面标志物表达率图；

图4是采用实施例6的干细胞表面标志物表达率图；

图5是采用实施例8的干细胞表面标志物表达率图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明提供了一种间充质干细胞冻存液和冻存方法，能够有效避免使用常规胎牛血清和二甲基亚砜冻存液对干细胞产生不良影响的缺点。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术上人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护的范围。

实施例1：

第一部分：细胞培养，冻存和复苏

1).将干细胞接种在皿中，并在含有10%FBS和1%青霉素和链霉素的α-MEM培养基中培养。待细胞融合率达到80%后，从培养箱中取出状态良好的，铺满底部的干细胞，去掉上清，用PBS清洗3次，加入胰酶进行消化；

2).消化分散的干细胞，1000rpm离心5min后去掉上清，加入培养基重悬，再次1000rpm离心5min，去掉上层PBS；

3).配制冻存液。按照总体积为10mL和如下比例进行配制：甘油10%，条件培养基40%，人血白蛋白50%；

4).按照一定的细胞量，分别加入到离心管中重悬细胞，随后转移到冻存管中。冻存管放在梯度降温盒中，放于-80℃过夜，随后转移到液氮罐中；

5).冻存数天后，取出细胞进行复苏和培养；

第二部分：形态学观察：

在细胞复苏后24h，从培养箱中取出培养皿，放置在倒置显微镜下观察并拍照记录；

第三部分：检测细胞存活率和细胞活性检测

1).检测细胞存活率：复苏后的细胞，快速复融，加入到培养基中稀释DMSO或者甘油，离心去掉上清，加入新鲜培养基进行重悬；

2).取出少许细胞，进行一定倍数稀释后，加入台盼蓝染色，染色1-2min；

3).染色后的细胞，滴入细胞计数板中进行计数。计算细胞存活率和实施例的相对存活率，计算方法如下：

细胞存活率=1-被染色细胞数/细胞总数

相对存活率=实验组存活率/对照组存活率

4).细胞继续培养，直至融合率达到80%以上，消化后，按照约10^4cells/mL接种100微升到96孔板，5个复孔，在48h后，加入CCK8孵育1h，然后在450 nm下检测OD值。

5).计算细胞相对增殖率，计算方法如下：

相对增殖率=细胞OD值/对比例细胞OD值

第四部分：流式细胞术检测细胞表面标志物

1).取第三部分步骤培养的融合率达到80%以上的干细胞，消化后，按照0.5-1.0×10^6个细胞量收集细胞。

2).根据样品类型标记流式管，将细胞分别按照标记加入管中。

3).加入2mL常温的PBS与流式管中。

4).1200rpm在常温下离心5min。

5).弃掉上清，并加入100uL的常温的PBS重悬细胞团。

6).分别加入带有荧光标签的CD34,CD45,CD90,CD105和HLA-DR进行标记。标记条件为2-8℃孵育25-30min。

7).从冰箱中取出抗体，孵育完成后，向每个流式管中加入PBS洗涤，随后在4℃进行1200rpm离心5min。最后用300μLPBS重悬，上机检测。

对比例1：

本对比例的操作步骤和检测项目和实施例1并无区别，只有在冻存液的配方处，在本对比例，采用的配方为常规的干细胞冻存液，即是90% FBS和10% DMSO。

实施例2：

本实施例的操作步骤和检测项目和实施例1并无区别，只有在冻存液的配方处，在本实施例中，采用的配方为甘油10%，条件培养基38%，人血白蛋白50%,1%海藻糖,1%甘氨酸。

实施例3：

本实施例的操作步骤和检测项目和实施例1并无区别，只有在冻存液的配方处，在本实施例中，采用的配方为甘油10%，条件培养基33%，人血白蛋白50%,5%海藻糖,2%甘氨酸。

实施例4：

本实施例的操作步骤和检测项目和实施例1并无区别，只有在冻存液的配方处，在本实施例中，采用的配方为甘油20%，条件培养基30%，人血白蛋白50%。

实施例5：

本实施例的操作步骤和检测项目和实施例1并无区别，只有在冻存液的配方处，在本实施例中，采用的配方为甘油20%，条件培养基28%，人血白蛋白50%,1%海藻糖,1%甘氨酸。

实施例6：

本实施例的操作步骤和检测项目和实施例1并无区别，只有在冻存液的配方处，在本实施例中，采用的配方为甘油20%，条件培养基23%，人血白蛋白50%,5%海藻糖,2%甘氨酸。

实施例7：

本实施例的操作步骤和检测项目和实施例1并无区别，只有在冻存液的配方处，在本实施例中，采用的配方为甘油15%，条件培养基20%，人血白蛋白65%。

实施例8：

本实施例的操作步骤和检测项目和实施例1并无区别，只有在冻存液的配方处，在本实施例中，采用的配方为甘油15%，条件培养基18%，人血白蛋白65%,1%海藻糖,1%甘氨酸。

实施例9：

本实施例的操作步骤和检测项目和实施例1并无区别，只有在冻存液的配方处，在本实施例中，采用的配方为甘油20%，条件培养基38%，人血白蛋白40%,1%海藻糖,1%甘氨酸。

具体结果为：

检测干细胞的生长状态和形态学特征，如附图1所示，在本发明的冻存液中，经过冻存后，复苏后的细胞生长和传统冻存液并没有区别，细胞在显微镜下都呈现为贴壁生长，并表现为细长的成纤维状。

干细胞经过培养和冻存过程，经过细胞复苏后，我们首先通过对坏死细胞染色，检测了细胞的存活率，结果如下表所示：

组别	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5
						存活率	89.37%	95.24%	93.68%	90.39%	92.83%
组别	实施例6	实施例7	实施例8	实施例9	对比例
						存活率	96.06%	82.84%	94.67%	86.64%	95.07%

从存活率可以看出来，所有干细胞在经过冻存和复苏后，细胞的存活率都高于80%，大多数用采用本发明的干细胞存活率都高于90%；

然后检测了细胞的相对存活率，结果如下表所示：

组别	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5
						相对存活率	94.00%	100.18%	98.54%	95.08%	97.64%
组别	实施例6	实施例7	实施例8	实施例9	对比例
						相对存活率	101.04%	87.14%	99.58%	91.13%	100.00%

从相对存活率可以分析不同实施例中，与对比例相比，存活率更高还是更低，结果显示，实施例2和实例6以及实施例8表现了与对比例相类似甚至更高的存活率。

随后，为了观察细胞经过本发明所述的冻存过程对细胞增殖能力的影响，我们使用CCK-8检测了细胞的增殖状态。结果下表所示，相比于传统含有FBS和DMSO的冻存液，本发明的冻存液可以促进干细胞增殖，且实施例2所述的本发明配方为最佳的促增殖组合。

实验组	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5
						相对增值率	107.93%	118.05%	104.18%	103.68%	106.70%
实验组	实施例6	实施例7	实施例8	实施例9	对比例
						相对增值率	94.99%	88.76%	99.57%	89.05%	100.00%

紧接着，综合上述结果，实施例2,6,8表现了更明显的对干细胞的有益效果，于是我们通过流式细胞术检测了相对应的细胞的免疫表型，结果如图2-5所示。结果显示了培养的干细胞都表现出了阳性表达标志物CD73，CD90和CD105，阴性表达CD14，CD19，CD34，CD45和HLA-DR。如下表所示：

	对比例	实施例2	实施例6	实施例8
					CD14	0.06%	0.00%	0.02%	0.00%
CD19	0.08%	0.00%	0.04%	0.00%
					CD34	0.04%	0.01%	0.00%	0.00%
CD45	1.64%	2.11%	2.27%	1.71%
					HLA-DR	0.01%	0.00%	0.00%	0.00%
CD90	99.99%	99.96%	100.00%	99.96%
					CD73	98.82%	99.19%	99.26%	99.05%
CD105	98.70%	98.95%	98.35%	99.10%

对比例显示了阴性表达CD14，CD19，CD34，CD45和HLA-DR都小于2%，而阳性标志物CD73，CD90和CD105都大于98%。就阴性标志物而言，实施例2,6,8的阳性率都表现很低，与对比例类似。另外，对阳性标志物来说，实施例2,6,8都表现了与对比例相类似甚至更高的标志物阳性率。

Claims

1.一种间充质干细胞的冻存液，其特征在于，所述冻存液的配方包括：甘油的体积百分含量为10-20%，条件培养基的体积百分含量为18-40%，人血白蛋白的体积百分含量为40-65%,海藻糖的体积百分含量为1-5%,甘氨酸的体积百分含量为1-2%。

2.如权利要求1所述的一种间充质干细胞的冻存液，其特征在于，所述条件培养基的获取方法：取正常培养的细胞的上清液， 2000 rpm 离心15分钟，离心后取上清，过0.22微米滤膜即可获得条件培养基，放4℃备用。

3.如权利要求1所述的一种间充质干细胞的冻存液，其特征在于，所述冻存液的配方包括：甘油的体积百分含量为10%，条件培养基的体积百分含量为38%，人血白蛋白的体积百分含量为50%,海藻糖的体积百分含量为1%，甘氨酸的体积百分含量为1%。

4.一种间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，向间充质干细胞中加入权利要求1-3任意所述冻存液，混匀后冻存。

5.如权利要求4所述的一种间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，冻存具体方法为：所述冻存液与所述干细胞混匀后分装到冻存管中，并转移至提前恢复至室温的程序降温盒中，在-80℃超低温冰箱中过夜降温稳定后，转移至液氮长期保存。