CN111343864A - 冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物及其方法和用途 - Google Patents

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亚历山大·巴布·德·阿尔梅达·派瓦
鲁伊·L·雷斯
里塔·波拉·派瓦·克拉维罗
若阿纳·马里亚·马克斯·达·席尔瓦
瓦尼亚·伊萨贝尔·巴普蒂丝塔·德·卡斯特罗
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Abstract

本公开涉及冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物及其方法和用途。该组合物可以用于细胞、生物和/或组织的保存和/或保护。

Description

冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物及其方法和用途
技术领域
本公开涉及冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物及其方法和用途。该组合物可以用于细胞、生物和/或组织的保存和/或保护。
背景技术
在细胞的冷冻过程期间，会发生两个主要事件。在环境压力下并当以快速冷却速率冷却到0℃以下时，水会以六方晶体或立方晶体的形式形成冰。冰晶的形成会损坏细胞膜和细胞器，导致细胞死亡。缓慢冷却会减少晶体的形成，但增加了由于水渗透到细胞外介质所引起的细胞脱水和收缩作用，这也可能导致对细胞膜和细胞器的物理应力，从而导致细胞死亡。在这两种情况下，细胞内溶质浓度的增加也会导致细胞死亡。可以找到最佳的冷却速率以使冷却速率足够慢，从而防止细胞内冰晶形成，而又足够快以克服严重的脱水作用。然而，在温血(同种异体(homeoterm))动物的器官细胞的情况下，很难找到这种冷却速率窗口，并且无法实现完整的细胞活力。通过控制冷却速率进行冷冻保存是一种昂贵的方法，仅在特定情况下如原核生物才是可行的3-5。
当水溶液被快速冷却时，避免结晶，导致水处于亚稳态的无定形固体状态，然后在低于玻璃化转变温度的温度下以玻璃状固体被玻璃化。在动物细胞的情况下，实现水玻璃化所需的冷却速度并不切实际，而必须使用冷冻保护剂。在这种条件下，人们认为细胞是无冰晶的。避免细胞内冰晶是细胞存活的关键6。不同的细胞和组织对冷却速率和冷冻保护剂的反应不同。实验仍然是确定最佳冷却条件的最有效方法7。冷冻保护剂能够按分子量(高MW或低MW)或细胞中的渗透速率进行划分；渗透快速的乙醇、乙二醇或甲基乙酰胺，或渗透缓慢的甘油。还有一类冷冻保护剂，如单糖、寡糖和多糖，蛋白质和生物聚合物，它们不会渗透细胞壁和/或细胞质膜中，并以10％～40％的浓度提供细胞外冷冻保护1,4。
除了最广泛使用的冷冻保护剂DMSO外，一些报道还表明，诸如甘油或1,2二醇丙烷之类的多元醇已经以一定程度成功应用于复杂细胞结构，如皮肤和神经组织。非渗透性冷冻保护剂，如右旋糖酐或海藻糖，也单独或与渗透性冷冻保护剂组合用于复杂组织的冷冻保护中。在海藻糖的情况下，观察到渗透性冷冻保护剂的结合是有利的3,7。
非渗透性和渗透性冷冻保护剂的作用之间的另一个重要区别是盐浓度。在仅包含盐的溶液中，随着温度降低，盐浓度将迅速增加，而在添加了冷冻保护剂的溶液中，溶质浓度将以相同的方式增加，但盐浓度将较低。在非渗透性冷冻保护剂的情况下，仅影响细胞外盐浓度，而高溶质浓度会引起细胞膜渗透应力。渗透性冷冻保护剂却不是这种情况。在这种情况下，随着水的扩散出来而冷冻保护剂扩散到细胞中，从而保持原始细胞体积并减少渗透应力。除渗透应力外，玻璃化过程中所需的高浓度冷冻保护剂还可能由于水化学势低或化学毒性而造成损害4。
活生物体已发现能够在极端温度范围内生存的策略依赖于精心策划的不同生物代谢产物的产生。
已经证明，臭名昭著的各种糖、多元醇和氨基酸是用于抵抗动物界中极端温度差异的多组分系统的一部分。该知识是上世纪冷冻保护剂解决方案开发的基础，然而，直到最近才与深共晶系统关联。
天然深共晶溶剂(NADES)定义为两种或多种固体或液体组分，如糖、氨基酸、有机酸或胆碱衍生物的混合物，其在特定的组成下会表现出高的熔点降低，相比于其各个组分，在室温或近室温就会变为液体25。
尽管冷冻保存的研究一直在发展，对深共晶溶剂的更新理解以及自然存在的DES(NADES)在细胞中的更具体的作用为开发更有效的自然-基冷冻保护剂打开了研究窗口。NADES实质上由氢键供体和氢键受体化合物构成。据估计，可以构成NADES的不同分子的排列出现高达10至第六种组合。
基于自然深共晶系统设计了一种新的冷冻保存系统，并评价了细胞冷冻保存的行为。
公开这些事实是为了举例说明本公开解决的技术问题。
发明内容
冷冻被认为是长期保存食物、器官甚至活体生物的最佳技术。随着温度下降，反应速度变慢，微生物活性降至最低。尽管冷冻保存进行保存时是一种技术选择，但冷冻保存提出了一些挑战。水是活体生物中的细胞最常见的组分，当温度下降并且水变成冰时，对生命至关重要的同一成分却变得有害。冻结时的水结晶会破坏细胞，这在许多情况下是无法解冻的，它会导致细胞在活生物体或器官中死亡。有几种解决方案可将这些影响减至最小，如使用特定的冷冻时间梯度控制细胞内冰晶的数量和大小，或使用冷冻保护剂，促进水非晶化从而部分或完全避免结晶过程。对于更复杂的系统的解决方案是使用冷冻保护剂，然而，有时需要高浓度的冷冻剂，这会出现毒性问题1。尽管冷冻保存是一个高价值的市场，但缺乏有效的解决方案。这种技术在工业上的应用实例主要是在胚胎、精子和干细胞的储存中，在这些情况下融化后大量细胞死亡是可以接受的2。
这些化合物已被定义为天然深共晶溶剂(NADES)的组分，并为冷冻保护剂的开发提供了巨大的前景，从而避免了使用DMSO和其他有毒的冷冻保护剂。
冷冻保护剂/冷冻保护剂是用于保护生物组织、细胞或生物免受冰冻损害的物质。
本公开具有的优点是
使用天然和生物相容性分子作为冷冻剂；
避免了使用有毒的冷冻保护剂，如DMSO；
提高了保存温度(从-196～8℃)；优选-50℃～-20℃；
允许储存细胞、组织和/或器官；
增加存储时间的可能性。
在一个实施方式中，本公开的组合物使用无DMSO的冷冻保护剂。
本公开涉及包含氢键供体化合物和氢键受体化合物的冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物，其包含
作为多元醇的甘油和作为糖的海藻糖，以及任选的脲和/或氨基酸；
或包含脲和氨基酸的水溶液。
在一个实施方式中，冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物由甘油和海藻糖以及任选的脲和/或氨基酸组成；或包含脲和氨基酸的水溶液。
在一个实施方式中，该组合物可以进一步包含第二糖，第二糖可以是单糖，二糖或多糖，特别是该糖可以选自由葡萄糖、果糖或它们的混合物组成的列表。
在一个实施方式中，该组合物可以进一步包含第二多元醇，第二多元醇可以选自由甘油、山梨糖醇、甘露糖醇或它们的混合物组成的列表。
在一个实施方式中，糖:多元醇的摩尔比可以为1:0.5～1:40；优选1:7～1:30；更优选1:10～1:20。优选该糖是海藻糖，而该多元醇是甘油(glicerol)。
在一个实施方式中，脲:多元醇的摩尔比可以为1:0.25～1:10；优选1:1～1:5；更优选1:3～1:4。优选的多元醇是甘油。
在一个实施方式中，脲:糖的摩尔比可以诶1:1～10:1；优选2:1～6:1；更优选3:1～4:1。优选该糖是海藻糖。
在一个实施方式中，冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物可以还包含氨基酸，特别是其中氨基酸选自由以下氨基酸组成的列表：脯氨酸，组氨酸，甘氨酸，赖氨酸，色氨酸，天冬氨酸，丙氨酸，谷氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，天冬酰胺，丝氨酸，谷氨酰胺或它们的混合物。更优选脯氨酸。
在一个实施方式中，脲:多元醇:氨基酸的摩尔比可以为1:1:0.25～3:3:1。优选该氨基酸是脯氨酸。
在一个实施方式中，脲:多元醇:氨基酸的摩尔比可以为
1:1:0.25，1:1:0.5，1:1:0.75，1:1:1，
2:1:0.25，2:1:0.5，2:1:0.75，2:1:1，
3:1:0.25，3:1:0.5，3:1:0.75，3:1:1，
1:2:0.25，1:2:0.5，1:2:0.75，1:2:1，
1:3:0.25，1:3:0.5，1:3:0.75，1:3:1，
2:2:0.25，2:2:0.5，2:2:0.75，2:2:1，
3:3:0.25，3:3:0.5，3:3:0.75，3:3:1。
在一个实施方式中，脲:糖:氨基酸的摩尔比可以为1:1:1～3:2:1。优选该氨基酸是脯氨酸和/或该糖是海藻糖/葡萄糖。
在一个实施方式中，脲:糖:氨基酸的摩尔比可以为1:1:1、2:1:1、3:1:1、2:2:1、3:2:1。优选该氨基酸是脯氨酸和/或该糖是海藻糖/葡萄糖。
在一个实施方式中，冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物可以还包含水。
在一个实施方式中，脲:糖:氨基酸:水的摩尔比可以为1:1:1:1～2:1:1:4；优选1:1:1:2、1:1:1:3、1:1:1:4、2:1:1:1、2:1:1:3。优选该氨基酸是脯氨酸和/或该糖是海藻糖/葡萄糖。
在一个实施方式中，脲:葡萄糖:脯氨酸:水的摩尔比可以为1:1:1:1～1:1:1:4。
在一个实施方式中，冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物可以用于保存细胞或组织，其中细胞或组织最高保存于8℃下，优选最高保存于-4℃下，优选最高保存于-20℃下，优选最高保存于-80℃下，优选最高保存于-196℃下。
本公开还涉及冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物作为细胞活力的增强剂的用途。
附图说明
以下附图提供了用于举例说明本发明的优选实施方式，并且不应该将其视为限制本发明的范围。
图1：在-90℃～40℃的温度下按照10℃·min-1获得的纯水和水与摩尔比为1:30的DES海藻糖:甘油的不同混合物的热分析图。
图2：与不同浓度的天然深共晶系统接触的细胞活力。
图3：与不同浓度的系统海藻糖:甘油1:30和DMSO接触的细胞活力。请注意基础溶液的％-w/v；X:Y是化合物的摩尔比。
图4：用不同系统冷冻保存后保存的细胞的形态学观察。右边是MTS活力测试的结果。请注意基础溶液的％-w/v；X:Y是化合物的摩尔比。
图5：不同代传、活死分析测试、MTS活力和DNA分析后的细胞活力。请注意基础溶液的％-w/v；X:Y是化合物的摩尔比。
图6：使用作为冷冻保护剂的不同系统和不同储存温度，在解冻(P0)和第一次传代(P1)之后，通过MTS分析测试测定的细胞活力。
图7：甘油(A)和海藻糖(B)系统的1H NMR谱，所有共振均找到归属。
图8：海藻糖:甘油(1:30)系统的1H NMR谱，所有共振均找到归属。
图9：海藻糖:甘油(1:30)系统的2D NMR(HMBC)谱，所有共振均找到归属。
具体实施方式
在一个实施方式中，天然深共晶溶剂(NADES)包括海藻糖-甘油(摩尔比，1:30；D(+)海藻糖二水合物，99％，Sigma-Aldrich，甘油，99.9％，Sigma-Aldrich)，通过在搅拌下于70℃加热直至形成澄清液体而制备。
在一个实施方式中，使用结合有徕卡数字相机的奥林巴斯透射显微镜，通过偏振光显微镜(POM)在室温下获取NADES样品的光学表征。用1～2滴NADES制备覆盖物，并在显微镜下观察。
在一个实施方式中，如下进行差示扫描量热分析(DSC)实验：在TA InstrumentsInc.的DSC Q2000(Tzero DSC技术)中以热流T4P选项操作进行量热实验。在无水高纯度氮气下以50mL min-1的流速进行测量。DSC Tzero校准在-90～200℃的温度范围内进行。纯化合物水、海藻糖、甘油和纯DES(不添加水)在-90～100℃(纯水情况下为120℃)下进行数次冷却和加热，速率为10℃/min。这些样品用带针孔的Tzero密封盖封装于Tzero(铝)密封锅中，而使水蒸发。通过DSC分析DES和水的混合物时，在-90～40℃之间还以10℃/min的速度进行了几次冷却，但在这种情况下，密封锅没有针孔，以避免任何失水。在某些样品中，扫描速率进行变化以便观察对水和DES混合物产生的热行为的影响。在这些情况下，加热扫描速率为5℃/min和20℃/min。
在一个实施方式中，L929细胞系在补充有10％热失活胎牛血清(FBS，BiochronAG，德国)和1％抗生素-抗微生物剂(Gibco，美国)的DMEM(Sigma，美国)中生长。在37℃，5％CO2的潮湿气氛中培养细胞。
在一个实施方式中，使用与细胞直接接触的方法(NADES与细胞培养物的直接接触)测量所制备的系统的活力。将该细胞以总共1×104个细胞/孔接种于96-孔井孔板上24小时。24小时后，取出培养基，并加入具有不同百分比，特别是1％，5％，10％和20％在培养基中的NADES的提取物。在24h和72h之后，通过MTS分析测定法测定用这些提取物培养的细胞的活力。
在一个实施方式中，细胞冷冻并解冻，特别是通过离心(300rpm 5分钟)收集该细胞并将其悬浮于具有FBS和冷冻保护剂(DMSO或Treh-Gly；5％和10％在FBS中的冷冻保护剂)的冷混合物中。将细胞和冷冻培养基分散于冷冻管(Nunc)(1×106个细胞/1mL)中，并立即置于-20℃的冷冻箱(Mr.Frosty)中2h。随后将它们在-80℃下放置24小时，然后将冷冻管放置在于液氮中。细胞冷冻1、2和3个月。作为对照物，单独使用了相同浓度的海藻糖和甘油。
在一个实施方式中，为了解冻，将冷冻管在37℃水浴中迅速温热约1分钟。在离心管中加入5mL培养基，并转移细胞悬液。将该悬浮液(在21℃下300rpm 5分钟)离心，并除去上清液。将细胞再悬浮于新鲜培养基中，并接种与96-孔井孔板中。
在一个实施方式中，如下进行MTS细胞活力分析测试：在培养24h和72h之后，通过MTS分析测试法(Cell Titer 96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay，Promega，USA)测定冷冻保护剂的影响。在涂涂覆时，将细胞用PBS洗涤，并以5:1的比率加入无血清细胞培养基和MTS试剂的混合物，并在含5％CO2的潮湿气氛中于37℃培养4h。此后，将每孔100μL转移到96-井孔孔板中。使用微板光谱仪(Synergy HT，Bio-TEK，美国)在490nm的波长处测量吸光度。吸光度的结果减去空白(含MTS试剂的MTS培养基)的吸光度。
在一个实施方式中，使用活/死细胞活力分析测试法(钙黄绿素AM/碘化丙啶(PI)染色)(每孔n＝5个样品)评价细胞活力。将细胞与2μL钙黄绿素AM(1mg mL-1，MolecularProbes，Invitrogen，美国)和3μL PI(1mg mL-1，Molecular Probes，Invitrogen，USA)在DMEM培养基中培养20分钟，并进行避光保护。用PBS洗涤细胞除去残留的荧光剂，并通过倒置显微镜(Axio Observer，ZEISS，德国)观察。
在一个实施方式中，进行了DAPI-鬼笔环肽分析测试法形态学表征。将细胞用10％福尔马林溶液固定45分钟。除去福尔马林，并用PBS代替。对于DAPI-鬼笔环肽分析测试法，使用了4,6-二脒基-2-苯基吲哚，二乙酸盐(DAPI，20mg mL-1，BIOTOIUM，美国)和鬼笔环肽-四甲基若丹明B异硫氰酸盐(Phalloidin，10mg mL-1，Sigma-Aldrich，美国)(每孔n＝5个样品，一式三份)。制备鬼笔环肽溶液，对于5μL鬼笔环肽和2μL DAPI用1mL PBS，然后添加到细胞中，在室温下培养45分钟，并避光保护。然后将样品用PBS洗涤3次，并在黑暗中通过倒置显微镜(Axio Observer，ZEISS，德国)可视化检测。图像在Z-堆叠模式下各载玻片之间4.5μm(10×)和2μm(20×)的分辨率获得。
在一个实施方式中并对于DNA定量，根据厂商的说明书使用Quant-IT PicoGreendsDNA分析试剂盒。最初，在96-孔井孔板中，通过渗透和热休克裂解细胞，并收集上清液进行分析测试。对每个样品或标准分析测试重复三次。根据染料的光谱特性，在微孔板读取器(Bio-TEK，美国)中，分别使用485和528nm作为激发和发射波长读取吸光度。为了计算DNA量，用校准曲线调整吸光度值。
在一个实施方式中，基于但不限于表1中列出的代谢物的组合，更具体而言，基于海藻糖、葡萄糖、甘油以及其他氨基酸、多元醇和糖，开发了新的NADES。
表1.能够用于形成NADES的天然代谢物的可能组合的列表
Figure BDA0002372515110000111
Figure BDA0002372515110000121
在一个实施方式中，在这项工作中产生了具有不同摩尔比的不同组合(表2)。
表2.不同系统的列表
Figure BDA0002372515110000122
Figure BDA0002372515110000131
Figure BDA0002372515110000141
在一个实施方式中，为了确定新的NADES的初步活力，对于那些呈现低于或接近室温的熔融温度的水，将其以不同的组成与NADES混合。NADES/水系统的热表征将通过差示扫描量热法(DSC)进行实施。
在一个实施方式中，研究了制剂中玻璃化和/或显著降低熔融温度所需的最小NADES浓度。对在冷热循环中发生的相变的理解对于评价系统是否为冷冻保护剂是至关重要的。结晶是一种动力学现象，因此，在-120℃～40℃内测试了不同的冷却和加热速率，以确定是否发生了熔融温度的显著降低，或如果完全避免了结晶现象，仅观察到玻璃化转变温度，这意味着水完全玻璃化。此外，通过将非晶态物质在一段时间内保持于低温下(退火)，则可以促进晶体的形成。
在一个实施方式中并且为了评价DES海藻糖:甘油(1:30)在水中的影响，制备了几种混合物，采用了不同的水和DES百分比(按照10wt％的间隔)。为了了解这种DES防止水结晶的潜力，通过DSC分析了这些混合物每种的热行为。在图1中，显示了纯水和所制备的DES的热分析图。对于DES热分析图，至少直到DSC检测极限为止，没有观察到热事件发生。当将一定量的海藻糖:甘油添加到水中时，其热行为会受到影响，而这种变化取决于混合物中存在的海藻糖:甘油的含量。对于具有海藻糖:甘油超过60wt％的样品，在热分析图中未观察到热事件，这意味着混合物表现为无定形物质，没有水晶体存在的迹象。当以40:60的重量百分比混合H2O和海藻糖:甘油时，在DSC中观察到冷结晶峰和熔融峰(图1)，但仍未观察到结晶峰。对于较高的水量(50wt％～90wt％)，始终会观察到熔融峰。根据该峰，能够计算出由峰的起点定义的熔融温度Tm，并且能够从峰下的面积确定熔融焓变(ΔHm)。
在一个实施方式中，对于呈现出水熔融温度的显著降低或完全玻璃化的NADES/水混合物，进行了毒性测试。尽管NADES组分是人体中天然存在的并且不会出现毒性问题，但是形成NADES的两种成分之间的相互作用可能会导致某些以前未知的毒性。为了确保所选择的NADES实际上可以用作冷冻保护剂，最重要的是它们对组织没有任何明显的毒性。为了确定NADES的毒性，按照ISO指南评价了NADES/水混合物的细胞毒性。评价了不同浓度的级分的细胞毒性，使用吸光度确定细胞活力。图2显示了在不同所测试的系统上进行的活力测试的结果。
在一个实施方式中，与用作冷冻保护剂的金标准DMSO相比，值得注意的是，该试剂的毒性特征有所不同(图3)。Treh:Gly(1:30)系统在37℃的温度下与细胞接触直至10wt％的浓度表都现出良好的活力结果。与DMSO接触的细胞即使在低浓度如1％或5％下也表现出非常低的活力，并且将DMSO在培养基中的浓度增加到10％和20％会导致细胞死亡。
在一个实施方式中，使用L929细胞系评价了作为冷冻保护剂的NADES性能的体外生物学评估。正如前所述，冷冻保存可能会引起与渗透应力相关的冷冻伤害，因此，必须研究与已开发的NADES制剂接触时的细胞渗透耐受性和膜完整性。
在一个实施方式中，冷冻保存的细胞在-20℃、-80℃和-196℃和不同浓度的不同系统下保持不同的储存时间(1、2和3个月)，一直与用作对照物的DMSO比较。在解冻后，通过显微镜评价细胞。这些将提供关于NADES作为冷冻保护剂对不同细胞类型和储存条件的影响的证据。
在一个实施方式中并且另外对于其他实施方式，进行了活死分析测试和Dapi-鬼笔环肽测试以评价细胞活力并在解冻后检查细胞膜的完整性。图4显示了细胞活力的形态学分析和首次测试。从图像中能够看出，采用10％DMSO和海藻糖:甘油(1:30)冷冻保存细胞具有相似的响应。另一方面，当单独使用海藻糖或甘油时，细胞活力有些受损。
在一个实施方式中，MTS活力测试证实了这些结果。因此，与单独的组分相比，由于存在海藻糖:甘油系统，实际上存在协同作用。
在一个实施方式中，细胞的形态在两个系统之间是相似的，并且在代传之间也没有差异。DAPI-鬼笔环肽显示了培养后细胞膜的完整性和细胞的细长形状。
在一个实施方式中，在不同的储存温度下，特别是在-196、-80和-20℃下测试了不同的系统。从图6中能够看出，有可能保存细胞并在-80℃下保持其活力。已测试了不同的系统，并获得了与DMSO相当的结果。
在一个实施方式中，令人惊讶的是，当使用脲:葡萄糖:脯氨酸:H2O(1:1:1:2)系统作为冷冻保护剂时，细胞能够在-20℃下保存至少一个月而不会损害细胞活力，并且能够复制和增长(P1)，这与其他所研究的系统不一样。
核磁共振(NMR)谱用于证明NADES中氢键的存在。在这项研究中，将1H NMR应用于Treh:Gly(1:30)(图8)，Treh(f图7B)和Gly(图7A)，并将2D NMR(HMBC)应用于Treh:Gly(1:30)(图9)。有可能观察到(图8和图9)Treh和Gly之间存在Treh:Gly(1:30)中的氢键，表明这就是低共熔混合物。
本公开不应该以任何方式看成局限于所描述的实施方式，并且本领域普通技术人员将预见其修改的许多可能性。
上述实施方式是可组合的。
所附权利要求进一步阐述了本公开的具体实施方式。
参考文献
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Claims (16)

1.包含氢键供体化合物和氢键受体化合物的冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物，其包含
作为多元醇的甘油和作为糖的海藻糖，以及任选的脲和/或氨基酸；
或包含脲和氨基酸的水溶液。
2.根据前述权利要求所述的冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物，其由以下组分组成
甘油和海藻糖，以及任选的脲和/或氨基酸；
或包含脲和氨基酸的水溶液。
3.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物，其包含脲、葡萄糖、脯氨酸和水。
4.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物，其中糖:多元醇的摩尔比为1:0.5～1:40；优选1:7～1:30；更优选1:10～1:20。
5.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物，其中脲:多元醇的摩尔比为1:0.25～1:10；优选1:1～1:5；更优选1:3～1:4。
6.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物，其中脲:糖的摩尔比为1:1～10:1；优选2:1～6:1；更优选3:1～4:1。
7.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物，其中所述氨基酸选自以下氨基酸：脯氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、色氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、或它们的混合物；优选脯氨酸。
8.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物，其中脲:多元醇:氨基酸的摩尔比为1:1:0.25～3:3:1。
9.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物，其中脲:糖:氨基酸的摩尔比为1:1:1～3:2:1，优选其中脲:糖:氨基酸的摩尔比为1:1:1、2:1:1、3:1:1、2:2:1、3:2:1。
10.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物，其还包含水。
11.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物，其中脲:糖:氨基酸:水的摩尔比为1:1:1:1～2:1:1:4；优选1:1:1:2、1:1:1:3、1:1:1:4、2:1:1:1、2:1:1:3。
12.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物作为细胞活力或组织的增强剂的用途。
13.根据前述权利要求所述的冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物的用途，其中细胞或组织最高保存于8℃下。
14.根据前述权利要求所述的冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物的用途，其中细胞或组织最高保存于-4℃下。
15.根据前述权利要求所述的冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物的用途，其中细胞或组织最高保存于-20℃下。
16.根据前述权利要求所述的冷冻保护剂和/或冷冻保护剂组合物的用途，其中细胞或组织最高保存于-80℃下，优选最高保存于-196℃下。
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