CN105263320A - 活细胞的冷冻保存 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于低温保存(植物)细胞、(植物)细胞器或(植物)组织的方法，其中在一种或多种具有冷冻保护剂效果的添加剂存在下将所述(植物)细胞、(植物)细胞器或(植物)组织包封在非生物材料形成的基质中。本发明的方法提供一种更快、更有效且更廉价的方式来低温保存生物材料。

Description

活细胞的冷冻保存
技术领域
本发明涉及冷冻保存(低温保存(冷冻保存，cryopreservation))细胞，特别是包括藻类的植物细胞、(植物)细胞器以及(植物)组织的领域。
背景技术
植物细胞和组织培养是在基础和应用研究中广泛使用的重要工具。它们允许高通量研究，如基因功能和调节、代谢分析或生物农药(生物杀虫剂)开发。它们还是引人注目且功能强大的在生物反应器中产生精细化学品的生物机制。尤其是，植物细胞培养在产生适当糖基化和折叠的药物活性蛋白(如免疫球蛋白、白细胞介素)方面令人感兴趣。它们本质上安全，这与哺乳动物或微生物生产平台相反，因为它们不是宿主人病原体，也不产生内毒素。然而，在涉及植物生物学的各实验室中维持多种野生型和转基因细胞系不仅费力费钱，而且还会产生微生物污染、不期望的遗传改变(例如，染色体变化，包括倍性变化、表观遗传不稳定性(epigeneticinstability))以及最终培养物损失的风险。
实际上，大多数的动物和陆生植物使用不同的机制以增强它们在极端环境条件下的存活。例如，为了适应其生长和发育，植物可以感觉小温度变化(1℃)。此外，生长在温带(temperate)和冷气候区中的大多数植物在其生命周期期间倾向于严寒(冰冻，freezing)温度。在这些环境条件下，导致细胞死亡的主要原因与细胞脱水和由胞外冰形成引发的机械应力连同包围细胞器或细胞本身的生物膜严重损伤有关。因此，植物已经发展出复杂的策略来预防在温和冷冻条件下的细胞损伤。为了存活，植物通常需要预暴露于非致命温度，即，冷适应步骤。该过程涉及多种机制，包括累积冷冻保护代谢物和抗冻蛋白。由于极端温度代表着对于植物的重大压力，耐冻性仍然为限制全球植物分布的关键因素。
50多年来，在材料内整合活细胞已被识别为生物技术中强有力的工具。通过粘附在基质(substrate)上的固定、在材料中的捕获或包封是可以在新设备如生物反应器、生物传感器、生物燃料细胞和人工器官的结构中操控全细胞利益的方法。实际上，从其天然环境分离的细胞通常是脆弱的。基于细胞的生物技术装置因此需要将细胞整合入非生物材料(abioticmaterials)。
保存植物材料的常用策略涉及建立在生长条件下的植物组织或在田间的植物群体的体外收集。对于长期储存，因为保存植物组织的成本和质量问题，这些方法是不合适的。现在，大多数植物在没有高浓度冷冻保护剂(防冻剂)(其可以是细胞毒性的)或脱水工序下不能存活于冻融循环。而且，这些方法的成功与复杂的冷却程序是紧密关联的。例如，以最佳速率将细胞冷却到中间温度(略低于凝固点)，然后在液氮中玻璃化。事实上，这些措施允许在细胞内空间使细胞脱水和冰结晶最小化，其负责不可逆的细胞损伤。最后，由此获得的生物材料存储在昂贵的填充液氮的罐中，以使温度维持在-196℃。在这些条件下，几乎所有的代谢活动都停止，而活组织可以保存延长的时间。
目前，已经提出了三种不同的方法用于低温保存在液氮中的植物细胞培养物：
(A)慢冷却技术
(B)玻璃化(vitrification)方法，以及
(C)在藻酸盐珠粒内脱水固定化的细胞
描述了各种固定或包封基质。比生物分子远远更加灵敏的，活性细胞的固定涉及使用生物相容性材料、温和(良性，benign)合成条件和外部流体支持系统或浸没于缓冲液中，以避免脱水。最常使用的材料为多糖及衍生物、聚合物膜、活性碳以及光聚合树脂。然而，在稳定性与生物相容性方面，这些有机基质显示出若干局限性。
尽管已普遍冷冻保存哺乳动物和微生物培养物，但用于植物细胞的保存方法的受限报告通常的特征在于低的细胞存活力。
实际上，与其它细胞类型相比，由大型有液泡结构组成的植物细胞悬液更趋于严重的低温损伤。植物细胞死亡的主要原因与细胞脱水和与包围细胞器或细胞本身的生物膜的严重损伤相结合的胞外冰形成引发的机械应力有关。另外，当前方法通常需要昂贵的液氮、专用装置来提供可编程的冷却速率以及可能是细胞毒性的高摩尔浓度的冷冻保护剂。由于这些原因，创建冷冻主细胞库(mastercellbanks)需要可替换的程序。
发明目的
本发明的目的在于提供用于冷冻保存或低温保存(植物)细胞、(植物)细胞器和(植物)组织(包括例如，植物愈伤组织、分生组织、芽尖(apices)、芽外植体、胚珠和根)的方法和试剂盒，其不存在现有技术的缺点。
本发明的目的在于提供这样的方法和试剂盒，其是简单的、不太昂贵的并且不影响处理的(植物)细胞、遗传修饰的(植物)细胞、(植物)细胞器以及(植物)组织(包括例如植物愈伤组织、分生组织、芽尖、芽外植体、胚珠和根)的特性，其因而可以用于维持(植物)细胞、(植物)细胞器以及(植物)组织的培养物并随时间保持它们的遗传特性，特别是几个星期或几个月或甚至数年的长时期。
发明内容
本发明涉及用于低温保存植物细胞(包括遗传修饰的植物细胞)、该植物的细胞器或者该植物的组织的方法，其包括以下步骤(由以下步骤组成)：
-将该植物细胞、细胞器或该植物组织包封(encapsulate)在包含一种或多种二氧化硅前体以及一种或多种冷冻保护剂的多孔二氧化硅基质中；
-在4℃至20℃温度下培养获得的混合物超过1小时并将所得到的杂化二氧化硅凝胶(hybridsilicagels)转入到在-30℃至-196℃温度下的冷冻器(制冷器)中，优选在约-80℃的温度下。
在本发明的方法中，包封步骤优选通过使包含一种或多种二氧化硅前体和一种或多种冷冻保护剂的溶液与植物细胞、植物细胞器或植物组织混合而获得。
本发明的另一方面涉及用于(低温保存)基因修饰的(植物细胞)、植物细胞器或植物组织的低温保存试剂盒，包括一种或多种二氧化硅前体和一种或多种冷冻保护剂。
在根据本发明的方法和试剂盒中，冷冻保护剂优选选自由二甲基亚砜(DMSO)、糖、氨基酸、两性离子化合物(甜菜碱)、二醇、多元醇或其混合物所组成的组。
在根据本发明的方法和试剂盒中，几种不同的冷冻保护剂可以混合在一起用于执行根据本发明的方法。
优选地，糖为蔗糖或海藻糖，氨基酸优选脯氨酸或甘氨酸，二醇优选为(聚)乙二醇而多元醇优选选自由山梨糖醇、麦芽糖醇、甘油、赤藻糖醇(赤藓糖醇，erythritol)、木糖醇、阿拉伯糖醇(arabitol)、甘露醇、乳糖醇，异麦芽糖醇(isomaltitol)或其混合物所组成的组。
在根据本发明的方法中，在二氧化硅基质中二氧化硅前体的浓度可以在约5％和约10％之间变化。
优选地，一种或多种二氧化硅前体选自由聚硅酸(H2SiO3)n，优选偏硅酸(metasilicicacid)H2SiO3，氢氧化硅、二氧化硅烷氧化物(硅酸烷基酯，silicaalkoxide)(例如原硅酸四甲酯(TMOS)、原硅酸四乙酯(TEOS)、原硅酸四丙酯(TPOS)、四(2-羟乙基)原硅酸酯(EGMS)、四(2-羟丙基)原硅酸酯(PGMS)和四(2,3-二羟丙基)原硅酸酯(GLMS))、硅酸盐(如硅酸钠或硅酸钾)、二氧化硅纳米颗粒、山梨醇硅烷、有机改性硅酸盐(ormosils)(有机改性的二氧化硅)、三甲氧基甲基硅烷、二甲氧基二甲基硅烷、TMOS(四甲氧基硅烷)、DGS(二甘油基硅烷)，或其混合物所组成的组。
作为在本发明的方法中的优选实施方式，冷冻保护剂为与二氧化硅前体混合的浓度分别在0.2M和1.0M之间(蔗糖)和1％和10％之间(DMSO)的蔗糖和DMSO。
在根据本发明的方法中，在二氧化硅前体和冷冻保护剂中的溶液的pH优选在约4至约8之间。
具体实施方式
本发明提供了简单、快速而廉价的方法用于低温保存(植物，包括藻类)细胞、遗传修饰的(植物)细胞、细胞器或组织培养物。该技术基于在低温(-30℃或更低至-196℃，优选-70℃或更低至-196℃)的二氧化硅基质的保护特性，其可以用作独创、简单而有效的技术用于在普通实验室冷冻器中低温保存(植物，包括藻类)细胞、遗传修饰的(植物)细胞、细胞器或组织系。
硅以硅酸盐(SiO2.nH2O)形式天然存在于土壤中。这些矿物相在水中气候老化(weather)以产生单体原硅酸(Si(OH)4)和一些焦硅酸(disilicicacid)，其被吸收、运输以及遍及植物，特别是在细胞壁中而不是植物的液泡中被沉积为无定形的二氧化硅。几项报导强调这些Si物质可以提高植物对细菌和真菌攻击的抵抗。此外，二氧化硅物质缓解了大范围的非生物应力，包括营养失衡、盐度、重金属毒性、水应力、紫外线、热和冷冻应力。
所要求保护的本发明方法不需要特定设备来控制冷却和/或加热速率，也不需要昂贵的液氮。宿主结构(hoststructure)保持植物细胞活力且不妨碍它们在冻融循环后的增殖。
在二氧化硅基质内包封(植物)细胞的主要优点是捕获的细胞更抵抗生物(例如细菌)或非生物应力(例如热、水应力和重金属)。
由于二氧化硅凝胶与典型的冷冻添加剂相比是无毒的化合物，因而细胞可以成功地低温保存短期或长期的时间(超过2年)。
基于该技术，根据已识别并很好建立的准则，商业植物来源的药物开发可以成为更便捷的途径。
因此，本方法是基于二氧化硅基质在低温(在约-30℃或更低，至-196℃，优选在约-70℃，低至-196℃)的意料不到的保护效果，其可以在标准实验室冷冻器中，以及在指定用于保存，尤其是低温保存细胞或其他生物材料的中心(如ATCC)中，用作用于长期低温保存(植物，包括藻类)细胞、遗传修饰的(植物)细胞、(植物，包括藻类)细胞系、细胞器(例如，类囊体)或组织的独创、简单而有效的技术。
(植物)细胞培养物(如，例如拟南芥)可以成功地通过根据本发明的方法低温保存，其包括三个基本步骤。
本发明的方法包括三个基本的连续步骤：
第一步骤包括在多孔二氧化硅基质内经由溶胶-凝胶方法包封(植物，包括藻类)细胞、遗传修饰的(植物)细胞、(植物，包括藻类)细胞器(例如，类囊体)或(植物，包括藻类)组织。所获得的基质，基于二氧化硅的溶胶由一种或多种二氧化硅前体和一种或多种冷冻保护剂制成。一种或多种二氧化硅前体选自自由聚硅酸(H2SiO3)n(优选偏硅酸H2SiO3)、氢氧化硅、二氧化硅烷氧化物(例如原硅酸四甲酯(TMOS)、原硅酸四乙酯(TEOS)、原硅酸四丙酯(TPOS)、四(2-羟乙基)原硅酸酯(EGMS)、四(2-羟丙基)原硅酸酯(PGMS)和四(2,3-二羟丙基)原硅酸酯(GLMS))、硅酸盐(如硅酸钠或硅酸钾)、二氧化硅纳米颗粒、山梨醇硅烷、有机改性硅酸盐(有机改性的二氧化硅)、三甲氧基甲基硅烷、二甲氧基二甲基硅烷、TMOS(四甲氧基硅烷)、DGS(二甘油基硅烷)，或其混合物所组成的组。更优选地，二氧化硅前体为聚硅酸(H2SiO3)n、三甲氧基甲基硅烷、二甲氧基二甲基硅烷或其混合物。此外，可以将其它添加剂，如二氧化硅胶体(例如，)、二氧化硅共前体，或二氧化硅纳米颗粒加入到二氧化硅前体溶液。这些添加剂作为附加的二氧化硅来源发挥作用。
一种或多种冷冻保护剂，优选选自由DMSO(二甲基亚砜)、氨基酸(例如脯氨酸或甘氨酸)、两性离子化合物(甜菜碱)和糖(海藻糖、蔗糖)、二醇(如(聚)乙二醇或乙二醇)或多元醇(或聚醇(多元醇、聚合醇，polyalcohol)，例如山梨糖醇、麦芽糖醇、甘油、赤藻糖醇、木糖醇、阿拉伯糖醇(arabitol)(树胶糖醇，lyxitol)、甘露醇、乳糖醇、异麦芽糖醇等)或其混合物所组成的组。
使用的二氧化硅前体的浓度可以在约5％和约10％(W/V)之间变化。二氧化硅前体的类型可影响低温保存方法的功效。
优选地，一种或多种冷冻保护剂以分别约1％至10％(DMSO)之间和约0.2M至约1.0M(蔗糖)之间的浓度与前体二氧化硅混合。
第二步骤(后续步骤)包括所得到的混合物在室温下的培养期，优选在控制室(controlledroom)内(在约4℃至约20℃之间的温度)，时间为超过1小时，优选约6小时到约48小时或更长时间。制备的杂化凝胶(hybridgels)优选保持在封闭的瓶中。
最后的步骤包括将所得的杂化二氧化硅凝胶转移到实验室冷冻器中(在约-30℃或更低，低到-196℃，优选在约-70℃，低到-196℃)，不需要任何特定的预防措施。
可以通过在室温下短时间快速加温样品瓶约5分钟至约10分钟来恢复(复原、回收，recovery)(植物)细胞悬液。然后将解冻的二氧化硅凝胶在含有固体营养培养基的板上铺展。宿主结构保持(植物)细胞活力并且不妨碍它们在冻融循环后的增殖。在约7天到约14天的时期后，将回收的杂合二氧化硅-细胞材料转移至含新鲜液体培养基的瓶中。可替换地，将培育物(cultivar)保持在固体营养培养基上。该方法是有效的、快速且价廉的并因此，比使用的现有方法如慢冻技术或脱水固定化细胞更加有效。
本发明的另一方面涉及低温保存试剂盒，特别是用于低温保存(植物，包括藻类)细胞、遗传修饰的(植物)细胞、(植物，包括藻类)细胞器(如类囊体)或(植物，包括藻类)组织的低温保存试剂盒，其可以用在根据本发明的方法中并包括由一种或多种二氧化硅前体，如聚硅酸，以及一种或多种冷冻保护剂制成的二氧化硅基质。根据本发明的试剂盒可以在单独的小瓶中包括这些用于根据本发明的基质的成分(element)。一种或多种二氧化硅前体优选选自由聚硅酸(H2SiO3)n(优选偏硅酸H2SiO3)、氢氧化硅、二氧化硅烷氧化物(例如原硅酸四甲酯(TMOS)、原硅酸四乙酯(TEOS)、原硅酸四丙酯(TPOS)、四(2-羟乙基)原硅酸酯(EGMS)、四(2-羟丙基)原硅酸酯(PGMS)和四(2,3-二羟丙基)原硅酸酯(GLMS))、硅酸盐(如硅酸钠或硅酸钾)、二氧化硅纳米颗粒、山梨醇硅烷、有机改性硅酸盐(有机改性的二氧化硅)、三甲氧基甲基硅烷、二甲氧基二甲基硅烷、TMOS(四甲氧基硅烷)、DGS(二甘油基硅烷)，或其混合物所组成的组。一种或多种冷冻保护剂是前面所描述的，如DMSO(二甲基亚砜)、糖(海藻糖、蔗糖)、氨基酸(脯氨酸或甘氨酸)、两性离子化合物(甜菜碱)、二醇、多元醇(或聚醇，例如山梨糖醇、麦芽糖醇、甘油、赤藻糖醇、木糖醇、阿拉伯糖醇(树胶糖醇，lyxitol)、甘露醇等)或其混合物。
优选地，在基质中二氧化硅前体的浓度可以在约5％到约10％(W/V)之间变化。在优选的实施方式中，一种或多种冷冻保护剂(DMSO和蔗糖)以分别约1％至10％(DMSO)之间和约0.2M至约1.0M(蔗糖)之间的浓度与二氧化硅前体混合。
将参考附图在下列实施例中描述本发明，它们作为本发明的非限制性优选实施方式。
附图说明
图1表示经由在20℃监测O2摄取(暗呼吸)确定低温保存拟南芥(A.Thaliana)细胞的最佳条件。在低温保存方法的三个步骤的每一个之后，评估植物细胞的代谢活动。杂化凝胶在不同温度下的温育时间对低温保存(A)后的细胞活性的影响。蔗糖(B)和DMSO(C)浓度对细胞保存的影响。100％对应于未经历任何冻融循环的细胞的耗氧(氧气消耗、耗氧量)。平均值(n＝3)以标准偏差来呈现。
图2表示二氧化硅物质在低温保存拟南芥细胞中的作用。比较用聚硅酸(A)或二氧化硅纳米颗粒(B)预温育的回收细胞的耗氧。平均值(n＝3)以标准偏差呈现。
图3表示植物细胞的长期保存。杂化凝胶在-80℃的存储时间对在解冻后代谢活性的影响。平均值(n＝3)以标准偏差呈现。
实施例
实施例1：用于低温保存拟南芥细胞的最佳条件。
材料和方法
二氧化硅纳米颗粒(5-15nm)、三(1,2-苯二醇酸根-O,O')硅酸钾(dipotassiumtris(1,2-benzenediolato-O,O’)silicate)、Murashige和Skoog培养基(MSMO)、蔗糖、二甲基亚砜(DMSO)、氢氧化钾、二水合草酸(oxalicaciddehydrate)99％、四水合钼酸铵99％、4(甲氨基)硫酸苯酚(4-(甲氨基)苯酚硫酸盐，4(methylamino)phenolsulfate)99％、亚硫酸钠99％、盐酸37％、硫酸95％、激动素和1-萘乙酸(1-naphtalenaceticacid)购自Sigma-Aldrich。如由C.F.Meunier,J等人描述的，聚硅酸(H2SiO3)是由硅酸钠溶液(测定25.5-28.5％，Merck)制备(J.Mater.Chem.,2010,20,929-936)。Amplex红色过氧化氢测定试剂盒和孔径0.2μm的膜过滤器分别获自MolecularProbes公司和Sartorius。
培养条件
在补充3％蔗糖、0.05mgL-1激动素和0.5mgL-1的1-萘乙酸的MSMO培养基(4.4gL-1，pH5.7)中培育衍生自拟南芥株L-MM1生态型Landbergerecta的叶的光能自养(Photomixotrophic)悬浮培养的细胞。将细胞保持在16/8h的光照/黑暗光周期、在22℃、在以每分钟115转(r.p.m)的转动摇动器上。
低温保存细胞培养物
将10mL的细胞悬浮液(最后次培养(传代培养，subculture)后3天)浓缩10倍，以获得约120mg新鲜重量每毫升的细胞密度。然后将植物细胞转移并与4mL用0.20μm膜过滤器进行过滤消毒并在4℃冷冻的冷冻保护二氧化硅溶胶(在1M和3M之间的H2SiO3、在1％和10％(v/v)之间的DMSO、在0.2M和1M之间的蔗糖、约4.4gL-1MSMO粉末，pH值用0.2MKOH调节至4和8之间)混合。然后将混合物在冷室(4℃)培养约1-6小时。同时，发生胶凝。所得到的杂化二氧化硅凝胶最后转移并存储在实验室冷冻器(约-80℃)中。
解冻和恢复
经将样品小瓶在室温下温热约5-10分钟将杂化二氧化硅基质快速解冻。将解冻的凝胶铺展在包含固体培养基(琼脂0.8％、补充有3％蔗糖、0.05mgL-1激动素和0.5mgL-11-萘乙酸的4.4gL-1MSMO培养基)的板上，并在22℃下、以16/8小时光照/黑暗光周期培养约7天。在此期间后，将恢复的杂化二氧化硅-细胞材料转移到含有20mL新鲜液体培养基的厄伦美厄烧瓶(Erlenmeyerflask)中。
解冻后的细胞活力
在解冻约1小时至约7天后通过用Clark型氧电极(由HansatechInstruments，UK制造的Oxy-lab)监测在20℃下的O2摄取来确定细胞生理功能。用活体染料染色(vitaldyestaining)(荧光素二乙酸酯，FDA)确认细胞活力。将解冻的细胞用5mMFDA在室温培育5分钟。通过使用荧光显微镜(MultizoomAZ100显微镜，购自Nikon)利用485/35nm激发光照射样品，用彩色摄像机(DSRi1，Nikon)在536/40nm采集显微照片。回收细胞生长以及形成所谓的愈伤组织的能力也用作细胞活力的指标。
在低温保存方法的每个三种步骤之后评估植物细胞的代谢活性(监测O2摄取)：包封(固定化)、温育(4℃)和冷冻(-80℃)。在图A中，评估杂化凝胶在不同温度(4℃或20℃)的温育步骤对低温保存后的细胞活性的影响。
然后，评估蔗糖(B)和DMSO(C)浓度对细胞保存的影响。100％对应于未经历任何冻融循环的细胞的耗氧。
图1A提供本发明方法的第二步骤中的最佳温育时间的数据。如在图1A中报告的，最佳温育时间在约6小时到约48小时之间变化。
图1B提供本发明方法的第一步骤中的冷冻保护二氧化硅溶液中蔗糖的最佳浓度的数据。如在图1B中报告的，最佳蔗糖浓度在约0.2M到约1M之间变化。
图1C提供本发明方法的第一步骤中的冷冻保护二氧化硅溶液中的DMSO的最佳浓度的数据。如在图1C中报告的，最佳DMSO浓度在约1％至约10％之间变化。
实施例2：二氧化硅物质对拟南芥细胞的低温保存的作用
按照在实施例1中所呈现的执行本实验。将植物细胞转移并与4mL包含不同浓度的聚硅酸(约0.4％到约10％)、二氧化硅纳米颗粒(约1％到约12％)的冷冻保护二氧化硅混合。图2比较了用聚硅酸(A)或二氧化硅纳米颗粒(B)预温育的回收细胞的耗氧。
可以由图2推导，在测试浓度范围内，作为二氧化硅前体使用的聚硅酸提供比二氧化硅纳米颗粒更高的代谢活性。如在图2A中报告的，最佳聚硅酸浓度在约5％至约10％之间变化。
最佳二氧化硅纳米颗粒浓度为约10％。
实施例3：拟南芥细胞的长期冷冻保存
按照在实施例1中所呈现的执行本实验。图3表示回收细胞在-80℃保存一个月到24个月的时间后的耗氧。
植物细胞在二氧化硅基质内冷冻保存两年仍有活力，如在图3中报告的。

Claims (17)

1.一种用于低温保存(基因修饰的)植物细胞、植物细胞器或植物组织的方法，其包括以下步骤：
-将所述植物细胞、植物细胞器或植物组织包封在包含一种或多种二氧化硅前体和一种或多种冷冻保护剂的多孔二氧化硅基质中；
-在4℃和20℃之间的温度下温育所获得的混合物超过1小时的时期；
-将所得到的杂化二氧化硅凝胶转移到在-30℃和-196℃之间的温度下的冷冻器中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述冷冻器处于-80℃的温度。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述一种或多种冷冻保护剂选自由二甲基亚砜(DMSO)、糖、氨基酸、两性离子化合物(甜菜碱)、二醇、多元醇或其混合物所组成的组。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述糖是蔗糖或海藻糖。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述氨基酸是脯氨酸或甘氨酸。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述二醇是(聚)乙二醇。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述多元醇选自由山梨糖醇、麦芽糖醇、甘油、赤藻糖醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、甘露醇、乳糖醇、异麦芽糖醇或其混合物所组成的组。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述二氧化硅基质中所述二氧化硅前体的浓度可以在5％和10％之间变化。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种二氧化硅前体选自由聚硅酸(H2SiO3)n(优选偏硅酸H2SiO3)、氢氧化硅、二氧化硅烷氧化物(例如原硅酸四甲酯(TMOS)、原硅酸四乙酯(TEOS)、原硅酸四丙酯(TPOS)、四(2-羟乙基)原硅酸酯(EGMS)、四(2-羟丙基)原硅酸酯(PGMS)和四(2,3-二羟丙基)原硅酸酯(GLMS))、硅酸盐(如硅酸钠或硅酸钾)、二氧化硅纳米颗粒、山梨醇硅烷、有机改性硅酸盐(有机改性的二氧化硅)、三甲氧基甲基硅烷、二甲氧基二甲基硅烷、TMOS(四甲氧基硅烷)、DGS(二甘油基硅烷)，或其混合物所组成的组。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂为与所述一种或多种二氧化硅前体混合的浓度分别在0.2M和1.0M之间(蔗糖)以及1％和10％之间(DMSO)的蔗糖和DMSO。
11.一种用于植物细胞、植物细胞器或植物组织的低温保存试剂盒，包括一种或多种二氧化硅前体和一种或多种冷冻保护剂。
12.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述一种或多种二氧化硅前体选自由聚硅酸(H2SiO3)n(优选偏硅酸H2SiO3)、氢氧化硅、二氧化硅烷氧化物(例如原硅酸四甲酯(TMOS)、原硅酸四乙酯(TEOS)、原硅酸四丙酯(TPOS)、四(2-羟乙基)原硅酸酯(EGMS)、四(2-羟丙基)原硅酸酯(PGMS)和四(2,3-二羟丙基)原硅酸酯(GLMS))、硅酸盐(如硅酸钠或硅酸钾)、二氧化硅纳米颗粒、山梨醇硅烷、有机改性硅酸盐(ormosils)(有机改性的二氧化硅)、三甲氧基甲基硅烷、二甲氧基二甲基硅烷、TMOS(四甲氧基硅烷)、DGS(二甘油基硅烷)，或其混合物所组成的组。
13.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述一种或多种冷冻保护剂选自由DMSO(二甲基亚砜)、糖、氨基酸、两性离子化合物(甜菜碱)、二醇或多元醇或其混合物所组成的组。
14.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述糖是蔗糖或海藻糖。
15.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述氨基酸为脯氨酸或甘氨酸。
16.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述二醇是(聚)乙二醇。
17.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述多元醇选自由山梨糖醇、麦芽糖醇、甘油、赤藻糖醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、甘露醇、乳糖醇、异麦芽糖醇或其混合物所组成的组。
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