CN107779432A - 一种car‑t细胞制剂及低温保存介质 - Google Patents

一种car‑t细胞制剂及低温保存介质 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CAR‑T细胞制剂及低温保存介质，属于细胞治疗技术领域。一种CAR‑T细胞制剂方法，包括以下步骤：(1)将培养的CAR‑T细胞混匀后，转移至离心管中，离心，弃掉上清液；(2)将离心后的细胞团先用DPBS重悬，加DPBS，在磁力架上静止，实现细胞跟磁珠的分离；(3)用移液管将细胞悬液转移至新的离心管中，重复去磁珠操作两次；(4)在200‑500g条件下，离心，弃掉上清液，备用；(5)根据回输的细胞数量，用低温保存介质重悬细胞。本发明的优点是：制剂后的细胞可以在低温(2‑8℃)的条件下至少保存24hr，同时细胞可以保持高于95％活细胞率和超过90％的杀伤率。

Description

一种CAR-T细胞制剂及低温保存介质
技术领域
本发明公开了一种CAR-T细胞制剂及低温保存介质，属于细胞治疗技术领域。
背景技术
免疫细胞治疗是继手术、化疗、放疗和靶向疗法后出现的一种新型疗法，被称为治疗癌症的“第五大疗法”。尽管免疫治疗历经了多年断断续续的发展，但是其研究正在取得越来越多令人激动的结果，因此被顶级学术期刊《科学》杂志评为2013年十大科学突破之首。
其中，CAR-T免疫细胞治疗(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)，是利用基因工程技术手段，特异性改造患者本身的免疫T细胞，使其能够识别病变癌症细胞，从而实现特异性杀伤的作用。
CAR-T一般治疗流程是：(1)先从癌症病人身上分离出免疫T细胞；(2)利用基因工程技术手段对其进行特定基因改造，使T细胞表面表达一种能识别肿瘤细胞、并且同时激活T细胞杀死肿瘤细胞的嵌合抗体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)，T细胞转变成CAR-T细胞，进而能靶向杀死癌细胞；(3)体外培养，大量扩增CAR-T细胞；(4)把扩增好的CAR-T细胞输回病人体内，特效杀死癌细胞。
因此，在CAR-T细胞体外大量扩增培养后，有效的制成易保存、易运输、易回输的制剂就显得极为重要。因此，本专利阐述了在CAR-T细胞体外培养后的制剂方法及低温保存介质。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种CAR-T细胞制剂方法。
本发明的另一目的是提供一种CAR-T细胞的低温保存介质。
一种CAR-T细胞制剂方法，包括以下步骤：
(1)将培养的CAR-T细胞混匀后，转移至离心管中，在200-500g条件下，离心5-8min，弃掉上清液；
(2)将离心后的细胞团先用DPBS重悬，确认细胞团被完全打碎，加DPBS，在磁力架上静止2-5分钟，实现细胞跟磁珠的分离；
(3)用移液管将细胞悬液转移至新的离心管中，重复去磁珠操作两次；
(4)在200-500g条件下，离心5-8min，弃掉上清液，备用；
(5)根据回输的细胞数量，用低温保存介质重悬细胞。
所述步骤5中的低温保存介质由葡萄糖、人血白蛋白、RPMI-1640基础培养基和生理盐水组成，其中葡萄糖的质量浓度为5-20％，人血白蛋白的质量浓度为5-25％，RPMI-1640基础培养基与生理盐水以1:1-1:9的体积比混合。
优选的，所述葡萄糖的质量浓度为10-20％，人血白蛋白的质量浓度为10-20％，RPMI-1640基础培养基与生理盐水以1:1-1:5的体积比混合。
进一步优选的，所述葡萄糖的质量浓度为10％，人血白蛋白的质量浓度为15％，RPMI-1640基础培养基与生理盐水以1:1的体积比混合。
所述步骤5中细胞的密度为1×106-500×106个/mL。
本发明还提供了一种CAR-T细胞的低温保存介质，由葡萄糖、人血白蛋白、RPMI-1640基础培养基和生理盐水组成，其中葡萄糖的质量浓度为5-20％，人血白蛋白的质量浓度为5-25％，RPMI-1640基础培养基与生理盐水以1:1-1:9的体积比混合。
优选的，所述葡萄糖的质量浓度为10-20％，人血白蛋白的质量浓度为10-20％，RPMI-1640基础培养基与生理盐水以1:1-1:5的体积比混合。
进一步优选的，所述葡萄糖的质量浓度为10％，人血白蛋白的质量浓度为15％，RPMI-1640基础培养基与生理盐水以1:1的体积比混合。
本发明还提供给了一种CAR-T细胞制剂，由CAR-T细胞和上述的CAR-T细胞的低温保存介质组成。
所述细胞的密度为1×106-500×106个/mL。
RPMI-1640基础培养基和生理盐水更多的作为保存介质的主要液体基质，葡萄糖和人血白蛋白主要用于细胞在运输过程中的保护，含量过高或过低，都会影响细胞在运输过程中的活性，特别是距离较长的运输。
本发明的优点是：制剂后的细胞可以在低温(2-8℃)的条件下至少保存24hr，同时细胞可以保持高于95％活细胞率和超过90％的杀伤率。
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，并非对本发明的限制。凡依照本发明内容所进行的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1为在低温保存介质中24小时内活细胞率
图2为在低温保存介质中24小时内细胞杀伤率
具体实施方式
以下实施例中，原料的来源如下：
RPMI-1640基础培养基：购自Invitrogen公司
人血白蛋白：购自四川远大蜀阳药业股份有限公司
生理盐水和葡萄糖：市售。
实施例1-实施例6：低温保存介质
一、配方
表1：实施例1-实施例6的原料表
二、制法
1、将RPMI-1640基础培养基与生理盐水混合均匀，得到溶液1；
2、将葡萄糖和人血白蛋白加入到溶液1中，完全溶解后，用0.22μm滤膜过滤，即得。
实施例7：CAR-T细胞制剂
一、材料
1.CAR-T细胞，按中国专利申请201610014730.6方法制备。
2.低温保存介质，按实施例3制备。
二、方法
(一)CAR-T细胞分离
1.将培养7天后的CAR-T细胞混匀后，转移至50mL离心管中，在500g条件下，离心5min，弃掉上清液。
2.将离心后的细胞团先用10mLDPBS重悬，确认细胞团被完全打碎，加DPBS至40mL，在磁力架上静止5分钟，实现细胞跟磁珠的分离。
3.用移液管将细胞悬液转移至新的50mL离心管中，重复去磁珠操作两次。
4.在500g条件下，离心5min，弃掉上清液，备用。
(二)CAR-T细胞制剂
1.将离心备用的细胞用低温保存介质重悬，细胞的密度为1×106个/mL，确认细胞团被完全打碎。
2.选取合适体积的血液运输袋，通过注射器相连，将低温保存介质重悬的细胞注射入袋内，并热密封。即得CAR-T细胞制剂。
三、结果
制剂后的细胞可以在低温(2-8℃)的条件下至少保存24hr。
实施例8：CAR-T细胞制剂
一、材料
1.CAR-T细胞，按中国专利申请201610014730.6方法制备。(也可以是其他来源的CAR-T细胞)
2.低温保存介质，按实施例3制备。
二、方法
(一)CAR-T细胞分离
1.将培养10天后的CAR-T细胞混匀后，转移至50mL离心管中，在200g条件下，离心8min，弃掉上清液。
2.将离心后的细胞团先用10mLDPBS重悬，确认细胞团被完全打碎，加DPBS至40mL，在磁力架上静止2分钟，实现细胞跟磁珠的分离。
3.用移液管将细胞悬液转移至新的50mL离心管中，重复去磁珠操作两次。
4.在200g条件下，离心8min，弃掉上清液，备用。
(二)CAR-T细胞制剂
1.将离心备用的细胞用低温保存介质重悬，细胞的密度为500×106个/mL，确认细胞团被完全打碎。
2.选取合适体积的血液运输袋，通过注射器相连，将低温保存介质重悬的细胞注射入袋内，并热密封。即得CAR-T细胞制剂。
三、结果
制剂后的细胞可以在低温(2-8℃)的条件下至少保存24hr。
实施例9：CAR-T细胞制剂的检验
一、材料
实施例7得到的CAR-T细胞制剂；
台盼蓝染色试剂；
肿瘤细胞株：K562细胞株，购自ATCC
二、方法
1.细胞存活率测定
CAR-T细胞在低温保存介质中制剂后，每隔2小时取样，用台盼蓝(Trypan Blue)染色后在显微镜下观察、计数。
2.细胞杀伤性测定
CAR-T细胞在低温保存介质中制剂后，每隔2小时取样，与K562肿瘤细胞株混合于96孔板中共培养后24小时后，加入10μL新鲜配置的5mg/mL MTT共培养4小时。弃上清后，每孔加入100μLDMSO震荡溶解10分钟，用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值。同时设置空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。每孔减去空白对照孔后，用杀伤率计算效应细胞的细胞毒活性。
细胞杀伤率(％)＝【靶细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A值)】/靶细胞对照A值X100％。
三、结果
1.细胞存活率测定
图1显示，在24小时内，细胞存活率超过95％，说明本发明制剂能够保持较高的活细胞率。
2.细胞杀伤性测定
图2显示，在24小时内，细胞杀伤率均超过90％，证明本发明制剂能够使细胞保持较高的杀伤率。

Claims (10)

1.一种CAR-T细胞制剂方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将培养的CAR-T细胞混匀后，转移至离心管中，在200-500g条件下，离心5-8min，弃掉上清液；
(2)将离心后的细胞团先用DPBS重悬，确认细胞团被完全打碎，加DPBS，在磁力架上静止2-5分钟，实现细胞跟磁珠的分离；
(3)用移液管将细胞悬液转移至新的离心管中，重复去磁珠操作两次；
(4)在200-500g条件下，离心5-8min，弃掉上清液，备用；
(5)根据回输的细胞数量，用低温保存介质重悬细胞。
2.根据权利要求1所述的一种CAR-T细胞制剂方法，其特征在于：所述步骤5中的低温保存介质由葡萄糖、人血白蛋白、RPMI-1640基础培养基和生理盐水组成，其中葡萄糖的质量浓度为5-20％，人血白蛋白的质量浓度为5-25％，RPMI-1640基础培养基与生理盐水以1:1-1:9的体积比混合。
3.根据权利要求2所述的一种CAR-T细胞制剂方法，其特征在于：所述葡萄糖的质量浓度为10-20％，人血白蛋白的质量浓度为10-20％，RPMI-1640基础培养基与生理盐水以1:1-1:5的体积比混合。
4.根据权利要求3所述的一种CAR-T细胞制剂方法，其特征在于：所述葡萄糖的质量浓度为10％，人血白蛋白的质量浓度为15％，RPMI-1640基础培养基与生理盐水以1:1的体积比混合。
5.根据权利要求3所述的一种CAR-T细胞制剂方法，其特征在于：所述步骤5中细胞的密度为1×106-500×106个/mL。
6.一种CAR-T细胞的低温保存介质，其特征在于：由葡萄糖、人血白蛋白、RPMI-1640基础培养基和生理盐水组成，其中葡萄糖的质量浓度为5-20％，人血白蛋白的质量浓度为5-25％，RPMI-1640基础培养基与生理盐水以1:1-1:9的体积比混合。
7.根据权利要求6所述的一种CAR-T细胞的低温保存介质，其特征在于：所述葡萄糖的质量浓度为10-20％，人血白蛋白的质量浓度为10-20％，RPMI-1640基础培养基与生理盐水以1:1-1:5的体积比混合。
8.根据权利要求7所述的一种CAR-T细胞的低温保存介质，其特征在于：所述葡萄糖的质量浓度为10％，人血白蛋白的质量浓度为15％，RPMI-1640基础培养基与生理盐水以1:1的体积比混合。
9.一种CAR-T细胞制剂，其特征在于：由CAR-T细胞和权利要求6-8中任何一项所述的CAR-T细胞的低温保存介质组成。
10.根据权利要求9所述的一种CAR-T细胞制剂，其特征在于：所述细胞的密度为1×106-500×106个/mL。
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