CN107771780A - 一种car‑t细胞冻存介质及冻存方法 - Google Patents

一种car‑t细胞冻存介质及冻存方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CAR‑T细胞冻存介质及冻存方法，属于细胞治疗技术领域。一种CAR‑T细胞冻存方法，包括以下步骤：(1)将培养的CAR‑T细胞在200‑500g条件下，离心，弃上清液；(2)细胞团用DPBS重悬，在磁力架上静止，细胞跟磁珠分离；(3)将细胞悬液转移至新的离心管中，重复去磁珠；(4)将细胞悬液离心，弃掉上清液；(5)根据需要冻存的细胞总数量，将细胞重悬于冻存介质中；(6)将细胞分装于冻存管或者冻存袋中，程序降温；降温结束后，转移至液氮中长期保存。本发明的优点是，对细胞保护效果明显，解冻后可直接回输人体，并且具有高活细胞率和杀伤率。

Description

一种CAR-T细胞冻存介质及冻存方法
技术领域
本发明公开了一种CAR-T细胞冻存介质及冻存方法，属于细胞治疗技术领域。
背景技术
免疫细胞治疗是继手术、化疗、放疗和靶向疗法后出现的一种新型疗法，被称为治疗癌症的“第五大疗法”。尽管免疫治疗历经了多年断断续续的发展，但是其研究正在取得越来越多令人激动的结果，因此被顶级学术期刊《科学》杂志评为2013年十大科学突破之首。
其中，CAR-T免疫细胞治疗(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)，是利用基因工程技术手段，特异性改造患者本身的免疫T细胞，使其能够识别病变癌症细胞，从而实现特异性杀伤的作用。
CAR-T一般治疗流程是：(1)先从癌症病人身上分离出免疫T细胞；(2)利用基因工程技术手段对其进行特定基因改造，使T细胞表面表达一种能识别肿瘤细胞、并且同时激活T细胞杀死肿瘤细胞的嵌合抗体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)，T细胞转变成CAR-T细胞，进而能靶向杀死癌细胞；(3)体外培养，大量扩增CAR-T细胞；(4)把扩增好的CAR-T细胞输回病人体内，特效杀死癌细胞。
因此，在CAR-T细胞体外大量扩增培养后，为方便细胞长期保存和长距离运输，有效的冻存细胞，并且保持细胞特性不变，对CAR-T疗法的临床应用极为重要。因此，本专利阐述了在CAR-T细胞体外培养后的超低温冻存方法及细胞冻存介质的制备方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种CAR-T细胞的超低温冻存方法。
本发明的另一目的是提供一种CAR-T细胞冻存介质的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种CAR-T细胞冻存方法，包括以下步骤：
(1)将培养的CAR-T细胞转移至离心管中，在200-500g条件下，离心5-8min，弃掉上清液；
(2)将离心后的细胞团先用DPBS重悬，确认细胞团被完全打碎，在磁力架上静止2-5分钟，实现细胞跟磁珠的分离；
(3)用移液管将细胞悬液转移至新的离心管中，重复去磁珠操作两次；
(4)将清除磁珠后的细胞悬液在200-500g条件下，离心5-8min，弃掉上清液，备用；
(5)根据需要冻存的细胞总数量，计算冻存介质的体积，将细胞重悬于冻存介质中；
(6)将细胞分装于冻存管或者冻存袋中，放置于-80℃超低温冰箱中缓慢冷冻8-18小时，或者放置于程序降温仪中按照相应程序降温至-85℃；降温结束后，将细胞冻存管或者冻存袋转移至液氮中长期保存。
回输需要时，在液氮条件下运送至治疗医院，在37℃条件下快速解冻后，可以直接回输给治疗病人。
所述步骤5中的冻存介质由氯化钠、二甲基亚砜、葡萄糖、人血白蛋白、低分子葡聚糖和RPMI-1640基础培养基组成，其中氯化钠的质量浓度为0.45-0.9％，二甲基亚砜溶液的体积浓度为5-15％，葡萄糖的质量浓度为5-20％、人血白蛋白的质量浓度为10-50％，低分子葡聚糖的质量浓度为5-20％。
优选的，所述步骤5中的冻存介质，其中氯化钠的质量浓度为0.9％，二甲基亚砜溶液的体积浓度为10-15％，葡萄糖的质量浓度为5-10％、人血白蛋白的质量浓度为10-30％，低分子葡聚糖的质量浓度为5-10％。
进一步优选的，所述步骤5中的冻存介质，其中氯化钠的质量浓度为0.9％，二甲基亚砜溶液的体积浓度为10％，葡萄糖的质量浓度为5％，人血白蛋白的质量浓度为10％，低分子葡聚糖的质量浓度为5％。
所述步骤5中CAR-T细胞的冻存密度为1×106个/ml-500×106个/ml。
本发明还提供了一种可用于各种CAR-T细胞的冻存介质。
一种CAR-T细胞的冻存介质，由氯化钠、二甲基亚砜、葡萄糖、人血白蛋白、低分子葡聚糖和RPMI-1640基础培养基组成，其中氯化钠的质量浓度为0.45-0.9％，二甲基亚砜溶液的体积浓度为5-15％，葡萄糖的质量浓度为5-20％、人血白蛋白的质量浓度为10-50％，低分子葡聚糖的质量浓度为5-20％。
优选的，所述氯化钠的质量浓度为0.9％，二甲基亚砜溶液的体积浓度为10-15％，葡萄糖的质量浓度为5-10％、人血白蛋白的质量浓度为10-30％，低分子葡聚糖的质量浓度为5-10％。
进一步优选的，所述氯化钠的质量浓度为0.9％，二甲基亚砜溶液的体积浓度为10％，葡萄糖的质量浓度为5％，人血白蛋白的质量浓度为10％，低分子葡聚糖的质量浓度为5％。
本发明中，终浓度为0.9％的氯化钠溶液和RPMI-1640基础培养基作为冻存介质的主要液体基质，葡萄糖、和人血白蛋白、低分子葡聚糖主要作为细胞在液体状态下的保护剂。二甲基亚砜主要保护细胞在冻存的降温过程中，不形成大的液体结晶而损坏细胞，浓度过高在病人直接回输过程中会带来副反应。
一种CAR-T细胞的冻存制剂，由CAR-T细胞和上述的CAR-T细胞的冻存介质组成。
所述CAR-T细胞的冻存密度为1×106个/ml-500×106个/ml。
本发明的优点是：对细胞保护效果明显，解冻后可直接回输人体，并且具有高活细胞率和杀伤率。
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，并非对本发明的限制。凡依照本发明内容所进行的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1为本发明超低温冻存复苏后的活细胞率
图2为本发明超低温冻存复苏后细胞杀伤率
具体实施方式
以下实施例中，原料的来源如下：
RPMI-1640基础培养基：购自Invitrogen公司
人血白蛋白：购自四川远大蜀阳药业股份有限公司
低分子葡聚糖：购自Baxter
二甲基亚砜：购自Sigma Aldrich
氯化钠、葡萄糖：市售
实施例1-实施例12：制备冻存介质
一、原料
表1：实施例1-实施例8的冻存介质原料配比
二、制法
1、按表1中的量精密称取各种原料；
2、将二甲基亚砜加入RPMI-1640基础培养基中，混匀，得到溶液1；
3、将氯化钠、葡萄糖、人血白蛋白和低分子葡聚糖分别加入到溶液1中，溶解并混合均匀，得到溶液2；
4、将溶液2过0.22μm滤膜一次，即得。
实施例9：CAR-T细胞冻存制剂
一、材料
1、CAR-T细胞，按中国专利申请201610014730.6方法制备。(也可以是其他来源的CAR-T细胞)
2、冻存介质，按实施例1方法制备。
二、方法
(一)CAR-T细胞分离
1、将培养7天后的CAR-T细胞混匀后，转移至50mL离心管中，在200g条件下，离心5min，弃掉上清液。
2、将离心后的细胞团先用10mLDPBS重悬，确认细胞团被完全打碎，加DPBS至40mL，在磁力架上静止2分钟，实现细胞跟磁珠的分离。
3、用移液管将细胞悬液转移至新的50mL离心管中，重复去磁珠操作两次。
4、将清除磁珠后的细胞悬液在200g条件下，离心5min，弃掉上清液，备用。
(二)CAR-T细胞冻存制剂
1、CAR-T细胞的冻存密度为1×106个/ml，根据需要冻存的细胞总数量，将细胞重悬于冻存介质中，确认细胞团被完全打碎。
2、将细胞分装于冻存管或者冻存袋中，放置于-80℃超低温冰箱中缓慢冷冻8小时，将细胞冻存管或者冻存袋转移至液氮中长期保存。
三、结果
得到的CAR-T细胞冻存制剂可以在液氮中长期保存。
实施例10：CAR-T细胞冻存制剂
一、材料
1、CAR-T细胞，按中国专利申请201610014730.6方法制备。(也可以是其他来源的CAR-T细胞)
2、冻存介质，按实施例6方法制备。
二、方法
(一)CAR-T细胞分离
1、将培养10天后的CAR-T细胞混匀后，转移至50mL离心管中，在500g条件下，离心8min，弃掉上清液。
2、将离心后的细胞团先用10mLDPBS重悬，确认细胞团被完全打碎，加DPBS至40mL，在磁力架上静止5分钟，实现细胞跟磁珠的分离。
3、用移液管将细胞悬液转移至新的50mL离心管中，重复去磁珠操作两次。
4、将清除磁珠后的细胞悬液在500g条件下，离心8min，弃掉上清液，备用。
(二)CAR-T细胞冻存制剂
1、CAR-T细胞的冻存密度为500×106个/ml，根据需要冻存的细胞总数量，将细胞重悬于冻存介质中，确认细胞团被完全打碎。
2、将细胞分装于冻存管或者冻存袋中，放置于程序降温仪中按照相应程序降温至-85℃。降温结束后，将细胞冻存管或者冻存袋转移至液氮中长期保存。
三、结果
得到的CAR-T细胞冻存制剂可以在液氮中长期保存。
实施例11：CAR-T细胞冻存制剂的检验
一、材料
实施例9得到的CAR-T细胞冻存制剂
台盼蓝染色试剂；
其他商业冻存介质：CryoStorTMCS10，购自STEMCELL Technologies
肿瘤细胞株：K562细胞株，购自ATCC
二、方法
1、细胞复苏：从液氮罐中取出细胞冷冻保存管，立即放入37℃水浴槽中快速解冻；待冻存管中细胞混合液完全溶化后，将细胞混合液缓慢加入含有9mL无血清培养基的试管中，混合均匀；在200-500g条件下，离心5-8min，弃掉上清液，备用。
2、细胞存活率测定
CAR-T细胞在低温保存介质中制剂后，每隔2小时取样，用台盼蓝(Trypan Blue)染色后在显微镜下观察、计数。
3、细胞杀伤性测定
CAR-T细胞冻存制剂复苏后，与肿瘤细胞株混合于96孔板中共培养后24小时后，加入10μL新鲜配置的5mg/mL MTT共培养4小时。弃上清后，每孔加入100μLDMSO震荡溶解10分钟，用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值。同时设置空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。每孔减去空白对照孔后，用杀伤率计算效应细胞的细胞毒活性。
细胞杀伤率(％)＝【靶细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A值)】/靶细胞对照A值×100％。结果显示，在24小时内，跟其他商业冻存介质相比，细胞保持较高的杀伤率。
三、结果
1.细胞复苏细胞存活率测定
图1显示，跟其他商业冻存介质相比，本发明细胞保持较高的活细胞率。本公司98％，其他商业介质75％。
2.细胞杀伤性测定
图2显示，在24小时内，跟其他商业冻存介质相比，本发明细胞保持较高的杀伤率，本公司97％，其他商业介质70％，证明本发明制剂能够使细胞保持较高的杀伤率。

Claims (10)

1.一种CAR-T细胞冻存方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将培养的CAR-T细胞转移至离心管中，在200-500g条件下，离心5-8min，弃掉上清液；
(2)将离心后的细胞团先用DPBS重悬，确认细胞团被完全打碎，在磁力架上静止2-5分钟，实现细胞跟磁珠的分离；
(3)用移液管将细胞悬液转移至新的离心管中，重复去磁珠操作两次；
(4)将清除磁珠后的细胞悬液在200-500g条件下，离心5-8min，弃掉上清液，备用；
(5)根据需要冻存的细胞总数量，计算冻存介质的体积，将细胞重悬于冻存介质中；
(6)将细胞分装于冻存管或者冻存袋中，放置于-80℃超低温冰箱中缓慢冷冻8-18小时，或者放置于程序降温仪中按照相应程序降温至-85℃；降温结束后，将细胞冻存管或者冻存袋转移至液氮中长期保存。
2.根据权利要求1所述的一种CAR-T细胞冻存方法，其特征在于：所述步骤5中的冻存介质由氯化钠、二甲基亚砜、葡萄糖、人血白蛋白、低分子葡聚糖和RPMI-1640基础培养基组成，其中氯化钠的质量浓度为0.45～0.9％，二甲基亚砜溶液的体积浓度为5～15％，葡萄糖的质量浓度为5～20％、人血白蛋白的质量浓度为10～50％，低分子葡聚糖的质量浓度为5～20％。
3.根据权利要求2所述的一种CAR-T细胞冻存方法，其特征在于：所述步骤5中的冻存介质，其中氯化钠的质量浓度为0.9％，二甲基亚砜溶液的体积浓度为10～15％，葡萄糖的质量浓度为5～10％、人血白蛋白的质量浓度为10～30％，低分子葡聚糖的质量浓度为5～10％。
4.根据权利要求3所述的一种CAR-T细胞冻存方法，其特征在于：所述步骤5中的冻存介质，其中氯化钠的质量浓度为0.9％，二甲基亚砜溶液的体积浓度为10％，葡萄糖的质量浓度为5％，人血白蛋白的质量浓度为10％，低分子葡聚糖的质量浓度为5％。
5.根据权利要求3所述的一种CAR-T细胞冻存方法，其特征在于：所述步骤5中CAR-T细胞的冻存密度为1×106/ml～500×106个/ml。
6.一种CAR-T细胞的冻存介质，其特征在于：由氯化钠、二甲基亚砜、葡萄糖、人血白蛋白、低分子葡聚糖和RPMI-1640基础培养基组成，其中氯化钠的质量浓度为0.45～0.9％，二甲基亚砜溶液的体积浓度为5～15％，葡萄糖的质量浓度为5～20％、人血白蛋白的质量浓度为10～50％，低分子葡聚糖的质量浓度为5～20％。
7.根据权利要求6所述的一种CAR-T细胞的冻存介质，其特征在于：所述氯化钠的质量浓度为0.9％，二甲基亚砜溶液的体积浓度为10～15％，葡萄糖的质量浓度为5～10％、人血白蛋白的质量浓度为10～30％，低分子葡聚糖的质量浓度为5～10％。
8.根据权利要求7所述的一种CAR-T细胞的冻存介质，其特征在于：所述氯化钠的质量浓度为0.9％，二甲基亚砜溶液的体积浓度为10％，葡萄糖的质量浓度为5％，人血白蛋白的质量浓度为10％，低分子葡聚糖的质量浓度为5％。
9.一种CAR-T细胞的冻存制剂，其特征在于：由CAR-T细胞和权利要求6-8中任何一项所述的CAR-T细胞的冻存介质组成。
10.根据权利要求9所述的一种CAR-T细胞的冻存制剂，其特征在于：所述CAR-T细胞的冻存密度为1×106/ml～500×106/ml。
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