CN107771780A - 一种car‑t细胞冻存介质及冻存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种CAR‑T细胞冻存介质及冻存方法,属于细胞治疗技术领域。一种CAR‑T细胞冻存方法,包括以下步骤:(1)将培养的CAR‑T细胞在200‑500g条件下,离心,弃上清液;(2)细胞团用DPBS重悬,在磁力架上静止,细胞跟磁珠分离;(3)将细胞悬液转移至新的离心管中,重复去磁珠;(4)将细胞悬液离心,弃掉上清液;(5)根据需要冻存的细胞总数量,将细胞重悬于冻存介质中;(6)将细胞分装于冻存管或者冻存袋中,程序降温;降温结束后,转移至液氮中长期保存。本发明的优点是,对细胞保护效果明显,解冻后可直接回输人体,并且具有高活细胞率和杀伤率。
Description
技术领域
本发明公开了一种CAR-T细胞冻存介质及冻存方法,属于细胞治疗技术领域。
背景技术
免疫细胞治疗是继手术、化疗、放疗和靶向疗法后出现的一种新型疗法,被称为治疗癌症的“第五大疗法”。尽管免疫治疗历经了多年断断续续的发展,但是其研究正在取得越来越多令人激动的结果,因此被顶级学术期刊《科学》杂志评为2013年十大科学突破之首。
其中,CAR-T免疫细胞治疗(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy,嵌合抗原受体T细胞免疫疗法),是利用基因工程技术手段,特异性改造患者本身的免疫T细胞,使其能够识别病变癌症细胞,从而实现特异性杀伤的作用。
CAR-T一般治疗流程是:(1)先从癌症病人身上分离出免疫T细胞;(2)利用基因工程技术手段对其进行特定基因改造,使T细胞表面表达一种能识别肿瘤细胞、并且同时激活T细胞杀死肿瘤细胞的嵌合抗体(Chimeric Antigen Receptor,CAR),T细胞转变成CAR-T细胞,进而能靶向杀死癌细胞;(3)体外培养,大量扩增CAR-T细胞;(4)把扩增好的CAR-T细胞输回病人体内,特效杀死癌细胞。
因此,在CAR-T细胞体外大量扩增培养后,为方便细胞长期保存和长距离运输,有效的冻存细胞,并且保持细胞特性不变,对CAR-T疗法的临床应用极为重要。因此,本专利阐述了在CAR-T细胞体外培养后的超低温冻存方法及细胞冻存介质的制备方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种CAR-T细胞的超低温冻存方法。
本发明的另一目的是提供一种CAR-T细胞冻存介质的制备方法。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种CAR-T细胞冻存方法,包括以下步骤:
(1)将培养的CAR-T细胞转移至离心管中,在200-500g条件下,离心5-8min,弃掉上清液;
(2)将离心后的细胞团先用DPBS重悬,确认细胞团被完全打碎,在磁力架上静止2-5分钟,实现细胞跟磁珠的分离;
(3)用移液管将细胞悬液转移至新的离心管中,重复去磁珠操作两次;
(4)将清除磁珠后的细胞悬液在200-500g条件下,离心5-8min,弃掉上清液,备用;
(5)根据需要冻存的细胞总数量,计算冻存介质的体积,将细胞重悬于冻存介质中;
(6)将细胞分装于冻存管或者冻存袋中,放置于-80℃超低温冰箱中缓慢冷冻8-18小时,或者放置于程序降温仪中按照相应程序降温至-85℃;降温结束后,将细胞冻存管或者冻存袋转移至液氮中长期保存。
回输需要时,在液氮条件下运送至治疗医院,在37℃条件下快速解冻后,可以直接回输给治疗病人。
所述步骤5中的冻存介质由氯化钠、二甲基亚砜、葡萄糖、人血白蛋白、低分子葡聚糖和RPMI-1640基础培养基组成,其中氯化钠的质量浓度为0.45-0.9%,二甲基亚砜溶液的体积浓度为5-15%,葡萄糖的质量浓度为5-20%、人血白蛋白的质量浓度为10-50%,低分子葡聚糖的质量浓度为5-20%。
优选的,所述步骤5中的冻存介质,其中氯化钠的质量浓度为0.9%,二甲基亚砜溶液的体积浓度为10-15%,葡萄糖的质量浓度为5-10%、人血白蛋白的质量浓度为10-30%,低分子葡聚糖的质量浓度为5-10%。
进一步优选的,所述步骤5中的冻存介质,其中氯化钠的质量浓度为0.9%,二甲基亚砜溶液的体积浓度为10%,葡萄糖的质量浓度为5%,人血白蛋白的质量浓度为10%,低分子葡聚糖的质量浓度为5%。
所述步骤5中CAR-T细胞的冻存密度为1×106个/ml-500×106个/ml。
本发明还提供了一种可用于各种CAR-T细胞的冻存介质。
一种CAR-T细胞的冻存介质,由氯化钠、二甲基亚砜、葡萄糖、人血白蛋白、低分子葡聚糖和RPMI-1640基础培养基组成,其中氯化钠的质量浓度为0.45-0.9%,二甲基亚砜溶液的体积浓度为5-15%,葡萄糖的质量浓度为5-20%、人血白蛋白的质量浓度为10-50%,低分子葡聚糖的质量浓度为5-20%。
优选的,所述氯化钠的质量浓度为0.9%,二甲基亚砜溶液的体积浓度为10-15%,葡萄糖的质量浓度为5-10%、人血白蛋白的质量浓度为10-30%,低分子葡聚糖的质量浓度为5-10%。
进一步优选的,所述氯化钠的质量浓度为0.9%,二甲基亚砜溶液的体积浓度为10%,葡萄糖的质量浓度为5%,人血白蛋白的质量浓度为10%,低分子葡聚糖的质量浓度为5%。
本发明中,终浓度为0.9%的氯化钠溶液和RPMI-1640基础培养基作为冻存介质的主要液体基质,葡萄糖、和人血白蛋白、低分子葡聚糖主要作为细胞在液体状态下的保护剂。二甲基亚砜主要保护细胞在冻存的降温过程中,不形成大的液体结晶而损坏细胞,浓度过高在病人直接回输过程中会带来副反应。
一种CAR-T细胞的冻存制剂,由CAR-T细胞和上述的CAR-T细胞的冻存介质组成。
所述CAR-T细胞的冻存密度为1×106个/ml-500×106个/ml。
本发明的优点是:对细胞保护效果明显,解冻后可直接回输人体,并且具有高活细胞率和杀伤率。
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明,并非对本发明的限制。凡依照本发明内容所进行的本领域等同替换,均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1为本发明超低温冻存复苏后的活细胞率
图2为本发明超低温冻存复苏后细胞杀伤率
具体实施方式
以下实施例中,原料的来源如下:
RPMI-1640基础培养基:购自Invitrogen公司
人血白蛋白:购自四川远大蜀阳药业股份有限公司
低分子葡聚糖:购自Baxter
二甲基亚砜:购自Sigma Aldrich
氯化钠、葡萄糖:市售
实施例1-实施例12:制备冻存介质
一、原料
表1:实施例1-实施例8的冻存介质原料配比
二、制法
1、按表1中的量精密称取各种原料;
2、将二甲基亚砜加入RPMI-1640基础培养基中,混匀,得到溶液1;
3、将氯化钠、葡萄糖、人血白蛋白和低分子葡聚糖分别加入到溶液1中,溶解并混合均匀,得到溶液2;
4、将溶液2过0.22μm滤膜一次,即得。
实施例9:CAR-T细胞冻存制剂
一、材料
1、CAR-T细胞,按中国专利申请201610014730.6方法制备。(也可以是其他来源的CAR-T细胞)
2、冻存介质,按实施例1方法制备。
二、方法
(一)CAR-T细胞分离
1、将培养7天后的CAR-T细胞混匀后,转移至50mL离心管中,在200g条件下,离心5min,弃掉上清液。
2、将离心后的细胞团先用10mLDPBS重悬,确认细胞团被完全打碎,加DPBS至40mL,在磁力架上静止2分钟,实现细胞跟磁珠的分离。
3、用移液管将细胞悬液转移至新的50mL离心管中,重复去磁珠操作两次。
4、将清除磁珠后的细胞悬液在200g条件下,离心5min,弃掉上清液,备用。
(二)CAR-T细胞冻存制剂
1、CAR-T细胞的冻存密度为1×106个/ml,根据需要冻存的细胞总数量,将细胞重悬于冻存介质中,确认细胞团被完全打碎。
2、将细胞分装于冻存管或者冻存袋中,放置于-80℃超低温冰箱中缓慢冷冻8小时,将细胞冻存管或者冻存袋转移至液氮中长期保存。
三、结果
得到的CAR-T细胞冻存制剂可以在液氮中长期保存。
实施例10:CAR-T细胞冻存制剂
一、材料
1、CAR-T细胞,按中国专利申请201610014730.6方法制备。(也可以是其他来源的CAR-T细胞)
2、冻存介质,按实施例6方法制备。
二、方法
(一)CAR-T细胞分离
1、将培养10天后的CAR-T细胞混匀后,转移至50mL离心管中,在500g条件下,离心8min,弃掉上清液。
2、将离心后的细胞团先用10mLDPBS重悬,确认细胞团被完全打碎,加DPBS至40mL,在磁力架上静止5分钟,实现细胞跟磁珠的分离。
3、用移液管将细胞悬液转移至新的50mL离心管中,重复去磁珠操作两次。
4、将清除磁珠后的细胞悬液在500g条件下,离心8min,弃掉上清液,备用。
(二)CAR-T细胞冻存制剂
1、CAR-T细胞的冻存密度为500×106个/ml,根据需要冻存的细胞总数量,将细胞重悬于冻存介质中,确认细胞团被完全打碎。
2、将细胞分装于冻存管或者冻存袋中,放置于程序降温仪中按照相应程序降温至-85℃。降温结束后,将细胞冻存管或者冻存袋转移至液氮中长期保存。
三、结果
得到的CAR-T细胞冻存制剂可以在液氮中长期保存。
实施例11:CAR-T细胞冻存制剂的检验
一、材料
实施例9得到的CAR-T细胞冻存制剂
台盼蓝染色试剂;
其他商业冻存介质:CryoStorTMCS10,购自STEMCELL Technologies
肿瘤细胞株:K562细胞株,购自ATCC
二、方法
1、细胞复苏:从液氮罐中取出细胞冷冻保存管,立即放入37℃水浴槽中快速解冻;待冻存管中细胞混合液完全溶化后,将细胞混合液缓慢加入含有9mL无血清培养基的试管中,混合均匀;在200-500g条件下,离心5-8min,弃掉上清液,备用。
2、细胞存活率测定
CAR-T细胞在低温保存介质中制剂后,每隔2小时取样,用台盼蓝(Trypan Blue)染色后在显微镜下观察、计数。
3、细胞杀伤性测定
CAR-T细胞冻存制剂复苏后,与肿瘤细胞株混合于96孔板中共培养后24小时后,加入10μL新鲜配置的5mg/mL MTT共培养4小时。弃上清后,每孔加入100μLDMSO震荡溶解10分钟,用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值。同时设置空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。每孔减去空白对照孔后,用杀伤率计算效应细胞的细胞毒活性。
细胞杀伤率(%)=【靶细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A值)】/靶细胞对照A值×100%。结果显示,在24小时内,跟其他商业冻存介质相比,细胞保持较高的杀伤率。
三、结果
1.细胞复苏细胞存活率测定
图1显示,跟其他商业冻存介质相比,本发明细胞保持较高的活细胞率。本公司98%,其他商业介质75%。
2.细胞杀伤性测定
图2显示,在24小时内,跟其他商业冻存介质相比,本发明细胞保持较高的杀伤率,本公司97%,其他商业介质70%,证明本发明制剂能够使细胞保持较高的杀伤率。
Claims (10)
1.一种CAR-T细胞冻存方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)将培养的CAR-T细胞转移至离心管中,在200-500g条件下,离心5-8min,弃掉上清液;
(2)将离心后的细胞团先用DPBS重悬,确认细胞团被完全打碎,在磁力架上静止2-5分钟,实现细胞跟磁珠的分离;
(3)用移液管将细胞悬液转移至新的离心管中,重复去磁珠操作两次;
(4)将清除磁珠后的细胞悬液在200-500g条件下,离心5-8min,弃掉上清液,备用;
(5)根据需要冻存的细胞总数量,计算冻存介质的体积,将细胞重悬于冻存介质中;
(6)将细胞分装于冻存管或者冻存袋中,放置于-80℃超低温冰箱中缓慢冷冻8-18小时,或者放置于程序降温仪中按照相应程序降温至-85℃;降温结束后,将细胞冻存管或者冻存袋转移至液氮中长期保存。
2.根据权利要求1所述的一种CAR-T细胞冻存方法,其特征在于:所述步骤5中的冻存介质由氯化钠、二甲基亚砜、葡萄糖、人血白蛋白、低分子葡聚糖和RPMI-1640基础培养基组成,其中氯化钠的质量浓度为0.45~0.9%,二甲基亚砜溶液的体积浓度为5~15%,葡萄糖的质量浓度为5~20%、人血白蛋白的质量浓度为10~50%,低分子葡聚糖的质量浓度为5~20%。
3.根据权利要求2所述的一种CAR-T细胞冻存方法,其特征在于:所述步骤5中的冻存介质,其中氯化钠的质量浓度为0.9%,二甲基亚砜溶液的体积浓度为10~15%,葡萄糖的质量浓度为5~10%、人血白蛋白的质量浓度为10~30%,低分子葡聚糖的质量浓度为5~10%。
4.根据权利要求3所述的一种CAR-T细胞冻存方法,其特征在于:所述步骤5中的冻存介质,其中氯化钠的质量浓度为0.9%,二甲基亚砜溶液的体积浓度为10%,葡萄糖的质量浓度为5%,人血白蛋白的质量浓度为10%,低分子葡聚糖的质量浓度为5%。
5.根据权利要求3所述的一种CAR-T细胞冻存方法,其特征在于:所述步骤5中CAR-T细胞的冻存密度为1×106/ml~500×106个/ml。
6.一种CAR-T细胞的冻存介质,其特征在于:由氯化钠、二甲基亚砜、葡萄糖、人血白蛋白、低分子葡聚糖和RPMI-1640基础培养基组成,其中氯化钠的质量浓度为0.45~0.9%,二甲基亚砜溶液的体积浓度为5~15%,葡萄糖的质量浓度为5~20%、人血白蛋白的质量浓度为10~50%,低分子葡聚糖的质量浓度为5~20%。
7.根据权利要求6所述的一种CAR-T细胞的冻存介质,其特征在于:所述氯化钠的质量浓度为0.9%,二甲基亚砜溶液的体积浓度为10~15%,葡萄糖的质量浓度为5~10%、人血白蛋白的质量浓度为10~30%,低分子葡聚糖的质量浓度为5~10%。
8.根据权利要求7所述的一种CAR-T细胞的冻存介质,其特征在于:所述氯化钠的质量浓度为0.9%,二甲基亚砜溶液的体积浓度为10%,葡萄糖的质量浓度为5%,人血白蛋白的质量浓度为10%,低分子葡聚糖的质量浓度为5%。
9.一种CAR-T细胞的冻存制剂,其特征在于:由CAR-T细胞和权利要求6-8中任何一项所述的CAR-T细胞的冻存介质组成。
10.根据权利要求9所述的一种CAR-T细胞的冻存制剂,其特征在于:所述CAR-T细胞的冻存密度为1×106/ml~500×106/ml。
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