KR20060007475A

KR20060007475A - 세포면역치료제의 제조를 위한 림프구 장기 보관 방법

Info

Publication number: KR20060007475A
Application number: KR1020040056280A
Authority: KR
Inventors: 정현진; 최종성; 박윤준
Original assignee: (주)이노셀
Priority date: 2004-07-20
Filing date: 2004-07-20
Publication date: 2006-01-26
Also published as: KR100569609B1

Abstract

본 발명은 항암, 항바이러스의 효과를 보이는 세포면역치료제의 제조를 위해, 정상인이 건강할 때 말초혈에서 림프구를 채집하여 장기간 냉동보관하였다가 차후에 본인에게 면역세포 투여가 필요한 질병이 발생시, 이를 융해, 복원하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 정상인으로부터 건강할 때의 말초혈에서 림프구를 채취하여 분리하는 제 1 단계와 상기 림프구를 시험관내 실험(in vitro)상에서 인터루킨 2, 인터루킨 1알파, 인터페론 감마, 항 CD 3항체를 조합하여 존재시킴으로써 활성화 림프구를 배양하는 제 2 단계와 상기 활성화 림프구를 일정 기간 동결보존하는 제 3 단계 및 상기 동결 보존 단계에서 얻은 세포를 융해, 복원하는 제 4 단계를 포함한다.

림프구, 배양, 증식, 활성화, 세포면역치료

Description

세포면역치료제의 제조를 위한 림프구 장기 보관 방법 { PROCESS FOR ITS PREPERATION, THE LYMPOCYTE LONGTERM CRYOPRESERVATION FOR A CELLULAR IMMUNOTHERAPY}

도 1은 유세포 분석기(flowcytometry)를 이용하여 림프구의 면역표현현을 검사한 그래프이다.

본 발명은, 건강한 정상인의 말초혈에서 림프구를 분리하여 시험관내 실험(in vitro)상에서 림프구를 증식, 활성화하고 상기 림프구를 냉동 보존하여 본인에게 면역세포의 투여가 필요한 질병의 발생시, 이를 사용하여 세포면역치료제로서 활용하기 위한 것이다.

기존의 림프구를 이용한 세포면역치료는 질병이 이미 발생한 상황에서 환자의 혈액으로부터 림프구를 채취하여 세포면역치료제를 제조하는 방식을 택하고 있 다. 이러한 방법은 제조 및 효과 측면에서 여러 가지 문제를 안고 있다. 암 환자의 경우 대부분이 수술, 항암화학요법, 방사선요법을 시술 받게 되고 이러한 치료는 환자의 면역체계 특히 림프구에 손상을 입히게 된다. 또한 암환자에서는 악액질이라는 신체의 전신적 상태가 불량해지는 증세가 나타나는데 이에 의한 림프구의 기능 저하가 수반된다. 따라서 발병 이후의 림프구를 이용한 세포치료제의 제조는 제조과정상 필수적인 림프구의 배양이 쉽게 되지 않는 문제를 극복해야만 하며, 이미 손상을 입은 림프구가 배양이 되더라도 효과를 내기에 충분한 수의 림프구를 얻기 어렵고, 배양이 되더라도 치료제로서의 효과가 떨어지는 문제가 있다.

또한 세포면역치료제의 효과 측면과는 별도의 문제가 존재하며 이 문제는 환자를 매우 고통스럽게 하는 것이다. 기존의 항암치료를 받는 환자들은 이미 정맥의 경화가 오게 되며 이로 인해 면역세포치료제의 제조를 위해 필수적인 채혈이 어려워지고, 그에 따라 여러 번 채혈 시도가 있게 되며, 또한 암환자는 대개 빈혈이 수반되는 경우가 많아 반복되는 채혈이 환자의 빈혈을 더욱 악화시킬 가능성이 있다.

상술한 바와 같은 문제를 해결하고자 발병 전에 림프구를 채취하여 보관하는 많은 시도가 있었고 방법이 소개되었지만 냉동보관과 해동에 따른 림프구의 증식능 저하와 면역능 저하를 해결하지는 못하고 있는 실정이다.

본 발명의 목적은 상술한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하여, 정상인으로부터 건강할 때의 말초혈에서 림프구를 분리하여 특정한 방법으로 시험관내 실험(in vitro)에서 림프구를 증식·활성화시킨 후, 상기 림프구를 동결·보존하였다가 일정기간이 경과한 후 본인의 면역능이 감소하여 암이나 바이러스성 질환 등에 쉽게 이환될 가능성이 높아지는 시기에 이를 자가투여함으로써 건강한 상태의 림프구를 혈액 내로 되돌려줘 면역능을 증진시킬 수 있고, 이를 통하여 질병의 예방 효과를 얻을 수 있으며, 암이나 바이러스성 질환이 발생한 경우는 보관된 림프구를 이용하여 세포면역치료제로 활용하는 데에 있다.

본 발명은, 세포면역치료제의 제조를 위한 림프구의 장기 보관 방법에 관한 것으로서,

정상인으로부터 건강할 때의 말초혈에서 림프구를 채취하여 분리하는 제 1 단계; 상기 림프구를 시험관내 실험(in vitro)에서 인터루킨 2, 인터루킨 1알파, 인터페론 감마, 항 CD 3항체를 조합하여 존재시킴으로써 활성화 림프구를 배양하는 제 2 단계; 상기 활성화 림프구를 일정 기간 냉동 보관하여 동결보존하는 제 3 단계 및 상기 동결 보존 단계에서 얻은 세포를 융해, 복원하는 제 4 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이하, 이들 발명의 구체적인 내용에 대하여 순차적으로 설명하기로 한다.

상기 제 1 단계는 말초혈에서 림프구를 채취하여 분리하는 단계를 말하는 것으로서, 이 경우 건강할 때의 자기 자신의 말초혈에서 림프구를 채취하며, 채혈방법으로서는 팔의 정맥에서의 채혈이 간편하여 바람직하지만 림프구를 함유하는 것이라면 어느 것도 재료로 할 수 있다. 채혈량으로서는 0.001ml 내지 500ml정도의 말초혈이 좋고 실용적으로는 10ml 내지 100ml 정도의 범위내의 말초혈 채취가 바람직하다.

상기 제 1 단계에서 채혈한 말초혈에는 응고가 일어나지 않도록 헤파린과 구연산을 첨가할 수 있다. 채취한 말초혈에서 림프구를 분리하고 이것을 체외배양을 통하여 증식, 활성화함으로써 본 발명에서의 활성화 림프구를 얻을 수 있다. 또한 본 발명에서 채취한 림프구에 대하여 '배양'이라는 것은 림프구를 림프구가 체외에서 살아가는 데 필요한 영양원을 함유한 배양액 중에 넣어 림프구를 인공적으로 증식시키는 것을 의미하고, '증식'이라는 것은 상기 배양에 의해 시험관내 실험(in vitro)에서 인공적으로 림프구를 양적으로 증가시키는 것을 의미한다. 또한 '활성화'라는 것은 상기 배양액 중에 증식인자와 활성화 인자를 첨가하여 세포를 자극함으로써 침체되어 있는 기능을 활발하게 작용하도록 제어하는 것, 보다 구체적으로는 항종양, 항 감염증 또한 항 자기면역질환 특성을 가지도록 하는 것을 의미한다.

상기 제 2 단계는, 상기 림프구를 활성화, 증식시키는 배양단계를 말하는데, 상기 제 1 단계에서 채취한 림프구의 배양법은 특별하게 한정된 것은 아니지만, 인터루킨 2와 인터페론 감마, 인터루킨 1알파, 항 CD3 항체 중 어느 것을 단독으로 또는 이것들을 조합하여 존재시킴으로써 배양하는 것이다. 이 경우, 상기 인터루킨 2와 인터페론 감마, 인터루킨 1알파, 항 CD3 항체를 단독으로 존재시킴으로써 배양하는 것보다 이들을 조합하여 존재시킴으로써 배양하는 것이 항암효과에서 더 뛰어난 효과를 발휘한다. 이는 이하에서 도 1에 대한 설명과 함께 상세하게 서술하기로 한다.

도 1은 유세포 분석기(flowcytometry)를 이용하여 림프구의 면역 표현형을 검사한 결과인데, 도 1에서 (a)와 (b)는 배양 시작일에서의 림프구의 면역표현형을 나타낸 것이고, (c)와 (d)는 배양 후 7일이 지난 경우의 림프구의 면역표현형을 나타낸 것이다. 한편, (a)와 (c)는 인터루킨-2와 항 CD3 항체를 조합하여 배양한 경우이고, (b)와 (d)는 본원발명의 바람직한 실시예대로 인터루킨 2와 인터페론 감마, 인터루킨 1알파, 항 CD3항체를 조합하여 배양한 경우를 나타낸 것이다. 또한 도 1의 그래프의 x축은 CD3(T-림프구 표지자)을 표지한 것이고 y축은 CD56(살해세포(killer cell)표지자)를 표지한 것으로서, 각 그래프는 4개의 구획으로 나뉘어서 분석되는데, 네 구획 중 우상 구획이 CD3와 CD56이 모두 양성인 림프구를 표시하는 부분이며, CD3와 CD56이 모두 양성인 림프구가 항암효과가 가장 뛰어난 림프구를 나타낸다. 그러므로, 이러한 분석에 의할 때 본원발명의 실시예대로 인터루킨 2와 인터페론 감마, 인터루킨 1알파, 항 CD3항체를 조합하여 배양한 경우 (b)에서는 CD3와 CD56이 모두 양성인 림프구가 4.9%를 나타냈으나 (d)에서는 50.7%로 증가하였고, 반면 인터루킨-2와 항 CD3 항체를 조합하여 배양한 경우 (a)에서는 CD3와 CD56이 모두 양성인 림프구가 4.9%를 나타냈으나 (c)에서는 18.1%로 증가한 것을 보아, 항암치료제로 사용될 경우 인터루킨-2와 항 CD3 항체만 조합한 경우((b),(c))보다 본원발명의 실시예대로 인터루킨 2와 인터페론 감마, 인터루킨 1알파, 항 CD3항체를 조합하여 배양한 경우((a),(c))가 항암효과가 훨씬 우수한 것으로 판단할 수 있다.

상술한 바와 같이, 림프구의 증식, 활성화에는 증식효울의 관점, 항암효과적인 측면에서 볼 때 인터루킨 2와 인터페론 감마, 인터루킨 1알파, 항 CD3항체를 조합하여 배양한 경우가 가장 바람직하며, 적당한 항원 등을 사용하여 항원 특이적인 T 림프구 등을 유도한 후 추가로 CD3항체 또는 C28항체, 또는 각종 마이토젠(mitogen)을 사용하여 항원 특이적인 활성화 림프구를 얻을 수도 있다. 또한 상기 항원은 항원으로 정제된 것 뿐만 아니라, 암세포나 바이러스로부터의 추출물, 암세포나 바이러스 자체, 또는 이것들과 교차반응성을 가지는 유사항원에 대하여도 사용할 수 있으며, 이 경우 림프구를 증식, 활성화시키는 기능을 가지는 물질이라면 어느 물질이라도 사용할 수 있다.

상기 제 2 단계에서 사용한 인터루킨 2와 인터페론 감마, 인터루킨 1알파 는 시판되고 있는 것을 사용할 수 있고 배양용 배지액은 1-2000U/ml의 농도로 사용하는 것이 바람직하며 인터루킨 2와 인터페론 감마, 인터루킨 1알파는 물, 생리식염수, 둘베코(Dulbecco) 인산완충액, RPMI-1640, DMEM, IMDM, AIM-V등 일반적으로 넓게 사용되는 세포 배양용 배지액 등에 용해하여 사용할 수 있다. 일단 용해한 것은 활성의 저하를 방지하기 위하여 냉장 보존하는 것이 필요하며, 이 경우에 사용되는 배양용 배지액으로는 림프구 세포의 배양에 적합한 것이라면 특별하게 제한되지 않고 예컨대 혈청 등의 생물 유래의 배양액, 평형 염류 용액에 아미노산, 비타민, 핵산염기 등을 첨가한 합성 배지 등이 사용될 수 있고 RPMI-1640, AIM-V, DMEM, IMDM등이 바람직한 것으로 들 수 있으나 RPMI-1640이 특히 우수하다.

상기 제 2 단계에서 사용하는 배양용 배지는 소의 태아혈청을 사용하는 것이 증식 효과에서 우수하여 바람직하지만, 이것들의 배지로서 시판품을 사용할 수도 있다. 또한 상기 소의 태아 혈청 이외에 정상인의 혈청을 사용할 수도 있다. 또한 혈청을 함유하지 않는 무혈청 배지를 사용하는 것도 가능하다. 배양은 일반적인 세포배양방법, 예컨대 CO₂인큐베이터 내에서 행해질 수 있다. CO₂농도는 1~10%범위 내이고, 바람직하게는 3~7%범위 내로 하고, 온도는 30~40°C범위 내로 하고, 특히 35~38°C이 바람직하다.

상기 배양에 있어서 일수는 특별히 제한되지는 않지만, 항 CD 3항체의 자극 정보가 세포에 전달되는 것이 전제되어야 하기 때문에, 2~9일 정도 행하는 것이 바람직하고, 특히 3~7일간 행하는 것이 세포에 대하여 안정한 자극정보전달을 할 수 있는 동시에 배양 효율의 관점에서 이상적이다. 상기 배양기간 내에는 현미경으로 세포상태를 관찰하여 적당한 세포수를 계측하면서 배양액을 적당히 첨가하는 것이 배양효율을 위하여 더욱 바람직하다. 또한 상기 배양에서는 통상 배양개시 1~2일째에는 세포증식이 없지만, 3일째부터 세포증식이 관찰되어 순조롭게 증식되기 시작하면 배양액이 오렌지색에서 황색으로 변화하게 되며, 배양액의 추가 첨가량은 첨가 전의 배양 중 배지액의 양에 대하여 0.1~5배 정도의 추가첨가가 바람직하다. 한편, 상기 추가첨가의 주기는 배양액의 열화 및 인터루킨 2와 인터페론 감마, 인터루킨 1알파 활성의 저하를 방지하기 위하여 1~7일, 바람직하게는 3~5일에 1회씩 하는 것이 필요하다.

상기 제 2 단계에서의 배양은, 인터루킨 2와 인터페론 감마, 인터루킨 1알파를 함유하는 배양용 배지액에 단핵구 세포를 부유시켜 상기 항 CD3 항체를 고형화한 배양 용기에 넣어 배양을 개시할 수 있다. 게다가 이 경우, 필요에 따라 배양액 중에 각종 사이토카인과 마이토젠을 첨가하여 사용하면 상기 림프구의 증식, 활성화의 효율이 더욱 향상된다. 또한 상기 림프구 세포의 자극에 사용하는 상기 항 CD3 항체는 동물 또는 세포에서 생산한 항체를 정제하여 사용할 수 있으며, 시판용 OKT-3항체를 사용할 수도 있다. 그러나 이것 이외에도 상기 림프구의 증식, 활성화를 촉진할 수 있는 항체라면 특별히 한정되지 않고, 항 CD28 항체 등도 사용될 수 있다.

또한, 상기 항 CD3 항체는 배양용 배지액에 함유시켜서 사용할 수 있지만, 바람직하게는 림프구의 증식효율, 조작 용이성의 관점에서 고형화하여 사용하는 것이 좋다. 항체를 고형화하는 기구로는 유리, 폴리우레탄, 폴리올레핀, 폴리스틸렌 등의 재질의 배양용기를 들 수 있다. 이 경우, 입수가 용이한 것으로 시판용 플라스틱제 의 세포배양플라스크 등을 사용할 수도 있고, 그 크기는 적당하게 선택할 수 있다. 고형화는 상기 항 CD3 항체의 희석액을 상기 고형화한 기구에 첨가하고 예컨대 4~37°C에서 2~24시간 방치하여 사용할 수 있다. 또한, 상기 항 CD3 항체의 고형화에는 멸균한 둘베코 인산 완충용액 등의 생리적인 완충용액 중에 항 CD3 항체를 0.1~30μg/ml의 농도로 희석하여 사용한다. 고형화 후 사용시까지 냉방과 냉장고(4°C)에 보존할 수 있고, 이 경우에는 사용시 액을 제거하고 필요에 따라 상온의 상기 둘베코 인산 완충용액 등의 생리적인 완충액에 세정하여 사용할 수 있다.

상기 제 3 단계는, 상기 활성화 림프구를 일정 기간 냉동 보관하는 동결 보존 단계를 말하는데, 보존하는 림프구는 그 크기 등에 따라서 세포 보존액에 현탁하는 밀도를 적당히 선택할 수 있는데 1×10³개/ml~ 1×10¹⁰개/ml 밀도에서 보존액 안에 현탁하고 동결 보존하는 것이 요구된다. 또한 이 경우에 사용되는 세포 보존 액의 양도 정해져 있지 않은데, 편의성을 생각해서 0.1ml에서 1000ml의 범위 내에서 사용할 수 있으나 0.5ml에서 100ml의 범위 내가 보다 바람직하다.

상기 제 3 단계에서의 동결보존액은 시판 중인 세포 보존액을 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 자가 조제하여 사용할 수도 있다. 세포보존액의 성분은 적당한 완충액 또는 기초 배지에 혈청이나 단백질, 다당류 등의 고분자 물질과 Dimethyl Sulfoxide(이하 'DMSO'라고 칭한다.)을 포함한 것을 사용할 수 있고 보존되는 세포에 따라서 열거되는 물질이 반드시 전부 필요한 것은 아니다. 그래서 세포보존이 가능한 보존액이라면 그 조성은 제한되지 않는다. 림프구는 적당한 세포보존액에 현탁되어 저온 하에 동결 보존된다. 제조된 동결 보존액은 제조 후 사용시까지 냉장고(4°C)에 보존할 수 있다.

상기 제 3 단계에서 동결 세포가 보존될 동결 튜브는 시판 중인 세포 동결 튜브를 사용하는 것이 바람직하며 동결 백을 사용할 수도 있으며, 그 크기는 적당하게 선택할 수 있다. 동결하는 세포의 수는, 각 동결 튜브당 1~5×10⁷개가 적당하며, 동결하는 튜브의 수는 채혈량에 따라 달라지며 2~1000개의 단위 수까지 보존 가능하고, 사용시에 이것을 해동, 융해하고 복원해서 투여한다. 한편, 동결의 경우에서는 냉장고와 냉동고, 초저온냉동고, 질소탱크 등을 통하여 얼릴 수 있으나 안정성과 림프구의 증식효율 면에서 동결처리용기를 사용하는 것이 바람직하다. 상 기 동결처리용기는 시판되고 있는 Bicell과 같은 동결처리용기를 사용해도 무방하며 직접 개발해서 사용할 수도 있다. 또한 상기 동결처리용기에서 동결세포를 보관하는 기간은 2~30일 범위 내이고 바람직하게는 3~9일 사이에 하는 것이 좋으며, 상기 동결처리용기에서 질소탱크로 옮길 때는 cane이나 동결튜브상자등이 바람직하나 질소탱크에 들어갈 수 있는 다른 시판용 물건을 사용해도 무방하다.

이하에서는, 본 발명에 따른 세포 면역 치료제의 제조에 사용하기 위한 림프구의 장기보관 처리방법을 순차적으로 설명하기로 한다.

1. 채혈/ 림프구의 분리

사람의 정맥에서 말초혈 60ml~80ml을 채혈하고 헤파린을 첨가해서 Clean Bench(JISICO)안에서 무균상태로 채혈된 채혈백의 syringe port 부분을 소독한 다음 50ml 주사기(한국백신)을 이용하여 혈액을 뽑아내었다. 그런 다음, 250ml 원심관에 세정용 배지(RPMI1640)을 60ml 주입하고 그 원심관에 채혈한 혈액을 천천히 주입하였다.

원심관의 덮개를 완전히 덮은 후 2~3회 정도 혼화하고, 10ml 피펫을 이용하여 Ficoll(Amershamphamacia)을 50ml 원심관 4개에 각각 10ml씩 넣은 후 배지로 희석한 혈액 30ml을 각 원심관에 액면을 흩뜨리지 않도록 서서히 넣어주었다. 또한 이것을 원심기에 의해 회전수 2000rpm, 원심분리 온도 20°C로 20분간 브레이크 OFF상태에서 원심분리한 후 흡인기로 무균적인 원심관 내 림프구 층의 약 1cm위까지 림프구 세포가 빨려들어가지 않도록 서서히 흡인하였다. 또한 5ml 피펫으로 혈병층이 빨려 들어가지 않도록 림프구 분리층을 취해, 이것을 미리 세정용 배지(RPMI1640)25ml를 넣어둔 50ml 원심관 2개에 회수하고, 원심관의 덮개를 닫아 2~3회 정도 혼화한 후 다시 원심분리기 회전수 1800rpm, 온도 20°C 상태로 10분간 원심분리하였다.

원심분리 후, 상층액을 버리고 림프구 침전물을 교반하여 잘 풀어주고, 림프구수를 측정한 후 림프구를 배지(RPMI1640) 90ml안에 300U/ml의 인터루킨2, 100U/ml의 인터루킨 1알파, 100U/ml의 인터페론 감마를 첨가하고 소태아혈청을 10ml함유시켜 100ml로 한 배양용 배지(이하 '배양용배지'라 한다)에 넣어 잘 전도혼화하여 림프구 현탁액을 조제하였다. 상기 림프구 현탁액 10μl를 40μl의 turk용액과 혼합해서 혈구 계산판에 10μl공급하고 현미경(올림푸스)하에서 림프구수를 측정한 결과 총 림프구수는 2.0×10⁷~1.0×10⁸개였다.

2. 항 CD3 항체의 고형화 플라스크의 존재

PBS에 5μl/ml로 조제한 항 CD3 항체 10ml을 바닥면적 225cm²인 배양용 플라스크에 넣고 밑면에 용액을 균일하게 퍼지도록 하였다. 다음날 플라스크의 항체용액을 흡인기로 빨아들이고 PBS 50ml을 부어넣고 다음 플라스크의 덮개를 닫고 세게 흔든 후 덮개를 열고 액을 따라 버렸다. 그 다음, 플라스크 내와 덮개에 묻어 있는 액을 흡인기로 천천히 빨아들이고 항 CD3 항체의 고형화 플라스크를 조제하였다.

3. 활성화 림프구 배양

상기 림프구 현탁액 100ml을 상기 2. 에서 조제한 항 CD3 항체의 고형화 플라스크 2개에 나누어 붓고 37°C, 5% 농도의 탄산가스 존재 하에서 배양하였다. 3일 후 배양용 배지를 각각의 플라스크에 50ml씩 첨가하고 37°C, 5% 농도의 탄산가스 존재 하에서 배양하였다. 또한 4일 후, 배양용 배지를 각각의 플라스크에 100ml씩 첨가하고 37°C, 5% 농도의 탄산가스 존재 하에서 배양하였다. 또한 1일 후, 37°C, 5% 농도의 탄산가스 존재 하에서 배양함으로써 활성화 림프구 3.0×10⁸~10×10⁸개를 얻었다.

4. 활성화 림프구의 동결보존

상기 3.에서 얻은 활성화 림프구 혼합액을 원심분리한 후 상기 배양용 배지를 흡인기로 제거하고 활성화 림프구 침전물을 얻었다. 상기 활성화 림프구 침전물에 세포보존액(CP-1 68ml, 20% 알부민 32ml, 배지(RPMI1640) 100ml을 혼합하여 제작)을 19.8ml 첨가해서 잘 혼합한 후 1.8ml의 세포 보존용 튜브(corning)에 1.8ml씩 11개의 튜브에 분리 주입했다. 그리고 튜브를 상기 동결처리용기에 넣고 -80°C에서 보존한 후 3-7일 후에 질소탱크로 옮겨 보관하였다.

5. 동결 보존 활성화 림프구의 융해, 검사

30일 후, 상기 4. 에서 동결보존해둔 튜브를 1개 꺼내, 이것을 37°C heat block에서 4분간 해동하고 동결 보존 활성화 림프구의 융해, 복원을 시행하였다. 융해한 동결 보존 활성화 림프구를 포함한 세포보존액 약 1.8ml을 15ml 원심관 안에 무균상태로 옮기고 배지 7.2ml을 주입하여 현탁했다. 15ml 튜브에 세포보존액을 2.5ml 옮기고 원심분리 1600rpm, 20°C ,10min간 시행한 후 상층액을 제거하고 상기 배양용 배지를 40ml 첨가해서 현탁했다. 상기 세포 현탁액 10μl를 20μl의 trypan blue(Gibco)용액과 혼합해서 혈구 계산판에 10μl 공급하고 현미경(올림푸스)하에서 생존율을 측정한 결과 생존율은 75% 이상이었으며 회수율은 70% 이상이었다. 상기 활성화 림프구 현탁액을 24 well plate에 well당 2ml씩 분주하여 2일 후에 림프구의 생존율과 회수율을 검사한 결과 생존율은 95% 이상이며 회수율은 100%이상이었다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 세포면역치료제의 제조상의 난점을 극복하고 세포면역치료제의 항암 효과가 떨어지는 문제점을 해결하여 자신이 건강할 때의 말초혈에서 림프구를 분리하고 시험관내 실험(in vitro)에서 증식, 활성화시켜 장기간 냉동 보관함으로써 후에 면역 세포가 투여가 필요한 질병의 발생시 이를 사용하여 세포면역치료제로서 활용하여 질병을 치료할 수 있으며, 배양 단계에서 림프구를 시험관내 실험(in vitro)상에서 인터루킨 2, 인터루킨 1알파, 인터페론 감마, 항 CD 3항체를 조합하여 존재시킴으로써, 항암 효과를 훨씬 높일 수 있다.

Claims

정상인으로부터 건강할 때의 말초혈에서 림프구를 채취하여 분리하는 제 1 단계;상기 림프구를 시험관내 실험(in vitro)에서 인터루킨 2, 인터루킨 1알파, 인터페론 감마, 항 CD 3항체를 조합하여 존재시킴으로써 활성화 림프구를 배양하는 제 2 단계; 상기 활성화 림프구를 일정 기간 냉동 보관하여 동결보존하는 제 3 단계 및 상기 동결 보존 단계에서 얻은 세포를 융해, 복원하는 제 4 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포면역치료제의 제조를 위한 림프구 장기 보관 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 제 2 단계의 상기 항 CD3 항체는 고형화하여 사용하는 것을 특징으로 하는 세포면역치료제의 제조를 위한 림프구 장기 보관 방법.
제 1 항의 방법에 의해 융해, 복원되는 것을 특징으로 하는 동결 보존 활성화 림프구.
제 3 항에 있어서,

상기 동결 보존 활성화 림프구는 항암, 항 바이러스의 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 동결 보존 활성화 림프구.