CN108721331A - 一种嵌合抗原受体t细胞制剂及其低温保存制剂制备方法 - Google Patents

一种嵌合抗原受体t细胞制剂及其低温保存制剂制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CART细胞制剂低温保存介质，属于细胞治疗技术领域。一种CART细胞制剂方法，包括以下步骤：(1)将培养的CART细胞混匀后，转移至离心管中，在300g条件下，离心5min，弃掉上清液；(2)将离心后的细胞团先用生理盐水重悬，确认细胞团被完全吹散，加生理盐水，在磁力架上静止3分钟，实现细胞跟磁珠的分离；(3)用移液管将细胞悬液转移至新的离心管中，重复去除磁珠操作两次；(4)在300g条件下，离心5min，弃掉上清液，备用；(5)根据每个患者回输的细胞数量，用低温保存介质重悬细胞。低温保存介质的成分复方电解质注射液、右旋糖酐40葡萄糖注射液、20％人血白蛋白、氯化钠注射液、10％葡萄糖注射液、DMSO注射液、50％葡萄糖注射液组成。本发明的优点是：制剂后的细胞可以在低温的条件下至少保存12个月，同时细胞在24小时内可以保持高于90％活细胞率。

Description

一种嵌合抗原受体T细胞制剂及其低温保存制剂制备方法
技术领域
本发明属于嵌合抗原受体领域，本发明公开了一种CART细胞制剂及低温保存介质。
背景技术
嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFv段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。
在CART细胞体外大量扩增培养后，有效的制备成易保存、易运输、易回输的制剂无论是对患者还是对生产CART细胞机构来说显得都极为重要。因此，本专利发明了一种CART细胞低温保存制剂，为将来的临床试验和临床治疗奠定了基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种CART细胞制剂的低温保存介质。
一种CART细胞制剂方法，包括以下步骤：
(1)将培养的CART细胞混匀后，转移至离心管中，在300g条件下，离心5min，弃掉上清液；
(2)将离心后的细胞团先用生理盐水重悬，确认细胞团被完全吹散，加生理盐水，在磁力架上静止3分钟，实现细胞跟磁珠的分离；
(3)用移液管将细胞悬液转移至新的离心管中，重复去除磁珠操作两次；
(4)在300g条件下，离心5min，弃掉上清液，备用；
(5)根据每个患者回输的细胞数量，用低温保存介质重悬细胞。
所述步骤5中的低温保存介质由复方电解质注射液、右旋糖酐40葡萄糖注射液、20％人血白蛋白、氯化钠注射液、10％葡萄糖注射液、DMSO注射液、50％葡萄糖注射液组成。
本发明低温保存介质要经过无菌、支原体、内毒素、PH值和外观观察检测合格之后才可以作为保存制剂用于保存CART细胞。
本发明还提供给了一种CART细胞制剂，由CAR-T细胞和上述的CAR-T细胞的低温保存介质组成。
所述细胞的密度为1×107个/mL。
本发明的优点是：制剂后的细胞可以在低温的条件下至少保存12个月，同时细胞可以保持高于90％活细胞率。
附图说明
图1：用低温保存介质保存后的CART细胞24小时细胞活率。
具体实施方式
实施例1：低温保存介质配置
配置低温保存介质要在生物安全柜内进行操作，环境洁净标准为整体万级局部百级。
实施例2：低温保存介质的质量标准
配置好的低温保存介质按如下质量标准进行检测，全部检测合格进行放行。
检验项目 检验标准
外观 透明液体
无菌 不能检出
支原体 不能检出
细菌内毒素 ＜0.50EU/ml
pH值 6.5～7.5
实施例3：CART细胞分离
(1)将培养的CART细胞混匀后，转移至离心管中，在300g条件下，离心5min，弃掉上清液；
(2)将离心后的细胞团先用生理盐水重悬，确认细胞团被完全吹散，加生理盐水，在磁力架上静止3分钟，实现细胞跟磁珠的分离；
(3)用移液管将细胞悬液转移至新的离心管中，重复去除磁珠操作两次；
(4)在300g条件下，离心5min，弃掉上清液，备用。
实施例4：CART细胞制剂的制备
(1)将实施例3制备好的CART细胞用低温保存介质进行重悬，细胞密度为1×107个/mL，确保细胞团被完全打散；
(2)根据所需细胞量，选取合适体积的血液冻存袋进行无菌灌装，并在程序降温仪中进行冻存，所得到的制剂为CART细胞制剂。
实施例5：CART细胞存活率测定
(1)CART细胞在低温保存介质中制剂后，在37度水浴锅复苏完毕后，每隔4小时取样，用台盼蓝(Trypan Blue)染色；
(2)染色后在显微镜下观察、计数；
(3)实施例结果如图1所示，24小时检测CART细胞活率都大于90％。

Claims (4)

1.一种CART细胞制剂方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将培养的CART细胞混匀后，转移至离心管中，在300g条件下，离心5min，弃掉上清液；
(2)将离心后的细胞团先用生理盐水重悬，确认细胞团被完全吹散，加生理盐水，在磁力架上静止3分钟，实现细胞跟磁珠的分离；
(3)用移液管将细胞悬液转移至新的离心管中，重复去除磁珠操作两次；
(4)在300g条件下，离心5min，弃掉上清液，备用；
(5)根据每个患者回输的细胞数量，用低温保存介质重悬细胞。
2.根据权利要求1所述的一种CART细胞制剂方法，其特征在于：所述步骤5中的低温保存介质由复方电解质注射液、右旋糖酐40葡萄糖注射液、20％人血白蛋白、氯化钠注射液、10％葡萄糖注射液、DMSO注射液、50％葡萄糖注射液组成。
3.根据权利要求1所述的一种CART细胞制剂方法，其特征在于：所述步骤5中细胞的密度为1×107个/mL。
4.根据权利要求2所述低温保存介质在加入CART细胞之前需要进行相应的质量检测即无菌、支原体、内毒素、PH值和外观观察。
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