TWI832868B - 用於誘發感染性免疫耐受之組合物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種免疫耐受之新技術。詳細而言，本發明首次發現：將包含經抑制CD80/CD86與CD28之相互作用之抑制因子誘導失能之細胞的細胞製劑投予至器官移植患者(接受者)而誘導免疫耐受之技術中，即便來自細胞製劑之細胞自接受者消失，免疫耐受亦持續(感染性免疫耐受)。進而證實，此種細胞製劑可誘發對過敏或由iPS細胞等或來自該等之細胞、組織或器官產生之免疫排斥反應之免疫耐受。

Description

用於誘發感染性免疫耐受之組合物
本發明係關於一種與免疫耐受相關之新穎技術。更特定而言，本發明係關於一種包含失能T細胞之醫藥組合物、該醫藥組合物之製造、及該醫藥組合物之品質管理。
肝臟移植廣泛用作針對晚期肝衰竭之患者之最終處置。每年日本以外有20,000以上之病例，日本有超過500之病例。
移植係針對晚期之腎臟、心臟、肝臟、胰腺等之器官衰竭所選擇之主要處置之一，近年來儘管移植排斥反應之處置取得顯著進步，但若無免疫抑制治療，則移植之大部分最終會被排斥。依賴連續之藥物療法之目前之免疫抑制療法由於係藉由藥物抑制全部免疫反應而非僅抑制明確針對移植之反應，故而器官移植患者容易增加對傳染病或癌之敏感性。
作為該誘導免疫耐受之技術，有T細胞之抗原特異性之免疫不應答(失能)之誘導。具體而言，報告有如下技術：將抑制抗原呈現細胞上之CD80/CD86與未活化(初始)T細胞上之CD28之相互作用的抗體直接投予至器官移植患者，而於體內誘導供給者抗原特異性失能(專利文獻1)；或者於相同抗體之存在下將接受者細胞與經放射線照射之供給者細胞共培養，藉此於體外誘導供給者抗原特異性失能細胞，並將其送返至接受者中(專利文獻2、專利文獻3及非專利文獻1~3)。
先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：日本專利特表2002-504120號公報
專利文獻2：日本專利特表2007-131598號公報
專利文獻3：日本專利特表2016-520081號公報
非專利文獻
非專利文獻1：Satoru Todo et al. Hepatorogy, 64(vol.2), 632-643 (2016)
非專利文獻2：Teraoka S, Koyama I, Bashuda H, Uchida K, Tonsho M, et al. (2017) J Transplant Res 2(1) p1-8
非專利文獻3：Bashuda H et al., J. Clin. Invest. 115:1896-1902 (2005).
本發明者等人進行了銳意研究，結果首次發現，於將包含藉由抑制CD80/CD86與CD28之相互作用之抗體等抑制因子誘導失能之細胞之細胞製劑投予至器官移植患者(接受者)而誘導免疫耐受之技術中，即便來自細胞製劑之細胞自接受者消失(變得檢測不到)免疫耐受亦持續(感染性免疫耐受)。進而，本發明者等人證實此種細胞製劑可誘發對過敏或由iPS細胞等或來自該等之細胞、組織或器官而產生之免疫排斥反應之免疫耐受。
因此，本發明提供以下。
(1)一種用以於受驗體中誘發對供給者之長久之免疫耐受(感染性免疫耐受)之組合物，該組合物包含 藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自該受驗體之細胞、及來自該供給者之抗原或該抗原含有物混合而被誘導免疫耐受的細胞。
(2)如上述項目所記載之組合物，其中上述免疫耐受係於上述受驗體中之CD8陽性T細胞中誘發免疫耐受。
(3)如上述項目之任一項所記載之組合物，其中上述抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。
(4)如上述項目之任一項所記載之組合物，其中上述蛋白質為抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。
(5)如上述項目之任一項所記載之組合物，其中上述抗體之變體為抗原結合片段。
(6)如上述項目之任一項所記載之組合物，其中上述細胞表面分子之變體為融合蛋白。
(7)如上述項目之任一項所記載之組合物，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。
(8)如上述項目之任一項所記載之組合物，其中上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。
(9)一種於受驗體中預防或治療疾病、障礙或狀態之方法，該方法包括如下步驟：1)對該受驗體投予包含藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自該受驗體之細胞、及來自該受驗體之抗原或不來自 該受驗體之抗原或者該抗原含有物混合而被誘導失能之細胞的製劑；及2)確認該受驗體之T細胞之失能狀態，於可確認到失能狀態之情形時不進行進一步處置，於無法確認到失能狀態之情形時，再次投予包含該細胞之製劑。
(10)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述製劑包含CD4陽性失能細胞、CD8陽性失能細胞、或該等之組合。
(11)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述製劑包含CD8陽性失能細胞。
(12)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述失能狀態之確認包括確認包含上述細胞之製劑消失之步驟。
(13)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述疾病、障礙或狀態選自由移植免疫排斥反應、過敏、自體免疫疾病、移植物抗宿主病、及由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應所組成之群。
(14)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述疾病、障礙或狀態包括過敏。
(15)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述疾病、障礙或狀態包括由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應。
(16)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。
(17)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述蛋白質為抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。
(18)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述抗體之變體為抗原結合片段。
(19)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述細胞表面分子之變體為融合蛋白。
(20)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。
(21)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。
(22)一種用以治療或預防受驗體之過敏之組合物，該組合物包含藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自該受驗體之細胞、及成為過敏之原因之抗原或該抗原含有物混合而被誘導免疫耐受的細胞。
(23)如上述項目之任一項所記載之組合物，其中上述成為過敏之原因之抗原選自食品、花粉、藥品、及金屬。
(24)一種用以於受驗體中抑制或預防由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官產生之免疫排斥反應的組合物，該組合物包含藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自該受驗體之細胞、及來自該iPS細胞或ES細胞之抗原或該抗原含有物混合而被誘導免疫耐受的細胞。
(25)一種T細胞，其不為控制性T細胞，且被誘導失能。
(26)一種製造T細胞之方法，該T細胞不為控制性T細胞，且已針對受 驗體被誘導失能，該方法包括如下步驟：A)將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自該受驗體之細胞、及不來自該受驗體之抗原或該抗原含有物混合；B)培養該混合物而獲得T細胞之步驟；及C)視需要以不來自該受驗體之抗原或該抗原含有物刺激該T細胞，確認該T細胞不反應。
(27)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。
(28)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述蛋白質為抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。
(29)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述抗體之變體為抗原結合片段。
(30)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述細胞表面分子之變體為融合蛋白。
(31)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。
(32)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。
(33)如上述項目之任一項所記載之T細胞或方法，其中上述T細胞包含CD4陽性細胞及/或CD8陽性細胞。
(34)一種組合物，其係用於誘導受驗體內之CD8陽性T細胞對特定之 抗原無反應或低反應。
(35)一種用以處置或預防由不來自受驗體之抗原產生之疾病、障礙或狀態之醫藥，其包含藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自該受驗體之細胞、及來自該受驗體之抗原或不來自該驗檢體之抗原或該抗原含有物混合而被誘導免疫耐受的細胞。
(36)如上述項目之任一項所記載之醫藥，其中上述抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。
(37)如上述項目之任一項所記載之醫藥，其中上述蛋白質為抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。
(38)如上述項目之任一項所記載之醫藥，其中上述抗體之變體為抗原結合片段。
(39)如上述項目之任一項所記載之醫藥，其中上述細胞表面分子之變體為融合蛋白。
(40)如上述項目之任一項所記載之醫藥，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。
(41)如上述項目之任一項所記載之醫藥，其中上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。
(42)如上述項目之任一項所記載之醫藥，其中上述疾病、障礙或狀態選自由移植免疫排斥反應、過敏、自體免疫疾病、移植物抗宿主病、及由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應所組成之群。
(43)如上述項目之任一項所記載之醫藥，其中上述疾病、障礙或狀態包括過敏。
(44)如上述項目之任一項所記載之醫藥，其中上述疾病、障礙或狀態包括由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應。
(A1)一種於受驗體中誘發對供給者之長久之免疫耐受(感染性免疫耐受)之方法，該方法包括將藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自該受驗體之細胞、及來自該供給者之抗原或該抗原含有物混合而誘導免疫耐受之細胞以有效量投予至該受驗體之步驟。
(A2)如上述項目所記載之方法，其中上述免疫耐受係於上述受驗體中之CD8陽性T細胞中誘發免疫耐受。
(A3)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。
(A4)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述蛋白質為抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。
(A5)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述抗體之變體為抗原結合片段。
(A6)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述細胞表面分子之變體為融合蛋白。
(A7)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。
(A8)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。
(A9)一種治療或預防受驗體之過敏之方法，該方法包括將藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自該受驗體之細胞、及成為過敏之原因之抗原或該抗原含有物混合而誘導免疫耐受之細胞以有效量投予至該受驗體之步驟。
(A10)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述成為過敏之原因之抗原選自食品、花粉、藥品、及金屬。
(A11)一種於受驗體中抑制或預防由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官產生之免疫排斥反應之方法，該方法包括將藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自該受驗體之細胞、及來自該iPS細胞或ES細胞之抗原或該抗原含有物混合而誘導免疫耐受之細胞以有效量投予至該受驗體之步驟。
(A12)一種誘導受驗體內之CD8陽性T細胞對特定之抗原無反應或低反應之方法。
(A13)一種處置或預防由不來自受驗體之抗原產生之疾病、障礙或狀態之方法，該方法包括將藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自受驗體之細胞、及來自該受驗體之抗原或不來自該驗檢體之抗原或該抗原含有物混合而誘導免疫耐受之細胞以有效量投予至該受驗體之步驟。
(A14)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。
(A15)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述蛋白質為抗體或 其變體、或者細胞表面分子或其變體。
(A16)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述抗體之變體為抗原結合片段。
(A17)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述細胞表面分子之變體為融合蛋白。
(A18)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。
(A19)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。
(A20)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述疾病、障礙或狀態選自由移植免疫排斥反應、過敏、自體免疫疾病、移植物抗宿主病、及由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應所組成之群。
(A21)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述疾病、障礙或狀態包括過敏。
(A22)如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述疾病、障礙或狀態包括由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應。
(B1)一種細胞之用途，該細胞係藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自該受驗體之細胞、及來自該供給者之抗原或該抗原含有物混合而誘導免疫耐受，該用途係用於製造用以於受驗 體中誘發對供給者之長久之免疫耐受(感染性免疫耐受)之醫藥。
(B2)如上述項目所記載之用途，其中上述免疫耐受係於上述受驗體中之CD8陽性T細胞中誘發免疫耐受。
(B3)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。
(B4)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述蛋白質為抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。
(B5)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述抗體之變體為抗原結合片段。
(B6)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述細胞表面分子之變體為融合蛋白。
(B7)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。
(B8)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。
(B9)一種細胞之用途，其係用於製造用以於受驗體中預防或治療疾病、障礙或狀態之醫藥，該細胞係藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自該受驗體之細胞、及來自該受驗體之抗原或不來自該受驗體之抗原或者該抗原含有物混合而誘導失能，該細胞之特徵在於：確認該受驗體之T細胞之失能狀態，於可確認到失能狀態之情形時不進行進一步處置，於無法確認到失能狀態之情形時，再次投予包含該細 胞之醫藥。
(B10)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述醫藥包含CD4陽性失能細胞、CD8陽性失能細胞、或該等之組合。
(B11)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述醫藥包含CD8陽性失能細胞。
(B12)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述失能狀態之確認包括確認包含上述細胞之製劑消失之步驟。
(B13)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述疾病、障礙或狀態選自由移植免疫排斥反應、過敏、自體免疫疾病、移植物抗宿主病、及由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應所組成之群。
(B14)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述疾病、障礙或狀態包括過敏。
(B15)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述疾病、障礙或狀態包括由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應。
(B16)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。
(B17)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述蛋白質為抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。
(B18)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述抗體之變體為抗原結合片段。
(B19)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述細胞表面分子之 變體為融合蛋白。
(B20)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。
(B21)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。
(B22)一種細胞之用途，其係用於製造用以治療或預防受驗體之過敏之醫藥，該細胞係藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自該受驗體之細胞、及成為過敏之原因之抗原或該抗原含有物混合而被誘導免疫耐受。
(B23)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述成為過敏之原因之抗原選自食品、花粉、藥品、及金屬。
(B24)一種細胞之用途，其係用於製造用以於受驗體中抑制或預防由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官產生之免疫排斥反應之醫藥，該細胞係藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自該受驗體之細胞、及來自該iPS細胞或ES細胞之抗原或該抗原含有物混合而被誘導免疫耐受。
(B25)一種細胞之用途，其係用於製造用以處置或預防由不來自受驗體之抗原產生之疾病、障礙或狀態之醫藥，該細胞係藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自受驗體之細胞、及來自該受驗體之抗原或不來自該驗檢體之抗原或該抗原含有物混合而被誘導免疫耐受。
(B26)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。
(B27)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述蛋白質為抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。
(B28)如上述項目之任一項所記載之醫藥，其中上述抗體之變體為抗原結合片段。
(B29)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述細胞表面分子之變體為融合蛋白。
(B30)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。
(B31)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。
(B32)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述疾病、障礙或狀態選自由移植免疫排斥反應、過敏、自體免疫疾病、移植物抗宿主病、及由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應所組成之群。
(B33)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述疾病、障礙或狀態包括過敏。
(B34)如上述項目之任一項所記載之用途，其中上述疾病、障礙或狀態包括由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應。
(C1)一種細胞，其係用以於受驗體中誘發對供給者之長久之免疫耐受(感染性免疫耐受)，且藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自該受驗體之細胞、及來自該供給者之抗原或該抗原含有物混合而被誘導免疫耐受。
(C2)如上述項目所記載之細胞，其中上述免疫耐受係於上述受驗體中之CD8陽性T細胞中誘發免疫耐受。
(C3)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。
(C4)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述蛋白質為抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。
(C5)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述抗體之變體為抗原結合片段。
(C6)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述細胞表面分子之變體為融合蛋白。
(C7)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。
(C8)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。
(C9)一種細胞，其特徵在於：其係用以於受驗體中預防或治療疾病、障礙或狀態，其藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自該受驗體之細胞、及來自該受驗體之抗原或不來自該受驗 體之抗原或者該抗原含有物混合而誘導失能，且確認該受驗體之T細胞之失能狀態，於可確認到失能狀態之情形時不進行進一步處置，於無法確認到失能狀態之情形時，再次投予該細胞。
(C10)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述細胞係包含CD4陽性失能細胞、CD8陽性失能細胞、或該等之組合之細胞混合物。
(C11)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述細胞包含CD8陽性失能細胞。
(C12)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述失能狀態之確認包括確認上述細胞消失之步驟。
(C13)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述疾病、障礙或狀態選自由移植免疫排斥反應、過敏、自體免疫疾病、移植物抗宿主病、及由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應所組成之群。
(C14)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述疾病、障礙或狀態包括過敏。
(C15)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述疾病、障礙或狀態包括由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應。
(C16)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。
(C17)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述蛋白質為抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。
(C18)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述抗體之變體為抗 原結合片段。
(C19)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述細胞表面分子之變體為融合蛋白。
(C20)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。
(C21)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。
(C22)一種細胞之用途，其係用以治療或預防受驗體之過敏，該細胞藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自該受驗體之細胞、及成為過敏之原因之抗原或該抗原含有物混合而被誘導免疫耐受。
(C23)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述成為過敏之原因之抗原選自食品、花粉、藥品、及金屬。
(C24)一種細胞之用途，其係用以於受驗體中抑制或預防由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官產生之免疫排斥反應，該細胞藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自該受驗體之細胞、及來自該iPS細胞或ES細胞之抗原或該抗原含有物混合而被誘導免疫耐受。
(C25)一種細胞，其係用以處置或預防由不來自受驗體之抗原產生之疾病、障礙或狀態，且藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自受驗體之細胞、及來自該受驗體之抗原或不來自該驗檢 體之抗原或該抗原含有物混合而被誘導免疫耐受。
(C26)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。
(C27)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述蛋白質為抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。
(C28)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述抗體之變體為抗原結合片段。
(C29)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述細胞表面分子之變體為融合蛋白。
(C30)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。
(C31)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。
(C32)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述疾病、障礙或狀態選自由移植免疫排斥反應、過敏、自體免疫疾病、移植物抗宿主病、及由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應所組成之群。
(C33)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述疾病、障礙或狀態包括過敏。
(C34)如上述項目之任一項所記載之細胞，其中上述疾病、障礙或狀態包括由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之移植引起 之免疫排斥反應。
本發明亦提供以下。
(D1)一種用以於受驗體中誘發對供給者之長久之免疫耐受(感染性免疫耐受)之組合物，該組合物包含藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體、來自該受驗體之細胞、及來自該供給者之抗原或該抗原含有物混合而被誘導免疫耐受的細胞。
(D2)如上述項目所記載之組合物，其中上述免疫耐受係於上述受驗體中之CD8陽性T細胞中誘發免疫耐受。
(D3)一種於受驗體中預防或治療疾病、障礙或狀態之方法，該方法包括如下步驟：1)對該受驗體投予包含藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體、來自該受驗體之細胞、及來自該受驗體之抗原或不來自該受驗體之抗原或者該抗原含有物混合而被誘導失能之細胞的製劑；及2)確認該受驗體之T細胞之失能狀態，於可確認到失能狀態之情形時不進行進一步處置，於無法確認到失能狀態之情形時，再次投予包含該細胞之製劑。
(D3A)一種於受驗體中用以預防或治療疾病、障礙或狀態之醫藥，該醫藥包含藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體、來自該受驗體之細胞、及來自該受驗體之抗原或不來自該受驗體之抗原或者該抗原含有物混合而誘導失能之細胞(例如，T細胞)，此處，該醫藥之特徵在於：於投予該醫藥後，確認該受驗體之T細胞之失能狀態，於可確認到失能狀態之情形時不進行進一步處置，於無法確認到失能狀態之情形時，再次投予包含該細胞之醫藥。
(D4)如上述項目之任一項所記載之方法、醫藥或組合物，其中上述 製劑包含CD4陽性失能細胞、CD8陽性失能細胞、或該等之組合。
(D5)如上述項目之任一項所記載之方法、醫藥或組合物，其中上述製劑包含CD8陽性失能細胞。
(D6)如上述項目之任一項所記載之方法、醫藥或組合物，其中上述失能狀態之確認包括確認包含上述細胞之製劑消失之步驟。
(D7)如上述項目之任一項所記載之方法、醫藥或組合物，其中上述疾病、障礙或狀態選自由移植免疫排斥反應、過敏、自體免疫疾病、移植物抗宿主病、及由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應所組成之群。
(D8)如上述項目之任一項所記載之方法、醫藥或組合物，其中上述疾病、障礙或狀態包括過敏。
(D9)如上述項目之任一項所記載之方法、醫藥或組合物，其中上述疾病、障礙或狀態包括由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應。
(D10)一種用以治療或預防受驗體之過敏之組合物，該組合物包含藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體、來自該受驗體之細胞、及成為過敏之原因之抗原或該抗原含有物混合而被誘導免疫耐受的細胞。
(D11)如上述項目之任一項所記載之組合物，其中上述成為過敏之原因之抗原選自食品、花粉、藥品、及金屬。
(D11A)如項目D10或D11所記載之組合物，其進而具有如項目D1至D9之任意一項或複數項所記載之特徵。
(D12)一種用以於受驗體中抑制或預防由iPS細胞或ES細胞或者來自 該等之細胞、組織或器官產生之免疫排斥反應的組合物，該組合物包含藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體、來自該受驗體之細胞、及來自該iPS細胞或ES細胞之抗原或該抗原含有物混合而被誘導免疫耐受的細胞。
(D12A)如項目D12所記載之組合物，其進而具有如項目D1至D11之任意一項或複數項所記載之特徵。
(D13)一種T細胞，其不為控制性T細胞，且被誘導失能。
(D13A)如項目D13所記載之組合物，其進而具有如項目D1至D11、D11A、D12或D12A之任意一項或複數項所記載之特徵。
(D14)一種製造T細胞之方法，該T細胞不為控制性T細胞，且已針對受驗體被誘導失能，該方法包括如下步驟：A)將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體、來自該受驗體之細胞、及不來自該受驗體之抗原或該抗原含有物混合；B)培養該混合物而獲得T細胞之步驟；及C)視需要以不來自該受驗體之抗原或該抗原含有物刺激該T細胞，確認該T細胞不反應。
(D15)如上述項目之任一項所記載之T細胞或如上述項目之任一項所記載之方法，其中上述T細胞包含CD4陽性細胞及/或CD8陽性細胞。
(D15A)如上述項目之任一項所記載之方法，其進而具有如項目D1至D11、D11A、D12、D12A或D13之任意一項或複數項所記載之特徵。
(D16)一種組合物，其係用於誘導受驗體內之CD8陽性T細胞對特定之抗原無反應或低反應。
(D16A)如上述項目之任一項所記載之組合物，其進而具有如項目D1至D1、D11A、D12、D12A、D13、D14、D15或D15A之任意一項或複數 項所記載之特徵。
(D17)一種用以處置或預防由不來自受驗體之抗原產生之疾病、障礙或狀態之醫藥，其包含藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體、來自該受驗體之細胞、及來自該受驗體之抗原或不來自該驗檢體之抗原或該抗原含有物混合而被誘導免疫耐受的細胞。
(D18)如上述項目之任一項所記載之醫藥，其中上述疾病、障礙或狀態選自由移植免疫排斥反應、過敏、自體免疫疾病、移植物抗宿主病、及由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應所組成之群。
(D19)如上述項目之任一項所記載之醫藥，其中上述疾病、障礙或狀態包括過敏。
(D20)如上述項目之任一項所記載之醫藥，其中上述疾病、障礙或狀態包括由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應。
(D20A)如上述項目之任一項所記載之醫藥，其進而具有如項目D1至D11、D11A、D12、D12A、D13、D14、D15、D15A、D16、D16A、D17至D19之任意一項或複數項所記載之特徵。
於本發明中，意圖為上述1個或複數個特徵除了所明示之組合以外，可進一步組合而提供。本發明之更進而之實施形態及優點只要視需要閱讀以下之詳細說明加以理解，即可被業者認識到。
本發明之組合物可誘發對供給者之長久之免疫耐受(感染性免疫耐受)。又，於用以誘導免疫耐受之醫藥之製造中，可以CD8陽性細 胞作為指標而管理醫藥之品質。本發明之組合物可治療過敏或者抑制iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之免疫排斥反應。
圖1表示實施例1中實施之實驗之流程(左圖、右圖下)及其結果(右圖上)。右圖上之結果表示胸苷摻入，左起表示刺激者細胞刺激後之應答者細胞之增生反應，左起第2根柱表示於上段加入新鮮之應答者細胞與刺激者細胞之情形，右起第2根柱表示於上段加入失能細胞與刺激者細胞之情形，右端表示將失能細胞加入至與刺激者細胞/應答者細胞同段之情形。
圖2係表示即便來自細胞製劑之細胞自接受者消失免疫耐受亦持續之實驗結果。圖2a係藉由左圖所示之方法進行實驗。將其結果(心臟之植活率)示於右下圖表。藉由移入失能細胞，所移植之心臟之植活率細胞數依賴性地提高。藉由移入6×106個失能細胞，全部小鼠可觀察到100天以上之移植心臟之植活之改善(植活率之改善)，證明誘導對所移植之心臟之免疫耐受。圖2b係研究於末梢血液(PBMC)、淋巴結(MLN)、脾臟(Spleen)、所移植之心臟(Transplant Heart)內是否檢測到所移入之失能細胞之結果。免疫耐受BALB/c心臟移植表示移植移入失能細胞之異體之BALB/c小鼠之心臟的B6小鼠，免疫耐受B6心臟移植表示移植移入失能細胞之同系B6小鼠之心臟的B6小鼠。不僅於末梢血液、淋巴結、脾臟內，而且於所移植之心臟內，藉由螢光表現亦未檢測到移入之失能細胞。
圖3係使用藉由PCR將基因組基因中之GFP基因擴增之感度更高之檢測方法，顯示即便來自細胞製劑之細胞自接受者消失免疫耐受亦持續。圖3a中左起表示分子量標記物、1：無模板、2：PC GFP小鼠基因組DNA、 3：1/100稀釋GFP小鼠基因組DNA、4：1/1000稀釋GFP小鼠基因組DNA、5：1/10000稀釋GFP小鼠基因組DNA、6：1/100000稀釋GFP小鼠基因組DNA、及7：野生型小鼠基因組DNA。如圖所示，使用即便0.1%(1/1000稀釋GFP小鼠基因組DNA之存在：區帶4)亦可檢測之將基因組基因中之GFP基因進行PCR之條件進行實施例2。將結果示於圖3b。圖3b中上段左起表示PBMC及脾臟，下段左起表示淋巴球(MLN)及心臟(Heart)。各區帶左起表示分子量標記物(M)、1：無NC模板、2：PC(陽性對照組：GFP小鼠淋巴球基因組DNA)、3：移植3天後、4：移植1週後、5：移植4週後、6：移植7週後、7：移植15週後(免疫耐受)。
圖4係表示利用失能細胞之免疫抑制對抗原具有特異性之圖。圖4表示於抗CD80/86抗體存在下經Balb/C小鼠脾臟細胞刺激之來自B6小鼠之失能細胞向B6小鼠之移入後的心臟之植活率。100%抑制所移植之BALB/c小鼠之心臟之排斥，即便100天後心臟亦植活，與此相對，作為異體(第三方)之CBA小鼠之心臟於移植後迅速引起排斥反應，顯示約50天內被100%排斥。
圖5表示呈現實施例4中進行之感染性免疫耐受之實驗。
圖6表示圖5所示之感染性免疫耐受之結果。左圖表示自藉由失能細胞之移入誘導對所移植之心臟之免疫耐受的小鼠獲得之CD4陽性T細胞之移入後的植活率(免疫耐受)。右圖表示自藉由失能細胞之移入誘導對所移植之心臟之免疫耐受的小鼠獲得之CD8陽性T細胞之移入後的植活率(免疫耐受)。
圖7表示實施例5中進行之人體外模型中之異體特異性抑制性失能細胞的繼代移入之方法。
圖8表示實施例5中進行之免疫抑制功能之評價。圖8a表示其模式圖。圖8b表示3H-胸苷摻入量之CPM(count per minute，每分鐘計數)值。圖表中左起表示：僅初始之應答者細胞之CPM值；異體細胞之刺激下之CPM值；以應答者細胞：失能細胞之比率為1：1、1：0.5、1：0.25、1：0.125於初始之應答者細胞中添加失能細胞時之CPM值。於圖8c中，表示IL-2(左)及IL-10(右)之產生。各圖表中左起表示僅初始之應答者細胞、CD4陽性初始細胞之異體細胞之刺激、添加1st失能細胞時之CD4陽性初始細胞之異體細胞之刺激、添加2nd失能細胞時之CD4陽性初始細胞之異體細胞之刺激、添加3rd失能細胞時之CD4陽性初始細胞之異體細胞之刺激。1st失能細胞、2nd失能細胞、3rd失能細胞均表現出抑制應答者CD4陽性細胞產生誘導細胞增生之細胞激素IL-2，另一方面，誘導抑制免疫反應之代表性之細胞激素IL-10之產生。均表示將於僅應答者細胞(無刺激)之條件下之各細胞激素產生量設為1時之比率。
圖9表示確認到CD8陽性細胞之反應性及CD4陽性T細胞之必要性之結果。左起分別表示於早期(3-24天)、中期(25-42天)、後期(80-100天)利用抗CD4抗體去除包含控制性T細胞(於本說明書中亦表示為regT細胞)之CD4陽性細胞之情形時移植時之心臟之植活率(未發生心臟之排斥之比例)。
圖10係表示對供給者之CD8陽性T細胞之反應之結果。圖10a表示呈現對供給者之CD8陽性T細胞之反應的實驗之程序。圖10b係將以CSFE(carboxy-succinimidyl-fluorescein-ester，羧基螢光素琥珀醯亞胺酯)標記之該細胞與來自BALB/c之放射線照射脾臟細胞以2×106細胞/mL按照1：1混合，利用12孔板(Corning公司製造，Cat.No.3513)或24孔板 (corningCat.No3526)進行培養，藉由流式細胞儀(BD verse)研究培養第5天之CD8陽性T細胞之CSFE之表現而得之結果。左起表示供給者細胞、免疫耐受小鼠、初始小鼠。上段表示點陣圖之結果，下段表示直方圖之結果。圖10c表示與抗CD3‧CD28抗體刺激相比之CD8MLR增生比率之比較。圖表中左組為無抗CD3‧CD28抗體刺激之結果，中央組為利用經放射線照射之自體細胞刺激之結果，右組為利用經放射線照射之供給者細胞刺激之結果，於各組中，左起表示初始B6細胞之CD8陽性T細胞、來自排斥移植心臟之小鼠之CD8陽性T細胞、成為免疫耐受之小鼠之CD8陽性T細胞之反應。
圖11表示實施例8中所示之過敏性肺炎(哮喘)模型中之免疫耐受之程序。
圖12表示圖11所示之過敏性肺炎(哮喘)模型中之免疫耐受之實驗結果。圖12a表示支氣管滲出液(BAL)中所含之白血球數，圖12b表示BAL中所含之嗜酸性球數。圖12c表示BAL中所含之IL-4之量。於各圖表中，左起表示僅投予磷酸緩衝生理鹽水之小鼠(PBS對照組)、經卵白蛋白刺激之小鼠(OVA攻擊)、投予卵白蛋白刺激與本發明之失能細胞之小鼠(細胞治療)。
圖13表示實施例9中所示之食品過敏模型中之免疫耐受誘發之程序。
圖14係作為圖13所示之食品過敏模型中之免疫耐受誘發之結果而表示典型之腸道之利用FoxP3/CD4的免疫螢光染色之結果。左圖(2列)表示誘發食物過敏之2隻小鼠(食物過敏小鼠)(11、12)之結果，中圖(2列)表示誘發食物過敏且移入失能細胞之2隻小鼠(移入有失能細胞之食物過敏小鼠)(21、22)之結果，右端表示2隻正常小鼠(無處置正常小鼠)(31、32)之 結果。於食物過敏小鼠及移入了移入有失能細胞之食物過敏細胞之小鼠中，表現出獨立之3處組織染色圖像(縱向3個)。
圖15表示圖13所示之食品過敏模型中之免疫耐受誘發之結果。圖15a表示各小鼠(圖14中之小鼠11及12(食物過敏小鼠)、21及22(移入有失能細胞之食物過敏小鼠)、31及32(無處置正常小鼠))之典型之腸的HE(hematoxylin-eosin，蘇木精-曙紅)染色之照片。圖15b表示由圖14所示之圖像之解析結果獲得之每1mm2之控制性T細胞(CD4+FOXP3+)之平均細胞數，圖表中左起表示食物過敏小鼠(過敏)、移入有失能細胞之食物過敏小鼠(移入失能細胞)、及無處置正常小鼠(無處置正常)。表示由圖15a所示之圖像之解析結果獲得之每1mm2之平均嗜酸性球數的圖表為圖15c，與圖15b同樣，圖表中左起表示過敏、移入失能細胞及無處置正常。
圖16表示利用iPS細胞之免疫耐受誘發之結果。圖表以3H-胸苷摻入量之CPM值表示淋巴球之增加。左起表示：僅初始淋巴球；利用來自同種異系iPS細胞之神經細胞之刺激；以初始淋巴球與失能細胞之比率成為1：1/2、1：1/4、1：1/8、1：1/16之方式於利用來自同種異系iPS細胞之神經細胞之刺激系中添加以來自iPS之神經細胞與抗體刺激誘導之失能細胞時之反應；將抗CD80/CD86抗體(10μg/ml)添加至利用來自同種異系iPS細胞之神經細胞之刺激系中時之反應。
以下，示出最佳之形態對本發明進行說明。應理解於本說明書全文中，只要未特別提及，則單數形之表現亦包括其複數形之概念。因此應理解，只要未特別提及，則單數形之冠詞(例如，英文之情形時為 「a」、「an」、「the」等)亦包括其複數形之概念。又，應理解，本說明書中所使用之用語只要未特別提及，則以該領域所通常使用之含義使用。因此，只要未作其他定義，則本說明書中所使用之全部專業用語及科學技術用語具有與本發明所屬領域之業者通常理解之含義相同之含義。於發生矛盾之情形時，本說明書(包括定義)優先。
(用語之定義)
於本說明書中，所謂「約」，於本說明書中使用之情形時，意指其後數值之±10%。
於本說明書中，所謂「免疫耐受」，係不表現出針對特定抗原之特異性免疫反應、或特異性免疫反應被抑制之狀態。免疫耐受可意指免疫細胞(尤其是T細胞)不表現出針對特定抗原之特異性免疫反應或特異性免疫反應被抑制之狀態，及人不表現出針對特定抗原之特異性免疫反應或特異性免疫反應被抑制之狀態之兩者或任一者。藉由誘發免疫耐受，而可處置免疫排斥反應、或可治療過敏，因此受到關注。於本說明書中，所謂「失能」意指藉由在由抗原呈現細胞呈現抗原時不輸入共同刺激，而於該下次有共同刺激之條件下即便被刺激亦無法反應之狀態。因此，本說明書中所謂「失能細胞」係指產生免疫耐受之(免疫不應答之)細胞，「失能T細胞」係產生免疫耐受之(免疫不應答之)T細胞，除了不被活化外，再次遇到相同之抗原時無反應之T細胞亦包含其中。再者，於本說明書中，「經誘導免疫耐受之PBMC(或T細胞)」與「失能之PBMC(或T細胞)」之含義相同。可藉由確認CD44陽性進行確認，但不限定於此。
於本說明書中，所謂「受驗體」，包括飼養動物(例如牛、羊、貓、狗、馬)、靈長類(例如人、及猴等非人靈長類)、兔、及嚙齒類 (例如小鼠及大鼠)。於特定之實施形態中，受驗體為人。
於本說明書中，所謂「長久之免疫耐受(感染性免疫耐受)」係指於投予藉由可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體等抑制因子誘導對特定抗原之失能之細胞之受驗體(接受者)中，經誘導失能之該細胞自受驗體消失後，對特定抗原之免疫耐受之狀態亦維持至少一定期間(例如，數月、或1年、或3年以上)。其意指於投予被誘導失能之細胞之受驗體(接受者)之體內，於可誘導失能之其他細胞中新誘導失能、即誘導感染性免疫耐受。
於本說明書中，「藥劑」、「劑」或「因子」(均相當於英文之agent)廣義上可交換使用，只要可達成意圖之目的，則可為任意物質或其他要素(例如光、放射能、熱、電等能量)。作為此種物質，例如可列舉：蛋白質、多肽、寡肽、肽、多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核酸(例如包括如cDNA、基因組DNA之DNA、如mRNA之RNA)、多醣、寡醣、脂質、有機低分子(例如，激素、配體、訊息傳遞物質、其他有機低分子化合物、藉由組合化學合成之分子、可用作醫藥品之低分子(例如，低分子配體等)等)、該等之複合分子，但不限定於該等。
於本說明書中，「抑制因子」係指可抑制特定作用(例如相互作用、訊號傳遞等)之所有種類之低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖等。無意受特定之理論約束，但於本發明中，藉由阻斷細胞表面之CD80及/或CD86與CD28之相互作用，抑制CD28共同刺激訊號，而對T細胞誘導失能。於本發明中，用於阻斷CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。於一態樣中，上述蛋白質係抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變 體。於其他態樣中，上述抗體之變體係抗原結合片段。於其他態樣中，上述細胞表面分子之變體係融合蛋白。於其他態樣中，上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。於其他態樣中，上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。又，亦假定亦可組合使用間接抑制上述相互作用之因子(例如，訊號傳遞之上游或下游之訊號之抑制因子)。
於本說明書中，廣義之「抗體」係指可特異性結合於抗原上之特定表位之分子或其集群。本說明書中之廣義之「抗體」可為全長抗體(即具有Fc部分之抗體)，亦可為Fc部分缺失之抗體。Fc部分缺失之抗體只要可結合於目標抗原即可，作為此種抗體，例如可列舉Fab抗體、F(ab')2抗體、Fab'抗體、Fv抗體、scFv抗體等，但並不限定於該等。抗體可為任意類型之抗體，即，可為該領域中公知之免疫球蛋白。於例示性之實施形態中，抗體為同型IgA、IgD、IgE、IgG、或IgM類別之抗體。於例示性之實施形態中，本說明書所記載之抗體包含1條或複數條α、δ、ε、γ、及/或μ重鏈。於例示性之實施形態中，本說明書所記載之抗體包含1條或複數條κ或輕鏈。於例示性之態樣中，抗體為IgG抗體，為4種人類亞型：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4中之1種。又，作為假定於本發明中使用之抗體，可列舉來自駱駝科動物之抗體(例如，VHH抗體)、來自鯊魚之抗體(例如，單鏈抗體)、肽體(peptibody)、奈米抗體(nanobody、單域抗體)、微型抗體(minibody)、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體、雙功能抗體(diabody)、三功能抗體(triabody)、四功能抗體(tetrabody)、串聯二-scFV、串聯三-scFv)等，該等於該領域為公知。例如，請參照Kortt等、 Biomol Eng.2001 18卷：95~108頁、(2001年)及Todorovska等、J Immunol Methods.248卷：47~66頁、(2001年)等。又，抗體包括抗體修飾物或抗體非修飾物。抗體修飾物可為抗體與例如聚乙二醇等各種分子結合。抗體修飾物可藉由使用公知之方法對抗體進行化學修飾而獲得。關於人工製作之抗體及抗體之各種修飾/變體化方法，亦參照生物化學(2016)第88卷第3號380~385頁。
於本說明書中，狹義之「抗體」係指可特異性結合於抗原上之特定表位之免疫球蛋白或其集群，將其變體稱為「抗體之變體」。本說明書中之狹義之「抗體」可為全長抗體(即具有Fc部分之抗體)，本說明書中之「抗體之變體」可為上述抗體之Fc部分缺失之變體。因此，本說明書中狹義之抗體亦可稱為全長抗體，抗體之變體亦可稱為全長抗體之變體。Fc部分缺失之變體只要可結合於目標抗原即可，作為此種變體，例如可列舉Fab抗體、F(ab')2抗體、Fab'抗體、Fv抗體、scFv抗體等，但並不限定於該等。又，抗體之變體包括抗體修飾物或抗體非修飾物。抗體修飾物可為抗體與例如聚乙二醇等各種分子結合。抗體修飾物可藉由使用公知之方法對抗體進行化學修飾而獲得。
於本發明之一實施形態中，關於「多株抗體」，例如為了誘導產生對抗原具有特異性之多株抗體，可藉由對哺乳類(例如大鼠、小鼠、兔、牛、猴等)、鳥類等投予含有目標抗原之免疫原而生成。免疫原之投予可注入1種以上之免疫劑、及於需要之情形時注入佐劑。佐劑有時亦用於增加免疫應答，可含有弗氏佐劑(Freund's adjuvant)(完全或不完全)、礦物凝膠(氫氧化鋁等)、或界面活性物質(脫脂酸卵磷脂等)等。免疫方案為該技術領域所公知，有時根據所選擇之宿主生物，藉由誘發免疫應 答之任意之方法實施(蛋白質實驗手冊，羊土社(2003)：86-91.)。
於本發明之一實施形態中，「單株抗體」包括構成集群之各抗體除了少量具有可自然產生之突變之抗體以外，實質上為對應於單一表位之相同抗體的情形。或者構成集群之各抗體亦可除了少量具有可自然產生之突變之抗體以外，實質上為相同抗體。單株抗體具有高度特異性，與典型地包含對應於不同表位之不同抗體、及/或典型地包含對應於同一表位之不同抗體的通常之多株抗體不同。除了該特異性以外，單株抗體就可由未被其他免疫球蛋白污染之融合瘤培養而合成之方面而言有用。「單株」之形容可表示可由實質上均一之抗體集群獲得之特徵，並非意指必須藉由某種特定之方法生產抗體。例如，單株抗體亦可藉由與"KohlerG,Milstein C.,Nature.1975 Aug 7；256(5517)：495-497."所揭示之融合瘤法相同之方法製作。或者單株抗體亦可藉由與美國專利第4816567號所記載之重組法相同之方法製作。或者單株抗體亦可使用與"Clackson et al.,Nature.1991 Aug 15；352(6336)：624-628."、或"Marks et al.,J Mol Biol.1991 Dec 5；222(3)：581-597."所記載之技術相同之方法自噬菌體抗體庫單離。或者亦可藉由"蛋白質實驗手冊，羊土社(2003)：92-96."所揭示之方法製作。
於本發明之一實施形態中，「嵌合抗體」例如為將異種生物間之抗體之可變區與抗體之恆定區連結而成者，可藉由基因重組技術構建。小鼠-人嵌合抗體例如可藉由"Roguska et al.,Proc Natl Acad Sci USA.1994Feb 1；91(3)：969-973."所記載之方法製作。用以製作小鼠-人嵌合抗體之基本之方法例如為將存在於經選殖化之cDNA中之小鼠前導序列及可變區序列連結於已存在於哺乳類細胞之表現載體中之編碼人類抗體恆 定區之序列。或者亦可將存在於經選殖化之cDNA中之小鼠前導序列及可變區序列連結於編碼人類抗體恆定區之序列後，連結於哺乳類細胞表現載體。人類抗體恆定區之片段可設為任意之人類抗體之H鏈恆定區及人類抗體之L鏈恆定區者，例如人H鏈者可列舉Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4，L鏈者可列舉Cλ或Cκ。
於本發明之一實施形態中，「人類化抗體」例如為具有來自非人種之1個以上之CDR、及來自人免疫球蛋白之架構區(FR)、進而具有來自人免疫球蛋白之恆定區且結合於所需之抗原之抗體。抗體之人類化可使用該技術領域已知之各種方法實施(Almagro et al.,Front Biosci.2008 Jan 1；13：1619-1633.)。例如，可列舉CDR移植(Ozaki et al.,Blood.1999 Jun1；93(11)：3922-3930.)、Re-surfacing(Roguska et al.,Proc Natl Acad Sci US A.1994 Feb 1；91(3)：969-973.)、或FR重排(Damschroder et al.,Mol Immunol.2007 Apr；44(11)：3049-3060.Epub 2007 Jan 22.)等。為了將抗原結合改型(較佳為改善)，人FR區之胺基酸殘基可置換為來自CDR供給者抗體之對應之殘基。該FR置換可藉由該技術領域周知之方法實施(Riechmann et al.,Nature.1988 Mar 24；332(6162)：323-327.)。例如，可藉由CDR與FR殘基之相互作用之建模鑑定對抗原結合重要之FR殘基。或者亦可藉由序列比較鑑定於特定之位置異常之FR殘基。
於本發明之一實施形態中，「人類抗體」例如為包含構成抗體之重鏈之可變區及恆定區、輕鏈之可變區及恆定區之區域來自編碼人免疫球蛋白之基因之抗體。作為主要之製作方法，有人類抗體製作用基因轉殖小鼠法、噬菌體呈現法等。於人類抗體製作用基因轉殖小鼠法中，若 對經剔除內源性Ig之小鼠導入功能性之人之Ig基因，則代替小鼠抗體而產生具有多種抗原結合能力之人類抗體。若進一步免疫該小鼠，則可藉由先前之融合瘤法獲得人類單株抗體。例如，可藉由"Lonberg et al.,Int Rev Immunol.1995；13(1)：65-93."所記載之方法製作。噬菌體呈現法典型而言為以不喪失噬菌體之感染性之方式使外源基因以融合蛋白之形式於作為大腸菌病毒之一之M13或T7等纖維狀噬菌體之鞘蛋白(g3p、g10p等)之N末端側表現之系統。例如，可藉由"Vaughan et al.,Nat Biotechnol.1996 Mar；14(3)：309-314."所記載之方法製作。
於本說明書中，所謂「來自受驗體之細胞」係指自投予本發明之組合物之受驗體獲得之細胞或來自從該受驗體獲得之細胞之細胞。於本說明書中，所謂「來自受驗體之抗原」係指使免疫應答產生之受驗體自身所產生之抗原，例如指成為具有自體免疫疾病之受驗體之自體免疫疾病之原因的受驗體自身所產生之抗原。於本說明書中，所謂「不來自受驗體之抗原」係指可使免疫應答產生之外來之抗原。於本說明書中，「不來自受驗體之抗原含有物(antigen-containing material)」係指含有不來自受驗體之抗原之任意之物質或物質之集合物，例如可列舉表現不來自受驗體之抗原之細胞、細胞集群、組織等。
於本說明書中，所謂「移植免疫排斥反應」係指接受器官、組織或細胞之移植之受驗體中受驗體之免疫系統對所移植之器官、組織或細胞進行攻擊而將其損傷或破壞。
於本說明書中，所謂「過敏」係指針對不來自受驗體之抗原而過度發生免疫應答之狀態。引起過敏之不來自受驗體之抗原亦稱為過敏原，例如可列舉蟎抗原、蛋白抗原、牛奶抗原、小麥抗原、花生抗原、 大豆抗原、蕎麥抗原、芝麻抗原、米抗原、甲殼類抗原、幾維果抗原、蘋果抗原、香蕉抗原、桃抗原、番茄抗原、金槍魚抗原、大馬哈魚抗原、青花魚抗原、牛肉抗原、雞肉抗原、豬肉抗原、貓皮屑抗原、昆蟲抗原、花粉抗原、狗皮屑抗原、真菌抗原、細菌抗原、乳膠、半抗原及金屬等，但不限定於該等。
於本說明書中，所謂「自體免疫疾病」係指免疫系統對自身之細胞、組織或器官進行不理想之免疫應答之任意之疾病。作為自體免疫疾病，例如可列舉類風濕性關節炎、多發性硬化症、1型糖尿病、炎症性腸病(例如，克隆氏病或潰瘍性大腸炎)、全身性紅斑狼瘡、牛皮癬、硬皮病、自體免疫性甲狀腺病、圓形禿、葛瑞夫茲氏病(Graves' Disease)、格-巴二氏(Guillain-Barre)症候群、乳糜瀉、修格連氏症候群(Sjögren's syndrome)、風濕熱、胃炎、自體免疫性萎縮性胃炎、自體免疫性肝炎、胰島炎、卵巢炎、睾丸炎、葡萄膜炎、晶狀體源性葡萄膜炎、重症肌無力症、原發性黏液水腫、惡性貧血、自體免疫性溶血性貧血、愛迪生氏病、硬皮病、古巴士德氏(Goodpasture)症候群、腎炎(例如，絲球體腎炎)、牛皮癬、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、特發性血小板減少性紫癜、特發性白血球減少症、韋格納(Wegener)肉芽腫及多發性/皮肌炎，但不限定於該等。
於本說明書中，所謂「移植物抗宿主病」係指所移植之器官、組織或細胞因免疫應答而攻擊接受移植之受驗體之細胞、組織或器官而將其損傷或破壞。
於本說明書中，所謂「由iPS細胞、ES細胞或來自該等細胞之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應」係指iPS細胞或ES細 胞所具有之抗原、或者來自iPS細胞或ES細胞(自該等細胞分化)之細胞、組織或器官所具有之抗原產生之免疫排斥反應。
(較佳之實施形態)
以下記載較佳之實施形態之說明，但應理解，該實施形態係本發明之例示，本發明之範圍並不限定於此種較佳之實施形態。又，應理解業者可參考如以下之較佳之實施例，於本發明之範圍內容易地進行修飾、變更等。關於該等實施形態，業者可適當參酌本說明書中之記載而將任意之實施形態加以組合。又，業界理解，本發明之以下之實施形態可單獨使用，或可將該等組合使用。
(用於誘發感染性免疫耐受之組合物)
本發明者等人發現，於將包含藉由抑制CD80/CD86與CD28之相互作用之抑制因子誘導失能之細胞之細胞製劑投予至器官移植患者(接受者)而誘導免疫耐受之技術中，意外地，於來自細胞製劑之細胞自接受者消失(檢測不到)後，免疫耐受亦持續(感染性免疫耐受)。
因此，於一態樣中，本發明提供一種組合物，其係用以於受驗體中誘發對供給者(來自供給者之抗原、或來自供給者之抗原含有物，例如供給者之細胞、組織或器官)之長久之免疫耐受(感染性免疫耐受)者，該組合物包含藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自該受驗體之細胞、及來自該供給者之抗原或該抗原含有物混合而被誘導免疫耐受(失能)之細胞。抗原含有物可為細胞，為了防止該細胞之增生及活化，可被放射線照射。
本發明之組合物於一旦誘導免疫耐受而抑制移植免疫排斥反應之情形時，無需持續投予細胞製劑，而可長久地抑制或預防移植免疫 排斥反應。
於若干實施形態中，其特徵在於：移植免疫排斥反應係因移植腎臟、肝臟、心臟、皮膚、肺、胰腺、食道、胃、小腸、大腸、神經、血液、包含免疫系統細胞之血球細胞、骨、軟骨、血管、角膜、眼球或骨髓產生。
於特定之實施形態中，免疫耐受(失能)係於CD4陽性T細胞及/或CD8陽性T細胞中被誘發，較佳為免疫耐受(失能)係於至少CD8陽性T細胞中被誘發。因此，本發明之組合物可包含CD4陽性失能T細胞及/或CD8陽性失能T細胞。又，本發明之組合物可進而包含控制性T細胞、例如FOXP3陽性CD4陽性CD25陽性T細胞。
該經誘發免疫耐受(失能)之細胞可藉由可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體等抑制因子而誘導。此種抑制因子選自由低分子、蛋白質、核酸、脂質、糖、及該等之組合所組成之群。於一態樣中，上述蛋白質係抗體或其變體、或者細胞表面分子或其變體。於其他態樣中，上述抗體之變體係抗原結合片段。於其他態樣中，上述細胞表面分子之變體係融合蛋白。於其他態樣中，上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。於其他態樣中，上述CTLA4-Ig融合蛋白為阿巴西普或貝拉西普。於若干實施形態中，CD80及/或CD86係藉由抗原呈現細胞表現，CD28係藉由T細胞表現。於特定之實施形態中，可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子可為抗CD80抗體及/或抗CD86抗體或CTLA4-Ig融合蛋白。作為假定於本發明中使用之抑制因子，如上所述可列舉CTLA-4 Ig 融合蛋白。CTLA-4 Ig融合蛋白以如下方式發揮功能：關於抗原呈現細胞上對CD80/CD86之結合，與T細胞上作為共同刺激受體之CD28競爭，其結果抑制T細胞之活化。於本發明中，作為上述CTLA-4 Ig融合蛋白，假定阿巴西普(Orencia(註冊商標))、貝拉西普或Maxy-4。貝拉西普含有顯著增大對CD80及CD86之結合性之2個胺基酸置換(L104E及A29Y)(參照Davies JK等、Cell Transplant.(2012)；21(9)：2047~61、Adams AB等、J Immunol.(2016)197(6)：2045~50)。又，作為可期待與CTLA4-Ig融合蛋白相同之效果之抑制因子，亦可列舉CD28-Ig融合蛋白(Peach RJ等、J Exp Med.(1994)180(6)：2049~2058)。本發明之抑制因子亦可以核酸之形態使用。若列舉一例，則亦可假定將編碼CTLA4-Ig融合蛋白之核酸經由腺病毒載體等導入至細胞中並使其表現。例如，參照Jin YZ等、Transplant Proc.(2003)；35(8)：3156~9。
(治療)
於其他態樣中，本發明提供一種於受驗體中預防或治療疾病、障礙或狀態之方法，該方法包括如下步驟：(1)將藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體等抑制因子、來自該受驗體之細胞、來自該受驗體之抗原或不來自該受驗體之抗原或者該抗原含有物混合而被誘導失能之細胞的製劑投予至該受驗體；及(2)確認該受驗體之T細胞之失能狀態，於可確認到失能狀態之情形時不進行進一步處置，於無法確認到失能狀態之情形時，再次投予包含該細胞之製劑。
又，於該態樣中，本發明係一種於受驗體中用以預防或治療疾病、障礙或狀態之醫藥，該醫藥包含藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體等抑制因子、來自該受驗體之細胞、來自該受 驗體之抗原或不來自該受驗體之抗原或者該抗原含有物混合而誘導失能之細胞(例如，T細胞)，此處，該醫藥之特徵在於：確認受驗體之T細胞之失能狀態，於可確認到失能狀態之情形時不進行進一步處置，於無法確認到失能狀態之情形時，再次投予包含該細胞之製劑。
於若干實施形態中，上述製劑或醫藥包含CD4陽性失能細胞、CD8陽性失能細胞、或該等之組合。於特定之實施形態中，上述製劑或醫藥包含CD8陽性失能細胞。
失能狀態之確認可藉由確認包含被誘導失能之細胞的製劑消失而進行。包含被誘導失能之細胞的製劑消失之確認典型而言可藉由以下方式等進行：自受驗體(例如，接受者)獲得末梢血液單核球(PBMC)並採集DNA，藉由PCR等方法解析表現之MHC(major histocompatibility complex，主要組織相容性複合物)，檢測有無於不來自受驗體之細胞(例如，來自供給者之細胞)中表現且不於受驗體(例如，來自接受者之細胞)中表現之MHC。或亦可藉由標記被誘導失能之細胞，自受驗體檢測有無末梢血液單核球(PBMC)中之標記，從而確認包含被誘導失能之細胞的製劑之消失。
於若干實施形態中，疾病、障礙或狀態可選自由過敏、自體免疫疾病、移植物抗宿主病、及由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應所組成之群。
於本發明作為對象之疾病等為移植免疫排斥反應之實施形態中，失能細胞可藉由將上述抑制因子、來自接受者之細胞(PBMC或脾臟細胞)、及來自供給者之抗原或來自供給者之該抗原含有物加以混合而誘導。來自供給者之抗原含有物可為PBMC、脾臟細胞或來自要移植之器 官之細胞。
於本發明作為對象之疾病等為過敏之實施形態中，失能細胞可藉由將上述抑制因子、來自受驗體之細胞(PBMC或脾臟細胞)、及引起過敏之不來自受驗體之抗原加以混合而誘導。
於本發明作為對象之疾病等為自體免疫疾病之實施形態中，失能細胞可藉由將上述抑制因子、來自受驗體之細胞(PBMC或脾臟細胞)、及成為自體免疫疾病之原因之來自受驗體之抗原加以混合而誘導。
於本發明作為對象之疾病等為移植物抗宿主病之實施形態中，失能細胞可藉由將上述抑制因子、提供移植物之供給者之PBMC或脾臟細胞、及來自接受者之抗原或該抗原含有物加以混合而誘導。來自接受者之抗原含有物可為PBMC、脾臟細胞或移植器官之部位之周邊之細胞或來自其之細胞。
於本發明作為對象之疾病等為由iPS細胞或ES細胞及來自該等細胞之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應之實施形態中，失能細胞可藉由將上述抑制因子、來自受驗體之細胞(PBMC或脾臟細胞)、及自iPS細胞或ES細胞分化之用於移植之細胞加以混合而誘導。
以下示出利用本發明之疾病等之治療例，但不限定於以下。
(過敏及自體免疫疾病)
於一態樣中，本發明提供一種使用本發明之醫藥治療或預防過敏及/或自體免疫疾病之方法及其使用之醫藥、組合物、細胞混合物。關於過敏及自體免疫疾病，藉由慣例之方法使自患者之末梢血液獲得之巨噬細胞分 化為抗原呈現能力較高之樹狀細胞(來自巨噬細胞之樹狀細胞)，使照射放射線(γ射線)後之該細胞呈現成為過敏或自體免疫疾病中之過度反應之原因之抗原，與自相同患者末梢血液獲得之T細胞群在抗CD80抗體及/或抗CD86抗體或CTLA4-Ig融合蛋白等抑制因子之存在下共培養1~2週，而獲得對成為過敏或自體免疫疾病之原因之抗原具有特異性之失能細胞。藉由將該失能細胞投予至患者，而誘導對成為過敏或自體免疫疾病之原因之抗原具有特異性之免疫耐受，用於過敏及自體免疫疾病之預防及治療。根據為預防療法或治療，進而根據症狀之強弱等各條件，亦存在投予次數成為複數次之情況。
(移植物抗宿主病)
於一態樣中，本發明提供一種使用本發明之醫藥治療或預防移植物抗宿主病之方法及其使用之醫藥、組合物、細胞混合物。於移植物抗宿主病中，與對移植免疫排斥反應之治療相反地，將提供移植物之供給者之PBMC或T細胞等可成為移植物抗宿主病之原因之細胞與照射過放射線(γ射線)之來自宿主之PBMC或其以外之細胞在抗CD80抗體及/或抗CD86抗體或CTLA4-Ig融合蛋白等抑制因子之存在下，共培養1~2週，獲得對宿主具有特異性之失能細胞。藉由將該失能細胞投予至宿主，而抑制成為移植物抗宿主病之原因之由移植物引起之對宿主之反應(誘導免疫耐受)，預防及治療移植物抗宿主病。根據為預防療法或治療，進而根據所移植之組織或其大小、症狀之強弱等各條件，亦存在投予次數成為複數次之情況。
(使用iPS細胞或ES細胞之治療中之應用)
於一態樣中，本發明提供一種於使用本發明之醫藥且使用iPS細胞或ES細胞之預防或治療中，治療或預防由iPS細胞或ES細胞及來自該等細胞 之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應或其他副作用的方法及其使用之醫藥、組合物、細胞混合物。於使用iPS細胞或ES細胞之治療中之應用中，代表性地例示由iPS細胞或ES細胞及來自該等細胞之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應作為治療對象。
若詳細說明代表性之例，則於在使用iPS細胞或ES細胞之治療中之應用中，對自iPS細胞或ES細胞分化之用於移植之細胞或樹狀細胞照射放射線(γ射線)，將該細胞與接受移植之患者之PBMC或T細胞群於抗CD80抗體及/或抗CD86抗體或CTLA4-Ig融合蛋白等抑制因子之存在下共培養1~2週，獲得對自iPS細胞或ES細胞分化之細胞具有特異性之失能細胞。藉由將該失能細胞投予至宿主，而誘導對來自iPS細胞或ES細胞之移植之細胞、組織、及器官具有特異性之免疫耐受，預防及治療對該等之排斥反應。根據為預防療法或治療，進而根據所移植之組織或其大小、症狀之強弱之各條件，亦存在投予次數成為複數次之情況。
(過敏)
於一態樣中，本發明提供一種使用本發明之醫藥治療或預防過敏之方法及其使用之醫藥、組合物、細胞混合物。本發明者等人證實包含藉由抑制CD80/CD86與CD28之相互作用之抗體等抑制因子被誘導失能之細胞的製劑可誘發對過敏之免疫耐受。因此，於其他態樣中，本發明提供一種用以治療或預防受驗體之過敏之組合物，該組合物包含藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體等抑制因子、來自該受驗體之細胞、及成為過敏之原因之抗原或該抗原含有物混合而被誘導免疫耐受的細胞。
於若干實施形態中，對過敏之免疫耐受可為長久之免疫耐 受(感染性免疫耐受)。
作為成為過敏之原因之抗原，可列舉食品、花粉、藥品、及金屬等，更具體而言，可列舉蟎抗原、蛋白抗原、牛奶抗原、小麥抗原、花生抗原、大豆抗原、蕎麥抗原、芝麻抗原、米抗原、甲殼類抗原、幾維果抗原、蘋果抗原、香蕉抗原、桃抗原、番茄抗原、金槍魚抗原、大馬哈魚抗原、青花魚抗原、牛肉抗原、雞肉抗原、豬肉抗原、貓皮屑抗原、昆蟲抗原、花粉抗原、狗皮屑抗原、真菌抗原、細菌抗原、乳膠、半抗原及金屬等，但不限定於該等。
(iPS細胞等產生之免疫排斥反應之抑制或預防)
於一態樣中，本發明提供一種用以抑制或預防iPS細胞等產生之免疫排斥反應之方法，且提供用於該抑制或預防之醫藥、組合物、細胞混合物。本發明者等人證實，包含藉由抑制CD80/CD86與CD28之相互作用之抗體等抑制因子被誘導失能之細胞的製劑可誘發對iPS細胞等或來自該等之細胞、組織或器官產生之免疫排斥反應之免疫耐受。因此，於其他態樣中，本發明提供一種組合物，其係用以於受驗體中抑制或預防由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官產生之免疫排斥反應者，該組合物包含藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體等抑制因子、來自該受驗體之細胞、及來自該iPS細胞或ES細胞之抗原或該抗原含有物混合而被誘導免疫耐受的細胞。
於若干實施形態中，對iPS細胞等或來自該等之細胞、組織或器官產生之免疫排斥反應之免疫耐受可為長久之免疫耐受(感染性免疫耐受)。
作為來自iPS細胞或ES細胞(自其分化)之細胞、組織或器 官，例如可列舉神經細胞或組織、角膜細胞或組織、心肌細胞或組織、肝臟或組織、軟骨細胞或組織、皮膚細胞或組織、腎臟或組織等，但並不限定於該等。於較佳之實施形態中，作為來自iPS細胞或ES細胞(自其分化)之細胞、組織或器官，可列舉神經細胞或組織、心肌細胞或組織、軟骨細胞或組織及皮膚細胞或組織。
(不為控制性T細胞且具有誘導失能之活性之T細胞及製造方法)
本發明者等人證實，於移植後後期(例如，移植後80天後)，CD8陽性細胞之反應性喪失，即便去除CD4陽性T細胞亦可誘導免疫耐受。因此，於本發明之一態樣中，可提供一種不為控制性T細胞且具有誘導失能之活性之T細胞。於進而之態樣中，本發明提供一種製造不為控制性T細胞且對受驗體具有誘導失能之活性之T細胞之方法，其包括：(A)將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自該受驗體之細胞、及不來自該受驗體之抗原或該抗原含有物混合之步驟；(B)培養該混合物而獲得T細胞之步驟；及(C)視需要以不來自該受驗體之抗原或該抗原含有物刺激該T細胞，確認該T細胞不反應之步驟。
於若干實施形態中，確認T細胞不反應之步驟可包括確認不因刺激而增生。
於若干實施形態中，上述T細胞包含CD4陽性細胞及/或CD8陽性細胞。於特定之實施形態中，上述T細胞包含CD8陽性細胞。
於其他態樣中，本發明提供一種組合物，其係用於誘導受驗體內之CD8陽性T細胞對特定之抗原無反應或低反應。
(醫藥)
於其他態樣中，本發明提供一種用以處置或預防由不來自受驗體之抗原產生之疾病、障礙或狀態之醫藥，其包含藉由將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抗體等抑制因子、來自該受驗體之細胞、來自該受驗體之抗原或不來自該驗檢體之抗原或該抗原含有物混合而被誘導免疫耐受的細胞。
於若干實施形態中，藉由本發明之醫藥處置之疾病、障礙或狀態選自由移植免疫排斥反應、過敏、自體免疫疾病、移植物抗宿主病、及由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應所組成之群。
以下示出典型之本發明之細胞製劑之製造及品質管理方法之一例。
(包含失能T細胞之細胞製劑之製造及品質管理)
1.來自生物之原料及其應對狀況
於一實施形態中，於失能T細胞之製造步驟中，使用與表1所記載之來自生物之原料基準相符之來自生物之原料。
失能T細胞之投予係於對接受者實施來自供給者之器官移植(例如，肝臟移植)後進行。供給者器官(例如，肝臟)中亦以不去除病毒之狀態含有作為來自自體之失能T細胞之材料的來自供給者之單核球，於含有來自供給者之單核球之狀態下將供給者器官(例如，肝臟)移植至接受者。因此，認為用作來自自體之失能T細胞之材料的來自供給者之單核球不屬於來自生物之原料。
Figure 108121827-A0305-02-0047-1
貝拉西普(例如，可從Bristol-Myers Squibb、New York、NY獲得)
2.細胞製劑之製法
於一實施形態中，細胞製劑可以如下方式製造。以下所例示之各種數值等為代表例，業者可適當變更而製造細胞製劑。
1)於投予19天前，於醫療機構對供給者實施血球分離，對供給者血球分離產物照射30 Gy之放射線，消除其細胞增生能力後，向實施細胞加工之細胞培養加工設施發送。
2)收置供給者血球分離產物後，於細胞培養加工設施藉由密度梯度離心法將供給者單核球分離、回收後，分成2份冷凍，於-80±10℃下保管。
3)於投予14天前，於醫療機構對接受者實施血球分離，將接受者血球分離產物向實施細胞加工之細胞培養加工設施發送。
4)收置接受者血球分離產物後，於細胞培養加工設施藉由密度梯度離心法將接受者單核球分離、回收，與經解凍之供給者單核球以及抗CD80抗體及抗CD86抗體或CTLA4-Ig融合蛋白等抑制因子共培養。
5)於投予7天前更換培養基。將培養7天之中間製品回收，與經解凍 之供給者單核球以及抗CD80抗體及抗CD86抗體或CTLA4-Ig融合蛋白等抑制因子共培養。
6)於投予當天藉由密度梯度離心法將細胞加工物回收後洗淨，填充至生理食鹽液中。
7)發送至醫療機構，於醫療機構投予至接受者。
(製造及品質試驗流程之代表例)
[化1]
Figure 108121827-A0305-02-0049-2
3.步驟內管理試驗
於一實施形態中，於製造步驟內可實施表2所記載之步驟內管理試 驗。以下所例示之各種數值等及程序為代表例，業者可適當變更而實施步驟內管理試驗。
Figure 108121827-A0305-02-0050-3
4.標準試驗、特性解析試驗
於一實施形態中，可使用最終製品進行表3所記載之標準試驗。表3所例示之程序為代表例，業者可適當變更而實施標準試驗、特性解析試驗。例如，作為其改變例，可列舉實施例11所例示之標準。於投予誘導性抑制性T細胞時未判明結果之情形時，可參考步驟內管理試驗之結果，判斷臨床試驗製品之出貨。
又，可使用製造步驟內之細胞、最終製品進行表3所記載之特性解析試驗。
Figure 108121827-A0305-02-0050-4
上述臨床試驗製品標準試驗、特性解析試驗如本說明書所 記載，臨床試驗製品標準試驗可包括外觀、細胞數、活細胞率、細胞表面標記物(CD3、CD4、CD8、CD25、CD44、CD45RA/CD45RO)、來自製造步驟之雜質(來自供給者之細胞、培養基成分、抗CD80抗體、抗CD86抗體、細胞凍傷保護液成分、比重分離液成分)、病毒否定試驗、無菌試驗、黴漿菌否定試驗、及內毒素。作為效能試驗，可包括利用使用培養細胞之淋巴球混合試驗(MLR)之細胞激素產生或氚摻入試驗。關於細胞表型之基準值，例如，CD3陽性細胞比率代表性而言可以表中之50%以上作為基準值，或者亦可為例如30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上或該等之間之數值(可每隔1%、0.5%等進行設定)。CD3陽性細胞中之CD8陽性CD44陽性細胞比率代表性而言可以表中之10%以上作為基準值，或亦可為例如1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、7%以上、8%以上、9%以上、10%以上、11%以上、12%以上、13%以上、14%以上、15%以上等。CD3陽性細胞中之CD4陽性CD44陽性細胞比率可不設定，或亦可設定例如1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、7%以上、8%以上、9%以上、10%以上、11%以上、12%以上、13%以上、14%以上、15%以上等作為基準值。CD3陽性細胞中之CD8陽性CD45RA陰性細胞比率可不設定，或亦可設定例如1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、7%以上、8%以上、9%以上、10%以上、11%以上、12%以上、13%以上、14%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上等作為基準值。CD3陽性細胞中之CD8陽性CD45RA陰性CD45RO陽性細胞比率可不設定，或亦可設定例如1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、7% 以上、8%以上、9%以上、10%以上、11%以上、12%以上、13%以上、14%以上、15%以上等作為基準值。CD3陽性細胞中之CD4陽性CD45RA陰性CD45RO陽性細胞比率可不設定，或亦可設定例如1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、7%以上、8%以上、9%以上、10%以上、11%以上、12%以上、13%以上、14%以上、15%以上等作為基準值。CD3陽性細胞中之CD4陽性CD25細胞比率代表性而言可以表中之5%以上作為基準值，或亦可為例如1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、7%以上、8%以上、9%以上、10%以上、11%以上、12%以上、13%以上、14%以上、15%以上等。細胞數代表性而言可採用1×109個以上作為基準，或亦可為例如1×108個以上、5×108個以上、1×109個以上、2×109個以上、3×109個以上等。活細胞率代表性而言可採用70%以上作為基準，或亦可採用50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上等作為基準。
最終製品之組成
最終製品若列舉一例，則包含下述表所記載之構成物。又，關於該等之標準，業者亦可適當變更，變更組成而構成再生醫療等製品。
Figure 108121827-A0305-02-0052-5
對於標準試驗、特性解析試驗，業者可適當參考本說明書所記載之技術性事項，視需要進行變更而具體實施。
5.再生醫療等製品之投予方法
於一實施形態中，於器官移植後14天後投予一次。關於投予方法及其期間等，業者可適當參考本說明書所記載之技術性事項，視需要進行變更而具體實施。
(來自自體之控制性T細胞製造程序)
以下，對來自自體之控制性T細胞之典型之製造方法進行說明。
事前之確認
於一實施形態中，事前之確認可以如下方式進行。以下所例示之各種數值、試劑、程序等為代表例，業者可適當變更而進行事前之確認之製造。
實施供給者及患者之傳染病篩選檢查，對於供給者，確認HBs抗原、HCV抗體、HIV-1/2、HTLV-1抗體全部為陰性。
1.供給者淋巴球之分離(於無菌下進行)
於一實施形態中，供給者淋巴球之分離可以如下方式製造。以下所例示之各種數值、試劑及程序等為代表例，業者可適當變更而進行供給者淋巴球之分離。
‧藉由血球分離將供給者淋巴球採集至回收袋中，對該回收袋照射放射線。
‧將前述經放射線照射之末梢血液單核球置於添加有適量之Ficoll-Paque PREMIUM(GE Healthcare #17-5442-02)或淋巴球分離液(Nacalai Tesque#20828)等(例如，20mL)之離心管中，於22℃下以860G離心分離(將離心分離機之加速器設定為slow、制動器設定為slow)20分鐘。
‧捨棄上清液，將包含淋巴球層之細胞懸浮液轉移至其他離心管(例如，50mL離心管2根)。
‧於加入有細胞懸浮液之離心管中追加生理食鹽液(例如追加適量至總液量成為50mL為止)，利用注射器(例如，帶有18G注射針之50mL注射器)或吸管反覆抽吸排出，使其充分混合。
‧於22℃下以500G離心分離(可將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為fast)10分鐘。
‧捨棄上清液，再次追加生理食鹽液(例如追加適量至總液量成為50mL為止)，利用吸管將細胞顆粒反覆抽吸排出，使其充分混合。
‧於22℃下以500G離心分離(可將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為fast)5分鐘。
‧捨棄上清液。
‧將含有預先自供給者採集之血漿之ALyS505N-0培養液(細胞科學研究所(CSTI)1020P10)加入細胞顆粒中(例如添加適量至總液量成為31mL為止)，利用吸管反覆抽吸排出，使其充分混合。
‧利用注射器(例如，帶有18G注射針之1mL注射器)或吸管抽出適量(例如，0.3mL)，對細胞數及活細胞數進行確認。
2.供給者淋巴球之冷凍保存(於無菌下進行)
於一實施形態中，供給者淋巴球之冷凍保存可以如下方式進行。以下所例示之各種數值、試劑及程序等為代表例，業者可適當變更而進行供給者淋巴球之冷凍保存。
‧冷凍袋(例如，冷凍袋F-050 25mL冷凍袋Nipro股份有限公司89-101)
於無菌下開封，於標籤記下必要事項(日期、製造編號、供給者名)。
‧以注射器(例如，帶有18G注射針之30mL注射器)取細胞懸浮液，裝入冷凍袋中。
‧將ACD液(Terumo股份有限公司TP-A05ACD，例如相對於細胞懸浮液15mL為2mL)添加至裝有細胞懸浮液之冷凍袋中，插入至4℃下冷卻之保冷劑中，冷卻10分鐘左右。
‧使用注射器(例如，帶有18G注射針之20mL注射器)，將於4℃下冷卻之CP-1(極東製藥工業股份有限公司551-27202-4細胞凍傷保護液CP-1，例如8.5mL)歷經1分半左右之時間添加至冷凍袋中。此時，緩慢攪拌冷凍袋。
‧使用注射器，將冷凍袋及其氣口內之空氣全部抽出。
‧使用管封機將冷凍袋密封，首先於4℃下冷卻約5~10分鐘，其後於-80℃之冷凍庫中保管。
3.供給者淋巴球之解凍(於無菌下進行)
於一實施形態中，供給者淋巴球之解凍可以如下方式進行。以下所例示之各種數值、試劑及程序等為代表例，業者可適當變更而進行供給者淋巴球之解凍。
‧將保存之供給者細胞之冷凍袋於例如37℃恆溫槽中解凍。其後之操作較佳為於無菌下進行。
‧使用注射器(例如，帶有18G注射針之50mL注射器)，自經解凍之冷凍袋中抽出細胞懸浮液，轉移至離心管(例如，50mL離心管2根，每根中12.5mL)中。
‧於加入有細胞懸浮液之離心管中追加例如5%白蛋白液(日本製藥股份有限公司123146364捐血白蛋白5%靜脈注射12.5g/250mL)(例如相對 於細胞懸浮液12.5mL為37.5mL)，使其充分混合。其後，靜置約5分鐘。
‧例如，於22℃下以600G離心分離(例如，較佳為將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為slow)10分鐘。
‧平穩地捨棄上清液，於細胞顆粒中添加洗淨用之白蛋白加生理食鹽液(例如，由5%白蛋白液25mL與生理食鹽液19mL製作)等適當液體並懸浮。
‧例如，於22℃下以600G離心分離(例如，較佳為將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為slow)10分鐘。
‧平穩地捨棄上清液，於細胞顆粒中添加ALyS505N培養液(例如，相對於50mL離心管為10mL)並懸浮。
‧於裝有ALyS505N-0培養液或與其等同之液體之培養袋(例如，Nipro股份有限公司87598 Nipro培養基ALyS505NB10)中分別以例如最終濃度10μg/mL添加抗人CD80抗體(例如，m2D10.4；Cat.No.16-0809-85、eBioscience公司)與抗人CD86抗體(例如，IT2.2；Cat.No.16-0869-85、eBioscience公司)(或添加CTLA4-Ig融合蛋白(例如，貝拉西普)等抑制因子)，利用注射器(例如，帶有18G注射針之20mL注射器)將上述細胞懸浮液注入添加至該培養袋中。於一例中，培養袋中之總液量約為840mL。
4.患者淋巴球之分離~一次培養開始(於無菌下進行)
於一實施形態中，患者淋巴球之分離可以如下方式進行。以下所例示之各種數值、試劑及程序等為代表例，業者可適當變更而進行患者淋巴球之分離。
‧將從患者採集之血漿於恆溫槽中、例如56℃下加溫30分鐘而預先滅活。不立即使用者進行冷凍保存。
‧將從患者採集之末梢血液加入至裝有適量合適之介質、例如Ficoll-Paque(例如，20mL)之離心管中，例如，於22℃下以860G離心分離(例如，較佳為將離心分離機之加速器設定為slow、制動器設定為slow)20分鐘。
‧捨棄上清液，將包含淋巴球層之細胞懸浮液轉移至其他離心管(例如，50mL離心管2根)。
‧於加入有細胞懸浮液之離心管中追加生理食鹽液(例如追加適量至總液量成為50mL為止)，利用吸管反覆抽吸排出，使其充分混合。
‧例如，於22℃下以500G離心分離(可將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為fast)10分鐘。
‧捨棄上清液，再次追加生理食鹽液(例如追加適量至總液量成為50mL為止)，利用吸管將細胞顆粒反覆抽吸排出，使其充分混合。
‧例如，於22℃下以500G離心分離(可將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為fast)5分鐘。
‧捨棄上清液，於細胞顆粒中例如添加ALyS505N-0培養液(例如，10mL)並懸浮，製作細胞懸浮液(例如，追加ALyS505N-0培養液至合計達到20mL為止)。此處，抽出0.5mL左右之細胞懸浮液，確認細胞數、活細胞數及表面抗原之表現。
‧於裝有「3.供給者淋巴球之解凍」中製作之ALyS505N-0培養液中供給者細胞及抗體等抑制因子之培養袋中追加來自患者之滅活血漿。
‧利用注射器(例如，帶有18G注射針之20mL注射器)將上述來自患 者之細胞懸浮液注入添加至該培養袋中，使用管封機將培養袋密封。於一例中，培養袋中之總液量約為1000mL。
‧於37℃培養箱內培養例如1週。
5-1.培養基更換(例如，第1週，較佳為於無菌下進行)
於一實施形態中，培養基更換可以如下方式進行。以下所例示之各種數值、試劑及程序等為代表例，業者可適當變更而進行培養基更換。
‧自培養箱取出培養袋，將內容物分注於離心管(例如，225mL離心管4根)中。
‧例如，於22℃下以600G離心分離(例如，較佳為可將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為fast)10分鐘。
‧平穩地捨棄上清液，於細胞顆粒中添加例如ALyS505N-0培養液並懸浮，製作細胞懸浮液(例如，追加ALyS505N-0培養液至合計達到20mL為止)。此處，抽出0.3mL左右之細胞懸浮液，對細胞數及活細胞數進行確認。
‧例如，利用注射器(例如，帶有18G注射針之20mL注射器)將細胞懸浮液注入添加至裝有ALyS505N-0培養液之培養袋中。
‧將抗人CD80抗體(例如，2D10.4)稀釋液與抗人CD86抗體(例如，IT2.2)稀釋液分別以例如最終濃度成為10μg/mL之方式(或CTLA4-Ig融合蛋白(例如，貝拉西普)等抑制因子)利用注射器(例如，帶有18G注射針之20mL注射器)注入添加至培養袋中。
5-2.供給者淋巴球之解凍/抗原再刺激~二次培養開始(例如，第1週，於無菌下進行)
於一實施形態中，供給者淋巴球之解凍/抗原再刺激~二次培養開始 可以如下方式進行。以下所例示之各種數值、試劑及程序等為代表例，業者可適當變更而進行供給者淋巴球之解凍/抗原再刺激~二次培養開始。
‧將保存之供給者細胞之冷凍袋與來自患者之滅活血漿於例如37℃恆溫槽中解凍。其後之操作較佳為於無菌下進行。
‧使用注射器(例如，帶有18G注射針之50mL注射器)，自經解凍之冷凍袋中抽出供給者細胞懸浮液，轉移至離心管(例如，50mL離心管2根)中。
‧於加入有供給者細胞懸浮液之離心管中追加5%白蛋白液(例如，每2根50mL離心管合計約50mL)，使其充分混合。其後，靜置約5分鐘。
‧例如，於22℃下以600G離心分離(將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為slow)10分鐘。
‧平穩地捨棄上清液，於細胞顆粒中添加洗淨用之白蛋白加生理食鹽液(例如，由5%白蛋白液25mL與生理食鹽液19mL製作)並懸浮。
‧例如，於22℃下以600G離心分離(將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為slow)10分鐘。
‧平穩地捨棄上清液，於細胞顆粒中添加例如ALyS505N-0培養液(例如，相對於50mL離心管為10mL)並懸浮。
‧於裝有「3.供給者淋巴球之解凍」中製作之ALyS505N培養液中患者細胞及抗體等抑制因子之培養袋中利用注射器(例如，帶有18G注射針之20mL注射器)注入添加經解凍之來自患者之滅活血漿(例如，10mL)，進而利用注射器(例如，帶有18G注射針之20mL注射器)將上述細胞懸浮液注入添加至該培養袋中。於一例中，培養袋中之總液量約為1000mL。
‧使用管封機將培養袋密封。
‧於37℃培養箱內培養例如1週。
6.二次培養中之檢查(培養細胞抽出試驗)
於一實施形態中，二次培養中之檢查可以如下方式進行。以下所例示之各種數值、試劑及程序等為代表例，業者可適當變更而進行二次培養中之檢查。
‧代表性而言，於二次培養開始起第3天(培養總計第10天)自培養袋抽出少量之培養液，檢查黴漿菌污染等。
7.培養淋巴球之回收、填充(於無菌下進行)
於一實施形態中，培養淋巴球之回收、填充可以如下方式進行。以下所例示之各種數值、試劑及程序等為代表例，業者可適當變更而進行培養淋巴球之回收、填充。
‧例如，於自二次培養開始起第7天(培養總計第14天)自培養箱取出培養袋，將內容物分注於離心管(例如，225mL離心管4根)中。
‧例如，於22℃下以600G離心分離(可將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為fast)10分鐘。
‧平穩地捨棄上清液，於細胞顆粒中添加生理食鹽液並懸浮。
‧例如，於22℃下以600G離心分離(例如，較佳為可將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為fast)10分鐘。
‧平穩地捨棄上清液，於細胞顆粒中添加生理食鹽液(例如，10mL)並懸浮，製作細胞懸浮液。
‧將細胞懸浮液平穩地加入至裝有適量Ficoll-Paque(例如，20mL)之離心管(例如，50mL離心管)中，形成多層。
‧例如，於22℃下以860G離心分離(將離心分離機之加速器設定為 slow、制動器設定為slow)20分鐘。
‧捨棄上清液，將包含淋巴球層之細胞懸浮液轉移至其他離心管(例如，50mL離心管)中。
‧於加入有細胞懸浮液之離心管中追加生理食鹽液(例如追加適量至總液量成為50mL為止)，利用注射器(例如，帶有18G注射針之50mL注射器)反覆抽吸排出，使其充分混合。
‧例如，於22℃下以500G離心分離(可將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為fast)10分鐘。
‧將上清液保留5mL左右，其餘捨棄，利用吸管反覆抽吸排出，使其充分混合。
‧追加生理食鹽液(例如追加適量至總液量成為50mL為止)，利用注射器(例如，帶有18G注射針之50mL注射器)反覆抽吸排出，使其充分混合(a)。
‧例如，於22℃下以500G離心分離(可將離心分離機之加速器設定為fast、制動器設定為fast)5分鐘(b)。
‧將上清液保留5mL左右，其餘捨棄，利用吸管反覆抽吸排出，使其充分混合(c)。
‧將上述(a)、(b)及(c)進一步重複2次。
‧抽出適量(例如，4mL)最後之離心分離後之上清液，供於無菌檢查及黴漿菌檢查。
‧再次添加生理食鹽液並懸浮，將細胞懸浮液轉移至最終之容器(例如，100mL生理食鹽液之瓶)中。抽出適量(例如，4mL)，確認最終產物之細胞數、活細胞數、表面抗原之表現及內毒素之含量。
8.二次包裝
於一實施形態中，二次包裝可以如下方式進行。以下所例示之各種數值、試劑及程序等為代表例，業者可適當變更而進行二次包裝。
‧代表性而言，基於合適之基準(代表性而言，NUHCPC-M-12-ATREG)，對標籤輸入受驗者ID、製造編號、使用期限並印刷，將標籤貼附於容器。
‧基於合適之基準(代表性而言，NUHCPC-PMF-ATREG14)，發行「用法、用量、效能或效果以及使用上之注意或操作上之注意」。
‧將試驗物及「用法、用量、效能或效果以及使用上之注意或操作上之注意」收納於帶拉鏈塑膠袋中。
‧出貨前裝入移送容器中保管於監控單元內。
(註釋)
於本說明書中，「或者」於可採用文章中所列舉之事項之「至少一者以上」時使用。「或」亦相同。於本說明書中，於明確記載為「2個值之範圍內」之情形時，該範圍亦包含2個值自身。
本說明書中所引用之科學文獻、專利、專利申請案等參考文獻係以與分別具體地記載者相同之程度將其整體作為參考援引至本說明書中。
以上，為了使本發明容易理解而示出較佳之實施形態進行說明。以下，基於實施例對本發明進行說明，但上述說明及以下之實施例係僅以例示為目的而提供，並非以限定本發明之目的提供。因此，本發明之範圍並不限定於本說明書中具體記載之實施形態或實施例，而僅由申請專利之範圍所限定。
實施例
以下，基於實施例更具體地說明本發明。但本發明並不限定於該等實施例。再者，於本說明書整體中，所引用之全部文獻係藉由參照直接併入至本案中。
(實施例1：免疫耐受誘導實驗)
於本實施例中，對為了發揮抑制作用，為了誘發免疫耐受而投予之細胞製劑是否必須與應反應之應答者細胞直接接觸進行試驗。以下說明方法。
(非接觸式混合培養)
(材料及方法)
(失能細胞之製備)
依照已記載於文獻之方法進行圖1所示之實驗(1-4)。概括而言，使用Promo cell公司製造之淋巴細胞分離培養基(Cat.No.C-44010)或Ficoll-Paque PREMIUM(GE Healthcare #17-5442-02)或淋巴球分離液(Nacalai Tesque#20828)等，自4位志願者(以2人作為刺激者、2人作為應答者)之人末梢血液中分離單核細胞(PBMC)，以成為4×106細胞/ml之方式利用添加有2%人AB型血清(混合血漿)之Biowest公司製造之ALyS505N-0培養基(細胞科學研究所(CSTI)1020P10)進行調整。對刺激者PBMC照射放射線(γ射線)30 Gy，與應答者PBMC以1：1混合。於上述混合之PBMC中，以最終濃度分別成為10μg/mL之方式添加eBioscience公司製造之小鼠抗人CD80抗體(2D10.4)(Cat.No.16-0809-85)與小鼠抗人CD86抗體(IT2.2)(Cat.No.16-0869-85)，利用12孔板(Corning，#3513)(1~2.5ml)、6孔板(Corning，Cat.No.3516)(3~6ml)、6cm培養皿(Greiner CELLSTAR(註冊商標)dish，Cat.No.628160)(3~6ml)、或10cm培養皿(Corning，Cat.No.430167)(10~15ml)，於37℃、5%CO2培養箱中開始培養(day0)。於培養開始後第5天(day5)藉由離心去除培養液後，於與開始培養時相同之條件下添加含有放射線照射過之刺激者PBMC與抗CD80抗體/抗CD86抗體之培養液。2天後(day7)將細胞回收，藉由離心洗脫培養液，獲得失能細胞。
(使用具有細胞非通過膜(Millicell(註冊商標))之插入式細胞培養板(Cat.N：PSHT004R1)之培養(雙室培養))
將所獲得之失能細胞或應答者PBMC與經放射線照射之刺激者PMBC調整為1：1之比率，於具有通稱為Transwell膜之體液性因子可透過但細胞無法透過之膜之上段之孔中進行培養。於該下段，將新採集之應答者PBMC及放射線照射過之刺激者PBMC以分別2×106細胞/mL混合為1：1(最終200μL/孔，每4孔一組)。將該等上段、下段之孔組裝於96孔板(Corning公司製造，Cat.No.3381)上，於37℃、5%CO2培養箱中培養。
於培養開始第4天添加3H-胸苷(10μL)，於培養開始第5天(添加3H-胸苷之16~20小時後)藉由細胞收集器(Molecular Devices)回收培養細胞，藉由閃爍計數器測定3H-胸苷摻入量。
(結果)
將結果示於圖1右圖上。
由於經由Transwell膜將上段與下段分離，故而使用其之培養中細胞間之接觸被限制於各段之孔內，但所產生之體液性因子可於孔間來往。於將失能細胞加入與刺激者細胞/應答者細胞同段之情形時(右端)，抑制左端可見之刺激者細胞刺激後之應答者細胞之增生反應。與此相對， 於在上段加入失能細胞與刺激者細胞之情形時，該抑制效果大幅減弱(右起第2個)，提示免疫抑制性之細胞激素(IL-10等)之參與較少。又，於在上段加入新鮮之應答者細胞與刺激者細胞之情形時(左起第2個)，可見若干增生之增強，推測其為如誘導藉由上段之反應產生之細胞增生之IL-2等體液性因子之效果。該結果表明，失能細胞為了發揮免疫抑制功能，除了與刺激者細胞接觸以外，亦必須與初始之應答者細胞直接接觸，又，表明為了發揮抑制功能，必需用以誘導失能之抗CD80/86抗體存在下之抗原刺激培養。
(實施例2：呈現小鼠心臟移植中之離體誘導性失能細胞之過繼移入之效果與細胞消失後免疫耐受亦持續之小鼠實驗)
於本實施例中，證實使用小鼠模型，即便來自細胞製劑之細胞自接受者消失免疫耐受亦持續。以下表示其程序。
(材料及方法)
以下表示本實施例所使用之方法及所使用之材料。
依照已記載於文獻之方法進行實驗(5-7)。概括而言，自以表現GFP之方式經基因改型之來自C57BL6(以下B6)之小鼠及BALB/c小鼠摘下脾臟，將紅血球溶血而獲得脾臟細胞(淋巴球)後，以成為4×106細胞/ml之方式，藉由含有10%滅活胎牛血清(FCS)(SIGMA # 172012-500ML Lot 11D257或biosera #FB-1380/500 Lot.015BS482)之RPMI1640培養基(Sigma；R8758-500MK)進行調整。對成為刺激者之BALB/c脾臟細胞照射放射線(γ射線)30 Gy後，以1：1與B6脾臟細胞混合，以最終濃度分別成為10μg/mL之方式添加eBioscience公司製造之倉鼠抗小鼠CD80抗體(16-10A1)(Cat.No.16-0801-82)與大鼠抗小鼠CD86抗體(GL1)(Cat.No.14- 0862-82)，利用12孔板(Corning，#3513)(1~2.5ml)、6孔板(Corning，Cat.No.3516)(3~6ml)、6cm培養皿(Greiner CELLSTAR(註冊商標)dish，Cat.No.628160)(3~6ml)或10cm培養皿(Corning，Cat.No.430167)(10~15ml)於37℃下在5%CO2培養箱中培養14天。於開始培養後第7天藉由離心去除培養液後，重新於與培養開始時相同之條件下添加含有BALB/c放射線照射脾臟細胞與抗CD80抗體/抗CD86抗體之培養液。14天後將細胞回收而獲得失能細胞。
自尾靜脈對2 Gy之放射線照射3天後移植BALB/c小鼠之心臟之野生型B6小鼠各投予6×106個、4×106個、或2×106個來自該GFP表現B6小鼠之失能細胞，觀察心臟之排斥。處死移植後經過3個月以上(達成免疫耐受)之移入6×106個失能細胞之接受者小鼠，獲得末梢血液單核球(PBMC)，且自摘下之脾臟、淋巴結、移植之心臟獲得淋巴球，藉由GFP之螢光，使用流式細胞儀研究所移入之失能細胞之存在。作為對照，使用移植同系之B6小鼠之心臟且移入6×106個失能細胞之B6接受者小鼠進行同樣之解析。又，於移植BALB/c小鼠心臟之3天後、7天後、28天後、50天後、100天後，處死移入6×106個失能細胞之心臟移植接受者小鼠，獲得末梢血液單核球(PBMC)，且自摘下之脾臟、淋巴結、移植之心臟獲得淋巴球，自該等提取基因組基因後，藉由以PCR擴增GFP基因之感度更高之方法研究所移入之失能細胞之存在。
(結果)
將結果示於圖2及圖3。如圖2a所示，藉由失能細胞之移入，所移植之心臟之植活率細胞數依賴性地改善，藉由6×106個失能細胞之移入，全部小鼠可觀察到100天以上之移植心臟之植活，即可見對移植之心臟之免 疫耐受之誘導。然而，如圖2b所示，所移入之失能細胞不僅於末梢血液、淋巴結、脾臟中，而且於所移植之心臟內，藉由螢光表現亦未檢測到。進而，如圖3a所示，藉由即便0.1%(1/1000稀釋GFP小鼠基因組DNA之存在：區帶4)亦可檢測之將基因組基因中之GFP基因利用PCR擴增的感度更高之檢測方法，如圖3b所示，GFP基因之表現於移植後第3天前於末梢血液、脾臟、腸系膜淋巴結、移植之心臟內均可確認到，但於移植後第7天之後，於全部組織中均未檢測到該基因之表現。該情況提示，藉由失能細胞之移入，雖然誘導100天以上之供給者特異性之免疫抑制帶來之移植心臟之植活(免疫耐受)，但所移入之細胞於1週以內在接受者體內消失。
(實施例3：利用失能細胞之免疫抑制對抗原具有特異性)
於本實施例中，證實失能細胞具有特異性，不會抑制對來自第三方之抗原之排斥。
(材料及方法)
藉由與實施例2相同之方法，將自野生型B6小鼠(H-2b)獲得之脾臟細胞於抗CD80/86抗體存在下以來自BALB/c小鼠(H-2b)之脾臟細胞刺激而獲得失能細胞。自尾靜脈對2 Gy之放射線照射3天後移植BALB/c小鼠或CBA小鼠(H-2k)之心臟之野生型B6小鼠投予5×106個該失能細胞，觀察心臟之排斥。
(結果)
如圖4所示，於抗CD80/86抗體存在下經Balb/C小鼠脾臟細胞刺激之來自B6小鼠之失能細胞向B6小鼠之移入100%抑制所移植之BALB/c小鼠之心臟之排斥，100天後心臟亦植活。與此相對，作為第三方之CBA小鼠之心臟於移植後迅速引起排斥反應，約50天內被100%排斥。以上表明， 於抗CD80/86抗體存在下與抗原反應之來自接受者之淋巴球對被刺激之抗原特異性地具有免疫反應之抑制功能。
(實施例4：呈現感染性免疫耐受之實驗)
於本實施例中，證實產生感染性免疫耐受。
(材料及方法)
藉由與實施例2同樣之方法獲得失能細胞，進行圖5所示之實驗。概括而言，將自以全部細胞表現螢光色素GFP之方式進行基因改型之B6小鼠獲得之脾臟細胞於抗CD80/86抗體存在下以來自BALB/c小鼠之經放射線照射之脾臟細胞刺激而獲得失能細胞。自尾靜脈對2 Gy之放射線照射4天後移植BALB/c小鼠之心臟之野生型B6小鼠投予5×106個該失能細胞。於自認為誘導免疫耐受之心臟移植起經過100天以上後，處死接受者小鼠，摘下脾臟後，將紅血球溶血而獲得脾臟細胞。使用CD8-T細胞隔離套組(BioLegend 480035)、或CD4-T細胞隔離套組(BioLegend 480033)，自該失能細胞分離來自接受者小鼠之GFP陰性CD8陽性或GFP陰性CD4陽性細胞。同樣地，亦從自B6小鼠新獲得之新鮮之(初始)脾臟細胞同樣地採集CD8陽性或CD4陽性細胞。自尾靜脈對2 Gy之放射線照射4天後移植BALB/c小鼠之心臟之野生型B6小鼠投予4×106個該等單離之細胞，觀察心臟之排斥。
(結果)
將結果示於圖6。
自藉由失能細胞之移入誘導對所移植之心臟之免疫耐受的小鼠獲得之CD4陽性T細胞或CD8陽性T細胞之移入於60%左右之接受者小鼠中，誘導了對所移植之心臟之免疫耐受。與此相對，相同數量之初始之 CD8陽性T細胞、CD4陽性T細胞之移入無法誘導免疫耐受，所移植之心臟於全部例中被排斥。以上結果表明，藉由體外之培養中獲得之失能細胞之移入，於接受者小鼠之體內可誘導失能之細胞被新誘導，即誘導了感染性免疫耐受。又，如圖1所示，推測藉由增加移入細胞數，可提高免疫耐受之誘導率。
(實施例5：人體外模型中之異體特異性抑制性失能細胞之繼代移入)
於本實施例中，證實人體外模型中之異體特異性抑制性失能細胞之繼代移入亦有效果。
(材料及方法)
藉由與實施例1相同之方法，獲得來自人之失能細胞(1-4)。概括而言，使用Promo cell公司製造之淋巴細胞分離培養基(Cat.No.C-44010)，自4位志願者(以2人作為刺激者、2人作為應答者)之人末梢血液中分離單核細胞(PBMC)，以成為4×106細胞/mL之方式利用添加有2%人AB型血清(混合血漿)之Biowest公司製造之ALyS505N-0培養基進行調整。對刺激者PBMC照射放射線30 Gy，與應答者PBMC以1：1混合。以最終濃度分別成為10μg/mL之方式於上述所混合之PBMC中添加eBioscience公司製造之小鼠抗人CD80抗體(Cat.No.16-0809-85)與小鼠抗人CD86抗體(Cat.No.16-0869-85)，利用12孔板(Corning，#3513)、6孔板(Corning，Cat.No.3516)、6cm培養皿(Greiner CELLSTAR(註冊商標)dish，Cat.No.628160)或10cm培養皿(Greiner CELLSTAR(註冊商標)dish，Cat.No.664 160-013)，於37℃、5%CO2培養箱中開始培養(day0)。於培養開始後第5天(day5)藉由離心去除培養液後，於與開始培 養時相同之條件下添加含有放射線照射過之刺激者PBMC與抗CD80抗體/抗CD86抗體之培養液。2天後(day7)將細胞回收，藉由離心洗脫培養液，獲得失能細胞(1st)，以螢光色素CFSE標記該細胞。
將使用CFSE細胞增生套組(cell proliferation kit)(Invitrogen C34554)以CFSE標記之細胞以與新採集之同一應答者PBMC之比率成為1：1之方式混合後，添加至經放射線照射之同一刺激者PBMC與應答者細胞之1：1之混合培養體系中(day7)。於該培養第4天(day11)再次補充放射線照射過之刺激者PBMC。於該培養第7天(day14)，使用JSAN(Bay bioscience公司)藉由分選僅回收CFSE陰性之來自應答者之細胞(2nd失能細胞)。將其以CFSE標記後，以與新採集之同一應答者PBMC之比率成為1：1之方式混合，添加至經放射線照射之同一刺激者PBMC與應答者細胞之1：1之混合培養體系中(day14)。於該培養第4天(day18)再次補充放射線照射過之刺激者PBMC。於該培養第7天(day21)，使用JSAN藉由分選而回收CFSE陰性之來自應答者之細胞(3rd失能細胞)。
(免疫抑制功能之評價)
於各混合培養體系中，於培養後第2天，藉由分選將CFSE陰性之應答者CD4陽性細胞單離，藉由定量即時PCR(qPCR)(TaqManTM)法解析IL-2、IL-10之表現mRNA水準。
又，將1st失能細胞與2nd失能細胞於各自之誘導最終日回收，以與應答者PBMC之比率成為1：1至1：0.125之方式稀釋，添加至以約1：1之細胞數含有應答者PBMC與新採集之來自同一刺激者之照射過放射線(γ射線)30 Gy之PBMC的96孔板(Corning公司製造，Cat.No.3799) 中之混合培養體系(各2×105/200μL/孔，每4孔一組)中，於37℃、5%CO2培養箱中培養。於培養開始第4天添加3H-胸苷(10μL)，於培養開始第5天(添加3H-胸苷之16~20小時後)藉由細胞收集器(Molecular Devices)回收培養細胞，藉由閃爍計數器測定3H-胸苷摻入量。
(結果)
於圖7所示之該實驗中，推測於體外發生如圖8a之模式圖所示之反應，認為藉由該機制可對失能細胞存在下反應之初始細胞賦予免疫抑制功能。
圖8b表示3H-胸苷摻入量之CPM值，顯示1st失能細胞與2nd失能細胞發揮出免疫抑制功能。於圖8c中，顯示1st失能細胞、2nd失能細胞、3rd失能細胞均抑制自應答者CD4陽性細胞產生誘導細胞增生之細胞激素IL-2，另一方面，誘導產生抑制免疫反應之代表性之細胞激素IL-10，說明1st失能細胞、2nd失能細胞、3rd失能細胞均具有免疫抑制作用。以上結果表明，利用失能細胞之免疫抑制功能由在該失能細胞之存在下對相同抗原刺激之反應被抑制之初始細胞承繼，即人免疫細胞亦繼承感染性之免疫抑制功能。
(實施例6：CD8陽性細胞之反應性及CD4陽性T細胞之必要性之確認)
於本實施例中，確認於小鼠中，於移植後後期(80天之後)，CD8陽性細胞之反應性喪失，即便去除CD4陽性T細胞亦誘導免疫耐受。
(材料及方法)
以下說明本實施例中之程序及所使用之材料。
藉由與實施例2相同之方法，將自野生型B6小鼠獲得之脾 臟細胞於抗CD80/86抗體存在下以BALB/c細胞刺激而獲得失能細胞。自尾靜脈對2 Gy之放射線照射3天後移植BALB/c小鼠之心臟之野生型B6小鼠投予5×106個該失能細胞。於心臟移植後3天~24天、25天~42天、80天~100天之間，為了去除包含regT細胞之CD4陽性T細胞，每隔3天於腹腔內投予各200μg研究室所製作之抗小鼠CD4抗體(GK1.5)，觀察所移植之心臟之排斥。
(結果)
將結果示於圖9。於在心臟移植後早期(3~24天)或中期(25~42天)利用抗CD4抗體去除包含regT細胞之CD4陽性細胞之情形時，可觀察到發生移植之心臟之排斥之小鼠。與此相對，於在後期(80~100天)去除包含regT細胞之CD4陽性細胞之情形時，全部小鼠均未見移植之心臟之排斥。即，約42天後之前免疫耐受需要包含regT細胞之CD4陽性T細胞，消耗完該細胞後，誘導CD8陽性T細胞導致之移植之心臟之排斥。但於80天之後，無需包含regT細胞之CD4陽性T細胞，提示CD8陽性細胞之反應性本身消失。即表明，接受細胞治療之接受者即便最終(80天之後)不存在免疫抑制性之細胞，亦誘導免疫耐受。
(實施例7：對供給者之CD8陽性T細胞之反應)
於本實施例中，確認對供給者之CD8陽性T細胞之反應。
(材料及方法)
藉由與實施例2相同之方法，將自野生型B6小鼠獲得之脾臟細胞於抗CD80/86抗體存在下以BALB/c細胞刺激而獲得失能細胞。自尾靜脈對2 Gy之放射線照射3天後移植BALB/c小鼠之心臟之野生型B6小鼠投予5×106個該失能細胞。自未見排斥反應而移植之心臟植活且經過100天以 上之免疫耐受誘導小鼠與初始小鼠獲得脾臟細胞，使用CFSE細胞增生套組(cell proliferation kit)(Invitrogen C34554)以CSFE標記(圖10a)。利用12孔板(Corning公司製造，Cat.No.3513)或24孔板(corningCat.No3526)，以2×106細胞/mL將經CSFE標記之該細胞與來自BALB/c之放射線照射脾臟細胞以1：1混合，進行培養，藉由流式細胞儀(BD verse)研究培養第5天之CD8陽性T細胞之CSFE之表現(圖10b)。
進而，使免疫耐受誘導小鼠(藉由投予4×106個失能細胞誘導免疫耐受之小鼠)、排斥小鼠(藉由2×106個失能細胞之不充分之投予而可見排斥反應之小鼠)、無移植之野生型小鼠之脾臟細胞與PE螢光標記抗小鼠CD8抗體(53-6.7；eBioscience、#12-0081-85)反應後，使用抗PE磁珠(Miltenyi Biotec#1300-10-639)，藉由auto-MACS(Miltenyi Biotec)將CD8陽性細胞分離。於96孔板(Corning公司製造，Cat.No.3799)上將該細胞與來自B6及BALB/c小鼠之放射線照射脾臟細胞以1×106細胞/mL、1：1混合，進行培養(培養體積為200μL)，於培養開始第4天添加3H-胸苷(10μL)，於培養開始第5天(添加3H-胸苷之16~20小時後)藉由細胞收集器(Molecular Devices)回收培養細胞，利用閃爍計數器測定3H-胸苷摻入量。作為陽性對照，亦進行誘導利用抗CD3抗體(eBioscience #MA5-17622)與抗CD28抗體(eBioscience#16-0281-82)之刺激(將各10μg直接添加於培養系或預覆於培養板)後之全CD8陽性T細胞之增生的實驗，藉由與其比較(%)研究增生能力之降低(圖10c)。
(結果)
將結果示於圖10。
如圖10b所示，初始之CD8陽性T細胞因供給者細胞之刺激 而分裂(增生)，由此較多細胞中CSFE之表現水準降低(右)，但僅初始細胞時不增生，因此不存在CSFE之螢光水準變低之細胞(左)。與此相對，誘發免疫耐受之小鼠之CD8陽性T細胞即便接受供給者細胞之刺激，亦幾乎不發生分裂(增生)反應，因此CSFE之表現降低之細胞較少(中)。即，原本單獨之CD8陽性細胞會與供給者細胞反應，但經誘導免疫耐受之小鼠之CD8陽性細胞單獨時失去反應性。即，誘導了不依賴抑制性細胞之存在之CD8陽性T細胞自身之免疫耐受(不反應性)。
又，如圖10c所示，經誘導免疫耐受之小鼠之CD8陽性T細胞與初始小鼠之CD8陽性T細胞或可見對所移植之心臟之排斥反應的小鼠之CD8陽性T細胞相比，與抗CD3/抗CD28抗體刺激相比之對供給者刺激之增生反應降低。表明全CD8陽性T細胞中，供給者抗原特異性地反應而增生之細胞減少，表現出於誘導失能之小鼠中對供給者抗原特異性之T細胞特異性地誘導純系失能或純系去除之可能性。
如以上所述，可認為作為細胞治療而移入之細胞於1週內消失之結果、及藉由表現出感染性免疫耐受之經誘導免疫耐受之小鼠之細胞亦可誘導免疫耐受之實驗結果，證實藉由本發明可誘發感染性免疫耐受。
根據以上結果，得到以下結論。
1.本發明之失能細胞藉由與接受者之初始細胞接觸而發揮出免疫抑制功能。
2.無法檢測出所移入之抑制性失能T細胞。
3.藉由所移入之抑制性失能細胞，於接受者體內可誘導新的具有免疫抑制功能之細胞。
4.最終供給者抗原特異性CD8陽性純系之反應性顯著降低。表明誘導純系失能或純系去除之可能性。
因此，提示所移入之供給者特異性失能細胞雖然於早期自接受者體內消失，但消失後亦繼續於接受者體內誘導新供給者特異性之免疫抑制細胞，最終被認為負責移植排斥之中心作用之供給者特異性之CD8陽性T細胞自身喪失其反應性。
因此，根據本實施例之結果，可理解對於使用本發明之治療之管理而言，有用的是無法檢測出所移入之抑制性失能T細胞、及/或於接受者體內檢測出誘導新的具有免疫抑制功能之細胞。進而，可理解藉由檢測供給者抗原特異性CD8陽性純系，可用於管理治療是否良好。
(實施例8：過敏性肺炎(哮喘)模型中之免疫耐受)
於本實施例中，證實過敏性肺炎模型(哮喘)中是否產生免疫耐受。
(材料及方法)
如圖11所示，使用已記載於文獻中之過敏性肺炎(哮喘)模型進行實驗(8)。
(OVA特異性失能細胞之取得)
將OVA(Sigma-Aldrich #O1641或MBL Life Science TS-5001-P等)100μg與抗小鼠CD80/86抗體各250μg同時投予至腹腔內，5天後處死OVA致敏之B6小鼠，摘下脾臟，藉由溶血而獲得脾臟細胞。以成為4×106細胞/mL之方式利用包含10%FCS之RPMI1640培養基調整該脾臟細胞，於其中以100μg/mL添加OVA，以最終濃度分別成為10μg/mL之方式添加CD80/86抗體。將該脾臟細胞懸浮物於37℃下於5%CO2培養箱中培養7天，獲得OVA特異性失能細胞。
(過敏(鼻炎)模型中之抑制功能評價)
作為過敏性肺炎(哮喘)模型，使用以下模型：於14日、17天、20天對在0天及7天對腹腔內投予含有OVA 100μg與明礬佐劑之乳液而OVA致敏之小鼠滴鼻投予含有OVA 140μg之70μL之PBS。於第14天自尾靜脈投予1×107個經誘導之失能細胞，於第24天藉由使用1ml之生理鹽水之氣管洗淨將支氣管洗淨液(BAL：Bronchoalveolar Lavage)回收，測定滲出至其中之白血球數(CD45陽性細胞)與嗜酸性球數(以CD45陽性CD11b陽性SiglecF陽性細胞之CD45陽性細胞中之比率而算出)。並且藉由ELISA測定BAL中之IL-4(eBioscience #88-704-88)。
(結果)
將結果示於圖12。圖12a表示支氣管滲出液(BAL)中所含之白血球數，圖12b表示BAL中所含之嗜酸性球數。藉由失能細胞之移入，滲出之白血球數及嗜酸性球減少。進而，如圖12c所示，BAL中所含之認為與過敏反應相關之IL-4亦減少。由此表明，利用OVA之過敏性肺炎(哮喘)模型中由抗CD80/86抗體與OVA之共培養誘導之失能細胞之移入誘導免疫耐受，減弱過敏反應。
(實施例9：食品過敏模型中之免疫耐受誘發)
於本實施例中，研究食品過敏模型中之免疫耐受誘發。
以下詳細說明。
(材料及方法)
如圖13所示，使用已記載於文獻中之食品過敏模型進行實驗(9)。概括而言，於第0天及第14天對腹腔內投予含有OVA 100μg與明礬佐劑(Thermo Fisher#77161)之乳液，自第28天起每隔2~3天對由此OVA致敏 之小鼠經口投予1次OVA 50mg，投予7次，於第14天自尾靜脈對由此誘導之食物過敏模型投予5×106個藉由與實施例8相同之方法獲得之失能細胞。於36天後處死小鼠，其後採集腸道，藉由使用生物素標記抗FoxP3抗體(eBioscience #13-5773-829)、Alexa594標記抗生蛋白鏈菌素(Molecular Probes #S11227)及FITC標記抗CD4抗體(RM4-5,Molecular Probes #553047)之免疫染色將腸道中存在之regT細胞染色，藉由HE染色將腸道中存在之嗜酸性球(曙紅強染色細胞)染色。對於CD4陽性Foxp3陽性細胞密度，藉由螢光顯微鏡Axioplan 2 imaging(Zeiss)，利用CCD攝影機AxioCam HRc(Zeiss)獲得螢光免疫染色圖像後，使用圖像解析軟體KS400(Zeiss)對存在於與測定對象區域面積之測定相同區域之陽性細胞進行計數，算出陽性細胞數/mm2。對於嗜酸性球密度，藉由光學顯微鏡Axioskop 2 plus(Zeiss)，利用CCD攝影機AxioCam MRc(Zeiss)獲得HE(蘇木精曙紅)染色圖像後，使用圖像解析軟體KS400(Zeiss)對存在於與測定對象區域面積之測定相同區域之曙紅強陽性嗜酸性球進行計數，算出陽性細胞數/mm2
(結果)
將結果示於圖14及15。圖14表示典型之FoxP3/CD4之免疫染色之結果。過敏發病小鼠為小鼠#11、#12(各腸道之不同部位之圖像3幅)，移入有失能細胞之小鼠為小鼠#21、#22(各腸道之不同部位之圖像3幅)，無處置之正常小鼠為小鼠#31、#32(各1幅)。圖15a表示各小鼠之典型之HE染色之照片各1幅。圖15b係將圖14所示之圖像之解析結果數值化，並以圖表表示每1mm2之regT細胞之個數，圖15c係將圖15a所示之圖像之解析結果數值化，並以圖表表示每1mm2之嗜酸性球之個數。
如圖15b所示，關於regT細胞之浸潤，失能細胞投予組中與過敏發病組相比有所增加，與正常小鼠相比更多地存在於腸道壁內。與該情況一致，如圖15c所示，認為於過敏時較多之嗜酸性球數因失能細胞之移入而減少至與正常小鼠相同水準。以上結果證實，於食品過敏中藉由失能細胞之移入亦可誘導免疫耐受，其結果為，誘導嗜酸性球之浸潤之減少及regT之浸潤，而緩和症狀。
(實施例10：利用iPS細胞之免疫耐受誘發)
於本實施例中，進行證實使用本發明之失能細胞是否可治癒使用iPS細胞及由其分化之細胞、組織之移植實驗中產生之嚴重之免疫排斥反應的實驗。以如下方式誘發免疫耐受。以下進行說明。
(材料及方法)
(由iPS細胞之神經元分化~免疫耐受誘發實驗)
依照已記載於文獻(10)之方法，使iPS細胞分化為神經細胞。對該神經細胞照射放射線(γ射線)30 Gy，用作刺激者細胞。應答者細胞使用自MHC不同之志願者之人末梢血液獲得之單核細胞(PBMC)，以刺激者細胞與應答者細胞分別成為2×106細胞/mL之方式利用添加有2%人AB型血清(混合血漿)之Biowest公司製造之ALyS505N-0培養基進行調整，與實施例1同樣地，於抗人CD80抗體與抗人CD86抗體各10μg/mL存在下，利用12孔板(Corning公司製造，Cat.No.3513)於37℃、5%CO2培養箱中培養7天。於7天後將細胞回收，藉由離心洗脫培養液，獲得失能細胞。
(免疫抑制功能之評價)
以與新採集之同一志願者之PBMC之比率成為1/2至1/16之方式將藉由與來自iPS細胞之神經細胞(刺激者細胞)之共培養獲得之失能細胞稀釋 後，添加至以約1：1之細胞數含有來自同一iPS細胞之經照射放射線(γ射線)30 Gy之神經細胞與新採集之同一志願者之PBMC之96孔板(Corning公司製造，Cat.No.3799)中的混合培養體系(各2×105細胞/200μL/孔，每4孔一組)中，於37℃、5%CO2培養箱中培養。於培養開始第4天添加3H-胸苷(10μL)，於培養開始第5天(添加3H-胸苷之16~20小時後)藉由細胞收集器(Molecular Devices)回收培養細胞，藉由閃爍計數器測定3H-胸苷摻入量。
(結果)
如圖16所示，自iPS細胞分化之神經細胞刺激MHC不一致之志願者之PBMC而誘導增生。表明藉由抗CD80/86抗體與自iPS細胞分化之神經細胞之共培養誘導之失能細胞於體外抑制與該自iPS細胞分化之神經細胞反應而引起之淋巴球之增生反應。由此證實，本發明可減弱使用來自iPS細胞之細胞或組織之移植中產生之免疫排斥反應。
(實施例11：使用各種抑制因子之免疫耐受之誘發)
於本實施例中，表明即便使用各種抑制因子亦可誘發免疫耐受。
(失能細胞之生成)
基本上依照實施例1所記載之方法及已記載於文獻之方法進行實驗(1~3)。接受者PBMC及供給者PBMC分別使用自人末梢血液新鮮分離者，或將-80℃下冷凍保存者急速解凍而使用，該等細胞均藉由包含自體血漿或10%滅活胎牛血清(FCS)(SIGMA # 172012-500ML Lot 11D257或biosera #FB-1380/500 Lot.015BS482)之RPMI1640培養基(Sigma；R8758-500MK)調整為4×106細胞/mL。預先對供給者PBMC照射20 Gy放射線。將該等接受者PBMC與供給者PBMC以1：1混合，於該混合物中添 加抑制因子(例如，若為抗CD80抗體/抗CD86抗體，則最終濃度分別為10μg/ml，若為貝拉西普(或阿巴西普)，則最終濃度為10μg/ml~40μg/ml)。培養係利用6cm培養皿(Greiner CELLSTAR(註冊商標)dish，Cat.No.628160)(培養體積3~6mL)或10cm培養皿(Corning，Cat.No.430167)(培養體積10~15mL)於37℃下在5%CO2培養箱中進行7天(開始培養時之細胞密度為4×106細胞/mL)。
自培養開始起第7天，藉由離心而將經培養之接受者PBMC回收，利用上述培養基調整為4×106細胞/mL。於該經培養之接受者PBMC中，以細胞數比成為2：1之方式添加新製備之經照射之供給者PBMC，進而亦添加抑制因子(例如，若為抗CD80抗體/抗CD86抗體，則最終濃度分別為5μg/ml~10μg/ml，若為貝拉西普(或阿巴西普)，則最終濃度為10μg/ml~40μg/ml)。培養係於與上述相同之條件下進行7天(細胞密度：4×106細胞/mL)。
(免疫反應抑制功能之評價)
於自培養開始起算第14天藉由離心回收誘導細胞，基本上依照已記載於文獻之方法進行淋巴球混合試驗(3)。將細胞懸浮物於37℃下於5%CO2培養箱中共培養。於共培養開始第4天添加3H-胸苷(10μl)，於共培養開始第5天(添加3H-胸苷之16~20小時後)去除培養液中之3H-胸苷，測定3H-胸苷摻入量，可確認免疫反應抑制功能。
(實施例12：細胞製劑之品質管理)
關於細胞製劑之製法，參照上述實施例1~10中之記載。對依照實施例製造之細胞製劑，以如下方式進行品質管理。
應滿足之品質標準之代表例如以下所述。
Figure 108121827-A0305-02-0081-6
細胞製劑之品質管理試驗
為了藉由本說明書所記載之方法研究例如依照實施例1~10之記載所生成之失能細胞是否符合最終製品之品質標準，而實施以下之試驗。
‧外觀
對於懸浮於生理食鹽液中之失能細胞，藉由目視研究外觀。符合品質標準之懸浮液應包含微黃白色~淡黃色之細胞。
‧細胞表型及失能細胞之純度
為了針對各表型而藉由流式細胞儀研究失能細胞，例如使用以下之抗體，藉由多重染色進行解析：
CD3：FITC螢光標記抗人CD3抗體(UCHT1；eBioscience #11-0038-42)或太平藍(Pacific Blue)螢光標記抗人CD3抗體(UCHT1；Invitrogen #CD0328)
CD4：PE螢光標記抗人CD4抗體(RPA-T4；eBioscience #25-0049-42)
CD8：APC螢光標記抗人CD8抗體(RPA-T8；eBioscience #17-0088-42)
CD25：PerCP(peridinin-chlorophyll-protein，多甲藻葉綠素蛋白)螢光標記抗人CD25抗體(MEM-181；eBioscience #A15802)
CD44：PE-Cy7螢光標記抗人CD44抗體(IM7；eBioscience #25-0441-82)
CD45：亮紫(Brilliant Violet)螢光標記抗人CD45抗體(HI30；BioLegend #304032)
CD45RA：FITC螢光標記抗CD45RA抗體(ALB11；Beckman Coulter A07786)或PE螢光標記抗CD45RA抗體(ALB11；Beckman Coulter IM1834U)
CD45RO：ECD(phycoerythrin-eexas red，藻紅素德州紅)螢光標記抗CD45RO抗體(UCHL1；Beckman Coulter IM2712U)或PE螢光標記抗CD45RO抗體(UCHL1；Beckman Coulter A07787)或APC螢光標記抗CD45RO抗體(UCHL1；Bay biosciences 20-0457)
(程序)
CD3陽性細胞比率、活細胞中之CD45陽性細胞比率、CD3陽性細胞中之CD8陽性CD44陽性細胞比率、CD3陽性細胞中之CD4陽性CD44陽性細胞比率、CD3陽性細胞中之CD8陽性CD45RA陰性細胞比率、CD3陽性細胞中之CD8陽性CD45RA陰性CD45RO陽性細胞比率、CD3陽性細胞中之CD4陽性CD45RA陰性CD45RO陽性細胞比率及CD3陽性細胞中之CD4 陽性CD25陽性細胞比率
使懸浮於生理食鹽液中之失能細胞與上述抗體反應後，使用Zombie NIR Fixable Viability Kit(BioLgened #423106)將死細胞染色。對於該經多重螢光染色之細胞，於FACS Verse(BD Bioscience社)中，確定全部活細胞中之CD3陽性細胞之比率。
符合品質標準之失能細胞應為50%以上之細胞為CD3陽性。同時，基於螢光，確定活細胞中之CD45陽性細胞之比率、存活之全部CD3陽性細胞中之CD8陽性CD44陽性細胞之比率、CD4陽性CD44陽性細胞之比率、CD8陽性CD45RA陰性細胞之比率、CD8陽性CD45RA陰性CD45RO陽性細胞之比率、CD4陽性CD45RA陰性CD45RO陽性細胞之比率、CD4陽性CD25陽性細胞之比率。
符合品質標準之失能細胞應為活細胞之95%以上之細胞為CD45陽性，且不以顯著量含有紅血球及血小板等雜質。進而，符合品質標準之失能細胞係CD3陽性細胞集群中5%以上為CD8陽性CD44陽性、5%以上為CD4陽性CD44陽性、5%以上為CD8陽性CD45RA陰性、5%以上為CD8陽性CD45RA陰性CD45RO陽性、5%以上為CD4陽性CD45RA陰性CD45RO陽性、且5%以上為CD4陽性CD25陽性之細胞。
‧安全性
基本上依照日本藥典或相當之各國藥典之記載進行試驗。以下，說明例示性之實施形態。
無菌試驗方法
對失能細胞懸浮液輕輕地進行離心分離，將其上清液供於無菌試驗。於作為日本藥典中具有代表性之無菌試驗之一的直接法中，將上清液 接種於大豆酪蛋白消化物培養基或液狀硫代乙醇酸培養基，分別於30~35℃或20~25℃下培養14天以上。其後，於培養期間中數次觀察培養物。於作為另一具有代表性之無菌試驗之膜濾法中，藉由無菌稀釋液(例如，1g/L之肉製或酪蛋白製蛋白腖溶液(pH值7.1±0.2))稀釋上清液，將經稀釋之上清液轉移至膜濾器上進行過濾。其後將該膜濾器分別放入至上述2種培養基中培養14天以上。於符合品質標準之製品中，於培養期間中及最終日，培養基中不存在肉眼可見之微生物之增生。
內毒素試驗方法
藉由生理食鹽液將失能細胞懸浮液適當稀釋，製備成pH值6.0~8.0。其後，與溶解物試劑混合，以溶解物試液之凝膠形成作為指標(凝膠化法)，或以溶解物試液之凝膠化過程中之濁度變化作為指標(比濁法)或以合成受質之水解引起之顯色作為指標(比色法)，定量求出試樣中之內毒素濃度。視需要進行確認溶解物試劑之顯示感度之預備試驗。於符合品質標準之製品中，內毒素濃度必須未達0.25EU/mL。
黴漿菌否定試驗
對培養液、或失能細胞懸浮液輕輕地進行離心分離，將其上清液供於黴漿菌否定試驗。於作為日本藥典中具有代表性之黴漿菌否定試驗之一的培養法中，將試樣接種於瓊脂平板培養基中，於包含5~10%之二氧化碳之氮氣中，於合適之濕度下在35~37℃下培養14天以上，或者將試樣接種於裝有液體培養基之容器中，於35~37℃下培養，於觀察到液體培養基之色調變化時，或自開始培養起每隔一定期間自液體培養物中取出等分試樣，接種於新瓊脂平板培養基中繼續培養。其後，以全部瓊脂平板培養基為對象，於第7天及第14天以倍率100倍以上之顯微鏡觀察有無黴漿 菌之群落。於作為另一具有代表性之黴漿菌否定試驗之使用指標細胞之DNA染色法中，典型而言，使用作為指標細胞之Vero細胞與指定之黴漿菌菌株。於該方法中，將指標細胞接種於沈有蓋玻璃之培養皿等中，於包含5%二氧化碳之空氣中在35~38℃增生一天。其後添加試樣(培養液或上清液)，於同樣之條件下繼續培養3~6天。將蓋玻璃上之培養細胞固定後，藉由雙苯甲亞胺等染色劑進行DNA螢光染色，以螢光顯微鏡(倍率400~600倍或其以上之倍率)進行鏡檢，與陰性(未接種)對照及黴漿菌陽性對照加以比較，於以包圍細胞核之方式具有微小之核外螢光斑點之細胞存在0.5%以上之情形時，判斷為黴漿菌陽性。符合品質標準之製品應為黴漿菌陰性。
‧細胞數
對於懸浮於生理食鹽液中之失能細胞，使用血球計數板於顯微鏡下、或藉由自動細胞計數器測定細胞數。符合品質標準之適於投予之失能細胞數為1×108~30×108個(例如，100mL生理食鹽液中)，於低於該範圍之情形時，應適當追加細胞。
‧活細胞率
將懸浮於生理食鹽液中之失能細胞與0.3~0.5%錐蟲藍染色液(例如，目錄#35525-02、Nacalai Tesque)混合，使用血球計數板於顯微鏡下、或藉由自動細胞計數器測定活細胞數。符合品質標準之製品應70%以上之細胞為活細胞。
該等見解可成為用以抑制免疫排斥之細胞製劑之品質管理中重要之檢查點。
參考文獻
以下參考文獻於實施例等中作為基本技術加以參照，並不認為該等文獻相對於本發明而構成先前技術。將該等之內容作為參考引用。
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(註釋)
如以上所述，已使用本發明之較佳之實施形態例示本發明，但業界理解，本發明應僅由申請專利之範圍解釋其範圍。理解本說明書中所引用之專利、專利申請案及其他文獻應與將其內容本身具體記載於本說明書中之程度同樣地將其內容作為對本說明書之參考而援引。本申請案對日本專利申請案特願2018-119003(2018年6月22日提出申請)主張優先權主張之利益，理解於本案中該申請案之內容(可為全部)係作為參考而被援引。又，日本專利申請案特願2018-118996及日本專利申請案特願2018- 119001(均於2018年6月22日提出申請)以及對該等主張優先權之國際申請案之內容係其一部分或全文作為參考被援引至本說明書中。
[產業上之可利用性]
本發明提供一種包含經誘導對特定之抗原具有特異性之免疫耐受之細胞的醫藥組合物。又，由於確認到感染性免疫耐受，故而本發明具有可於必需治療管理之領域使用之可能性。本發明提供一種可於基於此種技術之製劑等相關之產業(製藥)中利用之技術。

Claims (12)

  1. 一種將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自該受驗體之細胞、及來自該供給者之抗原或該抗原含有物混合而被誘導免疫耐受的細胞之用途，其係用於製造用以於受驗體中誘發對供給者之長久之免疫耐受而處置或預防由不來自受驗體之抗原產生之疾病、障礙或狀態之組合物，其中上述疾病、障礙或狀態選自由移植免疫排斥反應、過敏、自體免疫疾病、移植物抗宿主病、及由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應，且其中上述組合物包含CD4陽性失能細胞、CD8陽性失能細胞、或該等之組合。
  2. 如請求項1之用途，其中上述免疫耐受係於上述受驗體中之CD8陽性T細胞中誘發免疫耐受。
  3. 如請求項1或2之用途，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。
  4. 一種將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自該受驗體之細胞、及成為過敏之原因之抗原或該抗原含有物混合而被誘導免疫耐受的細胞之用途，其係用於製造用以治療或預防受驗體之過敏之組合物，其中上述組合物包含CD4陽性失能細胞、CD8陽性失能細胞、或該 等之組合。
  5. 一種將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自該受驗體之細胞、及來自該iPS細胞或ES細胞之抗原或該抗原含有物混合而被誘導免疫耐受的細胞之用途，其係用於製造用以於受驗體中抑制或預防由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官產生之免疫排斥反應的組合物，其中上述組合物包含CD4陽性失能細胞、CD8陽性失能細胞、或該等之組合。
  6. 一種將可抑制CD80及/或CD86與CD28之相互作用之抑制因子、來自該受驗體之細胞、及來自該受驗體之抗原或不來自該受檢體之抗原或該抗原含有物混合而被誘導免疫耐受的細胞之用途，其係用於製造用以處置或預防受驗體之疾病、障礙或狀態之醫藥，其中上述疾病、障礙或狀態選自由移植免疫排斥反應、過敏、自體免疫疾病、移植物抗宿主病、及由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應，且其中上述醫藥包含CD4陽性失能細胞、CD8陽性失能細胞、或該等之組合。
  7. 如請求項6之用途，其中該醫藥之特徵在於，投與該醫藥後，可確認該受驗體之T細胞為失能狀態，且於可確認到失能狀態之情形時不進行進一步處置，於無法確認到失能狀態之情形時，再次投予包含該細胞之醫藥。
  8. 如請求項6之用途，其中上述醫藥包含CD8陽性失能細胞。
  9. 如請求項7之用途，其中上述失能狀態之確認係藉由確認包含上述細胞之上述醫藥消失而進行。
  10. 如請求項6之用途，其中上述抑制因子選自由抗CD80抗體、抗CD86抗體、針對CD80及CD86之雙特異性抗體、抗CD28抗體或該等之抗原結合片段、CTLA4-Ig融合蛋白、CD28-Ig融合蛋白所組成之群。
  11. 如請求項6之用途，其中上述疾病、障礙或狀態包括過敏。
  12. 如請求項6之用途，其中上述疾病、障礙或狀態包括由iPS細胞或ES細胞或者來自該等之細胞、組織或器官之移植引起之免疫排斥反應。
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