CN115136955A - 细胞冻存液及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种用于冻存CAR‑T细胞的细胞冻存液及其制备方法和应用。其中，所述细胞冻存液由以下体积分数的各组分构成：65‑75％的右旋糖酐40葡萄糖注射液，23‑30％的人血白蛋白溶液；以及7‑9％的二甲基亚砜。该细胞冻存液的成分简单、安全性高、能够减少冻存过程中的CAR‑T细胞损伤、保持细胞复苏后的高活率及细胞活性和功能。
Description
技术领域
本申请涉及细胞冻存技术领域，具体涉及一种细胞冻存液及其制备方法和应用。
背景技术
CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell，嵌合抗原受体T细胞)疗法是一种新型免疫细胞治疗方法，它是将经过CAR改造的T细胞回输至人体，激活人体自身免疫系统，以提高机体对抗肿瘤等疾病的能力。因此，在CAR-T细胞体外大量扩增培养后，将其制成易保存、易运输、易回输的制剂非常重要，而CAR-T细胞的有效冻存则为其进行产业化应用提供了必要的基础技术保障。
目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用添加适量保护剂的缓慢冷冻法来冻存细胞，如采用二甲基亚砜(DMSO)为保护剂，因为如果细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。
目前市面上适合于CAR-T细胞冻存的冻存液，其成本通常较高，且成分多不明确或者配方复杂，临床应用存在一定风险性，且复苏后细胞的存活率及活性难以保持。
发明内容
鉴于此，本申请提供了一种成分简单、临床应用安全性高、能够防止冻存过程中的CAR-T细胞损伤、保持细胞复苏后的高活率及其功能的细胞冻存液。
具体地，本申请第一方面提供了一种细胞冻存液，用于冻存CAR-T细胞，所述细胞冻存液由以下体积分数的各组分构成：
65-75％的右旋糖酐40葡萄糖注射液，
23-30％的人血白蛋白溶液；以及
7-9％的二甲基亚砜(DMSO)。
本申请提供的细胞冻存液，仅含有3种临床药用级组分，成分简单且配比合理，且无动物源成分，该冻存液具备临床应用安全性且成本较低，用其冻存CAR-T细胞，可以减少细胞内的冰晶形成，减少对CAR-T细胞的损伤，且冻存后的CAR-T细胞在复苏后的存活率高，能更好的保持CAR-T细胞的体内抗肿瘤效果。
本申请一些实施方式中，所述细胞冻存液由以下体积分数的各组分构成：67.5％的右旋糖酐40葡萄糖注射液，25％的人血白蛋白溶液；以及7.5％的二甲基亚砜。此时，具有该配比的细胞冻存液在冻存CAR-T细胞方面的细胞损伤更小、复苏效果更好。
本申请第二方面提供了一种用于冻存CAR-T细胞的细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：
将右旋糖酐40葡萄糖注射液、人血白蛋白溶液和二甲基亚砜分别按照体积分数为65-75％、23-30％和7-9％进行混合，制得所述细胞冻存液。
上述细胞冻存液的制备方法，简单易操作，制备成本较低，易于产业化生产。
本申请第三方面提供了本申请第一方面所述的细胞冻存液在冻存所述CAR-T细胞中的应用。
采用上述细胞冻存液冻存的CAR-T细胞，其在复苏后的存活率高，并能保持良好的肿瘤杀伤功能。
本申请第四方面提供了一种药物组合物，包括CAR-T细胞和如本申请第一方面所述的细胞冻存液。
该药物组合物可以直接回输机体内，无需经过额外的处理工序，并能保持良好的抗肿瘤效果。
附图说明
图1为采用表3的10组冻存液冻存CAR-T细胞，细胞复苏后的活率检测结果。
图2为采用表4的5组冻存液冻存CAR-T细胞后，在细胞复苏0h和室温放置4h后的细胞活率检测结果。
图3为采用本申请实施例1的冻存液和诺华配方冻存液冻存靶向CD19的CAR-T细胞，CAR-T细胞复苏后在肿瘤小鼠体内的药效检测结果。
具体实施方式
本申请实施例提供了一种细胞冻存液，用于冻存CAR-T细胞，所述细胞冻存液由以下体积分数的各组分构成：
65％-75％的右旋糖酐40葡萄糖注射液，
23％-30％的人血白蛋白溶液；以及
7％-9％的二甲基亚砜(DMSO)。
本申请的细胞冻存液中，1)右旋糖酐40葡萄糖注射液为临床常用注射液，其中所含的右旋糖酐是目前最佳的血浆代用品之一。在冻存时，右旋糖酐葡萄糖可作为冻存保护剂来减少冰晶形成，维持渗透压，即使在温度下降的过程中，仍能维持良好的渗透压环境，避免因温度下降、渗透压改变而出现细胞死亡现象，在回输时能改善微循环，预防或消除血管内红细胞聚集和血栓形成等，亦有扩充血容量作用。2)人血白蛋白溶液在冻存CAR-T细胞时形成水化膜，降低冰晶形成，避免因温度下降时，冰晶的形成造成的细胞机械损伤和死亡，且在冻存的细胞复苏之后，人血白蛋白能提供适于细胞生存的营养环境，帮助细胞从冻存状态恢复，在回输时会起到血浆容量扩充剂的作用，不会引起人机体的过敏反应。3)DMSO为冻存保护剂，在冻存时减少冰晶形成、保护细胞不因冻存而死亡。
因此，本申请上述细胞冻存液中所含右旋糖酐40葡萄糖注射液、人血白蛋白溶液、DMSO的成分安全，并在这三者特定含量的协同配合下，能够很好地降低冻存时CAR-T细胞内的冰晶形成，减少细胞损伤，帮助冻存的细胞在复苏后维持良好存活率，更好地保持T细胞的抗肿瘤功能。且，上述冻存液的所有组分明确，可以直接回输人体，在临床应用中具有方便、快捷、安全等显著优势。
此外，所述冻存液组分简单且成分价格便宜，易获取，具有成本优势，例如本申请冻存液的成本仅为市面上常见冻存液成本的1/5到1/10，并且对CAR-T细胞的损伤小，复苏存活率高，CAR-T细胞复苏后在体内具有更优的抗肿瘤效果。因此，该冻存液具有良好的临床使用安全性和切实有效性，适合产业化生产，能够产生巨大的经济效益。
本申请一些实施方式中，所述细胞冻存液由以下体积分数的各组分构成：67.5％的右旋糖酐40葡萄糖注射液，25％的人血白蛋白溶液；以及7.5％的二甲基亚砜。此时，具有该配比的细胞冻存液在冻存CAR-T细胞方面的细胞损伤更小、复苏效果更好。
本申请实施例还提供了上述细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：
将右旋糖酐40葡萄糖注射液、人血白蛋白溶液和二甲基亚砜分别按照体积分数为65％-75％、23％-30％和7％-9％进行混合，制得所述细胞冻存液。
其中，上述各原料的混合可以在生物安全柜内进行，环境洁净标准为整体万级局部百级。将各原料按比例混合均匀后得到的细胞冻存液可以置于2-8℃储存。
上述细胞冻存液的制备方法，简单易操作，制备成本较低，易于产业化生产。
本申请一些实施方式中，将右旋糖酐40葡萄糖注射液、人血白蛋白溶液和二甲基亚砜分别按照体积分数为67.5％、25％和7.5％进行混合，制得所述细胞冻存液。
本申请实施例还提供了上述细胞冻存液在冻存CAR-T细胞中的应用。
具体地，采用所述细胞冻存液冻存所述CAR-T细胞包括：
1)向CAR-T细胞中加入所述细胞冻存液，获得细胞悬浮液；
2)将所述细胞悬浮液冻存，得到冻存的CAR-T细胞。
其中，所述细胞悬浮液中的CAR-T细胞可以是取自对数生长期的细胞。上述冻存可以通过含有适当浓度的CAR-T细胞的细胞悬浮液来进行。其中，所述细胞悬浮液中的所述CAR-T细胞的浓度可以为0.5×106个/mL-30×106个/mL。此种情况下，对CAR-T细胞的冻存效果较好，即，冻存后再复苏的活率较高。
其中，将所述细胞悬浮液冻存，具体包括：先将所述细胞悬浮液分装于冻存管中，将冻存管置于程序冻存盒中，经冷冻后，再移入液氮罐中保存。其中，冷冻的温度可以是-70℃、-80℃或更低的温度。冷冻过程可以是以每分钟恒定的速率来降温。
可选地，在所述冻存结束后，还包括：将所述冻存后的CAR-T细胞进行复苏，得到复苏后的CAR-T细胞。其中，所述复苏的方法包括：将冻存后的细胞悬浮液置于37℃水浴锅中，迅速晃动直至细胞悬浮液完全融解，得到复苏后的CAR-T细胞。
复苏后的CAR-T细胞可以进行后续细胞活性检测实验、细胞增殖实验、肿瘤杀伤实验等，也可以直接回输人体。
本申请实施例的上述细胞冻存液能够冻存CAR-T细胞，能够更有效的保持细胞复苏后的存活率(可在95％左右)，促进其增殖能力，并提高细胞活性，保持T细胞的肿瘤杀伤功能。且本申请冻存液重悬的细胞可直接回输体内。
本申请实施例还提供了一种药物组合物，其包括CAR-T细胞和本申请实施例上述的细胞冻存液。
其中，CAR-T细胞作为该药物组合物的活性成分，细胞冻存液作为CAR-T细胞的培养环境。
在一些实施方式中，所述药物组合物为CAR-T细胞注射液。此时，所述药物组合物中还可以包括生理盐水，进一步地还可以包含其他可注射药物等。
本申请实施例提供的上述药物组合物可以直接回输体内，无需经过额外的处理工序，从而减少操作流程，降低污染概率。
下面分多个实施例对本申请实施例进行进一步的说明。
以下为本申请实施例的细胞冻存液中所采用的各原料的厂家品牌与货号：
表1原料表
上述右旋糖酐40葡萄糖注射液中含有质量浓度为6％的低分子量右旋糖苷和5％的右旋葡萄糖(即500mL的右旋糖酐40葡萄糖注射液中含30g低分子量的右旋糖苷和25g的右旋葡萄糖)，为临床常用注射液。上述人血白蛋白溶液中含有质量浓度为20％的人血白蛋白(即50mL的人血白蛋白溶液中含有10g人血白蛋白)。
实施例1
一种细胞冻存液的配制方法，包括：
在环境洁净标准为整体万级局部百级的生物安全柜内，将右旋糖酐40葡萄糖注射液、人血白蛋白溶液和二甲基亚砜分别按照体积分数为67.5％、25％和7.5％进行混合，制得细胞冻存液。配制好的细胞冻存液置于2-8℃储存。
将配制好的细胞冻存液按下表2的质量标准进行检测，全部检测合格后再进行后续的实验。
表2细胞冻存液的检测项目及检验标准
| 检验项目 | 检验标准 |
| 外观 | 透明液体 |
| 无菌 | 阴性 |
| 支原体 | 阴性 |
| 内毒素 | <3.5EU/mL |
| pH | 6.0-8.0 |
实施例2
采用实施例1的细胞冻存液冻存CAR-T细胞：
(一)CAR-T细胞的制备：
采集外周血或单采血的单个核细胞(PBMC)，Ficoll离心分离后取白膜层细胞；采用生理盐水洗涤，得到PBMC。取PBMC，按比例加入CD3/28磁珠，室温孵育，经磁分选得到CD3阳性T细胞；然后采用携带CAR基因的慢病毒感染CD3阳性T细胞，并进行体外扩增培养；待细胞培养至8～12天，以500g离心8min，收获CAR-T细胞。
(二)冻存：向上述CAR-T细胞中分别加入实施例1的细胞冻存液，以获得含不同细胞浓度的细胞悬液；之后将各细胞悬液分装于冻存管中，并放置于程序降温盒中，先于-80℃下冷冻，第2天转入液氮罐中冻存。
(三)CAR-T细胞的复苏：从液氮罐中取出冻存管，立即在37℃水浴锅中，迅速晃动直至冻存液完全融解(约1min)，得到复苏的CAR-T细胞。
可以使用荧光细胞计数仪对复苏后细胞进行体外细胞活率的检测，以及进行后续的体内动物实验等。
效果实施例
1、为评估本申请的细胞冻存液对CAR-T细胞冻存、复苏后对其细胞活性的影响，根据实施例2记载的方法，将制得的靶向CD19的CAR-T细胞按表3所示的冻存液配方进行冻存，其中，1-8号为自配冻存液(3号对应实施例1的冻存液)，9和10号为购买的商品化冻存液。将各CAR-T细胞分别按照0.5×106/ml、1.5×106/ml、8×106/ml的密度冻存，冻存11天后进行复苏，采用AO/PI荧光染色方法检测复苏后CAR-T细胞的存活率，检测结果汇总在图1。
表3 10组冻存液的信息
注：亘诺冻存液购自三生生物(Selcell)公司，CS10冻存液是购自Stem celltechnologies公司的
产品。
从图1可以获知，使用3号冻存液(对应实施例1)对CAR-T细胞以1.5×106/ml和8×106/ml的细胞密度进行冻存时，复苏后细胞的活率要优于9或10号的商品化冻存液。
2、为评估本申请提供的冻存液在更高的细胞密度和室温使用温度下的效果，对靶向CD19的CAR-T细胞按表4所示的冻存液分别进行冻存，其中，1-3号为自配冻存液(1号对应实施例1的冻存液，2号对应诺华冻存液配方)，4和5号为购买的商业化冻存液。将各CAR-T细胞分别按照1×106/ml、10×106/ml、30×106/ml的密度冻存，冻存6天后进行复苏，采用AO/PI荧光染色方法检测复苏后细胞的活率，并且将复苏后细胞在室温下存放4h，再次检测活率。结果汇总在图2中。
表4 5组冻存液的信息
注：亘诺冻存液购自三生生物(Selcell)公司，CS10冻存液购自Stem celltechnologies公司的
产品；2号对应诺华公司上市的CD19CAR-T产品(Kymriah(tisagenlecleucel))的冻存液配方。
从图2可知，以10×106/ml、30×106/ml的细胞密度进行CAR-T细胞冻存时，使用1号冻存液(对应实施例1)，细胞复苏的活率比使用商品化冻存液及诺华配方冻存液都高，说明本申请的冻存液在高密度细胞冻存时，优势明显。
3、为了评估本申请冻存液的稳定性，将靶向CD19的CAR-T细胞分别采用本申请实施例1的冻存液、诺华配方的冻存液(表4中2号)以30×106/ml的密度进行冻存，这2种冻存液分别现配现用、及在配制后2-8℃下存放1周后再用，细胞在冻存4天后复苏以检测活率，结果见下表5。
表5
| 复苏后细胞活率 | 诺华配方冻存液 | 本申请实施例1冻存液 |
| 冻存液2-8℃存放1周 | 89.5％、88.9％ | 96.6％、95.8％ |
| 冻存液现用现配 | 89.0％、90.2％ | 94.9％、96.3％ |
结果表明，本申请实施例的冻存液较诺华配方冻存液在冻存高密度的CAR-T细胞时，细胞的复苏活率更高，且冻存液在配制后2-8℃下存放1周的稳定性良好。
4、为了评价本申请冻存液对冻存CAR-T细胞的体内抗肿瘤能力的影响，先检测上表4中5组冻存液的其它性质，包括外观、pH、渗透压以及支原体的检测，结果如下表6所示。
表6表4中5组冻存液的质检结果
表6的结果表明，这5组冻存液的质量均合格，可以用来进行动物实验。
接着，进行动物体内药效实验：准备B-NDG雌性小鼠6只，尾静脉注射CD19阳性的Nalm-6细胞(人急性B淋巴白血病细胞)悬液0.2mL，其中，每1mL的细胞悬液中含有5×106个Nalm-6细胞，注射量为1×106个Nalm-6细胞/只，以构建荷瘤小鼠模型。接种后第3天分成3组，分别对各组小鼠注射采用诺华冻存液冻存后复苏的靶向CD19的CAR-T细胞、采用本申请实施例1冻存液冻存后复苏的靶向CD19的CAR-T细胞(其中，前2组CD19 CAR-T细胞的冻存密度为45×106个/mL，CD19 CAR-T细胞的注射剂量为2.6×106个细胞/只小鼠)及模型对照组(小鼠只造模不注射T细胞)。使用小动物活体成像系统进行肿瘤负荷评估，称重并观察小鼠的生存情况。相关结果汇总在图3中。
图3的结果表明，采用本申请冻存液冻存的CAR-T细胞在小鼠体内具有更优的抑瘤效果，小鼠体重下降更慢，生存期更长。
以上所揭露的仅为本申请的示例性实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本申请实施例的保护范围。
Claims (9)
1.一种细胞冻存液，用于冻存CAR-T细胞，其特征在于，所述细胞冻存液由以下体积分数的各组分构成：
65-75％的右旋糖酐40葡萄糖注射液，
23-30％的人血白蛋白溶液；以及
7-9％的二甲基亚砜。
2.如权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液由以下体积分数的各组分构成：
67.5％的右旋糖酐40葡萄糖注射液，
25％的人血白蛋白溶液；以及
7.5％的二甲基亚砜。
3.一种用于冻存CAR-T细胞的细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将右旋糖酐40葡萄糖注射液、人血白蛋白溶液和二甲基亚砜分别按照体积分数为65-75％、23-30％和7-9％进行混合，制得所述细胞冻存液。
4.如权利要求1-2任一项所述的细胞冻存液在冻存CAR-T细胞中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，采用所述细胞冻存液冻存所述CAR-T细胞，具体包括：
向所述CAR-T细胞加入所述细胞冻存液，获得细胞悬浮液；
将所述细胞悬浮液冷冻，然后移入液氮中保存，得到冻存的CAR-T细胞。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述细胞悬浮液中的所述CAR-T细胞的浓度为0.5×106个/mL-50×106个/mL。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，在所述冻存结束后，还包括：将所述冻存后的CAR-T细胞进行复苏，得到复苏后的CAR-T细胞。
8.一种药物组合物，其特征在于，包括CAR-T细胞和如权利要求1-2任一项所述的细胞冻存液。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为CAR-T细胞注射液。
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