CN107148967B - 一种抗原特异性t淋巴细胞冻存液及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抗原特异性t淋巴细胞冻存液及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液，包括冻存液A和冻存液B，冻存液A包括以下体积分数的组分：30％‑40％的勃脉力电解质注射液、30％‑40％的葡萄糖氯化钠注射液、5％‑15％的右旋糖酐葡萄糖注射液和15％‑25％的人血白蛋白溶液；冻存液B包括以下体积分数的组分：20％‑30％的勃脉力电解质注射液、20％‑30％的葡萄糖氯化钠注射液、5％‑15％的右旋糖酐葡萄糖注射液、15％‑25％的人血白蛋白溶液和10％‑20％的二甲基亚砜；冻存液A与冻存液B分开储存，使用时，冻存液A与冻存液B按体积比为1:0.5‑2的比例混合，形成抗原特异性T淋巴细胞冻存液。该冻存液能够降低细胞内的晶体形成，提升细胞活率，保持细胞的肿瘤杀伤功能。本发明还提供了冻存液的制备方法和应用以及一种抗原特异性T淋巴细胞注射液。

Description

一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液及其制备方法和应用。
背景技术
基因修饰免疫细胞治疗技术是一种新兴的肿瘤治疗模式，已经成为全球的研究热点，特别是以CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)/TCR-T(嵌合型T细胞)技术为主要代表，成为全球生物医学新世纪的主要发展方向。
目前认为经体外扩增遗传修饰的免疫细胞后再回输到人体内，有利于提高机体的免疫防御能力，表现在可以提高机体对特异性抗肿瘤等疾病的治疗能力。在细胞免疫治疗过程中，不仅需要培养和促进细胞的增殖，特别是在体外培养一段时间后，随着传代次数的增加和体外环境条件的变化，免疫细胞的各种生物特性都将逐渐发生变化并而不断有新的变化，因此及时进行细胞冻存十分必要。
细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要是采用添加适量保护剂的缓慢冷冻法来冻存细胞，如采用甘油或二甲基亚砜(DMSO)为保护剂，因为如果细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应，如：细胞脱水使局部电解质浓度增高、导致pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，从而引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易被破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。
现有的冻存方案常采用：70％-80％DMEM/1640基础培养基，10％-20％胎牛血清和10％二甲基亚砜(DMSO)的冻存方案去保存细胞，该方案能够很好的为动物细胞提供营养物质，细胞经短时间冻存再复苏后仍能维持较高的活率。但是该细胞冻存方案经长时间冻存后细胞复苏率较低，只有70％-80％左右，直接制约冻存细胞的临床应用。且现有的冻存方法对于免疫细胞，在冻存过程中则易形成冰晶损伤细胞，复苏后存在细胞活率低、细胞增殖数量不足和细胞杀伤功能低下等问题。
因此，免疫细胞治疗的临床应用急需一种能够防止冻存过程中的细胞损伤、保持细胞复苏后的高活率及其功能的细胞冻存液。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液及其制备方法。本发明抗原特异性T淋巴细胞冻存液可以提升细胞活率，抗原特异性T淋巴细胞冻存液的制备方法工艺简单。
本发明第一方面提供了一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液，包括冻存液A和冻存液B，所述冻存液A包括以下体积分数的组分：
30％-40％的勃脉力电解质注射液、30％-40％的葡萄糖氯化钠注射液、5％-15％的右旋糖酐葡萄糖注射液和15％-25％的人血白蛋白溶液；
所述冻存液B包括以下体积分数的组分：
20％-30％的勃脉力电解质注射液、20％-30％的葡萄糖氯化钠注射液、5％-15％的右旋糖酐葡萄糖注射液、15％-25％的人血白蛋白溶液和10％-20％的二甲基亚砜；
所述冻存液A与所述冻存液B分开储存，使用时，所述冻存液A与所述冻存液B按体积比为1:0.5-2的比例混合，形成抗原特异性T淋巴细胞冻存液。
优选地，所述冻存液A包括以下体积分数的组分：
35％的勃脉力电解质注射液、35％的葡萄糖氯化钠注射液、10％的右旋糖酐葡萄糖注射液和20％的人血白蛋白溶液；
所述冻存液B包括以下体积分数的组分：
27.5％的勃脉力电解质注射液、27.5％的葡萄糖氯化钠注射液、10％的右旋糖酐葡萄糖注射液、20％的人血白蛋白溶液和15％的二甲基亚砜。
优选地，所述冻存液A与所述冻存液B的体积比为1:1。
优选地，所述葡萄糖氯化钠注射液中含有质量浓度为5％的右旋葡萄糖和0.45％的氯化钠，所述右旋糖酐葡萄糖注射液中含有质量浓度为10％的低分子量右旋糖苷和5％的右旋葡萄糖。
优选地，所述人血白蛋白溶液中含有质量浓度为25％的人血白蛋白。
本发明第一方面提供的冻存液配比合理，能够降低细胞内的晶体形成，减少细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损伤，提升细胞活率；并能减少免疫细胞表面抗原的丢失，保持T细胞的肿瘤杀伤功能。所有组分均可以直接回输人体，在临床应用中具有方便、快捷等显著优势，本发明冻存液所有组分明确，可以工业化生产，原材料价格便宜，易获取，具有成本优势。
本发明第二方面提供了一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液的制备方法，包括：
将勃脉力电解质注射液、葡萄糖氯化钠注射液、右旋糖酐葡萄糖注射液和人血白蛋白溶液分别按照体积分数为30％-40％、30％-40％、5％-15％和15％-25％进行混合，制得冻存液A；
将勃脉力电解质注射液、葡萄糖氯化钠注射液、右旋糖酐葡萄糖注射液、人血白蛋白溶液和二甲基亚砜分别按照体积分数为20％-30％、20％-30％、5％-15％、15％-25％和10％-20％进行混合，制得冻存液B；
所述冻存液A与所述冻存液B分开储存，使用时，将所述冻存液A与所述冻存液B按照体积比为1:0.5-2的比例混合，得到冻存液。
本发明第二方面提供的制备方法，方法简单易操作，制备成本较低，易于产业化生产。
本发明第三方面提供了一种如第一方面所述的冻存液在抗原特异性T淋巴细胞冻存中的应用，包括：
(1)取所述冻存液，所述冻存液包括冻存液A和冻存液B；取对数生长期的抗原特异性T淋巴细胞；
(2)向所述抗原特异性T淋巴细胞中加入所述冻存液A，得到细胞重悬液；然后加入冻存液B，得到细胞冻存液，所述冻存液A与所述冻存液B的体积比为1:0.5-2，冻存所述细胞冻存液，得到冻存的抗原特异性T淋巴细胞。
优选地，所述细胞重悬液中的所述抗原特异性T淋巴细胞的浓度为1×106个/mL-10×106个/mL。
优选地，冻存结束后，将所述冻存后的所述抗原特异性T淋巴细胞进行复苏，所述复苏的方法包括：
将冻存后的细胞冻存液置于37℃水浴锅中，迅速晃动直至冻存液完全融解，得到复苏后的抗原特异性T淋巴细胞。
本发明第三方面提供的应用，该冻存液能够冻存细胞，相对其他冻存液能够更有效的保持细胞的复苏成活率，促进其增殖能力，并提高细胞活性，减少免疫细胞表面抗原的丢失，保持T细胞的肿瘤杀伤功能。且本发明冻存液重悬的细胞可直接回输体内。
本发明第四方面提供了一种抗原特异性T淋巴细胞注射液，包括抗原特异性T淋巴细胞和第一方面所述的细胞冻存液，所述细胞注射液中，所述抗原特异性T淋巴细胞的浓度为0.5×106个/mL-2×106个/mL。
本发明第四方面提供的注射液，可以直接回输体内，无需经过额外的处理工序，从而减少操作流程，降低污染概率。本发明冻存液和血液成分相容，可作为水、电解质的补充源和碱化剂。
综上，本发明有益效果包括以下几个方面：
1、本发明提供的冻存液能够降低细胞内的晶体形成，减少细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损伤，提升细胞活率；并能减少免疫细胞表面抗原的丢失，保持T细胞的肿瘤杀伤功能；
2、本发明提供的冻存液的制备方法，方法简单易操作，制备成本较低，易于产业化生产；
3、本发明提供的冻存液的应用，相对其他冻存液，本发明冻存液能够更有效的保持细胞的复苏成活率，促进其增殖能力，并提高细胞活性，减少免疫细胞表面抗原的丢失，保持T细胞的肿瘤杀伤功能。且本发明冻存液重悬的细胞可直接回输体内；
4、本发明提供的注射液，可以直接回输体内，无需经过额外的处理工序，从而减少操作流程，降低污染概率。本发明冻存液和血液成分相容，可作为水、电解质的补充源和碱化剂。
附图说明
图1为实施例1提供的冻存液冻存抗原特异性T淋巴细胞后对其细胞活性的影响图；
图2为实施例1提供的冻存液冻存抗原特异性T淋巴细胞后对其细胞增殖速度的影响图；
图3为实施例1提供的冻存液冻存抗原特异性T淋巴细胞后对其肿瘤杀伤功能的影响图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
第一方面，本发明提供一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液，包括冻存液A和冻存液B，冻存液A包括以下体积分数的组分：
30％-40％的勃脉力电解质注射液、30％-40％的葡萄糖氯化钠注射液、5％-15％的右旋糖酐葡萄糖注射液和15％-25％的人血白蛋白溶液；
冻存液B包括以下体积分数的组分：
20％-30％的勃脉力电解质注射液、20％-30％的葡萄糖氯化钠注射液、5％-15％的右旋糖酐葡萄糖注射液、15％-25％的人血白蛋白溶液和10％-20％的二甲基亚砜；
冻存液A与冻存液B分开储存，使用时，冻存液A与冻存液B按体积比为1:0.5-2的比例混合，形成抗原特异性T淋巴细胞冻存液。
本发明冻存液分为A液(又称细胞重悬液)与B液(又称细胞冻存液)两部分，A液中不含DMSO，细胞可以较长时间保存于其中。而当开始冻存时，将A液与B液快速混合，立即进行冻存，即可将DMSO引起的毒性降到最低。当冻存大体积(例如100ml以上)或者多份(例如50份以上)的细胞样品时体现的作用尤为明显。
现有技术中大多数冻存液直接回输人体的问题有：一是冻存液成分与人血液差别过大，回输会引起渗透压变化；二是冻存液中含有对人体有潜在危害的成分(如过敏原、热原等)。而本发明提供的冻存液避免了上述问题，首先，本发明提供的冻存液兼具了细胞冻存保护液与电解质注射液的双重优点，既可以在低至-130℃以下的低温冻存过程中保护细胞，同时解冻后可以直接作为电解质注射液回输人体，无需经过额外的处理工序，从而减少操作流程，降低污染概率。患者接受细胞回输之时和之后均有可能出现电解质紊乱，需要输液补充水、葡萄糖和电解质，本发明提供的冻存液和血液成分相容，可作为水、电解质的补充源和碱化剂。
本发明冻存液中，(1)勃脉力A(Plasma-Lyte A)为复方电解质注射液，富含电解质，且与血液和血液成分相容。在冻存时，勃脉力A起到扩充容积的作用。在回输人体时可作为水、电解质的补充源和碱化剂。(2)葡萄糖氯化钠注射液(即5％右旋葡萄糖和0.45％氯化钠注射液)为临床常用药物注射稀释剂，在冻存时葡萄糖可作为冻存保护剂来减少冰晶形成、降低细胞的渗透收缩，在回输时，葡萄糖可提供肠外营养，补充能量，氯化钠则可以补充电解质。此外，在本发明提供的冻存液中也起到扩充容积的作用。(3)右旋糖酐葡萄糖注射液(即10％低分子量右旋糖苷和5％右旋葡萄糖溶液)为临床常用注射液，其中所含的右旋糖酐是目前最佳的血浆代用品之一。在冻存时右旋糖酐葡萄糖可作为冻存保护剂来减少冰晶形成，在回输时能改善微循环，预防或消除血管内红细胞聚集和血栓形成等，亦有扩充血容量作用。(4)人血白蛋白溶液在冻存细胞复苏之后提供适于细胞生存的营养环境，帮助细胞从冻存状态恢复。在回输时会起到血浆容量扩充剂的作用，且不会如牛血清(FBS)等非人体成分一样引起过敏反应。(5)二甲亚砜(DMSO)为冻存保护剂，在冻存时减少冰晶形成、保护细胞不因冻存而死亡。
本发明中的勃脉力(Plasma-Lyte A)电解质注射液和人血清白蛋共同构成了成分丰富多元的营养体系，在细胞冻存的过程中提供了稳定的、直接的营养供给，保证了细胞存活率。同时，右旋糖酐能够很好的维持渗透压，即使在温度下降的过程中，仍能维持良好的渗透压环境，避免因温度下降、渗透压改变而出现的细胞死亡现象。此外，在温度下降的过程中，蛋白质等大分子物质形成了水化膜，降低冰晶形成，避免了细胞因温度下降时，冰晶的形成造成的细胞机械损伤、死亡，从而提高免疫细胞的复苏成活率，并保持其细胞活性，延长免疫细胞存活期，减少免疫细胞表面抗原的丢失。在免疫细胞治疗领域，将极大提升回输病人体内的基因修饰淋巴T细胞的活性和功能。
本发明中，冻存液A包括以下体积分数的组分：
32％-38％的勃脉力电解质注射液、32％-38％的葡萄糖氯化钠注射液、7％-13％的右旋糖酐葡萄糖注射液和18％-22％的人血白蛋白溶液；
冻存液B包括以下体积分数的组分：
22％-28％的勃脉力电解质注射液、22％-28％的葡萄糖氯化钠注射液、8％-12％的右旋糖酐葡萄糖注射液、18％-22％的人血白蛋白溶液和12％-17％的二甲基亚砜。
本发明中，冻存液A包括以下体积分数的组分：
35％的勃脉力电解质注射液、35％的葡萄糖氯化钠注射液、10％的右旋糖酐葡萄糖注射液和20％的人血白蛋白溶液；
冻存液B包括以下体积分数的组分：
27.5％的勃脉力电解质注射液、27.5％的葡萄糖氯化钠注射液、10％的右旋糖酐葡萄糖注射液、20％的人血白蛋白溶液和15％的二甲基亚砜。
本发明中，冻存液A与冻存液B的体积比为1:1。
本发明中，葡萄糖氯化钠注射液中含有质量浓度为5％的右旋葡萄糖和0.45％的氯化钠(即100ml葡萄糖氯化钠注射液中含5g低分子量右旋葡萄糖和0.45g氯化钠)，右旋糖酐葡萄糖注射液中含有质量浓度为10％的低分子量右旋糖苷和5％的右旋葡萄糖(即100ml右旋糖酐葡萄糖注射液中含10g低分子量右旋糖苷和5g右旋葡萄糖)。
本发明中，人血白蛋白溶液中含有质量浓度为25％的人血白蛋白。
本发明中提供的冻存液除了可以冻存抗原特异性T淋巴细胞，还可以冻存其他一般的免疫细胞，如B淋巴细胞和NK细胞等。
本发明第一方面提供的冻存液配比合理，能够降低细胞内的晶体形成，减少细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损伤，提升细胞活率；并能减少免疫细胞表面抗原的丢失，保持T细胞的肿瘤杀伤功能。所有组分均可以直接回输人体，在临床应用中具有方便、快捷等显著优势，本发明冻存液所有组分明确，可以工业化生产，原材料价格便宜，易获取，具有成本优势。
本发明第二方面提供了一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液的制备方法，包括：
将勃脉力电解质注射液、葡萄糖氯化钠注射液、右旋糖酐葡萄糖注射液和人血白蛋白溶液按照体积分数为30％-40％、30％-40％、5％-15％和15％-25％的比例进行混合，制得冻存液A；
将勃脉力电解质注射液、葡萄糖氯化钠注射液、右旋糖酐葡萄糖注射液、人血白蛋白溶液和二甲基亚砜按照体积分数为20％-30％、20％-30％、5％-15％、15％-25％和10％-20％的比例进行混合，制得冻存液B；
冻存液A与冻存液B分开储存，使用时，将冻存液A与冻存液B按照体积比为1:0.5-2的比例混合，得到冻存液。
本发明中，冻存液A与冻存液B按照体积比为1:1的比例混合。
本发明中，使用时，先用冻存液A悬浮细胞，然后再以体积比为1:1的比例加入冻存液B混合即可得到冻存液。
本发明中，将冻存液A和冻存液B进行过滤。
本发明中，过滤操作为采用0.22um滤膜过滤。
本发明第二方面提供的冻存液的制备方法，方法简单易操作，制备成本较低，易于产业化生产。
本发明第三方面提供了一种如第一方面的冻存液在抗原特异性T淋巴细胞冻存中的应用，包括：
取冻存液，冻存液包括冻存液A和冻存液B；
取对数生长期的抗原特异性T淋巴细胞；
向抗原特异性T淋巴细胞中加入冻存液A，得到细胞重悬液；然后加入冻存液B，得到细胞冻存液，冻存液A与冻存液B的体积比为1:0.5-2，冻存细胞冻存液，得到冻存的抗原特异性T淋巴细胞。
本发明中，细胞重悬液中的抗原特异性T淋巴细胞的浓度为1×106个/mL-10×106个/mL。
本发明中，冻存的具体操作为：将细胞冻存液分装于冻存管中，将冻存管置于程序冻存盒中，在-80℃环境中冷冻后，移入液氮罐中冻存。
本发明中，冻存结束后，将冻存后的抗原特异性T淋巴细胞进行复苏，复苏的方法包括：
将冻存后的细胞冻存液置于37℃水浴锅中，迅速晃动直至冻存液完全融解，得到复苏后的抗原特异性T淋巴细胞。
本发明中，抗原特异性T淋巴细胞细胞复苏后继续培养，包括：将复苏后得到的冻存管中的细胞悬液转移到离心管内，加入完全培养基，轻轻吹打混匀，离心后弃上清，然后向细胞沉淀内加入完全培养基，轻轻吹打混匀后，转移到细胞培养瓶内，进行接种和培养。
本发明中，复苏后的抗原特异性T淋巴细胞可进行后续肿瘤杀伤实验、细胞增殖实验、细胞活性检测实验等，也可以直接回输人体。
按照上述细胞冻存和复苏方法，在复苏细胞后，能显著提高细胞的复苏活率，使得其比常规冻存液的复苏活性提升1.1至1.9倍；并能快速扩增抗原特异性T淋巴细胞，让免疫细胞的增殖速度比常规冻存液提高了1.3至2.7倍，提升了免疫细胞数量；而且本发明T淋巴细胞冻存液所复苏后的抗原特异性T淋巴细胞能保持很好的免疫细胞功能，其能起到很好的肿瘤特异性杀伤功能，较常规冻存液提升1.1至1.8倍。
经本发明免疫细胞冻存液复苏后的抗原特异性T淋巴细胞，相对其他冻存液能够更有效的保持细胞的复苏成活率，促进其增殖能力，并提高细胞活性，减少免疫细胞表面抗原的丢失，保持T细胞的肿瘤杀伤功能，因此本发明所描述的冻存液较常规冻存液相比更适合用于冻存和复苏抗原特异性T淋巴细胞，能快速繁殖获得足够数量的所需的免疫细胞，使其更好的应用于临床免疫细胞治疗中。
本发明第三方面提供的应用，该冻存液能够冻存细胞，相对其他冻存液能够更有效的保持细胞的复苏成活率，促进其增殖能力，并提高细胞活性，减少免疫细胞表面抗原的丢失，保持T细胞的肿瘤杀伤功能。且本发明冻存液重悬的细胞可直接回输体内。
本发明第四方面提供了一种抗原特异性T淋巴细胞注射液，包括抗原特异性T淋巴细胞和如第一方面的细胞冻存液，细胞注射液中，抗原特异性T淋巴细胞的浓度为0.5×106个/mL-2×106个/mL。
本发明中，抗原特异性T淋巴细胞注射液还可以包括生理盐水等溶剂。
本发明中，每次回输的细胞抗原特异性T淋巴细胞注射液为100mL，所述抗原特异性T淋巴细胞的浓度为0.5×106个/mL-2×106个/mL。
本发明中，本发明抗原特异性T淋巴细胞注射液的制备方法为：取冻存液，冻存液包括冻存液A和冻存液B；向抗原特异性T淋巴细胞中加入冻存液A，重悬细胞后，加入冻存液B，得到抗原特异性T淋巴细胞注射液。
本发明第四方面提供的注射液，可以直接回输体内，无需经过额外的处理工序，从而减少操作流程，降低污染概率。本发明冻存液血液和血液成分相容，可作为水、电解质的补充源和碱化剂。
实施例1：
一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液，包括冻存液A和冻存液B，冻存液A包括以下体积分数的组分：
35％的勃脉力电解质注射液、35％的葡萄糖氯化钠注射液、10％的右旋糖酐葡萄糖注射液和20％的人血白蛋白溶液；
冻存液B包括以下体积分数的组分：
27.5％的勃脉力电解质注射液、27.5％的葡萄糖氯化钠注射液、10％的右旋糖酐葡萄糖注射液、20％的人血白蛋白溶液和15％的二甲基亚砜；
以下为本发明实施例中所采用的各原料的厂家品牌与货号：
表1 原料表
Figure BDA0001148843210000111
葡萄糖氯化钠注射液中含有质量浓度为5％的右旋葡萄糖和0.45％的氯化钠，右旋糖酐葡萄糖注射液中含有质量浓度为10％的低分子量右旋糖苷和5％的右旋葡萄糖；
冻存液A与冻存液B分开储存，使用时，冻存液A与冻存液B按体积比为1:1的比例混合，形成抗原特异性T淋巴细胞冻存液。
实施例2：
一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液，包括冻存液A和冻存液B，冻存液A包括以下体积分数的组分：
30％的勃脉力电解质注射液、40％的葡萄糖氯化钠注射液、5％的右旋糖酐葡萄糖注射液和25％的人血白蛋白溶液；
冻存液B包括以下体积分数的组分：
30％的勃脉力电解质注射液、20％的葡萄糖氯化钠注射液、5％的右旋糖酐葡萄糖注射液、25％的人血白蛋白溶液和20％的二甲基亚砜；
葡萄糖氯化钠注射液中含有质量浓度为5％的右旋葡萄糖和0.45％的氯化钠，右旋糖酐葡萄糖注射液中含有质量浓度为10％的低分子量右旋糖苷和5％的右旋葡萄糖；
冻存液A与冻存液B分开储存，使用时，冻存液A与冻存液B按体积比为1:0.5的比例混合，形成抗原特异性T淋巴细胞冻存液。
实施例3：
一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液，包括冻存液A和冻存液B，冻存液A包括以下体积分数的组分：
40％的勃脉力电解质注射液、30％的葡萄糖氯化钠注射液、15％的右旋糖酐葡萄糖注射液和15％的人血白蛋白溶液；
冻存液B包括以下体积分数的组分：
20％的勃脉力电解质注射液、30％的葡萄糖氯化钠注射液、15％的右旋糖酐葡萄糖注射液、15％的人血白蛋白溶液和20％的二甲基亚砜；
葡萄糖氯化钠注射液中含有质量浓度为5％的右旋葡萄糖和0.45％的氯化钠，右旋糖酐葡萄糖注射液中含有质量浓度为10％的低分子量右旋糖苷和5％的右旋葡萄糖；
冻存液A与冻存液B分开储存，使用时，冻存液A与冻存液B按体积比为1:2的比例混合，形成抗原特异性T淋巴细胞冻存液。
实施例4：
一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液，包括冻存液A和冻存液B，冻存液A包括以下体积分数的组分：
40％的勃脉力电解质注射液、30％的葡萄糖氯化钠注射液、15％的右旋糖酐葡萄糖注射液和15％的人血白蛋白溶液；
冻存液B包括以下体积分数的组分：
30％的勃脉力电解质注射液、30％的葡萄糖氯化钠注射液、15％的右旋糖酐葡萄糖注射液、15％的人血白蛋白溶液和10％的二甲基亚砜；
葡萄糖氯化钠注射液中含有质量浓度为5％的右旋葡萄糖和0.45％的氯化钠，右旋糖酐葡萄糖注射液中含有质量浓度为10％的低分子量右旋糖苷和5％的右旋葡萄糖；
冻存液A与冻存液B分开储存，使用时，冻存液A与冻存液B按体积比为1:1的比例混合，形成抗原特异性T淋巴细胞冻存液。
实施例5：
一种如实施例1所述的冻存液在抗原特异性T淋巴细胞冻存中的应用，包括：
1. PBMC细胞的分离
1.1 抽取病人血液，送样至血液分离室；
1.2 采集外周血单个核细胞，Ficoll离心分离后取中间层细胞；
1.3 PBS洗涤，得到PBMC(外周血单个核细胞)。
2. 抗原特异性T淋巴细胞制备及培养
2.1 取PBMC，加入不含血清的基础培养基，配成细胞悬液；
2.2 按比例加入CD3磁珠，室温孵育；
2.3 将孵育好磁珠的细胞，放入磁铁进行分离；
2.4 PBS洗涤，得到CD3阳性T淋巴细胞；
2.5 取经过免疫磁珠分离法得到的CD3阳性T淋巴细胞，制备成细胞悬液，进行培养；
2.6 第3天，加入相应病毒滴度的病毒，进行扩增培养。
3.抗原特异性T淋巴细胞的冻存
3.1培养至9-11天，取对数生长期的细胞；
3.2离心，推荐转速1300r/min，离心3min，吸去上清；
3.3重悬，使用配制好的冻存液A，按照1×106个/ml至10×106个/ml浓度重悬；
3.4加入配制好的等体积的冻存液B；
3.5分装至细胞冻存管中，在细胞冻存管上记录好细胞信息；
3.6将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮罐中冻存，得到冻存的所述抗原特异性T淋巴细胞。
当程序冻存盒的温度大于-25℃时，程序冻存盒的温度将以1℃/min-2℃/min降温；当程序冻存盒的温度在从-25℃到-80℃时，降温过程中，将以5℃/min-7℃/min降温。
4.抗原特异性T淋巴细胞的复苏
4.1调节水浴锅至37℃；
4.2从液氮中取出冻存管，立即投入37℃水浴锅中，迅速晃动直至冻存液完全融解(约1min)，得到复苏的所述抗原特异性T淋巴细胞；
4.3回输体内
4.3.1将4.2步骤中的细胞以0.5×106个/mL-2×106个/mL浓度转移至输血袋内。
4.3.2将输血袋针头与病人血管连接固定，观察回输液点滴情况。
4.3.3预处理：一般不需任何预处理，但若患者为过敏体质或其它情况需根据医嘱加入相应处理。
4.3.4如果回输液点滴通顺，换上细胞转输袋，调节速度为30-40滴/min。
4.3.5一般病人观察10min后如没有特殊反应，将滴速改为60-80滴/min，直至输完；若患者有心血管方面疾病应按医嘱控制滴速。回输过程中可嘱家属或护士每隔5-10分钟轻轻挤压转输袋底部，使沉淀细胞重新悬浮。
4.3.6细胞回输完成。
4.4继续培养
4.4.1将4.2步骤中的复苏后的细胞冻存悬液转移到离心管内，加入5ml完全培养基，轻轻吹打混匀，推荐转速1300r/min离心3min，弃上清；
4.4.2向细胞沉淀内加入适量完全培养基，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到细胞培养瓶内，进行接种，培养。
复苏后的抗原特异性T淋巴细胞可进行后续肿瘤杀伤实验、细胞增殖实验、细胞活性检测实验等。
效果实施例
1、为评估本发明提供的冻存液对抗原特异性T淋巴细胞冻存、复苏后对其细胞活性的影响，选用人来源的血液进行外周血单个核细胞的分离、抗原特异性T淋巴细胞制备及培养后，将细胞分别使用以下类别冻存液冻存：CryoStor CS10(对照组1)、HyCryo-STEMCryopreservation media(对照组2)、Synth-a-Freeze medium(对照组3)、STEM-CELLBANKER(对照组4)、OriCell通用血清型冻存液(对照组5)和常规冻存液(70％-80％DMEM/1640基础培养基，10％-20％胎牛血清和10％DMSO)(对照组6)，本发明实施例1的冻存液为实验组。
以下为本发明实施例中所采用的其他厂家冻存液品牌与货号：
表2 冻存液商品表
Figure BDA0001148843210000151
表3 常规冻存液成分表
DMEM基础培养基(70％-80％) Thermo Fisher 11995-040
胎牛血清(10％-20％) Hyclone SH30084.03
DMSO10％ Miltenyi 170-076-303
细胞按照5×106/ml密度冻存，冻存3个月后进行复苏，做体外细胞活性率检测实验，通过前述细胞复苏方法，采用台盼蓝(trypan Blue)和活-死细胞染色试剂盒(Live/Dead assay kit)方法检测细胞活率。从图1中可以看出，使用本发明配方所配制成的冻存液，细胞活率明显提高，较对照组1-6，分别提高111.0％、122.5％、119.8％、115.8％、134.9％和190.4％。检测结果表明，采用本发明所描述的细胞冻存液对抗原特异性T淋巴细胞的复苏后细胞活率，与常规冻存液相比，在相同条件下细胞活率提高1.1至1.9倍。
2、为评估本发明所描述的冻存液对抗原特异性T淋巴细胞冻存、复苏后对其细胞增殖速度的影响，选用人来源的血液进行外周血单个核细胞的分离、抗原特异性T淋巴细胞制备及培养后，将细胞分别使用以下类别冻存液冻存：CryoStor CS10(对照组1)、HyCryo-STEM Cryopreservation media(对照组2)、Synth-a-Freeze medium(对照组3)、STEM-CELLBANKER(对照组4)、OriCell通用血清型冻存液(对照组5)和常规冻存液(70％-80％基础培养基，10％-20％胎牛血清和10％DMSO)(对照组6)，本发明实施例1的细胞冻存液为实验组。细胞按照5×106/ml密度冻存，冻存3个月后进行复苏，进行培养(37℃，5％CO2)，培养5天后通过CFSE流式细胞仪检测法，检测细胞增殖情况。从图2中可以看出，使用本发明配方所配制成的冻存液，细胞增殖速度明显提高，较对照组1-6，分别提高135.8％、162.6％、197.5％、139.6％、202.5％和271.0％。检测结果表明，采用本发明所描述的细胞冻存液对抗原特异性T淋巴细胞复苏后的增殖速度，与常规冻存液相比，在相同条件下细胞增殖速度提高1.3至2.7倍。
3.为评估本发明所描述的冻存液对抗原特异性T淋巴细胞冻存、复苏后对其肿瘤杀伤功能的影响，选用人来源的血液进行外周血单个核细胞的分离、抗原特异性T淋巴细胞制备及培养后，将细胞分别使用以下类别冻存液冻存：CryoStor CS10(对照组1)、HyCryo-STEM Cryopreservation media(对照组2)、Synth-a-Freeze medium(对照组3)、STEM-CELLBANKER(对照组4)、OriCell通用血清型冻存液(对照组5)和常规冻存液(70％-80％基础培养基，10％-20％胎牛血清和10％DMSO)(对照组6)，本发明实施例1的冻存液为实验组。细胞按照5×106/ml密度冻存，冻存3个月后进行复苏，与肿瘤细胞系Nalm-6进行共培养(37℃，5％CO2)，效应T细胞与肿瘤细胞系的比例为1:1，分别使用流式抗体染色。16小时后通过流式细胞仪检测肿瘤杀伤情况。从图3中可以看出，使用本发明配方所配制成的冻存液，肿瘤杀伤能力显著提升，较对照组1-6，分别提高113.5％、120.6％、144.5％、153.2％、144.8％和186.5％。检测结果表明，采用本发明所描述的细胞冻存液对抗原特异性T淋巴细胞复苏后的肿瘤杀伤活性，与常规冻存液相比，在相同条件下肿瘤杀伤活性提高1.1至1.8倍。
综上所述，本发明中的冻存液配方是针对CAR-T、TCR-T免疫细胞治疗过程中的，抗原特异性T淋巴细胞高活性冻存及复苏所设计的，该冻存液包含各类细胞稳定剂，在平衡细胞营养比例上进行了多次实验，最终确定使用本发明配方制备的冻存液，在冻存和复苏培养抗原特异性T淋巴中，相对其他冻存液能够更有效的保持细胞的复苏成活率，促进其增殖能力，并提高细胞活性，减少免疫细胞表面抗原的丢失，保持T细胞的肿瘤杀伤功能。实验结果表明，使用本发明中的冻存液在相同条件下，细胞复苏后活率较对照组提高1.1至1.9倍；细胞增殖率较对照组提高1.3至2.7倍；肿瘤杀伤能力较对照组提高1.1至1.8倍。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液，其特征在于，包括冻存液A和冻存液B，所述冻存液A包括以下体积分数的组分：
30％-40％的勃脉力电解质注射液、30％-40％的葡萄糖氯化钠注射液、5％-15％的右旋糖酐葡萄糖注射液和15％-25％的人血白蛋白溶液；
所述冻存液B包括以下体积分数的组分：
20％-30％的勃脉力电解质注射液、20％-30％的葡萄糖氯化钠注射液、5％-15％的右旋糖酐葡萄糖注射液、15％-25％的人血白蛋白溶液和10％-20％的二甲基亚砜；
其中，所述葡萄糖氯化钠注射液中含有质量浓度为5％的右旋葡萄糖和0.45％的氯化钠，所述右旋糖酐葡萄糖注射液中含有质量浓度为10％的低分子量右旋糖苷和5％的右旋葡萄糖；所述人血白蛋白溶液中含有质量浓度为25％的人血白蛋白；
所述冻存液A与所述冻存液B分开储存，使用时，所述冻存液A与所述冻存液B按体积比为1:0.5-2的比例混合，形成抗原特异性T淋巴细胞冻存液。
2.如权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液A包括以下体积分数的组分：
35％的勃脉力电解质注射液、35％的葡萄糖氯化钠注射液、10％的右旋糖酐葡萄糖注射液和20％的人血白蛋白溶液；
所述冻存液B包括以下体积分数的组分：
27.5％的勃脉力电解质注射液、27.5％的葡萄糖氯化钠注射液、10％的右旋糖酐葡萄糖注射液、20％的人血白蛋白溶液和15％的二甲基亚砜。
3.如权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液A与所述冻存液B的体积比为1:1。
4.一种抗原特异性T淋巴细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括：
将勃脉力电解质注射液、葡萄糖氯化钠注射液、右旋糖酐葡萄糖注射液和人血白蛋白溶液分别按照体积分数为30％-40％、30％-40％、5％-15％和15％-25％进行混合，制得冻存液A；
将勃脉力电解质注射液、葡萄糖氯化钠注射液、右旋糖酐葡萄糖注射液、人血白蛋白溶液和二甲基亚砜分别按照体积分数为20％-30％、20％-30％、5％-15％、15％-25％和10％-20％进行混合，制得冻存液B；
其中，所述葡萄糖氯化钠注射液中含有质量浓度为5％的右旋葡萄糖和0.45％的氯化钠，所述右旋糖酐葡萄糖注射液中含有质量浓度为10％的低分子量右旋糖苷和5％的右旋葡萄糖；所述人血白蛋白溶液中含有质量浓度为25％的人血白蛋白；
所述冻存液A与所述冻存液B分开储存，使用时，将所述冻存液A与所述冻存液B按照体积比为1:0.5-2的比例混合，得到冻存液。
5.一种如权利要求1-3任一项所述的冻存液在抗原特异性T淋巴细胞冻存中的应用，其特征在于，包括：
(1)取所述冻存液，所述冻存液包括冻存液A和冻存液B；取对数生长期的抗原特异性T淋巴细胞；
(2)向所述抗原特异性T淋巴细胞中加入所述冻存液A，得到细胞重悬液；然后加入冻存液B，得到细胞冻存液，所述冻存液A与所述冻存液B的体积比为1:0.5-2，冻存所述细胞冻存液，得到冻存的抗原特异性T淋巴细胞。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述细胞重悬液中的所述抗原特异性T淋巴细胞的浓度为1×106个/mL-10×106个/mL。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，冻存结束后，将所述冻存后的抗原特异性T淋巴细胞进行复苏，所述复苏的方法包括：
将冻存后的细胞冻存液置于37℃水浴锅中，迅速晃动直至冻存液完全融解，得到复苏后的抗原特异性T淋巴细胞。
8.一种抗原特异性T淋巴细胞注射液，其特征在于，包括抗原特异性T淋巴细胞和如权利要求1-3任一项所述的细胞冻存液，所述细胞注射液中，所述抗原特异性T淋巴细胞的浓度为0.5×106个/mL-2×106个/mL。
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