CN115868478B - 海藻糖和甜菜碱在冻存细胞中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞冻存领域，公开了海藻糖和甜菜碱在冻存细胞中的应用。本发明的细胞制剂包括细胞、海藻糖和甜菜碱，其中，所述海藻糖与甜菜碱的重量比为1:1‑4.2。本发明能够实现细胞(尤其是间充质干细胞)的长期保存，不需复苏培养扩增及洗涤等繁琐步骤即可直接使用，省去了复苏培养细胞的时间和细胞操作所需的操作平台，有利于节省设备和人力成本。
Description
技术领域
本发明涉及细胞制剂领域，具体涉及海藻糖和甜菜碱在冻存细胞中的应用。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有自我更新、多向分化潜能的细胞类群。MSCs具有低免疫原性、多来源途径、多分化潜能及强大的旁分泌功能等特征，能够在机体中通过全身性功能调节以恢复机体内环境稳态。已有多项研究针对MSCs在疾病中的治疗作用进行了试验探究，包括治疗心肌梗塞、自身免疫性疾病、糖尿病、肝损伤及肾脏损伤等。MSCs治疗涉及到多种途径，包括抗炎、抗氧化应激、抗内质网应激、激活免疫系统及促进受损部位再生等。
当前，MSCs的应用方法包括静脉输注、局部注射等方式。静脉输注因其操作简单，全身性调节作用强等优势成为了最普遍的方法。当前在研究和使用中，MSCs的一个疗程通常需要多次输注，每次间隔一定时间，一个疗程约在1-2个月。目前，MSCs分次输注操作繁琐，需每次输注前进行MSCs的复苏传代及扩增，单个流程通常需要3-5天，一般需要3-5次。其次，MSCs的保存、培养条件及操作人员的变化也影响着MSCs治疗的效果。此外，将MSCs疗法用于宠物临床中某些发病急、病程快的疾病的最大障碍包括MSCs准备时间长，操作要求高、保存时间短等。
长期以来，MSCs受限于操作时间和操作平台无法大规模应用于疾病治疗。已有部分研究集中于MSCs的储存温度和环境。Gálvez-Martín等研究表明短途运输(≤60小时)中4℃保存的MSCs比在25℃和37℃中具备更强的细胞活力。Gniadek等在MSCs制剂中加入5％人血清白蛋白提高了MSCs的冻存效率。Horcharoensuk P等在0.9％生理盐水基础上增加脯氨酸作为保护剂以增强MSCs短途运输效率。在MSCs短途运输(≤60小时)中常使用0.9％生理盐水、磷酸盐缓冲溶液、林格溶液等作为溶媒，但上述方案仍不能满足大规模制备和长期保存MSCs以用于临床疾病治疗。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的难以长期保存和直接使用问题，提供一种海藻糖和甜菜碱在冻存细胞中的应用。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种细胞制剂，该细胞制剂包括细胞、海藻糖和甜菜碱，其中，所述海藻糖与甜菜碱的重量比为1:1-4.2。
本发明第二方面提供了海藻糖和甜菜碱在促进细胞冻存活力或提高细胞移植安全性中的应用。
本发明第三方面提供了冻存细胞的方法，该方法包括：在缓冲液存在下，将细胞、海藻糖和甜菜碱混合；再将所得细胞混合物进行冷冻保存；其中，所述海藻糖与甜菜碱的重量比为1:1-4.2。
通过上述技术方案，本发明能够实现细胞(尤其是间充质干细胞)的长期保存，不需复苏培养扩增及洗涤等繁琐步骤即可直接使用，省去了复苏培养细胞的时间和细胞操作所需的操作平台(层流间、超净台、细胞培养箱、移液器、培养液等)，有利于节省设备和人力成本。此外，本发明能避免不同操作人员操作导致的细胞状态不一、细胞质量不均带来的细胞疗效差异。经体内实验验证，相较于10％二甲基亚砜的冻存体系，本发明的细胞制剂在临床使用安全性上具备极强优势。因此，本发明特别有利于破除目前间充质干细胞临床疗法的困局。
附图说明
图1为实施例1各组实验中冻存7天后复苏的细胞状态；
图2为实施例2各组实验中冻存60天后复苏的细胞状态；
图3为实施例3各组实验中冻存7天后复苏的细胞状态；
图4为根据本发明的优选实施方式获得的细胞制剂冻存后及普通MSCs移植治疗小鼠肝损伤后小鼠ALT和AST水平变化图；
图5为不同物质的体内安全性试验对比图。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供了一种细胞制剂，其特征在于，该细胞制剂包括细胞、海藻糖和甜菜碱，其中，所述海藻糖与甜菜碱的重量比为1:1-4.2，例如，1：1.2，1：1.8，1：1.9，1：2.2，1：3，1：3.5，1：3.8，1：3.9，1：4，1：4.1，1：4.2，或上述数值之间的任意范围或任意值，优选为1:3.8-4。
根据本发明，相对于107-109个细胞(特别是107个细胞)，所述海藻糖的含量优选为10-100mg，如15、18、19、20、21、22、25、28、35、45、55、65、75、85、95mg或上述数值之间的任意范围或任意值，更优选为18-22mg。
根据本发明，所述细胞制剂可以为液体制剂且细胞的含量可以为107-109个细胞/mL。
根据本发明，所述细胞制剂可以为液体制剂且海藻糖的含量优选为18-22mg/mL，如18、18.5、19、19.5、19.8、20、20.2、20.5、21、21.5、22mg/mL或上述数值之间的任意范围或任意值。
根据本发明，所述细胞制剂可以为液体制剂且甜菜碱的含量优选为78-82mg/mL，如78、78.5、79、79.5、79.8、80、80.2、80.5、81、81.5、82mg/mL或上述数值之间的任意范围或任意值。
根据本发明，为了配制液体制剂，可以使用生理盐水，因此所述液体制剂还可以含有生理盐水。
根据本发明的优选实施方式，所述细胞制剂仅由细胞、生理盐水、海藻糖与甜菜碱组成。
本发明的发明人发现，海藻糖和甜菜碱配合特别适用于间充质干细胞的冻存，相比于甘油和二甲基亚砜等常见细胞冻存保护剂，海藻糖和甜菜碱在下细胞冻存中更具优势，细胞冻存活力更高、保存时间更长且更安全，因此，优选地，所述细胞为间充质干细胞，更优选为脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、牙髓间充质干细胞中的至少一种。
本发明还提供了海藻糖和甜菜碱在促进细胞冻存活力或提高细胞移植安全性中的应用。
本发明还提供了一种冻存细胞的方法，其特征在于，该方法包括：在缓冲液存在下，将细胞、海藻糖和甜菜碱混合；再将所得细胞混合物进行冷冻保存；其中，所述海藻糖与甜菜碱的重量比等如前所述，不再赘述。
本发明中，可以按照常规的冷冻方式将所得细胞混合物进行冷冻，但本发明的发明人发现，按照特定的方式进行冷冻将进一步提高细胞冻存活力，延长保存时间，因此，在本发明的优选实施方式中，将所得细胞混合物进行冷冻保存的方式包括：将所得细胞混合物依次置于-5℃至-3℃下8-15分钟；-25℃至-15℃下25-35分钟；-85℃至-75℃下15-20小时；-200℃至-190℃液氮保存，最优选地，将所得细胞混合物进行冷冻保存的方式包括：将所得细胞混合物依次置于-5℃至-3℃下9-11分钟；-21℃至-19℃下29-31分钟；-81℃至-79℃下16-18小时；-197℃至-195℃液氮保存。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，间充质干细胞来源于陕西省干细胞工程技术中心，为犬脂肪间充质干细胞；D-海藻糖购自山东优索化工科技有限公司；甜菜碱购自山东优索化工科技有限公司；间充质干细胞的活力检测方法参照细胞复苏后Giemsa染色结果，使用ImageJ软件对细胞数量进行定量分析，活力＝冻存后复苏的细胞数量/冻存前的细胞数量×100％，结果取平均值。
实施例1
①复苏间充质干细胞，使用添加10mL/100mL血清替代物的α-MEM培养
基在37℃，5％CO2培养箱中正常培养传代；
②消化贴壁培养的第4代次间充质干细胞并检测其活力，计数；
③将1×107个间充质干细胞转至1.5mL离心管，1500rpm/min离心三分钟。
弃去上清液，沉淀为间充质干细胞，一共制备64组细胞，每组3个平行；
④分别加入0.9％生理盐水、甜菜碱储液(甜菜碱浓度为1mg/μL)和D-海藻糖储液(D-海藻糖浓度为1mg/μL)，混匀，各个成分的加入体积
如表1所示；
⑤将上述成分混匀后得到的细胞制剂通过程序化冷冻保存(4℃下10分钟；
-20℃下30分钟；-80℃下约17小时；-196℃液氮保存)。
⑥液氮保存7天后，将细胞制剂投入37℃水浴加热2min，检测间充质干细胞的活力等，各组实验中冻存7天后复苏的细胞状态如图1所示，活力检测结果如表1所示。
⑦将第34组制剂水浴加热后的细胞制剂用于急性肝损伤小鼠的治疗。选取6-8周龄昆明白小鼠20只，平均分为4组(NC组，CCl4组，MSC组，MSC-P组)，使用2μL/g CCl4溶于橄榄油中对后三组小鼠腹腔注射，NC组腹腔注射等量橄榄油。腹腔注射2小时后，对MSC组小鼠由尾静脉移植正常培养不经冻存的MSC 2×106个/只，对MSC-P组小鼠由尾静脉移植实施例1第34组水浴加热后的细胞制剂。24小时后收集小鼠血清分析小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平。结果如图4显示，对比正常培养后不经冻存，仅加入99％生理盐水立即移植的MSC，实施例1第34组处理的MSC-P具备相似的治疗作用，包括对小鼠ALT，AST的恢复作用。
表1
实施例2
按照实施例1中第34和64组的方式进行冻存，不同的是，冻存的时间为60天，将细胞制剂投入37℃水浴加热2min，检测间充质干细胞的活力，结果分别95.2％和100.7％，细胞状态如图2所示。
实施例3
按照实施例1中第34和64组的方式进行冻存，不同的是，步骤⑤中冷冻的条件为直接将制剂转移至-196℃液氮保存，活力检测结果为分别为80％和83％，细胞状态如图3所示。
实施例4
选取6-8周龄昆明白小鼠30只，平均分为10组(详见表2，NC组，10％甜菜碱，50％甜菜碱，100％甜菜碱，10％海藻糖，50％海藻糖，100％海藻糖，10％DMSO，50％DMSO，100％DMSO)。腹腔注射2小时后收集小鼠血清分析小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)，天冬氨酸转氨酶(AST)，肌酐(Cr)及尿素氮(BUN)水平。结果如图5显示，第1～7组小鼠各项指标均在正常范围中，第8～10组由于DMSO导致了不同程度的肝肾损伤，其损伤程度随DMSO浓度升高而增加，显然，本发明的细胞制剂在临床使用安全性上更具优势。
表2
| 组别 | 生理盐水(μL) | 甜菜碱(μL) | D-海藻糖(μL) | 二甲基亚砜(μL) |
| 1 | 100 | 0 | 0 | 0 |
| 2 | 900 | 100 | 0 | 0 |
| 3 | 500 | 500 | 0 | 0 |
| 4 | 0 | 1000 | 0 | 0 |
| 5 | 900 | 0 | 100 | 0 |
| 6 | 500 | 0 | 500 | 0 |
| 7 | 0 | 0 | 1000 | 0 |
| 8 | 900 | 0 | 0 | 100 |
| 9 | 500 | 0 | 0 | 500 |
| 10 | 0 | 0 | 0 | 1000 |
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (11)
1.一种细胞制剂，其特征在于，该细胞制剂包括细胞、海藻糖和甜菜碱，其中，所述海藻糖与甜菜碱的重量比为1:1-4.2；其中，所述细胞为间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的细胞制剂，其中，所述海藻糖与甜菜碱的重量比为1:3.8-4。
3.根据权利要求1或2所述的细胞制剂，其中，相对于107-109个细胞，所述海藻糖的含量为10-100mg。
4.根据权利要求1或2所述的细胞制剂，其中，相对于107-109个细胞，所述海藻糖的含量为18-22mg。
5.根据权利要求1或2所述的细胞制剂，其中，所述细胞制剂为液体制剂且细胞的含量为107-109个细胞/mL；
或者，所述细胞制剂为液体制剂且海藻糖的含量为18-22mg/mL；
或者，所述细胞制剂为液体制剂且甜菜碱的含量为78-82mg/mL。
6.根据权利要求5所述的细胞制剂，其中，所述液体制剂还含有生理盐水。
7.根据权利要求1所述的细胞制剂，其中，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、牙髓间充质干细胞中的至少一种。
8.海藻糖和甜菜碱在促进细胞冻存活力或提高细胞移植安全性中的应用，其中，所述海藻糖与甜菜碱的重量比为1:1-4.2；其中，所述细胞为间充质干细胞。
9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述海藻糖与甜菜碱的重量比为1:3.8-4。
10.一种冻存细胞的方法，其特征在于，该方法包括：在缓冲液存在下，将细胞、海藻糖和甜菜碱混合；再将所得细胞混合物进行冷冻保存；其中，所述海藻糖与甜菜碱的重量比为1:1-4.2；其中，所述细胞为间充质干细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述海藻糖与甜菜碱的重量比为1:3.8-4。
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